Summary
In den letzten Jahren ist die Bildung von Keimzellen mit in-vitro-Kultur Methoden nachgewiesen wurde mit mehreren verschiedenen Arten von somatischen Stammzellen. Dieser Artikel wird visuell präsentieren die Differenzierung der neugeborenen Maus-Stammzellen zu frühen Oozyten-ähnlichen Zellen.
Abstract
Studieren Keimzellbildung und Differenzierung ist traditionell sehr schwierig aufgrund der geringen Zellzahlen und ihre Lage tief in sich entwickelnden Embryonen. Die Verfügbarkeit eines "geschlossenen" in vitro System könnte von unschätzbarem Wert für unser Verständnis der Gametogenese. Die Bildung der Eizelle-ähnlichen Zellen (OLC) von somatischen Stammzellen, aus neugeborenen Maus Haut isoliert, hat sich gezeigt und visualisiert werden in diesem Video-Protokoll. Die resultierenden OLCs auszudrücken verschiedenen Markern im Einklang mit Eizellen wie Oct4, Vasa, BMP15 und SCP3. Allerdings bleiben sie nicht in der Lage, um die Reifung oder Befruchtung aufgrund eines Fehlers zu vervollständigen Meiose durchlaufen. Dieses Protokoll wird ein System, das nützlich für die Untersuchung der frühen Bildung und Differenzierung von Keimzellen in reifer Keimzellen ist. Während der frühen Differenzierung die Anzahl der Zellen, die Oct4 (potentiellen Keim-ähnlichen Zellen) erreicht ~ 5%, jedoch derzeit die formation von OLCs bleibt relativ ineffizient. Das Protokoll ist relativ geradlinig, aber auch besondere Vorsicht geboten, um sicherzustellen, dass die ab-Zell-Population ist gesund und in einer frühen Passage werden.
Introduction
Während der frühen Embryogenese kommt Gametogenese durch eine Reihe von Stufen einschließlich Urkeimzelle (PGC) Bildung, Migration und schließlich Kolonisierung der Gonaden Grate. Während dieser Zeit PGCs unterziehen Proliferation und Differenzierung in immer mehr reifen Gameten 1. Die Tatsache, dass PGCs von der Basis der Allantois in den Embryo Enddarm und schließlich entlang der dorsalen Wand schließlich Kolonisierung der Gonaden Grate migrieren macht sie außerordentlich schwierig, 2 studieren. Trotz der Fortschritte in diesem Bereich, haben Studien versuchen, PGC Bildung und Differenzierung zu verstehen durch ihre begrenzte Anzahl, Lage und wandernde 3,4 behindert worden.
In den letzten Jahren embryonalen Stammzellen haben gezeigt, dass das Potential, Keimzellen in vitro 5,6 bilden. In ähnlicher Weise wurden verschiedene somatische Stammzellen auch gezeigt, dass das Potential zur Bildung von Keimzellen foll habenwegen in vitro Kultivierung 7-11. Kürzlich Stammzellen aus der Haut von Mäusen isoliert Neugeborenen wurden in vitro in Keim-ähnlichen Zellen und frühen Oozyten 12 differenziert. Während der Differenzierung die Teilmenge der Stammzellen exprimiert Oct4 erhöht und ähnlichen Strukturen Cumulus-Oozyten-Komplexe gebildet wurden. Die Oozyten-ähnliche Zellen (OLC) aus den Kulturen aufgenommen und im Vergleich zu natürlichen Oozyten. Mit dieser Kultur Verfahren OLCs Messung 40-45 um erhalten, dass express ähnliche Markierungen, um Eizellen wie Gdf9b, VASA und DAZL. Bis heute bleiben die resultierenden OLCs nicht fällig oder befruchtete 12.
Obwohl die OLCs bleiben nicht in der Lage zu funktionieren, das Protokoll verwendet, um diese OLCs bilden können noch Nutzen als Test, um die Entstehung und Entwicklung des früheren Stadium Keimzellen innerhalb studieren ein in vitro System geschlossen. Die ursprüngliche Veröffentlichung diskutieren die Bildung von so OLCsmatic Stammzellen genutzt fetalen Schweinehaut als Stammzell-Quelle 8. Aufbauend auf dieser Studie die PGC-ähnlichen Zellen früh während induzierte Differenzierung gebildet wurde gezeigt, dass die Vorstufen der OLCs und Eil wie PGC Marker als OCT4, VASA, STELLA, C-KIT und DAZL 13. Diese Daten unterstützen das Potenzial der Verwendung dieses Systems zu Keimzellbildung und Differenzierung in vitro zu untersuchen. Das Protokoll verwendet werden, um OLCs aus neugeborenen Maus Haut bilden wird in diesem Video-Artikel gezeigt werden. Dieses Protokoll bietet ein in vitro Modell zur Keimzelle Entwicklung, die ein Mittel zur Aufklärung wichtige Faktoren für die Proliferation und Differenzierung bieten kann studieren.
