Summary
تصوير حي من الخلايا المعرضة لصبغ محبة للدهون FM1-43 يسمح التحديد الدقيق للحركية التي يتم من خلالها إزالة السموم تشكيل المسام من غشاء البلازما. هذا هو مقايسة الحساسة التي يمكن استخدامها لتقييم متطلبات كا 2 +، sphingomyelinase والعوامل الأخرى على إصلاح غشاء البلازما.
Abstract
إصابة غشاء البلازما هو الحدث بشكل متكرر، والجروح يتعين إصلاحه بسرعة لضمان البقاء على قيد الحياة الخلوية. تدفق كا 2 + هو حدث يشير المفتاح الذي يقوم بتشغيل إصلاح الجروح الميكانيكية على غشاء البلازما داخل ~ 30 ثانية. وكشفت الدراسات الحديثة أن خلايا الثدييات أيضا ختم غشاء البلازما الخاصة بهم بعد permeabilization مع المسام تشكيل السموم في كا 2 + التي تعتمد على عملية ينطوي على إيماس من sphingomyelinase حمض انزيم الليزوزومية تليها المسام الإلتقام. هنا، نحن تصف المنهجية المستخدمة لإثبات أن إعادة عزل الخلايا permeabilized من قبل O السم ستربتوليزين هو أيضا سريع وتعتمد على كا 2 + تدفق. تصميم مقايسة يسمح تزامن هذا الحدث الضرر وقياس الحركية الدقيقة للقدرة الخلايا على استعادة سلامة غشاء البلازما عن طريق التصوير وقياس مدى الذي الصبغة liphophilic FM1-43 تصل إلى أغشية الخلايا. هذا المرض فحص الحيةس يسمح بتقييم الحساسة من قدرة خارجيا أضاف العوامل القابلة للذوبان مثل sphingomyelinase لمنع تدفق FM1-43، مما يعكس قدرة الخلايا على إصلاح غشاء البلازما الخاصة بهم. يسمح هذا الاختبار لنا لإظهار للمرة الأولى التي sphingomyelinase يعمل المصب من كا 2 + إيماس التي تعتمد، منذ بالإضافة خارج الخلية من الانزيم يعزز إعادة عزل الخلايا permeabilized في غياب كا 2 +.
Introduction
وقد كان من المعروف لعدة عقود أن إصلاح غشاء البلازما بعد الإصابة الميكانيكية هو 1،2 كا 2 + التي تعتمد عملية. وأظهرت الدراسات فيما بعد أن كا 2 + تدفق من خلال الجرح يطلق عملية نشطة من إيماس من الحويصلات داخل الخلايا في موقع الإصابة، وهو مطلوب لإعادة عزل 3،4. تم استخدام معدل فقدان صبغة الفلورسنت تحميلها في سيتوبلازم الخلايا لتقييم سرعة إصلاح، وخلص إلى أن اكتمل إعادة عزل داخل <30 ثانية بعد الإصابة 5. واقترحت في البداية نموذجين لشرح متطلبات إيماس في إصلاح غشاء البلازما: 1) نموذج "التصحيح"، مما يوحي بأن كا 2 + تدفق من خلال الآفة يؤدي الانصهار في البداية مثلي النمط من الحويصلات داخل الخلايا، وتشكيل كبير "التصحيح" التي من شأنها أن ثم تطبيقها على غشاء البلازما لختم الجرح 6 و 2) نموذج خفض التوتر، الذي اقترح أن غشاء عديد بواسطة كا 2 + إيماس التي تعتمد في محيط الجرح من شأنه أن يقلل التوتر غشاء البلازما، وتسهيل إعادة إغلاق طبقة ثنائية 7. وقد تعزز دور كا 2 + إيماس أثار في البلازما إصلاح غشاء مزيدا من الدراسات التي تبين أن الجسيمات الحالة تحتوي على جزيء كا 2 + الاستشعار، synaptotagmin السابع، مما يسهل إيماس والبلازما إصلاح غشاء الخلايا المصابة في 8،9،10،11 .
ومع ذلك، فقد أشارت الأدلة الإضافية التي إيماس وحده لم يكن كافيا لتعزيز إصلاح غشاء البلازما. بالإضافة إلى الدموع الميكانيكية على غشاء البلازما، وهو شكل المتكرر للإصابة الخلية هو permeabilization بواسطة السموم تشكيل المسام التي تنتجها البكتيريا 12،13 أو 14،15 الخلايا المناعية. على عكس الدموع الميكانيكية والبروتينات المكونة للمسام إدراج نفسها على غشاء البلازما تشكيل مستقرة، المسام مبطنة البروتين الذي لا يمكن أن يتم إغلاقه ببساطة عن طريق تطبيق غشاء "التصحيح" أو احمرارجي التوتر الغشاء. يثير الاهتمام والفضول، وكشفت الدراسات أن خلايا الثدييات لديها آلية فعالة لإصلاح غشاء البلازما الخاصة بهم بعد permeabilization مع البروتينات التي تشكل المسام، وهذه العملية تتطلب أيضا وجود خارج الخلية كا 2 + 12. أثارت هذه النتيجة مسألة ما إذا كان إزالة الغشاء مسام من سطح الخلية أيضا عملية سريعة، كما لوحظ مع الجروح الميكانيكية 5. من المستغرب، كشفت الدراسات التي أجريناها مؤخرا أن إعادة عزل الخلايا permeabilized مع السموم تشكيل المسام لها خصائص مشابهة جدا لإصلاح الجروح الميكانيكية: تتطلب عملية خارج الخلية كا 2 +، وتكتمل في غضون 30 ثانية ~. التحقيق هذه العملية في مزيد من التفاصيل، علمنا مؤخرا أنه بالإضافة إلى كا 2 + إيماس تنظيما من الجسيمات الحالة، ينطوي إصلاح غشاء البلازما شكل السريع لالإلتقام، والتي يتم تشغيلها من قبل الإفراج عن انزيم الليزوزومية sphingomyelinase حمض (ASM) وضروري ليس فقط لعشرإزالة (ه) من المسام عبر الغشاء، ولكن أيضا لإصلاح الجروح الميكانيكية 16.
