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Immunology and Infection

Caratterizzazione delle risposte infiammatorie durante la colonizzazione intranasale con streptococco pneumoniae

Published: January 17, 2014 doi: 10.3791/50490
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Pathology and Molecule Medicine, McMaster University

Summary

Viene descritta la colonizzazione del nasofaringe murino con streptococco pneumoniae e la successiva estrazione di cellule aderenti o reclutate. Questa tecnica prevede il lavaggio del nasofaringe e la raccolta del fluido attraverso i nares ed è adattabile per varie letture, tra cui la quantificazione differenziale delle cellule e l'analisi dell'espressione dell'mRNA in situ.

Abstract

La colonizzazione nasofaringea da parte di Streptococcus pneumoniae è un prerequisito per l'invasione ai polmoni o al flusso sanguigno1. Questo organismo è in grado di colonizzare la superficie mucosa del rinofaringe, dove può risiedere, moltiplicarsi e infine superare le difese ospiti per invadere altri tessuti dell'ospite. L'accertamento di un'infezione nelle vie respiratorie normalmente inferiori provoca polmonite. In alternativa, i batteri possono diffondersi nel flusso sanguigno causando la batteriemia, che è associata ad alti tassi dimortalità 2, oppure portare direttamente allo sviluppo della meningite pneumococcica. Comprendere la cinetica e le risposte immunitarie alla colonizzazione nasofaringea è un aspetto importante dei modelli di infezione da S. pneumoniae.

Il nostro modello di topo di colonizzazione intranasale è adattato daimodelli umani 3 ed è stato utilizzato da più gruppi di ricerca nello studio delle risposte ospite-patogeno nel nasofaringe4-7. Nella prima parte del modello, usiamo un isolato clinico di S. pneumoniae per stabilire una colonizzazione batterica autolimitante che è simile agli eventi di trasporto negli adulti umani. La procedura qui dettagliata prevede la preparazione di un inoculo batterico, seguito dall'istituzione di un evento di colonizzazione attraverso la consegna dell'inoculo attraverso una via intranasale di somministrazione. I macrofagi residenti sono il tipo di cellula predominante nel nasofaringe durante lo stato stazionario. In genere, ci sono pochi linfociti presenti nei topi non infetti8, tuttavia la colonizzazione della mucosa porterà a infiammazioni di basso-alto grado (a seconda della virulenza delle specie batteriche e del ceppo) che si tradurrà in una risposta immunitaria e nel successivo reclutamento delle cellule immunitarie ospiti. Queste cellule possono essere isolate da un gabinetto del contenuto tracheale attraverso i narici e correlate alla densità dei batteri della colonizzazione per comprendere meglio la cinetica dell'infezione.

Protocol

Prima di iniziare: tutti i passaggi vengono eseguiti in un armadietto di sicurezza biologica (BSC) biohazard level 2 (BSL2) se non diversamente indicato. Assicurarsi di aver ottenuto l'approvazione a rischio biologico appropriata per l'uso di agenti patogeni batterici infettivi secondo le linee guida istituzionali prima dell'inizio degli esperimenti. Inoltre, assicurati di avere tutti i materiali e i reagenti necessari per condurre la procedura preparata in anticipo. I topi utilizzati in questi esperimenti hanno incluso topi C57BL/6 femminili dei Jackson Laboratories, Charles River o Taconic e avevano 10-14 settimane di età (anche se non abbiamo trovato differenze significative di genere nella cinetica della clearance o dell'infezione della colonizzazione nasale). Tutti i topi utilizzati in questi esperimenti sono stati allevati e mantenuti in condizioni specifiche esenti da agenti patogeni, ed erano esenti da virus comuni (LCMV, MNV, MPV, reovirus ECTV e altri) batteri(ad esempio H. pylori) e parassiti(ad esempio pinworm, ectoparassiti) mediante test del campione fecale e frequente valutazione anatomica dei topi sentinella cohousedall'interno delle loro stanze della struttura. Quando si conducono questi esperimenti, si consiglia di utilizzare topi di controllo non di età inferiore a 10-12 settimane e non più vecchi di 6 mesi di età. I topi più giovani o più anziani di questa fascia di età sono più suscettibili a una maggiore durata del trasporto nasofaringeo e a una maggiore probabilità di diffusione dell'infezione. Lo sfondo del topo è un'altra considerazione importante che può influire sui risultati di un esperimento di colonizzazione, poiché diversi gruppi hanno dimostrato che topi di diversa origine genetica hanno diverse suscettibilità al ceppo S. pneumoniae D39 (sierotipo 2)9,10. S. pneumoniae non è un agente patogeno murino presente in natura e il suo unico serbatoio naturale è il nasofaringe umano. La trasmissione avviene tramite goccioline respiratorie e, poiché i topi non producono secrezioni respiratorie, i singoli topi non possono trasmettere il batterio ad altri topi, quindi non c'è preoccupazione per la trasmissione da topo a topo11. Per una panoramica visiva delle procedure descritte all'interno di questo manoscritto, fare riferimento alla figura 1.