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Protocol
1. Nährmedienzubereitung
- Bereiten Medien 2-3 Stunden im Voraus über die Verwendung und Ort mit einem gelockerten Kappe in der Zellkulturbrutschrank wo das Experiment stattfindet. Medien in der vorliegenden Protokoll verwendet:
- Bereiten Stammzellen, das aus DMEM/F12 mit 1 x B27, 40 ng / ml bFGF und 20 ng / ml EGF ergänzt.
- Bereiten Keim Zelldifferenzierungsmedium bestehend aus M199 mit 0,05 IU FSH, LH 0,03 IU, 3 mg / ml BSA, 5 ul / ml ITS, 0,23 mM Natriumpyruvat, 1 mg / ml Fetuin und 1 ng / ml EGF ergänzt. Eine Basis, das aus allen Zusatzstoffen, jedoch unter Weglassen FSH, LH und EGF kann hergestellt und gelagert bei 4 ° C für bis zu einer Woche.
2. Stem Cell Culture Vorbereitung
- Isolieren Stammzellen aus neugeborenen Maus Welpen wie zuvor beschrieben 12. Nutzen Stammzellen bei Passage 2-4 für die in vitro Differenzierung Keimzelle. Der WirkungsgradOLC Bildung direkt mit der Qualität der Ausgangsstoffe Stammzellen verbunden. Am besten ist es, die Differenzierung, sobald die Bevölkerung sauber und gesund erscheint, das ist in der Regel bei rund Durchgang 2 zu starten. Weitere Kultivierung der Stammzellen letzten Durchgang 2 wirkt sich negativ auf die Effizienz OLC Bildung (unveröffentlichte Ergebnisse).
- 48 Stunden vor Beginn der Differenzierung Subkultur die Stammzellen. Entfernen Sie alle suspendiert kugelförmige Zellaggregate und verbrachte Medien aus der Kulturschale mit einer serologischen Pipette und in eine 15 ml Tube. Es ist wichtig zu erfassen nur die suspendierten sphärische Aggregate von Zellen und die Zellen nicht an der Unterseite der Schale, die spontan differenzierenden.
- Pellet die Zellen bei 500 xg für 5 min., Den Überstand verwerfen und Resuspension in 500 ml frisches Stammzell-Medien erwärmt auf 37 ° C. Gently Pipette die Aggregate teilweise distanzieren die Zellen. Nicht aggressiv Pipette in die Zelles, da dies die Lebensfähigkeit der Zellen zu reduzieren. Waschen Sie die teilweise dissoziierten Zellen in 9,5 ml frischem vorgewärmten Stammzell-Medium auf einem niedrigen Aufsatz 10 cm Zellkulturschale.
- Liefert die Zellen auf eine 37 ° C, 5% CO 2 Inkubator für Zellkulturen 48 Stunden vor Beginn der Differenzierung.
3. OLC Differenzierung
- Mit einer serologischen Pipette entfernen Sie die Stammzellen aus der Kulturschale und in einen 15-ml-Tube, hinter alle angeschlossenen Zellen zu verlassen. Pellet die Zellen bei 500 xg und Resuspendieren in 500 ul sterilem PBS. Kräftige Pipette die Zellen mit einer breiten Bohrung 1.000 ul Spitze in Klumpen nicht größer als 10-20 Zellen. Entfernen Sie regelmäßig eine kleine Menge von Zellen, während Dissoziation, und überprüfen unter einem weißen Lichtmikroskop zu bestätigen aggregierten Zellen sind in Klumpen von 10-20 einzelnen Zellen. Über Dissoziation führt zu verminderter Lebensfähigkeit der Zellen führen.
- In 9,5 ml PBS zu den dissoziierten Zellen und fügen Sie 15 ul dieser Zellsuspension auf eine Zählkammer zur Zellzählung. Pellet die Zellen bei 500 xg für 5 min.
- Resuspendieren der Zellen in einer Konzentration von 1.32X10 6 Zellen / ml in Differenzierungsmedium.