لتحديد حركية إعادة عزل الخلية بعد permeabilization مع البروتينات المكونة للمسام، في المختبر لدينا نحن تكييفها منهجية التصوير الحية التي كانت تستخدم في السابق لتقييم إعادة إغلاق ألياف العضلات المعزولة بجروح الليزر 17. يعتمد هذا الاختبار على خصائص صبغ محبة للدهون FM1-43، والتي intercalates ثابت في النشرة الخارجي من طبقات ثنائية الدهون وزيادة في كثافة مضان. عندما تعطل البلازما طبقة ثنائية الغشاء مكاسب صبغ خارج الخلية أغشية الخلايا الوصول إلى، وتوفير الفحص الحساسة للكشف عن إصابة غشاء البلازما وإصلاح 18،16،19،20. للتكيف مع هذا الاختبار لتقييم إعادة عزل الخلية بعد permeabilization مع البروتينات المكونة للمسام، ونحن الخلايا ما قبل المحتضنة في 4 درجات مئوية مع السم البكتيري ستربتوليزين O (سلوفاكيا)، الذي يربط لغشاء الكولسترول 21. خلية متزامنويمكن بعد permeabilization أن يتحقق بسهولة عن طريق نقل الخلايا من الجليد لتدفئة المتوسطة في مرحلة المجهر ساخنة، والتي ينشط oligomerization والتغيير في التشكل الذي يؤدي إلى تشكيل المسام عبر الغشاء. ميزة هذا النهج، على المقايسات التي تم نشرها مسبقا باستخدام الليزر جرح، غير أن عددا أكبر من الخلايا يمكن تحليلها في وقت واحد في حقل المجهرية، وتوفير أفضل أخذ العينات من السكان الخلية. نظرا للتشابه بين الآلية عملية إعادة عزل الخلايا ينظر بعد الإصابة الميكانيكية وpermeabilization مع السموم تشكيل المسام، مقايسة وصفنا هنا يوفر طريقة مرنة للغاية وقوية لتشريح العوامل التي تدخل في عملية الأساسية للإصلاح غشاء البلازما. كمثال على ذلك، وتبين لنا أنه من الممكن استخدام هذا الاختبار لتحديد الخطوات كا 2 + التي تعتمد ومستقلة عن عملية الإصلاح.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. النسخي إسكات ASM
- البذور 1.5 × 10 5 خلايا هيلا في 2 مل من وسائط النمو DMEM (DMEM الجلوكوز عالية مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS)، 2 مم L-الجلوتامين، 1٪ بنسلفانيا-بكتيريا) على الأطباق 35 ملم أسفل الزجاج (ماتيك) و احتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 الحاضنة.
- في اليوم التالي، نضح قبالة سائط النمو واستبدالها 2 مل DMEM انخفاض مصل المتوسطة (DMEM مع 4٪ FBS)، لا يقل عن 1 ساعة قبل إضافة الخليط ترنسفكأيشن سيرنا.
- إعداد 4 أنابيب لسيرنا خليط بنسبة ضئيلة ترنسفكأيشن. في أنابيب A و C، إضافة 250 ميكرولتر Optimem خفض المصل و 4 ميكرولتر Lipofectamine RNAiMax، في 35 مم طبق ليتم transfected. في أنبوب B، إضافة 250 ميكرولتر من Optimem خفض المصل و 8 ميكرولتر (160 pmoles) من التحكم في المحتوى GC المتوسطة بنسبة ضئيلة (التحكم سيرنا)، في 35 مم طبق ليتم transfected. في أنبوب D، إضافة 250 ميكرولتر من Optimem خفض المصل و 8 ميكرولتر (160 pmoles) من SMPD1 بنسبة ضئيلة (siASM)، في 35 مم طبق رس يتم transfected. احتضان الأنابيب في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
- الجمع بين أنابيب A و B لتشكيل مجمع ترنسفكأيشن للتحكم سيرنا، وأنابيب C و D لASM سيرنا. احتضان ردود الفعل في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.