1. Preparazione della cultura di S. pneumoniae

  1. Inoculare 5 ml di agar di soia triptica per la crescita sospensione di Streptococcus pneumoniae.
  2. Coltura in condizioni statiche a 37 °C nel 5% di CO2 fino a quando l'inoculo batterico raggiunge la crescita della fase logaro con una corrispondente densità liquida di10 8 CFU/ml determinata da un contachilometri impostato su 600 nm. La lettura esatta corrispondente a questa CFU differirà a seconda dello specifico ceppo batterico selezionato; per la maggior parte dei ceppi di S. pneumoniae questo corrisponde ad un intervallo OD600 di 0,45-0,55. Tipicamente, i ceppi di S. pneumoniae in coltura liquida cresceranno a questa densità entro 1,5-2,5 ore nelle condizioni raccomandate, senza bisogno di subcultura. Non si deve permettere che la coltura sbocci troppo (oltre una lettura OD di 0,75) in quanto rappresenta il punto in cui i batteri non sono più in fase di crescita di log e stanno subendo un'ampia autolisi.
  3. Ogni topo sarà inoculato con circa 107 batteri. Pertanto, per ogni 9 topi da colonizzare, pipettare 1 ml di inoculo in un tubo di Eppendorf e girare a 15.000 x g per 1 min. Un pellet biancastro dovrebbe essere visibile. Rimuovere il supernatante, facendo attenzione a non disturbare il pellet e rimescolare i batteri in 100 μl di soluzione salina tamponata dal fosfato (PBS), aumentando così la concentrazione a 109 CFU/ml. In questa fase, i batteri dovrebbero rimanere vitali, ma non si replicheranno prontamente.
  4. Se si utilizzano aliquote multiple, combinare in un unico tubo per controllare lievi variazioni intercampitiche nella densità batterica.
  5. Mantenere i batteri sul ghiaccio fino a quando non sono pronti per l'inoculazione, per un massimo di 1 ora.
  6. Per ottenere una conteggia batterica esatta, eseguire serie di diluizione seriale log-wise a partire dall'inoculo batterico pulito. Diluire serialmente 10 volte, aggiungendo 10 μl da a 90 μl di PBS sterile.
  7. Placcare 3 gocce di campioni da 10 μl di diluizioni 10-5 - 10-9, più un controllo della contaminazione solo PBS, su sezioni etichettate separatamente di piastra di agar di soia triptica (TSA) integrata con il 5% di sangue di pecora(Figura 2). Assicurarsi che le punte delle pipette vengano modificate per ogni passaggio diluindo da una maggiore concentrazione di CFU a una concentrazione di CFU inferiore per evitare di trasportare i batteri in eccesso e aumentare la variabilità dei risultati. Le piastre di agar del sangue umano (HBA) possono anche essere utilizzate al posto della TSA. Poiché molti ceppi di S. pneumoniae sono resistenti alla neomicina (da 5-20 μg/ml), questo antibiotico può anche essere aggiunto al mezzo di agar di scelta durante la fase di preparazione della piastra. Ciò facilita l'enumerazione in quanto elimina i batteri non resistenti. La suscettibilità antibiotica di ciascun ceppo deve essere testata in anticipo per determinare la concentrazione ottimale di antibiotico da utilizzare per ogni ceppo batterico.
  8. Lasciare asciugare per 15-30 minuti scoperti, quindi coprire le piastre e posizionarlo capovolto in un incubatore batterico impostato su 37 °C e 5% CO2. Cresci colonie batteriche sul piatto per 24 ore.
  9. Determinare il numero di unità di formazione della colonia e la loro concentrazione corrispondente. Sulla base delle determinazioni del valore OD600, la concentrazione dovrebbe essere nell'intervallo di 1-4 x10 9 colonie di CFU/ml.

2. Colonizzazione intranasale murina

  1. Trattenere i topi posizionandoli in un apparato di contenimento del topo (un tubo Falcon da 50 ml modificato con la punta tagliata per creare un'apertura) fissandoli dalla base del loro corpo con il pollice in modo che il loro naso emerga appena fuori dall'estremità affusolata dell'apparato di contenimento(figura 4). L'uso di questo apparecchio consente l'immobilizzazione della testa del topo e la segregazione dei suoi nares in modo da ridurre al minimo il movimento e impedire i tentativi dell'animale di masticare la punta della pipetta, consentendo la consegna completa dell'inoculo. In alternativa, i topi possono essere immobilizzati tramite graffi al collo e ritenuta manuale. Non consigliamo l'anestesia degli animali prima dell'inoculazione intranasale. L'amministrazione dell'inoculo agli animali in anestesia provoca la diffusione di parte dell'inoculo ai polmoni12,13.
  2. Utilizzando una pipetta P10 o P20, inoculare ogni topo depositando 10 μl della coltura preparata, distribuendolo uniformemente tra entrambi i nares (lasciare che l'inoculo goccioli nel naso pulendo gradualmente l'inoculazione, prendendo tempo perché i topi inalino l'inoculo). Per ottenere la consegna completa dell'inoculo, sospendere la somministrazione in qualsiasi momento il mouse inizia a muovere eccessivamente il naso. L'intero inoculo non può essere iniettato nei nares in quanto i topi possono espellere alcuni attraverso il naso durante l'espirazione; tuttavia, poiché la quantità espulsa tende ad essere minuscola e l'inoculo contiene una quantità estremamente elevata di batteri, ciò non influisce significativamente sulla carica batterica colonizzante. Inoltre, la superficie disponibile per la colonizzazione nella mucosa nasofaringea è limitata e di conseguenza noi e altri abbiamo scoperto che la dose raccomandata di 107 è sufficiente per ottenere livelli coerenti di batteri in tutti i topi, con conseguente variabilità minima nelle quantità iniziali di battericolonizzanti 14,15 .
  3. Pesare i topi se si utilizzano indicatori di peso come parte del monitoraggio del punto finale. Monitora i topi ogni 12-24 ore alla ricerca di sintomi clinici, tra cui letargia, pelliccia arruffata e perdita di peso. I topi in genere non mostreranno sintomi di malattia fino a 3-5 giorni dopo la colonizzazione, e questi saranno preceduti da perdita di peso che può in media circa il 5% del peso corporeo totale al giorno. Man mano che i topi si ammalano sempre di più, assumeranno posture curvo e mostreranno una diminuzione dell'attività e una diminuzione della reattività alla stimolazione, compresa la manipolazione. In questa fase, la malattia è tipicamente indicativa di sepsi e /o polmonite e sarà probabilmente terminale, anche se i topi possono essere trattati con 1 ml di soluzione salina sottocutanea al giorno per migliorare gli esiti. I topi sopravvissuti dovrebbero iniziare a mostrare un miglioramento dopo il giorno 7 dopo la colonizzazione, come evidenziato dalla stabilizzazione del peso seguita dall'aumento di peso, anche se diversi ceppi di S. pneumoniae possono indurre la malattia più rapidamente e provocare la progressione dei sintomi clinici lungo una diversa linea temporale. Si prega di vedere la figura 5 per un risultato rappresentativo del peso cicorato nei topi colonizzati con il ceppo P1547.

