Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

توصيف الاستجابات الالتهابية خلال الاستعمار داخل الشرج مع الالتهاب الرئوي العقدي

Published: January 17, 2014 doi: 10.3791/50490
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Pathology and Molecule Medicine, McMaster University

Summary

يتم وصف استعمار البلعوم الأنفي المورين مع الالتهاب الرئوي العقدي والاستخراج اللاحق للخلايا الملتصقة أو المجندة. تتضمن هذه التقنية مسح البلعوم الأنفي وجمع السائل من خلال nares وهي قابلة للتكيف مع قراءات مختلفة ، بما في ذلك تحديد كمية الخلايا التفاضلية وتحليل تعبير مرنا في الموقع.

Abstract

استعمار البلعوم الأنفي بواسطة المكورات العقدية الرئوية هو شرط أساسي لغزو الرئتين أو مجرى الدم1. هذا الكائن قادر على استعمار السطح المخاطي للناسوبهارين ، حيث يمكن أن يقيم ويتكاثر ويتغلب في نهاية المطاف على الدفاعات المضيفة لغزو الأنسجة الأخرى للمضيف. يؤدي إنشاء عدوى في الجهاز التنفسي السفلي عادة إلى الالتهاب الرئوي. بدلا من ذلك ، يمكن للبكتيريا أن تنتشر في مجرى الدم مما يسبب البكتيريا ، والتي ترتبط بارتفاع معدلات الوفيات2، أو تؤدي مباشرة إلى تطور التهاب السحايا الرئوي. فهم الحركية ، والاستجابات المناعية للاستعمار البلعومي الأنفي هو جانب مهم من نماذج العدوى الالتهاب الرئوي S.

نموذج الماوس لدينا من الاستعمار داخل الجهاز العصبي مقتبس من النماذج البشرية3 وقد استخدمت من قبل مجموعات بحثية متعددة في دراسة استجابات مسببات الأمراض المضيفة في البلعومالأنفي 4-7. في الجزء الأول من النموذج ، نستخدم عزلا سريريا للالتهاب الرئوي S. لإنشاء استعمار بكتيري ذاتي الحد يشبه أحداث النقل في البالغين البشريين. الإجراء المفصل هنا ينطوي على إعداد inoculum البكتيرية، تليها إنشاء حدث الاستعمار من خلال تسليم inoculum عبر طريق داخل الجهاز الداخلي للإدارة. الضامة المقيمة هي نوع الخلية السائد في البلعوم الأنفي خلال الحالة الثابتة. عادة، هناك عدد قليل من الخلايا الليمفاوية الموجودة في الفئران غير المصابة8،ولكن الاستعمار المخاطي سيؤدي إلى التهاب منخفض إلى عالي الجودة (اعتمادا على ضراوة الأنواع البكتيرية والإجهاد) التي من شأنها أن تؤدي إلى استجابة مناعية وتجنيد الخلايا المناعية المضيفة في وقت لاحق. يمكن عزل هذه الخلايا عن طريق مرحاض محتويات القصبة الهوائية من خلال nares ، وترتبط بكثافة البكتيريا الاستعمارية لفهم حركة العدوى بشكل أفضل.

Protocol

قبل البدء: يتم تنفيذ جميع الخطوات في خزانة السلامة البيولوجية من المستوى 2 (BSL2) من Biohazard (BSC) ما لم يذكر خلاف ذلك. يرجى التأكد من حصولك على الموافقة المناسبة على المخاطر البيولوجية لاستخدام مسببات الأمراض البكتيرية المعدية وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية قبل بدء التجارب. بالإضافة إلى ذلك، يرجى التأكد من أن لديك جميع المواد والكواشف اللازمة لإجراء الإجراء المعد مسبقا. وشملت الفئران المستخدمة في هذه التجارب الفئران C57BL/6 الإناث من مختبرات جاكسون، نهر تشارلز أو Taconic وكانت 10-14 أسابيع من العمر (على الرغم من أننا لم نجد أي اختلافات كبيرة تعتمد على نوع الجنس في الحركية لإزالة استعمار الأنف أو العدوى). تم تربية جميع الفئران المستخدمة في هذه التجارب وصيانتها في ظل ظروف خالية من مسببات الأمراض المحددة ، وكانت خالية من الفيروسات الشائعة ، (LCMV ، MNV ، MPV ، reovirus ECTV ، وغيرها) البكتيريا(مثل H. pylori)والطفيليات(مثل الدودة الدبوسية ، ectoparasites) عن طريق اختبار عينات البراز وكذلك التقييم التشريحي المتكرر للفئران الحارسة المتعايشة داخل غرف منشأتها. عند إجراء هذه التجارب، نوصي باستخدام فئران التحكم التي لا تقل أعمارها عن 10-12 أسبوعا ولا يزيد عمرها عن 6 أشهر. الفئران الأصغر سنا أو الأكبر سنا من هذه الفئة العمرية هي أكثر عرضة لفترة أطول النقل الأنفي وزيادة احتمال نشر العدوى. خلفية الماوس هو اعتبار مهم آخر قد يؤثر على نتائج تجربة الاستعمار ، حيث أثبتت عدة مجموعات أن الفئران من خلفيات وراثية مختلفة لديها قابليات مختلفة لسلالة S. pneumoniae D39 (النمط المصلي 2)910. S. الالتهاب الرئوي ليس الممرض مورين التي تحدث بشكل طبيعي وخزانها الطبيعي الوحيد هو البلعوم الأنفي البشري. يحدث انتقال العدوى عن طريق قطرات الجهاز التنفسي ، وبما أن الفئران لا تنتج إفرازات تنفسية ، لا يمكن للفئران الفردية نقل البكتيريا إلى الفئران الأخرى ، لذلك لا يوجد قلق لانتقال الماوس إلى الماوس11. للحصول على نظرة عامة مرئية على الإجراءات الموضحة في هذه المخطوطة، يرجى الرجوع إلى الشكل 1.

1. إعداد ثقافة الالتهاب الرئوي S.

  1. تلقيح 5 مل من أجار الصويا المحاولة لنمو تعليق المكورات العقدية الالتهاب الرئوي.
  2. الثقافة في ظل ظروف ثابتة في 37 درجة مئوية في 5٪ CO2 حتى يصل inoculum البكتيرية نمو مرحلة السجل مع كثافة السائل المقابلة من 108 CFU/ml كما يحددها عداد المسافات تعيين إلى 600 نانومتر. القراءة الدقيقة المقابلة لهذا CFU سوف تختلف تبعا لسلالة البكتيرية المحددة المختارة. بالنسبة لمعظم سلالات الالتهاب الرئوي S. وهذا يتوافق مع نطاق OD600 من 0.45-0.55. عادة، سوف تنمو سلالات الالتهاب الرئوي S. في الثقافة السائلة إلى هذه الكثافة في غضون 1.5-2.5 ساعة في ظل الظروف الموصى بها، مع عدم الحاجة إلى التصنيع الفرعي. لا ينبغي السماح للثقافة أن تنمو أكثر من مرة (بعد قراءة OD من 0.75) لأن هذا يمثل النقطة التي البكتيريا لم تعد في مرحلة النمو سجل وتخضع لتحلل تلقائي واسع النطاق.
  3. سيتم تلقيح كل فأر بحوالي 107 بكتيريا. لذلك ، لكل 9 فئران يتم استعمارها ، ماصة 1 مل من inoculum في أنبوب Eppendorf وتدور في 15000 × غرام لمدة 1 دقيقة. يجب أن تكون بيليه بيضاء مرئية. إزالة supernatant، مع الحرص على عدم تعكير صفو بيليه وإعادة إنفاق البكتيريا في 100 ميكروغرام من الفوسفات المالحة المخزنة (PBS)، وبالتالي زيادة التركيز إلى 109 CFU/ml. في هذه المرحلة ، يجب أن تظل البكتيريا قابلة للحياة ، ولكنها لن تتكرر بسهولة.
  4. إذا كنت تستخدم عدة أليوت، والجمع بين أنبوب واحد للسيطرة على اختلافات طفيفة بين العينة في الكثافة البكتيرية.
  5. احتفظ بالبكتيريا على الجليد حتى تصبح جاهزة للتلقيح، لمدة ساعة واحدة كحد أقصى.
  6. للحصول على عدد بكتيري دقيق ، قم بإجراء سلسلة تخفيف تسلسلي من الحكمة الخشبية بدءا من inoculum البكتيرية الأنيقة. تمييع تسلسلي 10 أضعاف، مضيفا 10 ميكروغرام من إلى 90 ميكروغرام من برنامج تلفزيوني عقيمة.
  7. لوحة من أصل 3 قطرات من عينات 10 ميكرولتر من التخفيفات10-5 -10 -9، بالإضافة إلى التحكم في التلوث PBS فقط ، على أقسام وصفت بشكل منفصل من أجار الصويا المحاولة (TSA) لوحة تكملها 5 ٪ من دم الأغنام(الشكل 2). تأكد من تغيير نصائح ماصة لكل خطوة تمييع من تركيز CFU أعلى إلى تركيز CFU أقل لتجنب حمل البكتيريا الزائدة وزيادة تقلب النتائج. يمكن أيضا استخدام ألواح أجار الدم البشري (HBA) بدلا من TSA. نظرا لأن العديد من سلالات الالتهاب الرئوي S. مقاومة للنيوميسين (من 5-20 ميكروغرام / مل) ، يمكن أيضا إضافة هذا المضاد الحيوي إلى وسيط أجار المفضل أثناء مرحلة إعداد اللوحة. وهذا يسهل التعداد لأنه يقضي على البكتيريا غير الكترتيز. يجب اختبار قابلية المضادات الحيوية لكل سلالة مسبقا لتحديد التركيز الأمثل للمضادات الحيوية لاستخدامها لكل سلالة بكتيرية.
  8. السماح لتجف لمدة 15-30 دقيقة كشف، ثم تغطية لوحات ووضع رأسا على عقب في حاضنة البكتيرية تعيين إلى 37 درجة مئوية و 5٪ CO2. يكبر المستعمرات البكتيرية على لوحة لمدة 24 ساعة.
  9. تحديد عدد وحدات تشكيل مستعمرة وتركيزها المقابلة. استنادا إلى تحديد قيمة OD600 ، يجب أن يكون التركيز ضمن نطاق 1-4 × 109 CFU / ml. يجب أن تظهر مستعمرات الالتهاب الرئوي الصغيرة الدائرية بلون مصفر بيج ، مع منخفض صغير في المركز يعطيها مظهرا يشبه الدونات (الشكل 3).