- إضافة عنصر تحكم سيرنا وسيرنا ASM مخاليط رد فعل ترنسفكأيشن ببطء، قطرة قطرة، في أطباق 35 ملم الزجاج السفلي منها واحتضان عند 37 درجة مئوية / 5٪ CO 2. في 24 ساعة بعد ترنسفكأيشن، نضح بلطف وسائل الإعلام واستبدالها مع وسائط النمو DMEM الطازجة. لكفاءة ضربة قاضية ASM، الأطباق ينبغي حضنت أخرى في 37 درجة مئوية / 5٪ CO 2 لمدة 31 ساعة (ما مجموعه 55 ساعة) قبل التصوير الحي.
2. إعداد الكواشف لايف المجهر
- يعد حل المؤتلف تشكيل المسام السم ستربتوليزين O (سلوفاكيا) بتركيز 100 نانوغرام / ميكرولتر في برنامج تلفزيوني 1X الباردة دون كا 2 + 2 + والمغنيسيوم. وسلوفاكيا المستخدمة في هذه المقايسات هو constitutivelذ متحولة السيستين النشطة التي لا يتطلب الحد من وكلاء للنشاط، شريطة التفضل الدكتور رود Tweten، جامعة ولاية أوكلاهوما. وأعرب عن السم في E. القولونية BL21 DE3 وتنقيته في ظل ظروف الأم، كما هو موضح سابقا 16.
- إعداد محلول المخزون FM1-43: في resuspend FM1-43 مسحوق مجفف بالتجميد في DMSO لإيجاد حل 25 ملم.
- إعداد الحل ج: تمييع الحل الأسهم FM1-43 في DMEM الباردة مع كا 2 + إلى تركيز النهائي من 4 ميكرومتر (وهناك حاجة إلى 1.5 مل لكل طبق ماتيك) وتخزينها على الجليد لحين الحاجة إليها.
- إعداد الحل B: تمييع الحل الأسهم FM1-43 في DMEM الباردة دون كا 2 + و 10 ملي EGTA (كا 2 + خالية من DMEM) إلى التركيز النهائي من 4 ميكرومتر (1.5 مل المطلوبة لكل طبق ماتيك) وتخزينها على الجليد حتى الحاجة.
- قبل دافئ (37 درجة مئوية) 1 مل aliquots من الحل والحل A B في أنابيب إيبندورف.
- الحفاظ على حلول الجليد من DMEM مع كا 2 +، C و2 + خالية من DMEM.
3. التصوير خلية حية من FM1-43 تدفق في سلوفاكيا المعالجة وغير المعالجة الخلايا
- ملء متوسطة الحجم حاوية معدنية الضحلة مع الثلج المجروش، عكس ذلك في وعاء زجاجي كبير مع الثلج، والجليد إضافة إضافية ولم يتبق سوى السطح السفلي من الحاويات المعدنية المكشوفة. وضع منشفة ورقية مبللة في القاع المعدن يتعرض للسماح لنقل حتى الحرارية.
- تأخذ واحدة تحكم سيرنا المعاملة طبق ماتيك (نموذج 1) ووضعه على منشفة ورقية رطبة باردة. نضح بلطف من جميع وسائل الإعلام وغسل 3X مع البرد كا 2 + خالية من DMEM. بعد غسل الماضي، ونضح من جميع وسائل الإعلام في الطبق.
- لصورة الخلايا المرتبطة FM1-43 في الخلايا مع عدم وجود إصابة سلوفاكيا (نموذج 1) في وجود كا 2 +، إضافة 180 ميكرولتر من الحل الباردة B إلى ساترة الزجاج وسط الطبق 35 ملم أسفل الزجاج واحتضان لمدة 5 دقيقة على الجليد (الجدول 1). وضع الطبق ماتيك على مرحلة المجهر متحد البؤر تسخينها إلى 37 درجة مئوية، وغرفة مجهزة البيئية (التي تحافظ على درجة الحرارة والرطوبة وثاني أكسيد الكربون مستويات 2). العثور على مجال الخلايا التي سيتم تصويرها يبحث من خلال 1.3 الهدف 40X NA (نيكون). إذا كانت متوفرة، بدوره على PerfectFocus أو جهاز مماثل لتصحيح الانحراف الحراري.
- إضافة 1 مل من prewarmed الحل A بلطف إلى جانب 35 ملم صحن واستبدال غطاء غرفة البيئية (الجدول 1).
- الحصول على صور لمدة 4 دقائق في 1 الإطار كل 3 ثانية باستخدام برامج التصوير المناسبة (Volocity في نظام الغزل متحد البؤر المجهري القرص UltraView فوكس بيركن إلمر). ويتم إنجاز الإثارة من FM1-43 مع خط ليزر 488 نانومتر باستخدام فلتر مزدوج اللون مع تمريرة الفرقة 488 نانومتر، ويتحقق من خلال التمييز الانبعاثات استخدام فلتر 527 (W55) الانبعاثات. يتم تعيين مستويات الطاقة ليزر وحساسية الكاميرا لتحقيق التعرض صورة 100 ميللي ثانية.
- كرر الخطوات من 3،2-3،6 لكشف FM1-43 في التحكم في الخلايا سيرنا المعاملة مع عدم وجود إصابة سلوفاكيا (نموذج 2) في غياب كا 2 +، إلا أنه في الخطوة 3.5 B الحل ينبغي أن تضاف (الجدول 1).