3. Raccolta di campioni di lavanda nasale

Prima dell'inizio: preparare aghi cannulati con siringhe da 1 ml conciate con aghi smussati da 26 3/8 G. Tagliare pezzi da 2,5 cm di tubi in polietilene PE20 con diametro interno 0,38 mm, assicurando che ogni estremità abbia una punta smussata. Utilizzando le pinta, far scorrere un pezzo lungo 2,5 cm di tubi in polietilene PE20 (diametro interno 0,38 mm) sulla punta dell'ago, evitando di forare il lato del tubo. Gli aghi cannulati possono essere conservati in etanolo al 70% fino a quando necessario.

  1. Eutanasia dei topi sperimentali. Poiché la lussazione cervicale può potenzialmente danneggiare la trachea, questo metodo di eutanasia deve essere evitato. Il nostro metodo preferito è l'anestesia isoflurana seguita dalla dissanguamento, tuttavia, assicurano di seguire le linee guida istituzionali quando si seleziona la modalità di eutanasia.
  2. Utilizzando il 70% di etanolo acquoso, sterilizzare la pelliccia superoanterior dell'animale, in particolare il collo, facendo attenzione a impedire all'etanolo di accedere ai nares.
  3. Fai un singolo taglio longitudinale lungo la linea mediana del collo dell'animale e due tagli orizzontali su entrambe le estremità, creando un'apertura per immaginare la trachea.
  4. Sbucciare con cura la pelle su entrambi i lati, rivelando il tessuto del collo sottostante.
  5. La trachea dovrebbe essere visibile, circondata da muscoli longitudinali su entrambi i lati. Snip attentamente questi per fornire una visione chiara della trachea stessa, facendo attenzione a non severare la vascucolatura circostante.
  6. Se la vascucolatura è stata tagliata e il sangue è presente, prima di procedere, lasciare che il sanguinamento si fermi, quindi pulire l'area più volte erogando PBS sterile e usando garza sterile per assorbire delicatamente l'umidità in eccesso nella zona.
  7. Una volta che la trachea è correttamente esposta, fare un taglio trasversale semilunare nella trachea circa a metà strada verso l'alto (Figura 6).
  8. Redigere 1.000 μl di PBS sterilizzato in ago cannulato precedentemente preparato.
  9. Inserire la cannula nella trachea verso il naso, mantenendo il bordo smussato rivolto verso il basso per facilitarne l'inserimento (Figura 7). Una volta che l'ago è in posizione, ruotarlo di 180 °, e sondare delicatamente verso l'alto fino a quando non si sente resistenza alla luce.
  10. Posizionare Eppendorf designato per la raccolta dei campioni appena sotto il naso del topo.
  11. Testare il corretto posizionamento dell'ago erogando una quantità minima (~20 μl) di liquido di lavaggio PBS - la goccia di fluido dovrebbe formarsi intorno ai nares del topo; in tal caso, procedere al passaggio 3.13).
  12. Se il PBS di prova emerge direttamente dalla bocca dell'animale, tirare indietro la cannula e riposizionarla di nuovo delicatamente sondando in avanti fino a quando non si sente una resistenza molto leggera - fare attenzione a non spingere la cannula troppo oltre questa resistenza, poiché la sposterai oltre il palato nasale e fino alla cavità orale.
  13. Erogare rapidamente il contenuto dell'ago per aiutare a spostare e raccogliere la massima quantità di cellule - il contenuto dovrebbe fluire attraverso i nares del mouse e nel tubo di raccolta. Posizionare immediatamente il campione sul ghiaccio.
  14. Per raccogliere campioni per l'analisi dell'RNA, ripetere i passaggi 3.8-3.13) utilizzando un ago cannulato contenente 500 μl di tampone di lisi dell'RNA sullo stesso mouse. Ciò consentirà la raccolta del campione di lisato dalle restanti popolazioni cellulari, in gran parte composto dall'epitelio mucoso nasofaringeo, poiché le cellule non aerenti avrebbero dovuto essere rimosse dopo il gabinetto iniziale del PBS. Si prega di notare che il tampone di lisi dell'RNA denuda l'epitelio e distrugge il tessuto circostante, quindi è necessario fare attenzione a evitare il contatto con organi come i polmoni, se si desidera la ritenzione di questi tessuti. Una volta raccolto, posizionare il campione nel tampone di lisi dell'RNA direttamente sul ghiaccio secco per congelare lo snap. Una volta nel buffer di lysis, i campioni possono essere conservati secondo le istruzioni del produttore e sono stabili in genere a -70 °C per diversi mesi.

4. Determinazione della carica batterica nel nasofaringe

  1. Quantitare i batteri preparando una serie di diluizione seriale per ogni campione di lavanda nasale murina. In generale, ci si può aspettare che la carica batterica sia compresa tra 0 e10 4 CFU, quindi condurre tre diluizioni seriali 10 volte. Aggiungere 10 μl del campione di lavanda nasale pulito (100 CFU/ml) al primo tubo ad una concentrazione di10-1 CFU/ml.
  2. Dividere la piastra batteriologica in quadranti e etichettare i quadranti ciascuno con un membro della serie di diluizione (100-10-3 CFU/ml). Estraere 3 gocce di campioni da 10 μl delle 3 diluizioni e il campione pulito su piastre di agar di soia triptiche integrate con il 5% di sangue di pecora, come nella figura 2.
  3. Lasciare asciugare per 15-30 minuti scoperti, quindi coprire le piastre e posizionarsi capovolto in un incubatore batterico con condizioni ottimali per la crescita batterica (in genere 37 °C e 5% CO2).
  4. Cresci colonie batteriche sul piatto per 18-24 ore.
  5. Determinare il numero di batteri colonizzati calcolando la media delle colonie formate su una piastra per ogni diluizione (Figura 3). La figura 8 mostra la densità batterica durante diversi punti di tempo, come determinato dalla coltura di lavaggi nasali, nei topi colonizzati con 3 diversi ceppi di S. pneumoniae per un massimo di 21 giorni.