2. مورين استعمار داخل الشرج

  1. كبح جماح الفئران عن طريق وضعها في جهاز ضبط النفس الماوس (تعديل أنبوب فالكون 50 مل مع طرف قطع لخلق فتحة) تأمين لهم من قبل قاعدة الجسم مع الإبهام بحيث أنوفهم تخرج للتو من نهاية مدبب من جهاز التقييد(الشكل 4). استخدام هذا الجهاز يسمح لشل حركة رأس الفأر والفصل من nares لها بطريقة تقلل من الحركة، فضلا عن يعوق محاولات من الحيوان لmasicate طرف ماصة، مما يسمح لتسليم كامل من inoculum. بدلا من ذلك، يمكن شل حركة الفئران عن طريق الشجار في الرقبة وضبط النفس اليدوي. نحن لا نوصي بتخدير الحيوانات قبل التلقيح داخل الجهاز. إدارة inoculum للحيوانات تحت التخدير يؤدي إلى بعض من inoculum تنتشر إلى الرئتين12,13.
  2. باستخدام ماصة P10 أو P20 ، تلقيح كل فأر عن طريق إيداع 10 ميكرولتر من الثقافة المعدة ، وتوزيعها بالتساوي بين كلا nares (اسمح ل inoculum بالتنقيط في الأنف عن طريق نبض التطعيم تدريجيا ، مع أخذ الوقت للفئران لاستنشاق الإكولوم). لتحقيق التسليم الكامل لل inoculum، وقفة الإدارة في أي نقطة الماوس يبدأ في تحريك أنفه بشكل مفرط. قد لا يتم حقن inoculum كامل في nares كما الفئران قد طرد بعض من خلال الأنف أثناء الزفير; ومع ذلك ، حيث أن الكمية المطرودة تميل إلى أن تكون ضئيلة ، ويحتوي inoculum على كمية عالية للغاية من البكتيريا ، فإن هذا لا يؤثر بشكل كبير على الحمل البكتيري المستعمر. بالإضافة إلى ذلك ، فإن المساحة السطحية المتاحة للاستعمار في الغشاء المخاطي الأنفي محدودة وبالتالي وجدنا نحن وآخرون أن الجرعة الموصى بها 107 كافية للحصول على مستويات ثابتة من البكتيريا في جميع الفئران ، مما يؤدي إلى الحد الأدنى من التباين في الكميات الأولية من البكتيريا المستعمرة14،15 .
  3. وزن الفئران إذا استخدام مؤشرات الوزن كجزء من رصد نقطة النهاية الخاصة بك. مراقبة الفئران كل 12-24 ساعة للأعراض السريرية، بما في ذلك الخمول والفراء المكشكش وفقدان الوزن. الفئران عادة لن تظهر أعراض المرض حتى 3-5 أيام بعد الاستعمار، وهذه سوف تسبقها فقدان الوزن الذي قد متوسط حوالي 5٪ من إجمالي وزن الجسم يوميا. كما الفئران تصبح مريضة على نحو متزايد أنها سوف تفترض المواقف حدب وتظهر انخفاض النشاط وانخفاض الاستجابة للتحفيز، بما في ذلك التعامل معها. في هذه المرحلة ، عادة ما يكون المرض مؤشرا على الإنتان و / أو الالتهاب الرئوي ومن المرجح أن يكون عضالا ، على الرغم من أنه يمكن علاج الفئران بمل واحد من المالحة تحت الجلد يوميا لتحسين النتائج. الفئران على قيد الحياة يجب أن تبدأ تظهر تحسنا بعد يوم 7 ما بعد الاستعمار، كما يتضح من تثبيت الوزن تليها زيادة الوزن، على الرغم من سلالات مختلفة من الالتهاب الرئوي S. قد تحفز المرض بسرعة أكبر ويؤدي إلى تطور الأعراض السريرية على طول خط زمني مختلف. يرجى الاطلاع على الشكل 5 للحصول على نتيجة تمثيلية للوزن الذي تم تتبعه في الفئران المستعمرة بسلالة P1547.

3. جمع عينة لافاج الأنف

قبل البداية: إعداد الإبر المعلبة باستخدام 1 مل من المحاقن المتوجة بإبر مشطوفة 26 3/8 G. قطع 2.5 سم قطعة من أنابيب البولي ايثيلين PE20 مع قطر داخلي 0.38 ملم، وضمان أن كل نهاية لديها طرف مشطوف. باستخدام ملقط، الشريحة قطعة 2.5 سم طويلة من أنابيب البولي ايثيلين PE20 (القطر الداخلي 0.38 ملم) على طرف إبرة، وتجنب ثقب الجانب أنابيب. يمكن الاحتفاظ بالإبر المعلبة في الإيثانول بنسبة 70٪ حتى الحاجة.