- لقياس تدفق FM1-43 في الخلايا تحكم سيرنا المعاملة أصيب سلوفاكيا إما في وجود (نموذج 3) أو عدم وجود كا 2 + (نموذج 4)، إضافة 180 ميكرولتر من محلول B الباردة التي تحتوي على سلوفاكيا لساترة الزجاج وسط 35 ملم صحن أسفل الزجاج واحتضان لمدة 5 دقائق على الجليد كما في الخطوة 3.3. كرر الخطوات من 3.2 خلال 3.6؛ ضبط مضيفا الحل إما A أو B في الحل خطوة 3.5 (الجدول 1).
- لتحديد دور ASM في البلازما إصلاح الغشاء، كرر الخطوات من 3،2-3،6 باستخدام الخلايا المعالجة سيرنا ASM لجميع الظروف (عينات 5-8) (الجدول 1).
- لتحديد دور sphingomyelinase المؤتلف خارج الخلية (SM) علىحركية إصلاح غشاء البلازما (التي تعكسها وتثبيط في FM1-43 التدفق) (عينات 9-10)، يضاف SM (0-50 μU) إما الحل أو الحل A B في الخطوة 3.5 ثم تضاف إلى الخلايا خلال الخلية الحية التصوير في إجمالي حجم 1 مل (الجدول 1).
4. الكمي للFM1-43 تدفق إلى خلايا
- بعد أن تم الحصول على الأفلام، وقياس كثافة مضان الخلايا من FM1-43 باستخدام برمجيات تحليل الصور (Volocity جناح، PERKINELMER). رسم المنطقة من اهتمام في المنطقة عصاري خلوي من كل خلية في الميدان وتطبيق أدوات البرمجيات لتحديد متوسط FM1-43 كثافة مضان في جميع إطارات من الفيديو.
- لضبط الاختلافات في الأولي FM1-43 تلطيخ، يتم التعبير عن البيانات لكل الفيديو وأضعاف الزيادة في كثافة مضان بمرور الوقت، وخططوا لكل حالة مختلفة. الزيادة أضعاف في مضان من كل فرد في timepointيتم احتساب الخليوي كما F T / F 0، حيث F T هو مضان يعني في timepoint محددة، وF 0 هو مضان يعني في ر = 0 (الأرقام 1-2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تركيزات منخفضة من البكتيريا البلازما sphingomyelinase (SM) الانقاذ إصلاح الغشاء في الخلايا المنضب في sphingomyelinase حمض الليزوزومية.
باستخدام FM1-43 فحص التصوير، وأظهرنا سابقا أن الخلايا ناقصة لASM انزيم الليزوزومية وتعرضت لاصابة في سلوفاكيا وجود كا 2 + يكون هو انقاذ عيب غشاء البلازما بإضافة خارج الخلية من الانزيم الإنسان المؤتلف 19. منذ ASM الليزوزومية البشري لديه درجة الحموضة المثلى المنخفض، ونحن التحقيق ما إذا كانت إعادة عزل ويمكن أيضا استعادة مضيفا SM تنقيته من العصوية الشمعية (سيغما)، والذي نشط بشكل كامل في درجة الحموضة محايدة. كما هو موضح سابقا، والخلايا تعامل مع تحكم سيرنا أو oligos ASM سيرنا وتتعرض لسلوفاكيا في غياب كا 2 + (الظروف غير متساهلة للإصلاح) تم permeabilized على قدم المساواة، والتي تبين أن لا تتدخل استنزاف ASM ذوي الحساسية تجاه السم (الشكل 1A ). ومن المثير للاهتمام، وس الإنقاذ الكاملو لوحظ قدرة الخلايا ASM ناقصة لختم بعد التعرض لسلوفاكيا مع تركيزات منخفضة من SM و 5 و 7.5 μU / مل (الشكل 1B). كما تركيز انزيم إضافتها إلى زيادة متوسطة، كان هناك فقدان تدريجي في النمط الظاهري الإنقاذ - الخلايا المعرضة إلى 10 μU / مل فقط سدت جزئيا تدفق FM1-43 بعد التعرض لسلوفاكيا، وأظهرت الخلايا المعرضة إلى 50 μU / مل نمط صبغ تدفق قوي، مما يعكس وجود خلل إعادة عزل كامل مماثلة لتلك التي لوحظت في الخلايا المنضب ASM (الأرقام 1B و 1C). وتشير هذه النتيجة إلى أن إزالة التقامي من سلوفاكيا المسام وينظم بإحكام من قبل مستويات سيراميد ولدت في غشاء البلازما التي كتبها SM - فوق مستوى معين لا تحدث العملية عادة، والخلايا لا يمكن إزالة الآفات.
بالإضافة إلى ذلك Sphingomyelinase يتجاوز شرط كا 2 + في البلازما إصلاح الغشاء.