5. Preparazione di campioni per citometria a flusso

Prima di iniziare: Preparare il mix di anticorpi. Per la quantificazione delle popolazioni di leucociti, si consiglia la seguente miscela alle diluizioni specificate: PE-Ly6G (clone 1A8, 1 μg/ml), FITC-Ly6C (clone AL-21,1 μg/ml), eFluor 450-CD45 (clone 30-F11, 2,67 μg/ml), APC-F4/80 (clone PM8 RUO, 0,67 μg/ml), PerCP-Cy5.5-CD11c (clone N418 RUO, 0,5 μg/ml), PE-Cy7-CD11b (clone M1/70, 0,33 μg/ml), Alexa Fluor 700-CD3 (clone 1782, 4 μg/ml), eFluor 605NC-CD4 (clone GK1.5, 6.67 μg/ml). Si prega di notare che questo mix è 2x concentrazione (vedere passo 5.5). Tutti gli anticorpi devono essere diluiti nelle FAC Tampone di lavaggio (siero fetale al vitello 0,5%, EDTA 2mM, 0,1% azide di sodio in PBS) che deve anche essere preparato in anticipo. In una miscela di anticorpi di controllo abbinati all'isotipo, idealmente dello stesso fornitore degli anticorpi etichettati e alle stesse concentrazioni degli anticorpi specifici, deve essere preparato. I campioni trattati con gli anticorpi di controllo dell'isotipo funzioneranno come controllo negativo. Qualsiasi fluorescenza osservata nei campioni trattati con gli anticorpi di controllo dell'isotipo deve essere considerata di sfondo.

  1. Prechill una centrifuga in grado di girare tubi Eppendorf da 1,5 ml a 4 °C.
  2. Centrifugare campioni di lavanda nasale a 2.000 x g per 10 min a 4 °C. Pipettare con cura il supernatante e prenotare. Nota: a causa della piccola quantità di cellule all'interno del rinofaringe, il pellet cellulare non sarà visibile a meno che non vi sia una contaminazione indesiderata dei globuli rossi, che si colorerà di rosso vivo. Se viene visto, il campione deve essere scartato.
  3. Campione di resuspend in 50 μl di Fc? Anticorpo RIIb/CD16-2 (2.4G2) (che lega i recettori Fc e riduce il legame anticorpale non specifico) nelle FAC Wash Buffer ad una concentrazione di 4 μg/ml.
  4. Incubare il campione sul ghiaccio per 30 minuti.
  5. Aggiungere 50 μl di miscela di anticorpi fluorescenti concentrati 2x prepreparata al campione. Accantonare un campione rappresentativo di ciascun gruppo sperimentale per fungere da controllo isotipo. Aggiungere la miscela di anticorpi isotipo a questo campione al posto della miscela di macchie.
  6. Incubare il campione sul ghiaccio per 1 ora.
  7. Campioni di centrifuga a 2.000 x g per 10 min a 4 °C. Scartare il supernatante e il resuspend in 200 μl di PBS.
  8. Ripetere il passaggio 5.7.
  9. Dopo il secondo lavaggio, centrifugare nuovamente i campioni a 2.000 x g per 10 minuti a 4 °C.
  10. Resuspend in PBS (se si esegue immediatamente il campione) o 2% paraformaldeide (se si eseguono campioni 1-3 giorni dopo la colorazione).
  11. Quando si conduce la citometria del flusso, raccogliere la quantità massima di eventi per campione o fino a quando l'intero campione non è stato aspirato. Nei topi giovani non infetti, sani, questo sarà solo 1.000-2.000 eventi totali; Durante un evento di colonizzazione batterica, questo numero può aumentare di oltre 2-5 volte a seconda dello stato della malattia negli animali e di fattori come l'età e il background genetico. La figura 9 mostra i risultati rappresentativi della citometria del flusso raccolti da un citometro a flusso Becton Dickenson LSRII a 3 laser utilizzando uno scatter in avanti di 450 e uno scatter laterale di 300, anche se si consiglia di ottimizzare i parametri per il citometro di flusso specifico che si intende utilizzare prima della raccolta del campione. Nota: se un campione contiene anche tracce di contaminazione del sangue, gli eventi totali raccolti saranno significativamente più alti del previsto e il campione deve essere scontato dall'analisi.

6. Analisi quantitativa PCR (qPCR) dei lavaggi nasali

  1. Scongelare i lire delle cellule dal passo 3.14 temperatura ambiente.
  2. Seguire il protocollo consigliato fornito con l'estrazione dell'RNA preferita di scelta.
  3. Dopo aver completato la procedura di estrazione dell'RNA come indicato, quantificare la quantità di RNA utilizzando un metodo basato sullo spettrofotometro o sull'elettroforesi (Figura 10). Otteniamo regolarmente tra 975 e 3.250 ng di RNA totale per campione con un rapporto di 260/280 nm di >1,7 o un numero di integrità dell'RNA (RIN) intorno, 8,1±0,13.
  4. Trascrivere cDNA utilizzando la transcriptasi inversa M-MULV secondo il protocollo del produttore con 1.000 ng di RNA (massimo 13 μl).
  5. Diluire i campioni di cDNA risultanti 8x e aliquota equamente in 4 tubi separati per lo stoccaggio a lungo termine a -20 o -80 °C.
  6. Per misurare l'espressione genica mediante qPCR, preparare reazioni di campioni da 25 μl in triplice copia su ghiaccio o blocco freddo contenenti: 12,5 μl di mix master qPCR 2x dal kit qPCR di vostra scelta, 0,25 μl di colorante di riferimento, 2 μl di cDNA diluito (fase 7.5), 1 μl di primer misti avanti e indietro (400 nM finali), 9,25 μl di acqua libera RNAse-DNAse. Questo protocollo è un adattamento dei metodi precedentemente pubblicati16.
  7. In generale troviamo che un'amplificazione qPCR in due fasi (95 °C per 10 minuti seguita da un massimo di 40 cicli x [95 °C x 15 sec, 60 °C x 1 min]) è efficace(Figura 11a); tuttavia, ogni coppia di primer deve essere ottimizzata. Le curve di dissociazione (fusione) devono essere eseguite dopo l'amplificazione per garantire che non si sia verificata alcuna amplificazione aspecifica. amplificazione(figura 11b)
  8. Eseguiamo regolarmente curve standard per ogni gene analizzato e un calibratore standard (derivato da omogeneato polmonare o milza) per ogni piastra da 96 pozza analizzata. Gli importi relativi di trascrizione sono ottenuti normalizzando prima i valori della soglia del ciclo grezzo (Ct) dal colorante di riferimento e trasformando i valori risultanti attraverso la rispettiva curva standard. Queste quantità relative vengono successivamente normalizzate al calibratore standard e a un gene di pulizia, a quanto applicabile.