  1. قتل الفئران التجريبية. وبما أن خلع عنق الرحم يمكن أن يضر القصبة الهوائية، يجب تجنب طريقة القتل الرحيم هذه. الطريقة المفضلة لدينا هي تخدير الأيزوفلوران متبوعا بالتخدير الزائد ، ومع ذلك ، تأكد من اتباع المبادئ التوجيهية المؤسسية عند اختيار طريقة القتل الرحيم.
  2. باستخدام الإيثانول المائي بنسبة 70٪، قم بتعقيم الفراء الفائق للحيوان، وخاصة الرقبة، مع الحرص على منع الإيثانول من الوصول إلى النرجس.
  3. جعل قطع طولية واحدة على طول خط الوسط من عنق الحيوان، واثنين من التخفيضات الأفقية على كلا الطرفين، وخلق فرصة لتصور القصبة الهوائية.
  4. قشر بعناية الجلد مرة أخرى إلى أي من الجانبين، والكشف عن أنسجة الرقبة تحت.
  5. يجب أن تكون القصبة الهوائية مرئية، وتحيط بها عضلات طولية على كلا الجانبين. قص بعناية هذه لتوفير رؤية واضحة للرغامى نفسها، مع الحرص على عدم قطع الأوعية الدموية المحيطة بها.
  6. إذا تم قطع الأوعية الدموية والدم موجود، قبل المتابعة، والسماح للنزيف لوقف، ومن ثم تطهير المنطقة عدة مرات عن طريق الاستغناء عن برنامج تلفزيوني عقيم واستخدام الشاش العقيم لامتصاص الرطوبة الزائدة بلطف في المنطقة.
  7. مرة واحدة يتم كشف القصبة الهوائية بشكل صحيح، وجعل عرضية، وقطع semilunar في القصبة الهوائية حوالي منتصف الطريق حتى(الشكل 6).
  8. رسم 1000 ميكروغرام من برنامج تلفزيوني معقم في إبرة المعلبة المعدة مسبقا.
  9. إدراج قنية في القصبة الهوائية نحو الأنف، والحفاظ على حافة مشطوف مشيرا إلى أسفل لسهولة الإدراج (الشكل 7). مرة واحدة إبرة في مكان، تدويره 180 درجة، والتحقيق بلطف صعودا حتى تشعر مقاومة الضوء.
  10. مكان Eppendorf المخصصة لجمع العينات فقط تحت أنف الماوس.
  11. اختبار الموضع الصحيح من إبرة عن طريق الاستغناء عن الحد الأدنى (~ 20 ميكرولتر) كمية من السائل lavage PBS - قطرة من السوائل يجب أن تشكل حول nares من الماوس; إذا كان هذا هو الحال، انتقل إلى الخطوة 3.13).
  12. إذا كان اختبار برنامج تلفزيوني يخرج مباشرة من فم الحيوان، وسحب القنية مرة أخرى، وإعادة وضع مرة أخرى بلطف التحقيق إلى الأمام حتى يشعر مقاومة طفيفة جدا - الحرص على عدم دفع القنية بعيدا جدا الماضي هذه المقاومة، كما سوف تتحرك عليه الماضي الحنك الأنفي ومن خلال لتجويف الفم.
  13. الاستغناء عن محتويات إبرة بسرعة للمساعدة في تشريد وجمع أقصى قدر من الخلايا - محتويات ينبغي أن تتدفق من خلال nares من الماوس وإلى أنبوب جمع. ضع العينة على الجليد مباشرة.
  14. لجمع عينات لتحليل الحمض النووي الريبي، كرر الخطوات 3.8-3.13) باستخدام إبرة معلبة تحتوي على 500 ميكرولتر من مخزن تحلل الحمض النووي الريبي على نفس الفأر. وهذا سيسمح بجمع عينة التحلل من مجموعات الخلايا المتبقية، التي تتكون إلى حد كبير من الظهارة المخاطية الأنفية الأنفية، حيث كان ينبغي إزالة الخلايا غير المبشرة بعد اللافاج الأولي لبرنامج تلفزيوني. يرجى ملاحظة أن العازلة تحلل الحمض النووي الريبي سوف تنضح الظهارة وتدمير الأنسجة المحيطة بها، لذلك يجب توخي الحذر لتجنب الاتصال مع أجهزة مثل الرئتين، إذا كان الاحتفاظ بهذه الأنسجة هو المطلوب. مرة واحدة جمعها، ضع عينة في الحمض النووي الريبي تحلل العازلة مباشرة على الجليد الجاف لالتقاط تجميد. مرة واحدة في تحلل العازلة، يمكن تخزين العينات وفقا لتعليمات الشركة المصنعة، ومستقرة عادة في -70 درجة مئوية لعدة أشهر.

4. تحديد الحمل البكتيري في البلعوم الأنفي

  1. البكتيريا الكمية عن طريق إعداد سلسلة تخفيف المسلسل لكل عينة المرحاض الأنف مورين. بشكل عام ، يمكن توقع أن يكون الحمل البكتيري بين 0-104 CFU ، وبالتالي إجراء ثلاثة مخففات تسلسلية 10 أضعاف. إضافة 10 ميكرولتر من عينة الحمم الأنفية أنيق (100 CFU /ml) إلى الأنبوب الأول إلى تركيز10-1 CFU/ml. دوامة جيدا.
  2. تقسيم لوحة البكتريولوجية إلى أرباع، وأرباع التسمية مع كل عضو في سلسلة التخفيف (100-10-3 CFU/ml). لوحة من أصل 3 قطرات من 10 ميكرولتر عينات من 3 التخفيفات وعينة أنيق على لوحات أجار الصويا tryptic تكملها مع دم الأغنام 5٪، كما هو الحال في الشكل 2.
  3. السماح لتجف لمدة 15-30 دقيقة كشف، ثم تغطية لوحات ووضع رأسا على عقب في حاضنة البكتيرية مع الظروف المثلى لنمو البكتيريا (عادة 37 درجة مئوية و 5٪ CO2).
  4. يكبر المستعمرات البكتيرية على لوحة لمدة 18-24 ساعة.
  5. تحديد عدد البكتيريا المستعمرة عن طريق متوسط المستعمرات التي تشكلت على لوحة لكل تخفيف (الشكل 3). يوضح الشكل 8 الكثافة البكتيرية خلال نقاط زمنية مختلفة ، كما تحددها ثقافة المراحيض الأنفية ، في الفئران المستعمرة ب 3 سلالات مختلفة من الالتهاب الرئوي S. لمدة تصل إلى 21 يوما.

5. إعداد عينات لتدفق الخلايا

قبل البدء: إعداد مزيج من الأجسام المضادة. من أجل تحديد كمي لتجمعات الكريات البيض، نوصي بالمزيج التالي في المخففات المحددة: PE-Ly6G (استنساخ 1A8، 1 ميكروغرام/مل)، FITC-Ly6C (استنساخ AL-21,1 ميكروغرام/مل)، eFluor 450-CD45 (استنساخ 30-F11، 2.67 ميكروغرام/مل)، APC-F4/80 (استنساخ PM8 RUO، 0.67 ميكروغرام/مل)، PerCP-Cy5.5-CD11c (استنساخ N418 RUO، 0.5 ميكروغرام/مل)، PE-Cy7-CD11b (استنساخ M1/70، 0.33 ميكروغرام/مل)، أليكسا فلور 700-CD3 (استنساخ 1782، 4 ميكروغرام/مل)، eFluor 605NC-CD4 (استنساخ GK1.5، 6.67 ميكروغرام/مل). يرجى ملاحظة أن هذا المزيج هو تركيز 2x (انظر الخطوة 5.5). وينبغي تخفيف جميع الأجسام المضادة في FACs غسل العازلة (0.5٪ مصل العجل الجنيني، 2mM EDTA، 0.1٪ azide الصوديوم في برنامج تلفزيوني) والتي ينبغي أيضا أن تكون مستعدة مسبقا. في خليط من isotype مطابقة الأجسام المضادة للسيطرة، من الناحية المثالية من نفس المورد كما الأجسام المضادة المسمى وبنفس تركيزات الأجسام المضادة محددة، ينبغي أن تكون مستعدة. العينات المعالجة بالأجسام المضادة للتحكم بالنمط المتساوي ستعمل كعنصر تحكم سلبي. وينبغي اعتبار أي مضان لوحظ في العينات المعالجة بالأجسام المضادة للتحكم بالنمط المتساوي خلفية.