بشكل ملحوظ، إضافة البكتيرية SM إلى الخلايا permeabilized بواسطة سلوفاكيا في غياب كا 2 + (عادة شرط أن لا يسمح إعادة عزل الخلية) كما أنقذت البلازما إصلاح الغشاء. كما رأينا في الخلايا المعرضة للسموم تشكيل المسام في وجود كا 2 + (الأرقام 1B و 1C)، كانت تركيزات منخفضة فقط من SM فعالة في عرقلة تدفق FM1-43 (الشكل 2A و 2B). وتشير هذه النتائج إلى أن وظائف sphingomyelinase المصب من خطوة + التي تعتمد على غشاء البلازما إصلاح كا 2. هذه النتيجة تتفق تماما مع النموذج المقترح لدينا سابقا، والتي تفترض أن كا 2 + التي تتدفق من خلال مسام الغشاء يؤدي إيماس من الجسيمات الحالة والإفراج ASM، الذي يشق سفينغوميالين على النشرة الخارجي للغشاء البلازما، سيراميد توليد وتشجيع إزالة المسام من الإلتقام 22 ، 19. حقيقة أن إضافة المنقى SM يتجاوز الحاجة إلى كا 2 + تعزز بقوةو ترى أن في ظل الظروف الفسيولوجية كا 2 + إيماس تنظيما من الجسيمات الحالة هو مصدر النشاط sphingomyelinase اللازمة لتعزيز الإلتقام.
الشكل 1. الشمعية sphingomyelinase العصوية (SM) يمكن أن تكمل عيب البلازما إصلاح غشاء الخلايا الصمت للتعبير عن sphingomyelinase حمض (ASM) أصيب السم تشكيل المسام ستربتوليزين O (سلوفاكيا). خلايا هيلا تعامل مع تحكم سيرنا أو ASM سيرنا oligos وأصيب في غياب أو وجود كا 2 + وتدفق الصبغة محبة للدهون وتصويرها FM1-43 في الإطار 1/3 ثانية لمدة 4 دقائق. وكان كميا FM1-43 مضان الخلايا باستخدام البرمجيات Volocity وأعرب عن زيادة أضعاف في كثافة مضان بمرور الوقت. (A) في غياب كا 2 +، تم permeabilized كلا تحكم سيرنا وسيرنا الخلايا ASM المعاملة على أيدي سلوفاكيا. وقد تم تحليل 18-27 الخلايا في كل حالة؛. أشرطة الخطأ تتوافق مع متوسط + / - SEM (B) في وجود كا 2 +، وكانت الخلايا المعالجة مع التحكم سيرنا قادرة على ختم غشاء البلازما ووقف تدفق صبغ، في حين الخلايا تعامل مع ASM سيرنا فشل في ختم. بالإضافة إلى ذلك في وجود كا 2 +، بالإضافة إلى الخارجية من الجرعات المنخفضة من sphingomyelinase يكمل عيب غشاء البلازما من خلايا ASM سيرنا المعاملة. وقد تم تحليل 18-62 الخلايا في كل حالة؛ أشرطة الخطأ تتوافق مع متوسط + / - SEM (C) الأطر الزمنية المحددة من الفيلم تحليلها في B. الحانات، 9 ميكرومتر. اضغط هنا لعرض أكبر شخصية .
ز "بديل =" الشكل 2 "FO: محتوى العرض =" 3.25in "FO: SRC =" / files/ftp_upload/50531/50531fig2highres.jpg "/>
الشكل 2. بالإضافة إلى ذلك Sphingomyelinase يتجاوز شرط كا 2 + في البلازما إصلاح الغشاء. أصيب خلايا هيلا تعامل مع تحكم سيرنا مع سلوفاكيا في غياب كا 2 + تم تصويرها وتدفق الصبغة محبة للدهون FM1-43 في الإطار 1/3 ثانية لمدة 4 دقيقة. وكان كميا FM1-43 مضان الخلايا باستخدام البرمجيات Volocity وأعرب عن زيادة أضعاف في كثافة مضان بمرور الوقت. (A) عدم وجود غشاء البلازما إعادة عزل ينظر عادة في الخلايا المصابة مع سلوفاكيا في غياب كا 2 + يتم عكس بإضافة الخارجية جرعات منخفضة من sphingomyelinase. وقد تم تحليل 18-31 الخلايا في كل حالة؛ أشرطة الخطأ تتوافق مع متوسط + / - SEM (B) الأطر الزمنية المحددة من الفيلم تحليلها في A. الحانات، 9 ميكرومتر.g2large.jpg "الهدف =" _blank "> اضغط هنا لعرض أكبر شخصية.
الرقم 3. الجدول الزمني الداخلي. الجدول الزمني للخطوات التجريبية تشارك في الإجراء. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .
| CA2 + شرط | CA2 خالية من + حالة | سلوفاكيا السم | الدافئة الحل و | الحارة الحل B | Sphingomyelinase | الإجراء الخطوة |
| + | - | - | + | - | - | 3.2 |
| - | + | - | - | + | - | 3.7 |
| + | - | + | + | - | - | 3.8 |
| - | + | + | - | + | - | 3.8 |
| + | - | - | + | - | - | 3.9 |
| - | + | - | - | + | - | 3.9 |
| + | - | + | + | - | - | 3.9 |
| - | + | + | - | + | - | 3.9 |
| - | + | + | - | + | + | 3.10 |
| + | - | + | + | - | + | 3.10 |
الجدول 1. يتم سرد تكوين الحلول المستخدمة في إجراء التجارب. العينات كما هو موضح في الإجراء في الصفوف. أعمدة دلالة على وجود (+) أو عدم وجود (-) المكون اسمه (بنسبة ضئيلة، كا 2 + أو كا 2 + خالية من المتوسطة، سلوفاكيا، الحل A أو B، sphingomyelinase). يشار إلى الخطوات التجريبية التي تستخدم هذه العينات الأولى للتصوير الخلايا الحية في القسم الداخلي 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
اعتمدت الدراسات السابقة على الإصابة الميكانيكية وإصلاح غشاء البلازما على آليات متنوعة من الخلايا جرح، بدءا من إسقاط الخرز الزجاجي، micropipetting، القص، خدش أو كشط. كانت قراءات من كل هذه المقايسات النوعية بدلا من الكمية، ولم تعطي معلومات دقيقة عن حركية آلية إصلاح. تم قياس قدرة الخلايا على ختم غشاء البلازما الخاصة بهم بعد هذه الأشكال من الإصابة من جراء وجود أو عدم وجود استشفاف تضاف إلى السائل خارج الخلية في السيتوبلازم، اختراق غشاء كتيمة الأصباغ، وفقدان الإنزيمات عصاري خلوي ومستويات ATP، أو طويلة الأجل البقاء على قيد الحياة الخلوية. على الرغم من أن العديد من هذه المقايسات لا يمكن أن يؤديها من الناحية الكمية، وكان عقبة رئيسية واحدة في هذه الدراسات صعوبة في مزامنة الحدث اصابة، في حين تقييم بسرعة حركية إعادة عزل على مستوى خلية واحدة.
تطوير واستخدام الأشعة فوق البنفسجية إصابة الليزر من الألياف العضلية فولو فوتبال شيالأربعاء من خلال الكشف عن تدفق الصبغة محبة للدهون FM1-43 كان تقدما كبيرا في هذه الدراسات 17،20. بدلا من الأضرار الجسيمة التي لحقت السكان خلية كاملة عن طريق كشط أو وسائل ميكانيكية مشابهة للإصابة، وعرض هذه المقايسات وسيلة أكثر تحديدا إلى الجرح الخلايا التي يسمح تحليل خلية واحدة. ومع ذلك، ظلت العديد من المشاكل في مثل هذه المقايسات. حجم الآفات التي يسببها الليزر كبير ومتغير تماما اعتمادا على كثافة الليزر، ومختلفة جدا في الطبيعة من أشكال إصابة الأغشية التي تحدث أثناء الظروف الفسيولوجية. مشكلة أخرى هي أن خلية واحدة فقط أو الألياف العضلية يمكن أصيب في وقت باستخدام الليزر المرتبطة المجهر، والحد من أعداد إعادة عزل الأحداث التي يمكن اتباعها، وبالتالي فإن الدلالة الإحصائية للنتائج. هذه المشاكل مع استنساخ وأخذ العينات تقلص إلى حد كبير فائدة إصابة الليزر كوسيلة لتحقيق آليات إصلاح غشاء البلازما.
Tس معالجة هذه القضايا، وضعنا مقايسة التصوير الخلية الحية جديدة لقياس بدقة حركية إصلاح غشاء البلازما الآفات التي تسببها السموم تشكيل المسام البكتيرية. هذا هو شكل من أشكال الإصابة التي تحدث بشكل متكرر في الطبيعة، لأن العديد من الميكروبات تمتلك العديد من السموم التي هي قادرة على permeabilizing غشاء الخلايا حقيقية النواة. هذا الفحص يمكن أن تكون متزامنة بدقة لما قبل احتضان الخلايا مع السم في درجات الحرارة المنخفضة، وتسمح لعدد كبير من الخلايا المجهرية في حقل ليتم تحليلها لتدفق FM1-43، ودرجة الحرارة وزيادة لتحريك تشكيل المسام.
التزامن الدقيق للمسام تشكيل يتحقق مع هذا الاختبار يسمح قياسات استنساخه من حركية إصلاح غشاء البلازما، والتي يمكن quantitated في وقت واحد في عدة خلايا فردية ضمن الحقل المجهري. أحد العوامل الفنية الهامة في هذه المقايسات هو نوعية المجهر عدسة الهدف لاستخدامها في التصوير. Tانه 40X NA 1.3 (نيكون) الهدف المستخدمة في فحوصات لدينا يسمح لأخذ عينات كافية من الخلايا في السكان دون أن تفقد دقة وضوح الصورة. أن التحول إلى الهدف 10X تسمح عينة أكبر من السكان الخلية، ولكن القرار الذي يتحقق غير كاف لتقدير السليم لداخل الخلايا FM1-43. خطوة حاسمة لهذا الحي فحص التصوير الخلية هو استخدام PerfectFocus أو جهاز مماثل لتصحيح الانحراف الحراري. يتطلب الإجراء لدينا قبل ملزم من البكتيريا التي تشكل المسام السم إلى الخلايا على الجليد ومن ثم تحويل درجة الحرارة بسرعة إلى 37 درجة مئوية لمدة التصوير الخلية الحية. وهذا التعديل في درجة الحرارة يسبب تقلبات التركيز المحوري خلال الفترة الحصول على الصور، ويجب تصحيحه. سوف PerfectFocus أو جهاز مماثل تصحيح هذه المشكلة والسماح التصوير الخلية الحية من المستوى البؤري اختيارها على مدى فترات طويلة من الزمن، مما يسمح الكمي الدقيق لحركية إصلاح غشاء البلازما.