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Representative Results

La figura 1 rappresenta uno schema di panoramica che riassume i passaggi principali del protocollo. Le figure 2-3 forniscono la visualizzazione della metodologia microbiologica inerente ai protocolli descritti nel presente documento. La figura 4 rappresenta il corretto posizionamento di un topo per eseguire una colonizzazione intranasale, mentre la figura 5 descrive tipicamente i cambiamenti di peso dei topi colonizzati con ceppo S. pneumoniae P1547. Le figure 6-7 rappresentano fasi specifiche della porzione di lavanda nasale del processo, per la visualizzazione assistita di queste due tecniche. Le figure 8-11 consistono in risultati rappresentativi delle analisi effettuate su campioni prelevati dal nasofaringe di un topo dopo la lavanda nasale. In particolare, la figura 8 è un risultato rappresentativo della carica batterica nel nasofaringe, determinata attraverso la coltivazione di lavaggi nasali ottenuti da topi colonizzati con ceppo S. pneumoniae P1121, P1547 o P1542. La figura 9 rappresenta la fenotipizzazione cellulare delle cellule immunitarie nasofaringee isolate utilizzando tecniche citometriche a flusso. Le figure 10-11 mostrano risultati rappresentativi relativi all'analisi espressioniale dell'mRNA nasofaringeo tramite PCR quantitativo.

Figure 1
Figura 1. Diagramma di flusso dell'inoculazione intranasale e delle procedure di isolamento delle cellule di lavaggio nasale utilizzando un modello di topo. In primo luogo, i batteri vengono preparati per l'inoculazione e quindi somministrati ai soggetti murini per via intranasale. Trascorso il periodo di tempo desiderato, i topi vengono eutanasiati tramite sanguinamento terminale e le loro cellule nasofaringee vengono isolate attraverso due passaggi di lavaggio nasale: un passaggio di lavaggio PBS seguito da un lavaggio secondario nel buffer di lisi dell'RNA. Le cellule del lavaggio preliminare PBS sono isolate e analizzate utilizzando tecniche di citometria a flusso, mentre l'RNA isolato dal secondo campione può essere utilizzato per indagare l'abbondanza relativa di molecole di interesse a livello trascrizionale.

Figure 2
Figura 2. Per determinare la concentrazione batterica, 10 μl gocce sono placcate in triplice copia su una piastra divisa in sezioni che rappresentano una diversa diluizione seriale. Queste gocce vengono quindi autorizzate ad asciugarsi e le piastre vengono incubate durante la notte a 37 °C, 5% CO2.

Figure 3
Figura 3. Concentrazione di Streptoccous pneumoniae isolato dal nasofaringe di un animale rappresentativo. Ogni colonia discreta rappresenta un'unità di formazione di colonie, ogni collezione di colonie rappresenta una goccia di 10 μl (placcata in triplicati) e ogni quadrante sulla piastra rappresenta una diluizione seriale separata. La concentrazione batterica è determinata in CFU/ml calcolando la media del numero di colonie numerabili e completamente formate all'interno e poi tra i quadranti qualificanti.

Figure 4
Figura 4. Il movimento di qualsiasi topo da inoculare deve essere ridotto al minimo, in particolare al collo, per consentire una corretta consegna dell'inoculo batterico. A tal fine, il mouse soggetto viene trattenuto in un apparato di restrizione modificato costituito da un tubo Falcon da 50 ml con un'apertura all'estremità affusolata. Il topo viene quindi posizionato in modo che il suo naso emerga dall'apertura, dove è accessibile dal ricercatore, consentendo l'inoculazione intranasale.

Figure 5
Figura 5. Peso dei topi colonizzati con ceppo P1547 da un minimo di 2 esperimenti rappresentativi tracciati giornalmente dopo l'inoculazione iniziale (n=6) per descrivere i cambiamenti tipici di peso attesi dopo la colonizzazione nasofaringea. Il peso è mostrato come una variazione percentuale del peso iniziale. Si prega di notare la forte perdita di peso iniziale prevista osservata tra i giorni 3-5, seguita da stabilizzazione e graduale aumento di peso nei topi sopravvissuti.

Figure 6
Figura 6. All'esposizione tracheale, i muscoli longitudinali fiancheggianti vengono rimossi con attenzione prima dell'incisione tracheale in un modo che non recise i vasi sanguigni circostanti. Una piccola incisione semilunare viene quindi fatta a metà della trachea usando forbici chirurgiche fini. È importante tagliare il diametro della trachea solo parzialmente, lasciandola intatta posteriormente.

Figure 7
Figura 7. Inserimento dell'ago cannulato nell'apertura tracheale verso l'alto verso il naso. Una volta che la cannula è in posizione, sondare delicatamente fino a quando non viene incontrata la resistenza, quindi sciacquare il contenuto attraverso i nares.

Figure 8
Figura 8. Una serie rappresentativa di carico batterico isolato dal nasofaringe utilizzando la procedura di lavaggio nasale descritta in seguito alla colonizzazione di topi C57BL/6 (triangoli) con ceppo di S. polmonite P1547 (A), P1542 (B) o P1121 (C). Una colonizzazione comparativa dei topi BALB/C (cerchi) dopo la colonizzazione P1121 è visualizzata anche in (C). Diversi punti di tempo sono mostrati durante il corso della colonizzazione, inclusi i giorni 3, 7, 14 e 21. Generalmente, un carico iniziale elevato è previsto al giorno 3, con poca diminuzione al giorno 7. Lo sgombero è tipicamente iniziato entro il giorno 14, con il nulla osta completo o quasi evidenziato dal giorno 21 dopo la colonizzazione con la maggior parte dei ceppi. Clicca qui per visualizzare la figura più grande.

Figure 9
Figura 9. Istogramma rappresentativo (A) e grafico a punti (B) delle cellule totali isolate dai lavaggi nasali murini analizzati dalla citometria del flusso. L'espressione differenziale dei marcatori sulle popolazioni cellulari consente l'identificazione di sottoinsiemi di leucociti attraverso l'uso di anticorpi fluorescenti diretti contro queste proteine. Come illustrato qui, le popolazioni di leucociti vengono selezionate prima gating su celle singole utilizzando un gate Forward Scatter (area) vs Forward Scatter (width) (A), quindi arricchendo per le celle CD45+ all'interno di tale sottoinsieme (B). Questa popolazione può essere ulteriormente suddivisa in tipi di cellule specifiche per gating per neutrofili doppio positivo CD11b e Ly6G (C). L'analisi della popolazione di CD11b può essere condotta per rivelare cellule CD4/80+, CD11b-macrofagi (D) o CD11b-, CD3 e CD4 doppiamente positive CD4 T (E). Le popolazioni cellulari possono essere fenotipate purché ne esprimono una o una combinazione di diversi recettori superficiali unici che possono essere utilizzati per distinguerle dagli altri tipi di cellule. Clicca qui per visualizzare la figura più grande.

Figure 10
Figura 10. Elettroferogramma rappresentativo a seguito del sequenziamento automatico dell'elettroforesi di un campione isolato dai lavaggi nasali murini. L'elettroferogramma risultante mostra i dati di quantificazione e la firma caratteristica di un campione di RNA totale di alta qualità derivato dalla regione nasofaringea. Quando si effettuano analisi dell'RNA totale, le aree sotto i picchi di RNA per i due principali RNA ribosomiali, 18S e 28S, sono usate per calcolare il loro rapporto corrispondente. Variazioni significative dei rapporti dei picchi attribuibili a 18S e 28S sono tipicamente indicative dell'RNA degradato. Il grado di degradazione può essere riassunto dal numero di integrità dell'RNA (RIN); il RIN per questo campione rappresentativo è 8.1. Un esempio di RNA altamente degradato è mostrato in (B) e (C), e il RIN successivo è rispettivamente 1,9 e 4,6. Clicca qui per visualizzare la figura più grande.

Figure 11
Figura 11. Grafico di amplificazione (A) e curva di dissociazione (fusione) (B) dall'analisi qPCR dei lire di cellule di lavaggio nasali, fornendo un esempio di come queste due letture dovrebbero in genere apparire seguendo un'amplificazione efficiente e correttamente rilevata dei prodotti mRNA isolati dal nasofaringe murino. Rappresentata è una curva standard per il gene delle pulizie 18S. I risultati visualizzati in (A) mostrano il prodotto PCR desiderato dopo l'amplificazione utilizzando primer contro GAPDH. La linea rappresenta la soglia del ciclo (Ct). Il punto in cui i grafici di amplificazione corrispondenti a diversi campioni varchere questa soglia consente il confronto tra campioni, con valori inferiori corrispondenti a quantità più elevate di RNA di interesse i vi contenute. La particella di (B) mostra che la temperatura massima di fusione del prodotto qPCR è di 85 °C e che non ci sono prodotti contaminanti presenti in questa reazione, che si presenterebbe come un picco aggiuntivo separato dal picco di prodotto desiderato. Clicca qui per visualizzare la figura più grande.

Nome ceppo sierotipo Virulenza Mortalità nei topi Durata colonizzazione prevista
P1121 23F Asintomatica 0% 21-28 giorni
P1542 4 basso 0-20% 21-28 giorni
P1547 6A metà 20-50% 14-21 giorni
D39 2 alto 70-100% 14-21 giorni

La tabella 1. Una panoramica tabellare di 4 ceppi isolati clinici di S. pneumoniae comunemente impiegati, il loro corrispondente numero di sierotipo, il grado associato di virulenza, la proporzione prevista di in invasività all'interno di un sottoinsieme colonizzato di topi e la durata tipica di una colonizzazione nasofaringea.

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Discussion

In questo studio abbiamo presentato metodi dettagliati per la colonizzazione intranasale dei topi utilizzando un ceppo isolato clinico di Streptococcus pneumoniae e il successivo isolamento e caratterizzazione delle cellule immunitarie reclutate in rinofaringe in risposta ai batteri. Abbiamo dimostrato come un inoculo batterico possa essere coltivato in mezzi ricchi di nutrienti e utilizzato per stabilire un evento di colonizzazione nei topi, che è inizialmente limitato al rinofaringe. Abbiamo quindi mostrato come i tipi di cellule immunitarie che rispondono che vengono reclutati nel nasofaringe possano essere isolati a seguito di esposizione tracheale, incisione e una lavanda nasale attraverso l'uso di un ago cannulato. I campioni di lavanda nasale possono essere raccolti in PBS per isolare cellule intatte e leggermente aderenti; l'RNA proveniente da cellule più aderenti e dallo strato mucoso epiteliale circostante può essere isolato applicando un lavaggio secondario costituito da tampone di lisi dell'RNA. Il primo di questi campioni può quindi essere utilizzato per fenotipare le cellule specifiche reclutate nel contesto della colonizzazione attraverso tecniche di citometria a flusso, mentre il secondo può essere applicato all'analisi Q-PCR, per determinare le funzioni dell'effettore di queste cellule reclutate osservando l'espressione trascrizionale dei regolatori immunitari di interesse. I campioni di lavanda nasale possono inoltre essere utilizzati per determinare la cinetica di clearance di un evento di colonizzazione batterica confrontando diversi gruppi sperimentali per affrontare specifiche domande di ricerca.