  1. Prechill جهاز طرد مركزي قادر على الغزل 1.5 مل أنابيب Eppendorf إلى 4 درجة مئوية.
  2. عينات المراحيض الأنفية الطرد المركزي في 2000 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية. ماصة بعناية من supernatant والاحتياطي. ملاحظة: نظرا لكمية صغيرة من الخلايا داخل البلعوم الأنفي، فإن بيليه الخلية لن تكون مرئية ما لم يكن هناك تلوث خلايا الدم الحمراء غير مرغوب فيه، والتي سوف مشرق الأحمر. إذا كان هذا هو مشاهدة، يجب تجاهل نموذج.
  3. عينة ريسوسبند في 50 ميكرولتر من Fc؟ RIIb/CD16-2 (2.4G2) الأجسام المضادة (الذي يربط مستقبلات Fc ويقلل من ربط الأجسام المضادة غير محددة) في FACs غسل العازلة بتركيز 4 ميكروغرام / مل.
  4. عينة حضانة على الجليد لمدة 30 دقيقة.
  5. إضافة 50 ميكرولتر من 2x preprepared مزيج الأجسام المضادة الفلورية المركزة لعينة. خصص عينة تمثيلية من كل مجموعة تجريبية لتكون بمثابة عنصر تحكم متساوي النمط. إضافة مزيج الأجسام المضادة isotype إلى هذه العينة بدلا من مزيج وصمة عار.
  6. عينة حضانة على الجليد لمدة ساعة واحدة.
  7. عينات الطرد المركزي عند 2000 × غرام لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. تجاهل supernatant وإعادة الإنفاق في 200 ميكروغرام من برنامج تلفزيوني.
  8. كرر الخطوة 5.7.
  9. بعد الغسيل الثاني، عينات الطرد المركزي مرة أخرى في 2000 x ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية.
  10. Resuspend في أي من برنامج تلفزيوني (إذا تشغيل العينة على الفور) أو 2٪ paraformaldehyde (إذا كان تشغيل عينات 1-3 أيام بعد تلطيخ).
  11. عند إجراء قياس التدفق الخلوي جمع الحد الأقصى من الأحداث لكل عينة أو حتى تم يستنشق العينة بأكملها. في الفئران الصغيرة غير المصابة والصحية ، سيكون هذا أقل من 1000-2000 حدث إجمالي ؛ خلال حدث استعماري بكتيري، قد يزيد هذا العدد أكثر من 2 إلى 5 أضعاف اعتمادا على حالة المرض في الحيوان وعوامل مثل العمر والخلفية الوراثية. يظهر الشكل 9 نتائج قياس التدفق الخلوي التمثيلية التي تم جمعها من مقياس تدفق Becton Dickenson LSRII ثلاثي الليزر باستخدام مبعثر أمامي من 450 و Side Scatter من 300 ، على الرغم من أننا نوصي بتحسين المعلمات لمقياس التدفق الخلوي المحدد الذي تنوي استخدامه قبل جمع العينات. ملاحظة: إذا كانت العينة تحتوي على كميات ضئيلة من تلوث الدم، فإن إجمالي الأحداث التي تم جمعها سيكون أعلى بكثير مما كان متوقعا وينبغي خصم العينة من التحليل.

6. تحليل PCR الكمي (qPCR) لأجهزة غسل الأنف

  1. ذوبان lysates الخلية من درجة حرارة الغرفة الخطوة 3.14.
  2. اتبع البروتوكول الموصى به المقدم مع استخراج الحمض النووي الريبي المفضل للاختيار.
  3. بعد الانتهاء من إجراء استخراج الحمض النووي الريبي وفقا للتعليمات، تحديد كمية الحمض النووي الريبي باستخدام مطياف أو طريقة المستندة إلى الكهربائي(الشكل 10). نحصل بشكل روتيني على ما بين 975 و 3250 نانوغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي لكل عينة بنسبة 260/280 نانومتر من 1.7 > أو رقم سلامة الحمض النووي الريبي (RIN) حول 8.1±0.13.
  4. نسخ cDNA باستخدام النسخ العكسي M-MULV وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة مع 1000 نانوغرام من الحمض النووي الريبي (الحد الأقصى 13 ميكرولتر).
  5. تمييع الناتجة عينات cDNA 8x، وaliquot بالتساوي في 4 أنابيب منفصلة للتخزين على المدى الطويل في -20 أو -80 درجة مئوية.
  6. لقياس التعبير الجيني بواسطة qPCR، قم بإعداد 25 تفاعلات عينات ميكرولتر في ثلاثية البلورات على كتلة جليدية أو باردة تحتوي على: 12.5 ميكرولتر من مزيج qPCR الرئيسي 2x من مجموعة qPCR التي تختارها، 0.25 ميكرولتر صبغة مرجعية، 2 ميكرولتر من cDNA المخفف (الخطوة 7.5)، 1 ميكرولتر من التمهيديات المختلطة إلى الأمام والعكس (400 nM النهائي)، 9.25 ميكروغرام من المياه الحرة RNAse-DNAse. هذا البروتوكول هو التكيف من الأساليب المنشورة سابقا16.
  7. بشكل عام نجد أن التضخيم qPCR خطوتين ( 95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة تليها ما يصل إلى 40 دورة × [95 درجة مئوية × 15 ثانية، 60 درجة مئوية × 1 دقيقة]) فعالة (الشكل 11a)؛ ومع ذلك، يجب تحسين كل زوج التمهيدي. يجب إجراء منحنيات التفكك (الذوبان) بعد التضخيم لضمان عدم حدوث تضخيم غير محدد. التضخيم (الشكل 11ب)
  8. نحن نقوم بشكل روتيني بتشغيل منحنيات قياسية لكل جين يتم تحليله بالإضافة إلى معايرة قياسية (مشتقة من تجانس الرئة أو الطحال) لكل لوحة من 96 بئرا تم تحليلها. يتم الحصول على مبالغ النسخ النسبية عن طريق تطبيع قيم عتبة الدورة الخام (Ct) أولا بواسطة الصبغة المرجعية وتحويل القيم الناتجة من خلال المنحنى القياسي المعني. ويتم بعد ذلك تطبيع هذه المبالغ النسبية إلى المعايرة القياسية وجين التدبير المنزلي، حسب الاقتضاء.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يمثل الشكل 1 نظرة عامة تخطيطية تلخص الخطوات الرئيسية للبروتوكول. وتوفر الأرقام 2-3 تصورا للمنهجية الميكروبيولوجية الملازمة للبروتوكولات الموصوفة هنا. يمثل الشكل 4 تحديد المواقع الصحيحة للفأر لإجراء استعمار داخل الرحم، في حين يصور الشكل 5 عادة التغيرات في وزن الفئران المستعمرة بسلالة الالتهاب الرئوي P1547. تمثل الأشكال 6-7 مراحل محددة من الجزء من المرحاض الأنفي من العملية ، من أجل التصور المساعد لهذين التقنيتين. وتتألف الأرقام 8-11 من نتائج تمثيلية للتحليلات التي أجريت على عينات جمعت من البلعوم الأنفي للفأر بعد غسل الأنف. على وجه التحديد ، الشكل 8 هو نتيجة تمثيلية للحمولة البكتيرية في البلعوم الأنفي ، كما هو محدد من خلال زراعة الحمم الأنفية التي تم الحصول عليها من الفئران المستعمرة إما بسلالة الالتهاب الرئوي S. P1121 أو P1547 أو P1542. يمثل الشكل 9 ظاهرة الخلايا للخلايا المناعية الأنفية البلعومية المعزولة باستخدام تقنيات قياس التدفق الخلوي. تعرض الأرقام 10-11 نتائج تمثيلية تتعلق بالتحليل التعبيري لرنا البلعوم الأنفي عبر PCR الكمي.

Figure 1
الشكل 1 - الأرقام 1- الأرقام 1 مخطط تدفق للتلقيح داخل الأنف وإجراءات عزل الخلايا اللافاج الأنفية باستخدام نموذج الماوس. أولا ، يتم إعداد البكتيريا للتلقيح ، ومن ثم تعطى لمواضيع مورين داخل الفم. بعد انقضاء المدة الزمنية المطلوبة ، يتم قتل الفئران عن طريق نزيف نهائي ، ويتم عزل خلاياها الأنفية عن طريق خطوتين من الحمم الأنفية: خطوة غسل PBS تليها غسل ثانوي في مخزن تحلل الحمض النووي الريبي. يتم عزل الخلايا من غسل PBS الأولي وتحليلها باستخدام تقنيات قياس التدفق الخلوي ، في حين يمكن استخدام الحمض النووي الريبي المعزول عن العينة الثانية للتحقيق في الوفرة النسبية للجزيئات ذات الأهمية على المستوى النسخي.

Figure 2
الشكل 2 - الأرقام 2- الأرقام التي تم لتحديد التركيز البكتيري ، يتم صفيحة قطرات 10 ميكرولتر في ثلاثة أطباق على طبق مقسم إلى أقسام تمثل تخفيفا تسلسليا مختلفا. ثم يسمح لهذه القطرات لتجف ويتم احتضان لوحات بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2.