مفتاح لنجاح هذا الاختبار هو دائما عيار تركيزات مختلفة من السم قبل تشكيل لتحديد الجرعات للإصلاح وغير للإصلاح، لأن هذا يمكن أن تختلف عن كل دفعة من السموم المستخدمة. نشاط العديد من السموم، وسلوفاكيا على وجه الخصوص، هو درجة الحرارة حساسة ومتعددة تجميد يذوب دورات تضر نشاطها. ومع ذلك، جنبا إلى جنب مع تنفيذ المعايرة في كل تجربة السماح للجرعة السم الصحيح ليتم تحديدها بدقة في بضع دقائق فقط من الوقت الفاصل بين التصوير.
يعتمد هذا الاختبار على الكشف عن الخلايا كافية FM1-43 مضان بعد إصابة غشاء البلازما. هذا يمكن أن يحد في ظل ظروف معينة. بعد إدخالها في الأغشية أشكال سلوفاكيا المسام التي يبلغ قطرها حوالي 30 نانومتر، مما يسمح لقوة كا 2 + تدفق واستجابة البلازما إصلاح غشاء السريع في الخلايا حقيقية النواة. ومع ذلك، المسام تشكيل-السموم التي تشكل آفات أصغر، مثل aerolysin وlysenin التي لها أقطار المسام من حوالي1-3 نانومتر 23-25 مايو لا تكون كافية لهذا الفحص لأنها قد تؤدي إلى عدم كفاية كا 2 + وFM1-43 التدفق.
حتى باستخدام السم الذي يولد المسام الكبيرة مثل سلوفاكيا، من المهم أن نأخذ في الاعتبار أن هذا الفحص التصوير لا يسمح لتقدير المطلق للكثافة مضان، بل مضان النسبي. وبالتالي، فمن الأهمية بمكان أن يتم تنفيذ التصوير داخل النطاق الديناميكي intrascene من الكاميرا الرقمية. منذ يتأثر كثافة مضان من قبل قوة الليزر، وقت التعرض، وزيادة كاميرا، فمن المهم وضع هذه المعايير الثلاثة في بداية كل تجربة، عن طريق إجراء التصوير الأولي من الخلايا تعامل مع FM1-43 وسلوفاكيا في كل إصلاح وغير -إصلاح الأوضاع (كا 2 + أو كا 2 + خالية متوسطة). وهذا يسمح للاختيار الإعدادات الحصول على الصور التي تسمح الكشف عن مضان في وقت صفر (قبل SLO بالإضافة إلى ذلك)، ولكن لا يؤدي إلى كشف التشبع (كما determINED بواسطة برنامج قراءات) في نهاية الاستحواذ في ظل ظروف غير إصلاح.
باستخدام هذا الاختبار، تمكنا من إثبات أن تتم إزالة المسام سلوفاكيا من غشاء البلازما من خلايا الثدييات في أقل من 30 ثانية، مما يدل على أن هذه العملية لديه حركية مماثلة السريع لإصلاح الجروح الميكانيكية 16. وأظهرت دراسات لاحقة أن ASM انزيم الليزوزومية هو مطلوب لإصلاح غشاء البلازما، وقادرة على استعادة إعادة عزل عند إضافتها إلى خارج الخلية خلايا ASM ناقص 19. في هذه الدراسة، ونحن استغل حساسية FM1-43 تدفق مقايسة لاظهار، للمرة الأولى، يمكن أن يحدث إصلاح غشاء البلازما أيضا في غياب خارج الخلية كا 2 +. وكان تعرض خلايا الجرحى إلى sphingomyelinase المؤتلف كافية لتعزيز إعادة عزل في الخلايا permeabilized بواسطة سلوفاكيا في كا 2 + خالية المتوسطة، وهي حالة عادة لا متساهلة لإصلاح غشاء البلازما. ومن المثير للاهتمام، مجمعاتلم يكن لوحظ نشاط عقلي قدرة البلازما إصلاح الغشاء بعد التعرض لتركيزات عالية من sphingomyelinase، مما يشير إلى أن كمية سيراميد الناتجة عن هذا الانزيم على النشرة الخارجي للغشاء البلازما هي من العوامل الهامة لعملية إزالة الآفة. يوضح هذا الاكتشاف الذي كا 2 + ضروري لتحريك خطوة الليزوزومية إيماس، ولكن ليست هناك حاجة لالإلتقام التي يسببها sphingomyelinase هي المسؤولة عن استيعاب الجرح.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن الكتاب ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح R37 R01 GM064625 AI34867 وإلى NWA نشكر الدكتور R. Tweten من جامعة أوكلاهوما للتعبير البلازميد سلوفاكيا.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| HeLa 229 cell line | ATCC | CCL2-1 | |
| DMEM High Glucose | Invitrogen | 11965 | |
| DMEM High Glucose No Calcium | Invitrogen | 20168 | |
| FM1-43 | Invitrogen | T3163 | |
| Optimem Reduced Serum | Invitrogen | 31985 | |
| Lipofectamine RNAiMax | Invitrogen | 13778 | |
| Control medium GC content RNAi oligo | Invitrogen | 12935300 | |
| SMPD1 RNAi oligo | Invitrogen | HSS143988 | |
| Fetal Bovine Serum Heat-inactivated | Gemini-Bioproducts | 100-106 | |
| Sphingomyelinase from Bacillus cereus | Sigma | S7651 | |
| 35 mm-glass bottom dishes | MatTek | P35G-0-14 | |
| Material | |||
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| Camera | Hamamatsu Photonics | C9100-50 | |
| Spinning disk confocal microscope | PerkinElmer | UltraViewVoX | |
| Software analysis software | PerkinElmer | Volocity Suite | |
| Environmental chamber | Pathology Devices | LiveCell System Chamber | |
References
- Heilbrunn, L. The dynamics of living protoplasm. , Academic Press. (1956).