- Platte die Zellen durch Zugabe von 500 ul pro Well in eine 24-Well-Flachboden Suspension Gericht.
- Legen Sie die 24 Well-Platte in einer Zellkultur-Inkubator bei 37 ° C in 5% CO 2 für 48 Stunden. Entfernen 250 ul Medium aus jedem Well entnommen und in einen entsprechend gekennzeichneten 1,5 ml Tube. In 250 ul frisch Differenzierung Medium in jede Vertiefung. Zentrifuge das verbrauchte Medium bei 500 xg für 5 min. und den Überstand verwerfen. Resuspendieren keine pelletierten Zellen in 50 ul frisch Differenzierung Medium und auf die entsprechende Kultur auch auf die Differenzierung Platte.
- Jede 48 Stunden verändern Hälfte des Mediums bis zum Tag 12 der Differenzierung.
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Representative Results
Zunächst werden die Zellen auf der Kulturschale Boden anlagern und ausbreiten. Bei 42-72 h in Differenzierung kleine suspendiert OCT4 positive Zellen zu bilden und vermehren (Abbildung 1A). Kurz nach der Visualisierung dieser Zellen die Mehrheit wird verschwinden und die anhaftenden Zellen entsteht dichter Kolonie Aggregate auf die Kultur Boden zu bilden. Nach ein paar Tagen wird diese Aggregate aus der Kultur Oberfläche lösen. In einigen dieser Aggregate eine große Zelle zu beobachten (Abb. 1b und 1c) werden. Bei der ersten Visualisierung werden die Zellen ~ 35 um im Durchmesser. Bei fortgesetzter Kultur die OLCs wird wachsen, um ~ 45 &mgr; m im Durchmesser erreichen. Das sind die OLCs und kann mit Unterstützung Zellen gesammelt werden oder Trypsin zu OLCs ohne andere Zellen angebracht (Abbildung 1d) erhalten.
Um zu bestätigen, dass die OLCs ähnliche Transkripte ausdrücken als natürliche Oozyten die OLCs können gesammelt und für die getestet werdenAusdruck solcher Marker als zpc, SCP3, CMOS, Oct4, BMP15 und Vasa. Während Oct4 und Vasa in den undifferenzierten Stammzellen exprimiert werden mehrere Marker wie BMP15 und zpc sind spezifische Eizelle. BMP15 ist ein Mitglied der TGF-β-Familie und ist in Oozyten und Follikel-Entwicklung beteiligt. Die Eizelle spezifischen zona pellucida Membran-Struktur besteht aus mehreren Proteinen, einschließlich ZP3 gemacht. Die Expression dieser Eizelle Marker können verwendet werden, um das Vorhandensein von in OLCs Differenzierungen zu bestätigen. Darüber hinaus kann die Expression von meiotischen spezifischen Markern wie SCP3 und CMOS potentiell meiotischen Zellen in der Kultur zu identifizieren. In dem angeführten Beispiel 10 und 10 OLCs Oozyten wurden gesammelt und direkt cDNA-Synthese durchgeführt werden (Abb. 2). Die erhaltenen Proben wurden dann unter Verwendung von semi-quantitative PCR. Vergleichen der Expression dieser Marker natürliche Mausoocyten wirUnterschiede in der Höhe der Transkripte (Abbildung 2). Viele Marker von Oozyten exprimiert wird OLCs ausgedrückt werden, wenn die Differenzierung erfolgreich war.
Abbildung 1. Gemeinsame Morphologien während induzierte Differenzierung von Stammzellen aus der Haut. a) Während des frühen Differenzierung positiven Zellen OCT4 (grün) in dem Kulturmedium nachgewiesen werden. Kerne werden Zähler mit Hoechst (blau) gefärbt. B) Differenzierung fortschreitet einige Zellaggregate mit OCT4 (grün) positive Zellen durch OCT4 negativen Zellen umgeben zu sehen sein wird. Kernfärbung mit Hoechst wird auch (blau). C) Ein weißes Licht Bild von einem Follikel-Struktur nach dem Ablösen von der Kulturfläche. D) Während Unterschied dargestellterentiation große OCT4 positiv (grün) Oozyten-ähnlichen Zellen zu sehen entweder durch Zellen oder einfach in der Kultur umgeben sein. Maßstab Bars: a = 20 um, b = 100 um, c = 40 &mgr; m, d = 10 um.