Figure 3
الشكل 3 - الأرقام 3- الأرقام التي يمكن أن تركيز التهاب رئوي العقدية معزولة عن البلعوم الأنفي من تمثيلي. تمثل كل مستعمرة منفصلة وحدة تشكيل مستعمرة واحدة ، وتمثل كل مجموعة من المستعمرات قطرة واحدة 10 ميكرولتر (مطلية في ثلاثية) ويمثل كل ربع على اللوحة تخفيفا تسلسليا منفصلا. يتم تحديد التركيز البكتيري في CFU / مل عن طريق متوسط عدد المستعمرات القابلة للعد والمتشكلة بالكامل داخل الأرباع المؤهلة ، ثم بينها.

Figure 4
الشكل 4 - الأرقام 4- الأرقام التي تم ال يجب تقليل حركة أي فأر يتم تلقيحه ، خاصة في الرقبة ، للسماح بالتسليم السليم للبكتيريا inoculum. لتحقيق ذلك ، يتم تقييد الماوس الموضوع في جهاز تقييد معدل يتكون من أنبوب فالكون 50 مل مع فتحة في نهايته مدبب. ثم يتم وضع الماوس بحيث يخرج أنفه من الفتحة ، حيث يمكن الوصول إليه من قبل الباحث ، مما يسمح بإجراء التطعيم داخل الأنف.

Figure 5
الشكل 5 - الأرقام 5- الأرقام التي تم وزن الفئران المستعمرة مع سلالة P1547 من ما لا يقل عن 2 التجارب التمثيلية تتبع يوميا بعد التطعيم الأولي (ن = 6) لتصوير التغيرات النموذجية في الوزن المتوقع بعد الاستعمار البلعومي الأنفي. يظهر الوزن نسبة تغيير في الوزن الأولي. يرجى ملاحظة فقدان الوزن الأولي الحاد المتوقع بين الأيام 3-5 ، يليه الاستقرار والزيادة التدريجية في الوزن في الفئران الناجية.

Figure 6
الشكل 6 - الأرقام 6- الأرقام 10 عند التعرض القصبي، تتم إزالة العضلات الطولية المحيطة بعناية قبل شق القصبة الهوائية بطريقة لا تشد الأوعية الدموية المحيطة. ثم يتم إجراء شق صغير نصف سونار في منتصف الطريق حتى القصبة الهوائية باستخدام مقص جراحي دقيق. من المهم قطع قطر القصبة الهوائية جزئيا فقط ، مما يتركها سليمة بشكل خلفي.

Figure 7
الشكل 7 - الأرقام 7- الأرقام التي تم إدخال الإبرة المعلبة في فتحة القصبة الهوائية صعودا نحو الأنف. مرة واحدة كانولا في مكان، والتحقيق بلطف حتى يتم الوفاء المقاومة، ثم تدفق محتويات من خلال nares.

Figure 8
الشكل 8 - الأرقام 8- الأرقام التي تم سلسلة تمثيلية من الحمل البكتيري المعزول عن البلعوم الأنفي باستخدام إجراء المرحاض الأنفي الموصوف بعد استعمار فئران C57BL/6 (مثلثات) مع سلالة الالتهاب الرئوي S. P1547 (A) أو P1542 (B) أو P1121 (C). كما يتم عرض الاستعمار المقارن للفئران BALB / C (الدوائر) بعد الاستعمار P1121 في (C). وتظهر نقاط زمنية مختلفة طوال فترة الاستعمار، بما في ذلك الأيام 3 و7 و14 و21. بشكل عام، من المتوقع تحميل أولي مرتفع في اليوم 3، مع تضاؤل طفيف في اليوم 7. وعادة ما يبدأ التطهير بحلول اليوم الرابع عشر، مع إثبات التخليص الكامل أو شبه الكامل بحلول اليوم الحادي والعشرين بعد الاستعمار مع معظم السلالات. انقر هنا لعرض الرقم الأكبر.

Figure 9
الشكل 9 - الأرقام 10-199 الرسم البياني التمثيلي (A) ومؤامرة نقطة (B) من مجموع الخلايا المعزولة من حمم الأنف مورين كما تم تحليلها عن طريق قياس التدفق الخلوي. التعبير التفاضلي للعلامات على مجموعات الخلايا يسمح بتحديد مجموعات فرعية الكريات البيض من خلال استخدام الأجسام المضادة الفلورية الموجهة ضد هذه البروتينات. كما هو موضح هنا، يتم تحديد مجموعات الكريات البيض عن طريق النثر الأول على الخلايا المفردة باستخدام بوابة مبعثر أمامي (منطقة) مقابل مبعثر أمامي (عرض)(A)،ثم إثراء خلايا CD45+ داخل تلك المجموعة الفرعية(B). ويمكن تقسيم هذه الفئات السكانية إلى أنواع محددة من الخلايا عن طريق gating لCD11b وLy6G العدلات إيجابية مزدوجة (C). ويمكن إجراء تحليل CD11b - السكان للكشف عن F4/80 + ، CD11b - الضامة(د)أو CD11b - ، CD3 و CD4 المزدوجة الإيجابية CD4 الخلايا التائية (هاء). يمكن أن تكون مجموعات الخلايا النمط الظاهري طالما أنها تعبر عن واحد، أو مزيج من عدة مستقبلات سطح فريدة من نوعها التي يمكن استخدامها لتمييزها عن أنواع الخلايا الأخرى. انقر هنا لعرض الرقم الأكبر.

Figure 10
الشكل 10 - الأرقام 10- الأرقام التي تم 1 مخطط كهربية كهربائي تمثيلي بعد التسلسل التلقائي للكهرومورفوريسيس لعينة معزولة عن مراحيض الأنف المورينية. يظهر الرسم الكهربائي الناتج بيانات الكمية والتوقيع المميز لعينة الحمض النووي الريبي الإجمالي عالية الجودة المستمدة من منطقة البلعوم الأنفي. عند إجراء تحليلات لإجمالي الحمض النووي الريبي، يتم استخدام المناطق الواقعة تحت قمم الحمض النووي الريبي لاثنين من الحمض النووي الريبي الريبوسومي الرئيسي، 18S و 28S، لحساب النسبة المقابلة لها. وعادة ما تكون التغيرات الكبيرة في نسب القمم المنسوبة إلى 18S و 28S مؤشرا على تدهور الحمض النووي الريبي. ويمكن تلخيص درجة التدهور من خلال رقم سلامة الحمض النووي الريبي (RIN)؛ RIN لهذه العينة التمثيلية هو 8.1. ويظهر مثال على الحمض النووي الريبي المتدهور للغاية في (B) و (C)، و RIN اللاحق هو 1.9 و 4.6 على التوالي. انقر هنا لعرض الرقم الأكبر.

Figure 11
الشكل 11 - الأرقام 11- الأرقام التي تم 1 مؤامرة تضخيم (A) وتفكك (ذوبان) منحنى (B) من تحليل qPCR من lysates خلايا غسل الأنف، وتوفير مثال على كيفية هذه قراءات اثنين ينبغي أن ننظر عادة بعد تضخيم كفاءة والكشف بشكل صحيح من منتجات الحمض النووي الريبي معزولة عن البلعوم المرين. Represented هو منحنى قياسي لجين التدبير المنزلي 18S. النتائج المعروضة في (أ) إظهار المنتج PCR المطلوب بعد التضخيم باستخدام التمهيديات ضد GAPDH. يمثل الخط عتبة الدورة (Ct). وتسمح النقطة التي تعبر فيها قطع التضخيم المقابلة لعينات مختلفة هذه العتبة بالمقارنة عبر العينات، مع انخفاض القيم المقابلة لكميات أعلى من الحمض النووي الريبي من الفائدة الواردة فيه. تظهر المؤامرة في (B) أن درجة حرارة الذوبان القصوى لمنتج qPCR هي 85 درجة مئوية وأنه لا توجد منتجات ملوثة موجودة في رد الفعل هذا ، والتي ستظهر كذروة إضافية منفصلة عن ذروة المنتج المطلوب. انقر هنا لعرض الرقم الأكبر.