L'utilizzo di questo metodo di colonizzazione intranasale consente la creazione di un evento di colonizzazione che è inizialmente limitato al rinofaringe dell'animale. Qualsiasi successiva diffusione dei batteri al sangue o agli organi avviene quindi secondaria alle violazioni nelle difese immunitarie localizzate all'interno della mucosa nasofaringea. La progressione graduale raggiunta attraverso questo modello riflette più accuratamente il processo di invasione pneumoccocale nell'uomo, permettendo di studiare la dinamica tra i batteri colonizzanti e la mucosa nasale ospite - e forse comprendere meglio i cambiamenti nella patogenicità batterica e / o nell'immunità ospite che consentono lo sviluppo della diffusione della malattia. Questo è in contrasto con i modelli che rinunciano alla creazione di un evento di colonizzazione iniziale e scelgono di studiare la malattia invasiva in isolamento attraverso la consegna diretta dell'inoculo batterico ai polmoni attraverso l'instillazione intratracheale, al sangue tramite iniezione vascolare o al peritoneo tramite iniezione peritoneale.

Condurre una lavanda nasale PBS a seguito di un evento di colonizzazione consente l'isolamento di cellule non aderenti o leggermente aderenti reclutate al nasofaringe, così come di qualsiasi batterio associato alla mucosa. Va notato, tuttavia, che questa tecnica è limitata in quanto non rilascerà cellule o batteri che hanno viaggiato tra o sotto l'epitelio, né consentirà la raccolta di cellule o batteri che si sono localizzati nel tessuto linfoide associato alla nasale (NALT), un organo linfoide che è stato segnalato come un potenziale sito di infezione a seguito di una colonizzazione pneumococcica17,18. Se si desidera un ulteriore studio del NALT, si consiglia la microdisezione e la rimozione di questo tessuto all'ingrosso per lo studio a seguito della lavanda nasale PBS; poiché queste due tecniche non si escludono a vicenda, possono essere condotte sullo stesso animale. Tuttavia, a causa della natura litica e distruttiva della fase di raccolta dell'RNA (il lavaggio secondario usando il buffer di lisi dell'RNA), questo passaggio dovrebbe essere omesso se si intende raccogliere il NALT. Sebbene il lavaggio nasale sia una procedura meno tecnicamente impegnativa, per i gruppi che desiderano ottenere una valutazione più completa della carica batterica che include non solo i batteri associati alla mucosa, ma anche quelli che hanno invaso il tessuto rinofaringeo, suggeriamo di raccogliere il tessuto nasofaringeo dopo la rimozione dell'osso crano superiore dei topi colonizzati e la dissezione del tessuto all'interno della conca nasale, come descritto daaltri 19.

La natura di una risposta immunitaria suscitata dipende dall'interazione tra ospite e agente patogeno. Oltre 90 sierotipi di S. pneumoniae sono stati finora caratterizzati, tutti con diversi livelli di patogenicità ed espressione del fattore di virulenza, con conseguente prevalenza differenziale nella popolazione umana20-23. Allo stesso modo, nei topi, è stato riferito che l'estensione e la cinetica associate alla risposta immunitaria suscitata in risposta a una colonizzazione nasofaringea dipende dal ceppo colonizzantestesso 24. Pertanto, la selezione di un ceppo appropriato da utilizzare per l'istituzione di una colonizzazione nasofaringea non è una questione banale, né lo è la selezione del background genetico del topo. La figura 8 fornisce dati di esempio che descrivono la cinetica di clearance di una colonizzazione nasofaringea da 3 diversi ceppi di S. pneumoniae a seguito della colonizzazione intranasale di topi femmine su sfondo C57BL/6. La tabella 1 fornisce una panoramica del grado di virulenza e della durata del tempo di colonizzazione previsto (se utilizzato sullo sfondo C57BL/6) con 4 ceppi isolati clinici di S. pneumoniae descritti in letteratura e noti per essere in grado di stabilire una colonizzazione nasofaringea25: l'avirulento P1121 (sierotipo 23F)26,27 la bassa virulenza P1542 (sierotipo 4)28, la virulenza media P1547 (sierotipo 6A)29-31, e il ampiamente utilizzato, ben caratterizzato, altamente virulento D39 (sierotipo 2)32-36. Se l'obiettivo sperimentale è quello di studiare rigorosamente un evento di colonizzazione nasale asintomatica senza alcuna diffusione batterica di accompagnamento ad altri tessuti, si consiglia l'uso del ceppo Avirulent P1121, che è caratterizzato come un potente colonizzatore, poiché eventi di colonizzazione più lunghi (fino a 28 giorni prima della clearance osservata) sono un segno distintivo di questo ceppo. Tipicamente i topi colonizzati con P1121 non correranno alcun rischio di malattia invasiva e non mostreranno indicatori clinici di malattia (ad eccezione della perdita temporanea di peso). Il resto dei ceppi dovrebbe essere impiegato a seconda del grado desiderato di virulenza e mortalità associata, con virulenza che non significa il grado di infezione che si sviluppa all'interno di un singolo topo, ma piuttosto la proporzione di topi che mostrano segni clinici di malattia. Va anche notato che tipicamente, il grado di virulenza è correlato inversamente con la durata della colonizzazione, con ceppi più virulenti che colonizzano per un periodo di tempo più breve. Tutti e 3 i ceppi virulenti descritti portano alla mortalità nei topi a causa, più comunemente, della sepsi, con polmonite fulminante, o polmonite simultanea e sepsi che si sviluppano in un sottoinsieme di topi. Le differenze nella localizzazione dei batteri invasivi possono essere specifiche del ceppo, poiché è stato precedentemente riferito che alcuni ceppi mostrano tropismi per particolari organi37. In una piccola percentuale di animali, la meningite spontanea può anche svilupparsi dopo la colonizzazione. La determinazione della causa della morte, così come il grado di invasività, può essere effettuata attraverso la raccolta di tessuti associati (polmoni, milza e / o cervello) dagli animali all'endpoint. L'omogeneizzazione di questi tessuti e la successiva placcatura possono indicare la presenza di batteri invasivi e titoli corrispondenti.

Un esempio di quantificazione della densità di coltura batterica è mostrato nella figura 3. Se la coltura è troppo concentrata, le colonie crescono troppo densamente per essere contate individualmente, tuttavia le colonie derivate da singole cellule possono essere distinte se una serie di diluizioni log-wise è placcata. Placcare tre repliche tecniche per diluizione riduce al minimo la variabilità. Si prega di notare che quando si quantificano i batteri recuperati da un evento di colonizzazione nasale, si possono incontrare contaminanti cocolturati, che rappresentano altre specie batteriche simultaneamente isolate dal nasofaringe murino. Se il ceppo batterico di interesse ha resistenze antibiotiche note (ad esempio, molti ceppi di S. pneumoniae sono resistenti alla gentamicina o alla neomicina fino a 5 μg/ml), si può ridurre al minimo l'incidenza dei contaminanti integrando il supporto di crescita con l'antibiotico ad una concentrazione appropriata, limitando così la crescita dei contaminanti.

La citometria a flusso può essere utilizzata per analizzare i marcatori della superficie cellulare su campioni di lavanda nasale. Ad esempio, per l'analisi dei tipi di cellule reclutati nel contesto di un'infezione, è possibile utilizzare come precedentemente pubblicate una combinazione di anticorpi specifici per la differenziazione lorda dei leucociti, compresi i macrofagi (F4/80+),i neutrofili (CD11b+ e Ly6G+) e le cellule T (CD3+ e CD4+ o CD8+). Inoltre, queste analisi possono essere combinate con l'analisi citometrica del flusso condotta su diversi tessuti o sangue, per comprendere meglio il traffico delle cellule immunitarie nel corso di un'infezione. A causa del numero limitante di cellule (tipicamente numerate nelle migliaia basse) che possono essere isolate dal nasofaringe, identificare sottoinsiemi rari è in genere impegnativo, anche se i ricercatori che desiderano raggiungere questo obiettivo dovrebbero prendere in considerazione la possibilità di mettere in comune campioni da più topi per ottenere il conteggio delle cellule desiderato. Inoltre, poiché un numero finito di celle può essere estratto da questa regione, si consiglia di analizzare questi dati per quanto riguarda i numeri di cella totali.

Sebbene i livelli di espressione proteica siano tipicamente bassi nel nasofaringe limitando la possibilità di saggiare la produzione di proteine, è possibile analizzare la produzione di molecole ospiti in risposta ai batteri colonizzanti a livello di RNA. Per raggiungere questo obiettivo, i lavaggi nasali possono essere condotti usando il buffer di lisi dell'RNA al posto del PBS, che consente l'analisi dell'espressione genica. Per il rilevamento dell'amplificazione qPCR, è importante eseguire una curva di dissociazione corrispondente (Figura 11) per garantire che sia stato rilevato il prodotto corretto e desiderato. Ciò è dovuto al fatto che il saggio rileverà qualsiasi DNA a doppio filamento, inclusi i dimeri primer, il DNA contaminante e il prodotto PCR da primer misannealed.

Speriamo che i metodi qui descritti ti incoraggino ad applicare un modello di colonizzazione intranasale per studiare le risposte degli ospiti agli agenti patogeni importanti nel contesto di questa regione sottostudiata. Per alcuni agenti patogeni umani, come S. pneumoniae, un precedente evento di colonizzazione nasofaringea agisce come un importante precursore della conseguente diffusione batterica e delle sequele fatali che possono seguire, compresa la propagazione nei polmoni, che può portare a polmonite, oppure al sangue, e conseguente batteriemia e shock settico. Pertanto, studiando la colonizzazione batterica in questa regione, possiamo capire meglio come controllarla e prevenire che si verifichi una patologia più grave del tutto.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Gli autori ringraziano il Dr. Jeffery Weiser dell'Università della Pennsylvania per il suo dono dei ceppi clinici di Streptococcus pneumoniae. Questo lavoro è stato finanziato dal Canadian Institutes for Health Research. CV è stato finanziato da una borsa di studio M. G. DeGroote e da una borsa di studio della Canadian Thoracic Society. Questo lavoro è stato finanziato dalla Ontario Lung Association e dal Canadian Institutes of Health Research (CIHR). Il lavoro nel laboratorio bowdish è supportato in parte dal Michael G. DeGroote Centre for Infectious Disease Research e dal McMaster Immunology Research Centre.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-Mouse Ly6C FITC BD Pharmingen 553104
Anti-Mouse Ly6G PE BD Pharmingen
Anti-Mouse CD45.1 eFluor 450 eBioscience 48-0453-82
Anti-Mouse F4/80 Antigen APC eBioscience 17-4801-82
Anti-Mouse CD11c PerCP-Cy5.5 eBioscience 45-0114-82
Anti-Mouse CD11b PE-Cy7 eBioscience 25-0112-82
Anti-Mouse CD3 Alexa Fluor 700 eBioscience 56-0032-82
Anti-Mouse CD4 eFluor 605NC eBioscience 93-0041-42
Intramedic Polyethylene Tubing - PE20 Becton Dickinson 427406
BD 1 ml Syringe Becton Dickinson 309659
BD 26 G 3/8 Intradermal Bevel Becton Dickinson 305110
Buffer RLT Lysis Buffer Qiagen 79216
Difco Tryptic Soy Agar Becton Dickinson 236950
Defibrinated Sheep Blood PML Microbiologicals A0404
RNAqueous-Micro Kit Ambion AM1931
M-MuLV Reverse Transcriptase New England Biolabs M0253L
GoTaq qPCR Master Mix Promega A6001

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References

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Immunologia Numero 83 Streptococcus pneumoniae Lavanda nasale nasofaringe murino citometria del flusso RNA PCR quantitativo macrofagi reclutati neutrofili cellule T cellule effettori colonizzazione intranasale
Caratterizzazione delle risposte infiammatorie durante la colonizzazione intranasale <em>con streptococco pneumoniae</em>
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