يعيش التصوير الفحص لتقييم أدوار كا<sup&gt; 2 +</sup&gt; وSphingomyelinase في إصلاح مسام تشكيل الجروح السمية

Christina Tam; Andrew R. Flannery; Norma Andrews

doi:10.3791/50531

يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

يعيش التصوير الفحص لتقييم أدوار كا

11.3K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/50531

⸱

أغسطس 25, 2013

Christina Tam¹ , Andrew R. Flannery¹ , Norma Andrews¹

¹Department of Cell Biology and Molecular Genetics, University of Maryland

في هذه المقالة

ملخص

تصوير حي من الخلايا المعرضة لصبغ محبة للدهون FM1-43 يسمح التحديد الدقيق للحركية التي يتم من خلالها إزالة السموم تشكيل المسام من غشاء البلازما. هذا هو مقايسة الحساسة التي يمكن استخدامها لتقييم متطلبات كا ^{2 +،} sphingomyelinase والعوامل الأخرى على إصلاح غشاء البلازما.

الملخص

إصابة غشاء البلازما هو الحدث بشكل متكرر، والجروح يتعين إصلاحه بسرعة لضمان البقاء على قيد الحياة الخلوية. تدفق كا ^{2 +} هو حدث يشير المفتاح الذي يقوم بتشغيل إصلاح الجروح الميكانيكية على غشاء البلازما داخل ~ 30 ثانية. وكشفت الدراسات الحديثة أن خلايا الثدييات أيضا ختم غشاء البلازما الخاصة بهم بعد permeabilization مع المسام تشكيل السموم في كا ^{2 +} التي تعتمد على عملية ينطوي على إيماس من sphingomyelinase حمض انزيم الليزوزومية تليها المسام الإلتقام. هنا، نحن تصف المنهجية المستخدمة لإثبات أن إعادة عزل الخلايا permeabilized من قبل O السم ستربتوليزين هو أيضا سريع وتعتمد على كا ^{2 +} تدفق. تصميم مقايسة يسمح تزامن هذا الحدث الضرر وقياس الحركية الدقيقة للقدرة الخلايا على استعادة سلامة غشاء البلازما عن طريق التصوير وقياس مدى الذي الصبغة liphophilic FM1-43 تصل إلى أغشية الخلايا. هذا المرض فحص الحيةس يسمح بتقييم الحساسة من قدرة خارجيا أضاف العوامل القابلة للذوبان مثل sphingomyelinase لمنع تدفق FM1-43، مما يعكس قدرة الخلايا على إصلاح غشاء البلازما الخاصة بهم. يسمح هذا الاختبار لنا لإظهار للمرة الأولى التي sphingomyelinase يعمل المصب من كا ^{2 +} إيماس التي تعتمد، منذ بالإضافة خارج الخلية من الانزيم يعزز إعادة عزل الخلايا permeabilized في غياب كا ^{2 +.}

المقدمة

وقد كان من المعروف لعدة عقود أن إصلاح غشاء البلازما بعد الإصابة الميكانيكية هو ^1،2 كا ^{2 +} التي تعتمد عملية. وأظهرت الدراسات فيما بعد أن كا ^{2 +} تدفق من خلال الجرح يطلق عملية نشطة من إيماس من الحويصلات داخل الخلايا في موقع الإصابة، وهو مطلوب لإعادة عزل ^3،4. تم استخدام معدل فقدان صبغة الفلورسنت تحميلها في سيتوبلازم الخلايا لتقييم سرعة إصلاح، وخلص إلى أن اكتمل إعادة عزل داخل <30 ثانية بعد الإصابة ^5. واقترحت في البداية نموذجين لشرح متطلبات إيماس في إصلاح غشاء البلازما: 1) نموذج "التصحيح"، مما يوحي بأن كا ^{2 +} تدفق من خلال الآفة يؤدي الانصهار في البداية مثلي النمط من ال....