اسم السلالة النمط المصلي خبث وفيات الفئران مدة الاستعمار المتوقعة
P1121 23F بلا أعراض 0% 21-28 يوما
P1542 4 منخفض 0-20% 21-28 يوما
P1547 6A منتصف 20-50% 14-21 يوما
D39 2 عال 70-100% 14-21 يوما

الجدول 1 - الجداول نظرة عامة جدولية من 4 سلالات العزل السريري S. الالتهاب الرئوي المستخدمة عادة، وعددها النمط المصلي المقابلة، ودرجة المرتبطة الفوعة، ونسبة المتوقع من في الغازية داخل مجموعة فرعية مستعمرة من الفئران ومدة نموذجية من الاستعمار الأنفي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في هذه الدراسة قدمنا أساليب مفصلة للاستعمار داخل الجهاز الداخلي للفئران باستخدام سلالة عزل سريرية من الالتهاب الرئوي العقدي والعزلة اللاحقة وتوصيف الخلايا المناعية المجندة إلى البلعوم الأنفي استجابة للبكتيريا. لقد أظهرنا كيف يمكن زراعة inoculum البكتيرية في وسائل الإعلام الغنية بالمغذيات واستخدامها لإنشاء حدث استعماري في الفئران ، والذي يقتصر في البداية على البلعوم الأنفي. ثم أظهرنا كيف يمكن عزل أنواع الخلايا المناعية المستجيبة التي يتم تجنيدها لحنجرة الأنف بعد التعرض القصبي ، شق ومرحاض الأنف من خلال استخدام إبرة معلبة. يمكن جمع عينات المرحاض الأنفي في برنامج تلفزيوني لعزل الخلايا السليمة والملتصقة بخفة؛ يمكن عزل الحمض النووي الريبي من الخلايا الملتصقة بإحكام أكثر وطبقة المخاطية الظهارية المحيطة بها عن طريق تطبيق غسل ثانوي يتكون من مخزن تحلل الحمض النووي الريبي. ويمكن بعد ذلك استخدام العينات الأولى لصياغة الخلايا المحددة التي تم تجنيدها في سياق الاستعمار عن طريق تقنيات قياس التدفق الخلوي، في حين يمكن تطبيق هذه الأخيرة على تحليل Q-PCR، لتحديد الوظائف التأثيرية لهذه الخلايا المجندة من خلال النظر في التعبير النسخي لمنظمي المناعة المثيرين للاهتمام. يمكن بالإضافة إلى ذلك استخدام عينات الحمم الأنفية لتحديد حركية إزالة حدث استعماري بكتيري يقارن مجموعات تجريبية مختلفة لمعالجة أسئلة بحثية محددة.

استخدام هذه الطريقة من الاستعمار داخل الرحم يسمح لإنشاء حدث الاستعمار الذي يقتصر في البداية على البلعوم الأنفي للحيوان. وبالتالي فإن أي نشر لاحق للبكتيريا على الدم أو الأعضاء يحدث ثانويا للخروقات في الدفاعات المناعية المترجمة داخل الغشاء المخاطي الأنفي. يعكس التقدم التدريجي الذي تحقق من خلال هذا النموذج بشكل أكثر دقة عملية الغزو الرئوي في البشر ، مما يسمح للمرء بدراسة الديناميكيات بين البكتيريا المستعمرة والغشاء المخاطي للأنف المضيف - وربما فهم أفضل للتحولات في الإمراض البكتيري و / أو مناعة المضيف التي تسمح بتطوير انتشار المرض. هذا على النقيض من النماذج التي تتخلى عن إنشاء حدث استعماري أولي وتختار دراسة الأمراض الغازية في عزلة من خلال التسليم المباشر لل inoculum البكتيرية إلى الرئتين عن طريق غرس داخل التراشيل ، إلى الدم عن طريق حقن الأوعية الدموية أو إلى الصفاق عن طريق الحقن الصفاقي.

إجراء مرحاض الأنف PBS بعد حدث استعماري يسمح لعزل الخلايا غير أو أقل ما يقال المنتسبين تجنيدهم إلى البلعوم الأنفي، فضلا عن أي البكتيريا المرتبطة mucosally. ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى أن هذه التقنية محدودة لأنها لن تطلق الخلايا أو البكتيريا التي سافرت بين الظهارة أو تحتها ، ولن تسمح بحصاد الخلايا أو البكتيريا التي تم توطينها في الأنسجة اللمفاوية المرتبطة بالأنف (NALT) ، وهو عضو لمفاوي تم الإبلاغ عن أنه موقع محتمل للعدوى بعد استعمار المكورات الرئوية17،18. إذا كان من المرغوب إجراء مزيد من الدراسة من NALT, نوصي microdissection وإزالة هذا النسيج بالجملة للدراسة بعد المرحاض الأنفي PBS; وبما أن هاتين التقنيتين لا يستبعد أحدهما الآخر، فقد يتم إجراؤهما على نفس الحيوان. ومع ذلك ، نظرا للطبيعة اللتيتيكية والمدمرة لخطوة حصاد الحمض النووي الريبي (المرحاض الثانوي باستخدام مخزن تحلل الحمض النووي الريبي) ، يجب حذف هذه الخطوة إذا كانت تنوي حصاد NALT. على الرغم من أن المرحاض الأنفي هو إجراء أقل تحديا من الناحية الفنية ، بالنسبة للمجموعات التي ترغب في الحصول على تقييم أكثر شمولا للحمولة البكتيرية التي لا تشمل البكتيريا المرتبطة بالغشاء المخاطي فحسب ، ولكن أيضا تلك التي غزت الأنسجة الأنفية ، نقترح حصاد أنسجة البلعوم الأنفي بعد إزالة عظم الجمجمة العلوي للفئران المستعمرة وتشريح الأنسجة داخل سلسلة الأنف ، كما وصفها الآخرون19.

تعتمد طبيعة الاستجابة المناعية التي يتم الحصول عليها على التفاعل بين المضيف ومسببات الأمراض. وقد تم وصف أكثر من 90 من الأنماط المصلية للالتهاب الرئوي S. حتى الآن، وكلها مع مستويات مختلفة من الإمراض والتعبير عامل الفوعة، مما أدى إلى انتشار الفرق في السكانالبشرية 20-23. وبالمثل ، في الفئران ، أفيد أن مدى ، والحركية المرتبطة ، والاستجابة المناعية التي أثيرت ردا على الاستعمار البلعومي يعتمد على سلالة استعمار نفسها24. وبالتالي، فإن اختيار سلالة مناسبة لاستخدامها في إنشاء استعمار البلعوم الأنفي ليس مسألة تافهة، ولا اختيار الخلفية الوراثية للفأر. ويقدم الشكل 8 بيانات عينة تصور حركية إزالة الاستعمار الأنفي الأنفي من 3 سلالات مختلفة من الالتهاب الرئوي S. بعد الاستعمار داخل الجهاز التناسلي للفئران الإناث على خلفية C57BL/6. الجدول 1 يقدم لمحة عامة عن درجة الفوعة وطول فترة الاستعمار المتوقع (عند استخدامها على خلفية C57BL/6) مع 4 س. الالتهاب الرئوي سلالات العزل السريرية الموصوفة في الأدب والمعروف أن تكون قادرة على إنشاء استعمار البلعومالأنفي 25: أفيرولنت P1121 (النمط المصلي 23F)26,27 P1542 منخفضة الفوعة (النمط المصلي 4)28, وP1547 متوسطة الفوعة (النمط المصلي 6A)29-31, وتستخدم على نطاق واسع, تتميز جيدا ، D39 شديدة الضراوة (النمط المصلي 2)32-36. إذا كان الهدف التجريبي هو دراسة صارمة لحدث استعمار الأنف بدون أعراض مع عدم وجود نشر بكتيري مصاحب للأنسجة الأخرى ، فإننا نوصي باستخدام سلالة avirulent P1121 ، التي تتميز بأنها مستعمر قوي ، حيث أن أحداث الاستعمار الأطول (حتى 28 يوما قبل إزالة الألغام الملاحظة) هي السمة المميزة لهذه السلالة. عادة الفئران المستعمرة مع P1121 لن تتعرض لخطر الإصابة بأمراض الغازية ولن تظهر أي مؤشرات سريرية للمرض (باستثناء فقدان الوزن المؤقت). وينبغي استخدام ما تبقى من السلالات اعتمادا على الدرجة المطلوبة من الفوعة والوفيات المرتبطة بها، مع الفوعة التي اتخذت لتعني ليس درجة العدوى التي تتطور داخل فأرة فردية، ولكن بدلا من ذلك نسبة الفئران التي تظهر علامات سريرية للمرض. وتجدر الإشارة أيضا إلى أن درجة الفوعة ترتبط عادة عكسيا بطول مدة الاستعمار، مع استعمار سلالات أكثر ضراوة لفترة زمنية أقصر. جميع السلالات الخبيثة ال 3 الموصوفة تؤدي إلى وفيات في الفئران بسبب ، الأكثر شيوعا ، الإنتان ، مع الالتهاب الرئوي الرئوي ، أو الالتهاب الرئوي المتزامن والإنتان النامية في مجموعة فرعية من الفئران. الاختلافات في توطين البكتيريا الغازية قد تكون محددة سلالة، كما تم الإبلاغ سابقا أن بعض السلالات تظهر تروبيزم لأعضاء معينة37. في نسبة صغيرة من الحيوانات ، قد يتطور التهاب السحايا العفوي أيضا بعد الاستعمار. يمكن تحديد سبب الوفاة ، وكذلك درجة التوغل ، من خلال جمع الأنسجة المرتبطة (الرئتين والطحال و / أو الدماغ) من الحيوانات عند نقطة النهاية. تجانس هذه الأنسجة والطلاء اللاحق يمكن أن تشير إلى وجود البكتيريا الغازية والثدي المقابلة.