- Chambers, R., Chambers, E. Explorations into the nature of the living cell. , Harvard University Press. (1961).
- Bi, G. Q., Alderton, J. M., Steinhardt, R. A. Calcium-regulated exocytosis is required for cell membrane resealing. J. Cell Biol. 131, 1747-1758 (1995).
- Miyake, K., McNeil, P. L. Vesicle accumulation and exocytosis at sites of plasma membrane disruption. J. Cell Biol. 131, 1737-1745 (1995).
- Steinhardt, R. A., Guoqiang, B., Alderton, J. M. Cell membrane resealing by a vesicular mechanism similar to neurotransmitter release. Science. 263, 390-393 (1994).
- McNeil, P. L., Vogel, S. S., Miyake, K., Terasaki, M. Patching plasma membrane disruptions with cytoplasmic membrane. J. Cell Sci. 113, 1891-1902 (2000).
- Togo, T., Alderton, J. M., Bi, G. Q., Steinhardt, R. A. The mechanism of facilitated cell membrane resealing. J. Cell Sci. 112, 719-731 (1999).
- Rodriguez, A., Webster, P., Ortego, J., Andrews, N. W. Lysosomes behave as Ca2+-regulated exocytic vesicles in fibroblasts and epithelial cells. J. Cell Biol. 137, 93-104 (1997).
- Reddy, A., Caler, E., Andrews, N. Plasma membrane repair is mediated by Ca2+-regulated exocytosis of lysosomes. Cell. 106, 157-169 (2001).
- Jaiswal, J. K., Andrews, N. W., Simon, S. M. Membrane proximal lysosomes are the major vesicles responsible for calcium-dependent exocytosis in nonsecretory cells. J. Cell Biol. 159, 625-635 (2002).
- Chakrabarti, S., et al. Impaired membrane resealing and autoimmune myositis in synaptotagmin VII-deficient mice. J. Cell Biol. 162, 543-549 (2003).
- Walev, I., et al. Delivery of proteins into living cells by reversible membrane permeabilization with streptolysin-O. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 3185-3190 (2001).
- Iacovache, I., van der Goot, F. G., Pernot, L. Pore formation: an ancient yet complex form of attack. Biochim. Biophys. Acta. 1778, 1611-1623 (2008).
- Morgan, B. P., Campbell, A. K. The recovery of human polymorphonuclear leucocytes from sublytic complement attack is mediated by changes in intracellular free calcium. Biochem. J. 231, 205-208 (1985).
- Keefe, D., et al. Perforin triggers a plasma membrane-repair response that facilitates CTL induction of apoptosis. Immunity. 23, 249-262 (2005).
- Idone, V., et al. Repair of injured plasma membrane by rapid Ca2+-dependent endocytosis. J. Cell Biol. 180, 905-914 (2008).
- Bansal, D., et al. Defective membrane repair in dysferlin-deficient muscular dystrophy. Nature. 423, 168-172 (2003).
- McNeil, P. L., Miyake, K., Vogel, S. S. The endomembrane requirement for cell surface repair. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 4592-4597 (2003).
- Tam, C., et al. Exocytosis of acid sphingomyelinase by wounded cells promotes endocytosis and plasma membrane repair. J. Cell Biol. 189, 1027-1038 (2010).
- Weisleder, N., et al. Visualization of MG53-mediated cell membrane repair using in vivo and in vitro systems. J. Vis. Exp. (52), e2717 (2011).
- Tweten, R. K. Cholesterol-dependent cytolysins, a family of versatile pore-forming toxins. Infect. Immun. 73, 6199-6209 (2005).
- Zha, X., et al. Sphingomyelinase treatment induces ATP-independent endocytosis. J. Cell Biol. 140, 39-47 (1998).
- Buckley, J. T. Crossing three membranes. Channel formation by aerolysin. FEBS Lett. 307, 30-33 (1992).
- Parker, M. W., et al. Structure of the Aeromonas toxin proaerolysin in its water-soluble and membrane-channel states. Nature. 367, 292-295 Forthcoming.
- Yamaji-Hasegawa, A., et al. Oligomerization and pore formation of a sphingomyelin-specific toxin, lysenin. J. Biol. Chem. 278, 22762-22770 (2003).