Abbildung 2. Transcript Ebene in OLCs, im Vergleich zu Oozyten, gemeinsamer Eizelle Marker. Repräsentative real time PCR Ergebnisse, die die Abschrift Ebene der gemeinsamen Eizelle Marker in OLCs. Dieser Vergleich wird von 10 Oozyten-ähnlichen Zellen auf 10 neugeborenen Maus-Oozyten Vergleich resultierenden.
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Discussion
Um funktionelle OLCs bisher nicht entwickelt worden, mit einer komplett in-vitro-Assay. Vor kurzem wurde eine Studie von Hayashi et al. Konnte Nachkommen von PGC-ähnlichen Zellen in vitro gebildet und übertragen in vivo für die weitere Entwicklung 14 produzieren. Beginnend mit ES-Zellen oder induzierten pluripotenten Zellen konnten sie PGC wie Zellen, die, wenn nach in vivo Transplantation erholt bilden konnten gereift, befruchtet werden, und verwendet werden, um Nachkommen zu erzeugen 14. Dies zeigt, dass Stammzellen aus verschiedenen Quellen haben das Potenzial, unter den richtigen Bedingungen, um funktionelle Oozyten zu bilden.
Bestimmte Aspekte der Kultur-System sind für sie funktioniert. Der Stamm von Mäusen verwendet, um die Stammzellen zu isolieren ist sehr wichtig. Dieses Protokoll wurde entwickelt und mit B6-Mäusen aus dem Jackson Lab (Stock # 008214) verwendet. Diese Mäuse tragen eine Oct4-EGFP transgene ermöglicht visualization von Zellen Oct4 über die EGFP. Wenn das Protokoll wurde versucht, mit Stammzellen aus CD1-Mäusen die Effizienz war viel niedriger und der OLC Bildung war weniger zuverlässig. Derzeit ist die Effizienz der OLC Bildung niedrig bleibt auch bei Verwendung von B6-Mäusen. Die Stammzellen genutzt werden sollten bei Passage 2-4 vor Beginn der Keimzelle Differenzierung so die Effizienz der Keimzellbildung ist viel niedriger, wenn Sie später Durchgang Zellen. Die Quelle von verschiedenen Reagenzien auch hat sich als wichtig erwiesen.
Die Analyse der verschiedenen mRNA-Transkripte in der OLCs kann sich als nützlich erweisen bei der Optimierung der Kultur-System. Mit semi-quantitative PCR ermöglicht den Vergleich mehrerer Marker Expression zwischen OLCs und Oozyten (Abbildung 2). Die Ergebnisse zeigen, dass die OLCs weniger als zpc Oozyten, die die fragile Natur und dünner zona pellucida Membran OLCs erklären ausdrücken darf. Die Expression des Marker Meiose
Das hier beschriebene Protokoll stellt eine in vitro-Methode gesteuert, um Keimzellbildung und Differenzierung zu studieren. Derzeit werden die PGC-ähnlichen Zellen erzeugt werden, sind nicht in der Lage, um funktionelle OLCs bilden, wenn in vitro gehalten. Bei Neugeborenen mit Eierstock-somatischen Zellen aggregiert und verpflanzt in vivo die PGC-ähnliche Zellen sind in der Lage, frühzeitig Sekundärfollikel bilden. Allerdings, wenn die OLCs gewonnen werden, sie sind immer noch nicht zuverlässig gereift und befruchtet 12. Das Dienstprogramm in diesem Test kommt aus dem Studium vor meiotischen Keimzellen von somatischen Stammzellen abgeleitet.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
PWD wird von einem kanadischen Institutes of Health Research Fellowship (CIHR) und einen Zuschuss für CIHR Gerald M. Kidder bei Western University unterstützt. Der Autor möchte auch Julang Li an der University of Guelph bestätigen für die Hilfe bei der Entwicklung des hier vorgestellten Protokoll.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 | Invitrogen | 12500 | |
| B27 | Invitrogen | 17504044 | |
| EGF | Invitrogen | PHG0311 | |
| bFGF | Invitrogen | PHG0266 | |
| ITS | Invitrogen | 41400-045 | |
| BSA | Sigma | A-6003 | |
| Sodium Pyruvate | Invitrogen | 11360-070 | |
| Fetuin | Sigma | F3385 | |
| FSH | Sioux Biochemicals | 915 | |
| LH | Sioux Biochemicals | 925 | |
| M199 | Invitrogen | 31100-035 | |
| 24 well plates | Nunc | 144530 | |
| 10 cm dishes | VWR | 25384-088 | |
| 15 ml tubes | BD | 352095 |
References
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