يظهر مثال على قياس كمي كثافة الثقافة البكتيرية في الشكل 3. إذا كانت الثقافة مركزة جدا ، تنمو المستعمرات بكثافة كبيرة بحيث لا يمكن عدها بشكل فردي ، ولكن يمكن تمييز المستعمرات المشتقة من خلايا واحدة إذا كانت سلسلة تخفيف من الحكمة الخشبية مطلية. الطلاء ثلاثة تكرارات تقنية لكل تخفيف يقلل من التباين. يرجى ملاحظة أنه عند قياس البكتيريا التي تم استردادها من حدث استعمار الأنف ، قد يواجه المرء ملوثات متعايشة ، تمثل أنواعا بكتيرية أخرى معزولة في الوقت نفسه عن البلعوم الأنفي. إذا كانت السلالة البكتيرية ذات الاهتمام لديها أي مقاومة معروفة للمضادات الحيوية (على سبيل المثال ، فإن العديد من سلالات الالتهاب الرئوي S. مقاومة للجنتاميسين أو النيوميسين حتى 5 ميكروغرام / مل) ، يمكن للمرء تقليل حدوث الملوثات عن طريق استكمال وسائل الإعلام النمو مع المضادات الحيوية بتركيز مناسب ، وبالتالي الحد من نمو الملوثات.

يمكن استخدام قياس التدفق الخلوي لتحليل علامات سطح الخلية على عينات المرحاض الأنفي. على سبيل المثال، لتحليل أنواع الخلايا التي يتم تجنيدها في سياق العدوى، يمكن استخدام مزيج من الأجسام المضادة المحددة للتمايز الإجمالي للخلايا البيضاء، بما في ذلك الضامة (F4/80+ +) ، العدلات (CD11b+ و Ly6G+) ، والخلايا التائية (CD3+ و CD4+ أو CD8+) ، كما تم نشرها سابقا. وعلاوة على ذلك، يمكن الجمع بين هذه التحليلات وتحليل التدفق الخلوي الذي أجري على أنسجة أو دم مختلفة، لفهم أفضل للاتجار بالخلايا المناعية أثناء العدوى. نظرا للعدد المقيد للخلايا (التي عادة ما تكون مرقمة بالآلاف المنخفضة) التي يمكن عزلها عن البلعوم الأنفي ، فإن تحديد المجموعات الفرعية النادرة عادة ما يكون صعبا ، على الرغم من أن الباحثين الذين يرغبون في تحقيق ذلك يجب أن يفكروا في تجميع عينات من فئران متعددة لتحقيق عدد الخلايا المطلوب. علاوة على ذلك، نظرا لأنه يمكن استخراج عدد محدود من الخلايا من هذه المنطقة، نوصي بتحليل هذه البيانات فيما يتعلق بإجمالي أعداد الخلايا.

على الرغم من أن مستويات التعبير عن البروتين عادة ما تكون منخفضة في البلعوم الأنفي مما يحد من إمكانية اختبار إنتاج البروتين ، فمن الممكن تحليل إنتاج الجزيئات المضيفة استجابة للبكتيريا المستعمرة على مستوى الحمض النووي الريبي. لتحقيق ذلك ، يمكن إجراء مراحيض الأنف باستخدام مخزن تحلل الحمض النووي الريبي بدلا من PBS ، والذي يسمح بتحليل التعبير الجيني. للكشف عن تضخيم qPCR ، من المهم تشغيل منحنى فصيلة مقابل(الشكل 11)لضمان اكتشاف المنتج الصحيح والمطلوب. ويرجع ذلك إلى حقيقة أن المقايسة سوف تكشف عن أي الحمض النووي المزدوج الذين تقطعت بهم السبل بما في ذلك التمهيدية، وتلوث الحمض النووي، ومنتج PCR من التمهيدي misannealed.

نأمل أن تشجعك الطرق الموصوفة هنا على تطبيق نموذج استعمار داخل الرحم لدراسة استجابات المضيف لمسببات الأمراض المهمة في سياق هذه المنطقة غير المدرسة. بالنسبة لبعض مسببات الأمراض البشرية ، مثل الالتهاب الرئوي S.، يعمل حدث استعماري البلعومي الأنفي السابق كمقدمة مهمة للنشر البكتيري الذي يترتب على ذلك والتتمة القاتلة التي قد تتبع ذلك ، بما في ذلك الانتشار في الرئتين ، مما قد يؤدي إلى الالتهاب الرئوي ، أو إلى الدم ، والبكتيريا الناتجة وصدمة الصرف الصحي. وهكذا ، من خلال دراسة الاستعمار البكتيري في هذه المنطقة ، قد نفهم بشكل أفضل كيفية السيطرة عليه ومنع حدوث أمراض أكثر خطورة تماما.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

Acknowledgments

الكتاب أود أن أشكر الدكتور جيفري ويزر من جامعة بنسلفانيا لهديته من سلالات السريرية من المكورات العقدية الالتهاب الرئوي. وتم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الكندية للبحوث الصحية. تم تمويل السيرة الذاتية من زمالة M. G. DeGroote وزمالة من الجمعية الكندية للصدر. وقد مولت هذا العمل رابطة أونتاريو للرئة والمعاهد الكندية للبحوث الصحية. ويدعم العمل في مختبر بوديش جزئيا من قبل مركز مايكل G. DeGroote لأبحاث الأمراض المعدية ومركز أبحاث المناعة ماكماستر.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-Mouse Ly6C FITC BD Pharmingen 553104
Anti-Mouse Ly6G PE BD Pharmingen
Anti-Mouse CD45.1 eFluor 450 eBioscience 48-0453-82
Anti-Mouse F4/80 Antigen APC eBioscience 17-4801-82
Anti-Mouse CD11c PerCP-Cy5.5 eBioscience 45-0114-82
Anti-Mouse CD11b PE-Cy7 eBioscience 25-0112-82
Anti-Mouse CD3 Alexa Fluor 700 eBioscience 56-0032-82
Anti-Mouse CD4 eFluor 605NC eBioscience 93-0041-42
Intramedic Polyethylene Tubing - PE20 Becton Dickinson 427406
BD 1 ml Syringe Becton Dickinson 309659
BD 26 G 3/8 Intradermal Bevel Becton Dickinson 305110
Buffer RLT Lysis Buffer Qiagen 79216
Difco Tryptic Soy Agar Becton Dickinson 236950
Defibrinated Sheep Blood PML Microbiologicals A0404
RNAqueous-Micro Kit Ambion AM1931
M-MuLV Reverse Transcriptase New England Biolabs M0253L
GoTaq qPCR Master Mix Promega A6001

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bogaert, D., de Groot, R., et al. Streptococcus pneumoniae colonisation: the key to pneumococcal disease. Lancet Infect. Dis. 4, 144-154 (2004).
  2. Kadioglu, A., Weiser, J. N., et al. The role of Streptococcus pneumoniae virulence factors in host respiratory colonization and disease. Nat. Rev. Microbiol. 6 (4), 288-301 (2008).
  3. McCool, T. L., Cate, T. R., et al. The immune response to pneumococcal proteins during experimental human carriage. J. Exp. Med. 195, 359-365 (2002).
  4. Nelson, A., Roche, A. M., et al. Capsule enhances pneumococcal colonisation by limiting mucus-mediated clearance. Infect. Immun. 75, 83-90 (2007).
  5. van Rossum, A., Lysenko, E., et al. Host and bacterial factors contributing to the clearance of colonisation by Streptococcus pneumoniae in a murine model. Infect. Immun. 73, 7718-7726 (2005).
  6. Barocchi, M. A., Ries, J., et al. A pneumococcal pilus influences virulence and host inflammatory responses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 2857-2862 (2006).
  7. Malley, R., Henneke, P., et al. Recognition of pneumolysin by Toll-like receptor 4 confers resistance to pneumococcal infection. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 1966-1971 (2003).
  8. McCool, T. L., Weiser, J. N. Limited role of antibody in clearance of Streptococcus pneumoniae in a murine model of colonization. Infect. Immun. 72, 5807-5813 (2004).
  9. Gingles, N. A., et al. Role of genetic resistance in invasive pneumococcal infection: identification and study of susceptibility and resistance in inbred mouse strains. Infect. Immun. 69 (1), 426-434 (2001).
  10. Jeong, D., Jeong, E., et al. Difference in resistance to Streptococcus pneumoniae infection in mice. Lab Anim. Res. 27, 91-98 (2011).
  11. Wu, H. Y., Virolainen, A., et al. Establishment of a Streptococcus pneumoniae nasopharyngeal colonization model in adult mice. Microb. Pathog. 23, 127-137 (1997).
  12. Southam, D. S., Dolovich, M., et al. Distribution of intranasal instillations in mice: effects of volume, time, body position. Lung Physiol. 282, 833-839 (2002).
  13. Miller, M. A., Stabenow, J. M., et al. Visualization of Murine Intranasal Dosing Efficiency Using Luminescent Francisella tularensis: Effect of Instillation Volume and Form of Anesthesia. PLoS ONE. 7 (2), (2012).
  14. Briles, D. E., Novak, L. Nasal Colonization with Streptococcus pneumoniae includes subpopulations of surface and invasive pneumococci. Infect. Immun. 73 (10), 6945-6951 (2005).
  15. Wu, H. -Y., Virolainen, A., et al. Establishment of a Streptococcus pneumoniae nasopharyngeal colonization model in adult mice. Microb. Pathog. 23, 127-137 (1997).
  16. Mo, Y., Wan, R., et al. Application of reverse transcription-PCR and real-time PCR in nanotoxicity research. Methods Mol. Biol. 926, 99-112 (2012).
  17. Kuper, C. F., Koornstra, P. J., et al. The role of nasopharyngeal lymphoid tissue. Trends Immunol. 13, 219-224 (1992).
  18. Zhang, Q., Leong, S. C., et al. Characterisation of regulatory T cells in nasal associated lymphoid tissue in children: relationships with pneumococcal colonization. PLoS Pathog. 7, (2011).
  19. Briles, D. E., Novak, L., et al. Nasal colonization with Streptococcus pneumoniae includes subpopulations of surface and invasive pneumococci. Infect. Immun. 73, 6945-6951 (2005).
  20. Weinberger, D. M., Trzcinski, K., et al. Pneumococcal capsular polysaccharide structure predicts serotype prevalence. PLoS Pathog. 5, (2009).
  21. Bryant, W. P., J,, et al. Which Pneumococcal Serogroups Cause the Most Invasive Disease: Implications for Conjugate Vaccine Formulation and Use, Part I. Clin. Infect. Dis. 30, 100-121 (2000).
  22. Hausdorff, W. P., Feikin, D. R., et al. Epidemiological differences among pneumococcal serotypes. Lancet Infect. Dis. 5, 83-93 (2005).
  23. Brueggemann, A., Griffiths, D., et al. Clonal Relationships between Invasive and Carriage Streptococcus pneumoniae and Serotype and Clone Specific Differences in Invasive Disease Potential. J. Infect. Dis. 187, 1424-1432 (2003).
  24. Mohler, J., Azoulay-Dupis, E., et al. Streptococcus pneumoniae strain-dependent lung inflammatory responses in a murine model of pneumococcal pneumonia. Intensive Care Med. 29, 808-816 (2003).
  25. Wu, H. Y., Virolainen, A., Mathews, B., King, J., Russell, M. W., et al. Establishment of a Streptococcus pneumoniae nasopharyngeal colonization model in adult mice. Microb. Pathog. 23, 127-137 (1997).
  26. Zhang, Z., Clarke, T. B., et al. Cellular effectors mediating Th17-dependent clearance of pneumococcal colonization in mice. J. Clin. Invest. 119, 1899-1909 (2009).
  27. Parker, D., Martin, F. J., et al. Streptococcus pneumoniae DNA initiates type I interferon signaling in the respiratory tract. MBio. 2, (2011).
  28. Haya, D. L., Camilli, A. Large-scale identification of serotype 4 Streptococcus pneumoniae virulence factors. Mol. Microbiol. 45, 1389-1406 (2002).
  29. Nakamura, S., Favis, K. M., et al. Synergistic stimulation of type I interferons during influenza virus coinfection promotes Streptococcus pneumoniae colonization in mice. J. Clin. Invest. 121, 3657-3665 (2011).
  30. Kim, J. O., Weiser, J. N. Association of intrastrain phase variation in quantity of capsular polysaccharide and teichoic acid with the virulence of Streptococcus pneumoniae. J. Infect. Dis. 177, 368-377 (1998).
  31. Roche, A. M., King, S. J., et al. Live attenuated Streptococcus pneumoniae strains induce serotype-independent mucosal and systemic protection in mice. Infect. Immun. 75, 2469-2475 (2007).
  32. Cohen, J. M., Khandavalli, S., Camberlein, E., Hyams, C., Baxendale, H. E., Brown, J. S. Protective contributions against invasive Streptococcus pneumoniae pneumonia of antibody and Th17-Cell responses to nasopharyngeal colonisation. PLoS One. 6 (10), (2011).
  33. Cohen, J. M., Khandavalli, S., Camberlein, E., Hyams, C., Baxendale, H. E., Brown, J. S. Protective contributions against invasive Streptococcus pneumoniae pneumonia of antibody and Th17-Cell responses to nasopharyngeal colonisation. PLoS One. 6 (10), (2011).
  34. Richards, L., Ferreira, D. M., Miyaji, E. N., Andrew, P. W., Kadioglu, A. The immunising effect of pneumococcal nasopharyngeal colonisation; protection against future colonisation and fatal invasive disease. Immunobiology. , 215-251 (2010).
  35. Lanie, J. A., Ng, W. L., et al. Genome sequence of Avery's virulent serotype 2 strain D39 of Streptococcus pneumoniae and comparison with that of unencapsulated laboratory strain R6. J. Bacteriol. 189, 38-51 (2007).
  36. Robertson, G. T., Ng, W. L., Foley, J., Gilmour, R., Winkler, M. E. Global transcriptional analysis of clpP mutations of type 2 Streptococcus pneumoniae and their effects on physiology and. 184, 3508-3520 (2002).
  37. Orihuela, C. J., Gao, G., et al. Tissue-specific contributions of pneumococcal virulence factors to pathogenesis. J. Infect. Dis. 190, 1661-1669 (2004).
  38. Orihuela, C. J., Gao, G., et al. Organ-specific models of Streptococcus pneumoniae disease. Scand. J. Infect. D. 35, 647-652 (2003).
  39. Swirski, F. K., Nahrendorf, M., et al. Identification of splenic reservoir monocytes and their deployment to inflammatory sites. Science. 325, 612-616 (2009).

Tags

علم المناعة، العدد 83، المكورات العقدية الالتهاب الرئوي،لافاج الأنف، البلعوم الأنفي، مورين، قياس التدفق الخلوي، الحمض النووي الريبي، PCR الكمي، الضامة المجندة، العدلات، الخلايا التائية، الخلايا التأثيرية، الاستعمار داخل الأنف
توصيف الاستجابات الالتهابية خلال الاستعمار داخل الشرج مع <em>الالتهاب الرئوي العقدي</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Puchta, A., Verschoor, C. P., Thurn, … More

Puchta, A., Verschoor, C. P., Thurn, T., Bowdish, D. M. E. Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae. J. Vis. Exp. (83), e50490, doi:10.3791/50490 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter