Summary
Sanntids avbildning av celler eksponert for den lipofile fargestoff FM1-43 tillater nøyaktig bestemmelse av kinetikken ved hvilken poredannende toksiner blir fjernet fra plasmamembranen. Dette er en følsom analyse som kan brukes til å vurdere krav Ca 2 +, sphingomyelinase og andre faktorer på plasmamembranen reparasjon.
Abstract
Plasma membranskade er en hyppig hendelse, og sårene har til å bli hurtig utbedres for å sikre celle overlevelse. Tilstrømningen av Ca 2 + er en viktig signal hendelse som utløser reparasjon av mekaniske skader på plasma membranen innenfor ~ 30 sek. Nyere studier viser at pattedyrceller også forsegle sine plasmamembran etter permeabilization med pore danner giftstoffer i en Ca 2 +-avhengig prosess som involverer eksocytose av lysosomalenzymet syre sphingomyelinase fulgt av pore endocytose. Her beskriver vi metodene som er brukt for å vise at den forsegles av celler permeabilized av toksinet streptolysin O er også rask og avhengig av Ca 2 + tilstrømningen. Analysen utforming tillater synkronisering av skaden arrangement og en presis måling av kinetiske evne til å gjenopprette celler plasmamembranintegritet etter avbildning og kvantifisere omfanget hvorved liphophilic fargestoff FM1-43 nådd intracellulære membraner. Denne live analyse also tillater en følsom vurdering av evnen til eksogent tilsatt løselige faktorer som sphingomyelinase å inhibere FM1-43 strøm, som gjenspeiler evnen til cellene å reparere deres plasma membran. Denne analysen tillater oss å vise for første gang at sphingomyelinase opptrer nedstrøms av Ca 2 +-avhengige exocytose, siden ekstracellulære tilsetning av enzymet fremmer forsegles av celler permeabilized i fravær av Ca 2 +.
Introduction
Det har vært kjent i flere tiår at plasma membran reparasjon etter mekanisk skade er en Ca 2 +-avhengig prosess 1,2. Senere studier viste at Ca 2 + tilstrømningen gjennom såret utløser en kraftig prosess med eksocytose av intracellulære vesikler på stedet av skader, noe som er nødvendig for forsegles 3,4. Satsen for tap av et fluorescerende fargestoff lastet inn i cytoplasma av celler ble brukt til å vurdere hastigheten på reparasjon, og konkluderte med at forsegles ble fullført innen <30 sek etter skade fem. To modeller ble opprinnelig foreslått å forklare behovet for eksocytose i plasma membran reparasjon: 1) "patch"-modellen, som antydet at Ca 2 + tilstrømningen gjennom lesjonen utløser i utgangspunktet homotypic fusjon av intracellulære vesikler, danner en stor "patch" som ville deretter brukes på plasmamembranen til å forsegle såret 6 og 2) å redusere spenningen modellen, som foreslått at membranen added av Ca 2 +-avhengige exocytose i nærheten av såret ville redusere plasma membran spenning, tilrettelegging forsegles av bilayer 7.. Rollen av Ca 2 +-utløst eksocytose i plasma membran reparasjon ble ytterligere forsterket av studier som viser at lysosomes inneholde en Ca 2 + sensor molekyl, synaptotagmin VII, som forenkler deres eksocytose og plasma membran reparasjon i skadde celler 8,9,10,11 .
Imidlertid har ytterligere bevis indikerte at exocytose alene ikke var tilstrekkelig for å fremme plasma membran reparasjon. I tillegg til mekaniske tårer på plasmamembranen, er en vanlig form for celleskade permeabilization av poredannende toksiner produsert av bakterier 12,13 eller immunceller 14,15. I motsetning til mekaniske tårer, pore-dannende proteiner som setter seg på plasmamembranen danner en stabil, protein-foret porer som ikke kan lukkes igjen ved å anvende en membran "patch" eller ved reduksjoning membran spenning. Intriguingly studier vist at pattedyrcellene har en effektiv mekanisme for å reparere deres plasma membran etter permeabilization med pore-dannende proteiner, og denne prosessen krever også tilstedeværelse av ekstracellulær Ca 2 + 12. Dette funnet reist spørsmålet om hvorvidt transmembrane pore fjerning fra celleoverflaten var også en rask prosess, som observert med mekaniske sår 5. Overraskende, våre nyere studier viste at resealing av celler permeabilized med poredannende giftstoffer har svært like egenskaper som reparasjon av mekaniske sår: prosessen krever ekstracellulære Ca 2 +, og er fullført innen ~ 30 sek. Gransker denne prosessen i mer detalj, vi har nylig lært at i tillegg til Ca 2 +-regulert eksocytose av lysosomer, innebærer plasma membran reparere en rask form for endocytose, som er utløst av utgivelsen av lysosomalenzymet syre sphingomyelinase (ASM) og er avgjørende ikke bare for the fjerning av transmembrane porene, men også for reparasjon av mekaniske sår 16.
For å bestemme kinetikken av celle resealing etter permeabilization med poredannende proteiner, i vårt laboratorium vi tilpasset en direkte avbildning metodikk som hadde blitt brukt tidligere for å vurdere resealing av laser-skadet isolerte muskelfibre 17. Denne analysen er avhengig av egenskapene til den lipofile fargestoff FM1-43, som stabilt intercalates inn i den ytre paknings av lipid dobbeltlag øker i fluorescensintensiteten. Når plasma membranen bilayer blir forstyrret ekstracellulære fargestoff får tilgang til intracellulære membraner, som gir en følsom analyse for å påvise plasma membran skader og reparere 18,16,19,20. For å tilpasse denne assay for vurdering av cellen forsegles etter permeabilization med pore-dannende proteiner, vi pre-inkuberes cellene ved 4 ° C med den bakterielle toksin streptolysin O (SLO), som binder seg til membrankolesterol 21.. Synkron cellepermeabilization kan da lett oppnås ved å føre cellene fra isen for å varme medium i en oppvarmet objektbord, som aktiverer oligomerisering og forandring i konformasjon som fører til transmembrane poredannelse. En fordel med denne tilnærming, i de tidligere publiserte analyser ved hjelp av laser såret, er at et større antall celler kan bli analysert samtidig i en mikroskopisk felt, noe som gir bedre utvalg av cellepopulasjonen. Analysen vi beskriver her gitt mekanistiske likheter mellom cellen resealing prosessen sett etter mekanisk skade og permeabilization med poredannende giftstoffer, gir en meget allsidig og kraftig metode for å dissekere faktorer involvert i den grunnleggende prosessen med plasma membran reparasjon. Som et eksempel viser vi at det er mulig å bruke denne analysen å identifisere Ca 2 +-avhengige og uavhengige trinn av reparasjonsprosessen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Transcriptional stanse av ASM
- Seed 1,5 x 10 5 HeLa-celler i 2 ml DMEM vekstmedium (DMEM høy glukose med 10% føtalt bovint serum (FBS), 2 mM L-glutamin, 1% Penn-Strep) på 35 mm glassbunn retter (Mattek) og Inkuber over natten ved 37 ° C i en 5% CO 2 inkubator.
- På den påfølgende dagen, aspirer av vekstmedier og erstatte den med 2 ml DMEM redusert serum medium (DMEM med 4% FBS), minst en time før du legger den siRNA transfeksjon blanding.
- Forbered fire rør for siRNA oligo transfeksjon blanding. I rør A og C, tilsett 250 mL Optimem redusert serum og 4 mL Lipofectamine RNAiMax, per 35 mm rett til å bli tilført. I rør B, tilsett 250 mL Optimem redusert serum og 8 pl (160 pmol) av kontroll medium GC innhold oligo (kontroll siRNA), per 35 mm rett til å bli tilført. I rør D, legge 250 mL Optimem redusert serum og 8 pl (160 pmol) av SMPD1 oligo (siASM), per 35 mm fatet to bli tilført. Inkuber rørene ved romtemperatur i 5 min.
- Kombiner rør A og B for å danne transfeksjon kompleks for kontroll siRNA, og rør C og D for ASM siRNA. Inkuber reaksjonene ved romtemperatur i 20 min.
- Tilsett kontroll siRNA og ASM siRNA transfeksjon Reaksjonsblandingene sakte, dråpevis, i de respektive 35-mm glassbunn retter og inkuberes ved 37 ° C / 5% CO 2. På 24 timers post-transfeksjon, forsiktig aspirer av media og erstatte med frisk DMEM vekstmedier. For effektiv ASM knockdown, bør retter bli ytterligere inkubert ved 37 ° C / 5% CO2 i ca 31 timer (totalt 55 timer) før levende avbildning.
2. Forberedelse av reagenser for Levende Mikros
- Tilbered en oppløsning av rekombinant pore-dannende toksiner streptolysin O (SLO) ved en konsentrasjon på 100 ng / mL i kald 1 x PBS uten Ca2 + og Mg 2 +. Den SLO som brukes i disse assays er en constitutively aktive cystein mutant som ikke krever reduserende midler for aktivitet, vennligst gitt av Dr. Rod Tweten, University of Oklahoma. Giften ble uttrykt i E. coli BL21 DE3 og renset i henhold innfødte forhold, som beskrevet tidligere 16.
- Klargjør FM1-43 stamløsning: Resuspender FM1-43 frysetørret pulver i DMSO å lage en 25 mM løsning.
- Forbered Løsning A: Fortynn FM1-43 stamløsning i kaldt DMEM med Ca 2 + til en sluttkonsentrasjon på 4 pM (1,5 ml for per Mattek Skål) og lagre på is inntil de trengs.
- Forbered Løsning B: Fortynn FM1-43 stamløsning i kaldt DMEM uten Ca2 + og 10 mM EGTA (Ca 2 +-fri DMEM) til en sluttkonsentrasjon på 4 pM (1,5 ml trengs pr Mattek Skål) og lagre på is inntil nødvendig.
- Pre-varm (37 ° C) 1 ml alikvoter av Løsning A og løsning B i Eppendorf-rør.
- Hold på is løsninger av DMEM med Ca 2 +, og Cet 2 +-free DMEM.
Tre. Live-Cell Imaging av FM1-43 Tilstrømningen til SLO behandlede og ubehandlede celler
- Fyll en middels størrelse grunt metallbeholder med knust is, inverterer den inn i en stor glassbeholder med is, og legge til ytterligere is slik at bare den nederste overflate av metallbeholder utsettes for. Plasser et vått papirhåndkle på eksponert metall bunnen for å tillate enda termisk overføring.
- Ta en kontroll siRNA-behandlet Mattek fatet (Eksempel 1) og plasser den på kalde våte papirhåndkle. Forsiktig aspirer av alle medier og vaske 3x med kald Ca 2 +-free DMEM. Etter siste vask, aspirer av alle medier i fatet.
- Til bilde celle-forbundet FM1-43 i celler uten SLO såret (Eksempel 1) i nærvær av Ca 2 +, legge 180 mL av kaldt Løsning B til sentrum glass dekkglass av 35-mm glassbunn fatet og inkuberes i 5 min på is (tabell 1). Plasser Mattek fatet på scenen av en konfokalmikroskop varmes til 37 ° C og er utstyrt med et miljøkammer (som opprettholder temperatur, fuktighet og CO 2 nivåer). Finn feltet med celler som skal bli fotografert leter gjennom en 40X NA 1,3 objektiv (Nikon). Hvis tilgjengelig, slå på PerfectFocus eller en lignende enhet for å korrigere for termisk drift.
- Tilsett 1 ml av løsning A varmet forsiktig til den siden av den 35 mm fatet og erstatt lokket av miljøkammeret (tabell 1).
- Acquire bilder for 4 minutter ved en ramme hver 3 sek ved hjelp av egnet bildebehandlingsprogrammer (Volocity i Ultra Vox Perkin Elmer roterende disk konfokalmikroskopi system). Eksitasjon av FM1-43 er oppnådd med en 488 nm laser-linjen ved hjelp av et dikroisk filter med et 488 nm båndpass, og utslipps diskriminering oppnås ved bruk av en 527 (W55) emisjonsfilter. Laser effektnivåer og kameraets følsomhet er satt til å oppnå bilde eksponeringer av 100 msek.
- Gjenta trinn 3.2 til 3.6 for å detektere FM1-43 i kontroll siRNA-behandlede celler uten SLO såret (Eksempel 2) i fravær av Ca 2 +, bortsett fra at i trinn 3.5 Løsning B skal tilsettes (tabell 1).
- For å måle FM1-43 innstrømning i kontroll siRNA-behandlede celler såret med SLO enten i nærvær (Eksempel 3) eller fravær av Ca 2 + (Prøve 4), tilsett 180 ul kald løsning B som inneholder SLO til midten glass dekkglass i 35-mm glassbunn fatet og inkuberes i 5 minutter på isen som i trinn 3.3. Gjenta trinn 3.2 gjennom 3.6, justere legge enten Solution A eller Solution B på trinn 3,5 (Tabell 1).
- For å bestemme hvilken rolle ASM i plasma membran reparasjon, gjenta trinn 3.2 til 3.6 ved hjelp av ASM siRNA-behandlede celler for alle forhold (Samples 5-8) (Tabell 1).
- For å finne ut hvilken rolle av ekstracellulært rekombinant sphingomyelinase (SM) påKinetikken for plasma membran reparasjon (reflekteres av inhibering i FM1-43 strøm) (Prøvene 9-10), blir SM tilsatt (0-50 μU) til enten Løsning A Løsning B eller i trinn 3.5, og deretter tilsatt til cellene i løpet av levende celle avbildning i et totalt volum på 1 ml (tabell 1).
4. Kvantifisering av FM1-43 Tilstrømningen inn i celler
- Etter filmer har blitt kjøpt opp, måle den intracellulære fluorescens intensiteten av FM1-43 ved hjelp av bildeanalyse programvare (Volocity Suite, PerkinElmer). Tegn en region av interesse i den cytosoliske regionen i hver celle i feltet og bruke programvareverktøy for å bestemme den gjennomsnittlige FM1-43 fluorescens intensitet gjennom alle rammene i videoen.
- For å justere for variasjoner i den første FM1-43 flekker, er dataene for hver video uttrykt som fold økning i fluorescens intensitet over tid, og plottet for hver annen tilstand. Økning av fluorescens av hver enkelt endepunktet percelle er beregnet som F-T / F 0, hvor F T er den midlere fluorescens ved den bestemte endepunktet, og F 0 er den midlere fluorescens ved t = 0 (figurene 1-2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Lave konsentrasjoner av bakteriell sphingomyelinase (SM) redning plasma membran reparasjon i celler utarmet i lysosomal syre sphingomyelinase.
Ved hjelp av FM1-43 avbildning assay, vi tidligere viste at cellene som mangler for det lysosomale enzym ASM og utsatt for SLO såret i nærvær av Ca 2 + har en plasma membran defekt reddes av ekstracellulær tilsetning av det rekombinante humane enzym 19.. Siden den menneskelige lysosomal ASM har en lav pH-optimum, undersøkte vi hvorvidt forsegles kan også gjenopprettes legge SM renset fra Bacillus cereus (Sigma), som er fullt aktive ved nøytralt pH. Som tidligere vist, celler behandlet med kontroll siRNA eller ASM siRNA oligos og utsatt for SLO i fravær av Ca 2 + (forholdene ikke givende for reparasjon) ble like permeabilized, viser at ASM uttømming ikke forstyrrer følsomhet for toksinet (Figur 1A ). Interessant nok en full rednings of evne ASM-manglende celler å forsegle etter eksponering for SLO ble observert med lave konsentrasjoner av SM, 5 og 7,5 μU / ml (figur 1B). Som enzymkonsentrasjon tilsettes til mediet økes, var det en gradvis tap i rednings fenotypen - celler eksponert for 10 μU / ml bare delvis blokkert tilstrømningen av FM1-43 etter eksponering for SLO, og cellene utsettes for 50 μU / ml viste en sterk fargestoff tilstrømningen mønster, noe som reflekterer en full resealing defekt lik den som ble observert i ASM-utarmet celler (figur 1B og 1C). Dette resultatet tyder på at endocytic fjerning av SLO porene er strengt regulert av ceramid nivåene som genereres i plasmamembranen av SM - over et visst nivå i prosessen ikke finner sted på vanlig måte, og cellene kan ikke fjerne lesjoner.
Sphingomyelinase tillegg omgår kravet om Ca 2 + i plasma membran reparasjon.
Bemerkelsesverdig, tilsetning av bakteriell SM til celler permeabilized av SLO i fravær av Ca 2 + (vanligvis en tilstand som ikke tillater celle resealing) også reddet plasma membran reparasjon. Som sett i celler eksponert for den pore-dannende toksiner i nærvær av Ca 2 + (figurene 1B og 1C), bare lave konsentrasjoner av SM var effektiv i å blokkere tilstrømningen av FM1-43 (figur 2A og 2B). Disse resultatene indikerer at sphingomyelinase funksjoner nedstrøms av Ca 2 +-avhengige trinn i plasma membran reparasjon. Dette funnet er helt i tråd med våre tidligere foreslåtte modellen, som postulerer at Ca 2 + strømmer gjennom transmembrane porene utløser eksocytose av lysosomer og ASM utgivelsen, som kløyver sphingomyelin på den ytre vedlegget plasma membran, genererer ceramide og fremme pore fjerning av endocytose 22 , 19. Det faktum at tilsetningen av renset SM omgår behovet for Ca 2 + sterkt forsterkes den oppfatning at under fysiologiske forhold Ca 2 +-regulert eksocytose av lysosomer er kilden til sphingomyelinase aktivitet er nødvendig for å fremme endocytose.
Figur 1. Bacillus cereus sphingomyelinase (SM) kan utfylle plasma membran reparasjon defekt av celler forstummet for uttrykk av syre sphingomyelinase (ASM) såret av pore-forming toksin streptolysin O (SLO). HeLa celler behandlet med kontroll siRNA eller ASM siRNA oligos ble såret i fravær eller tilstedeværelse av Ca 2 + og tilstrømningen av lipofile fargestoff FM1-43 ble fotografert på en ramme / 3 sek for 4 min. FM1-43 intracellulære fluorescens ble kvantifisert ved hjelp av Volocity programvare og uttrykt som ganger økning i fluorescens-intensitet over tid. (A) I fravær av Ca 2 +, ble både kontroll siRNA og ASM siRNA-behandlede celler permeabilized av SLO. 18 til 27 celler ble analysert i hver tilstand,. Feilfelt svarer til den midlere + / - SEM (B) I nærvær av Ca 2 +-celler som ble behandlet med kontroll siRNA var i stand til å forsegle deres plasma membran og stoppe fargestoff tilstrømning, samtidig celler behandlet med ASM siRNA klarte å forsegle. I tillegg i nærvær av Ca 2 +, eksogene tilsetning av lave doser av sphingomyelinase utfyller plasma membran defekt ASM siRNA-behandlede celler. 18-62 celler ble analysert i hver tilstand, feilfelt tilsvarer gjennomsnittet + / - SEM (C) Valgt tidsrammer av filmen analysert i B.. Barer, 9 mikrometer. Klikk her for å se større figur .
g "alt =" Figur 2 "fo: content-width =" 3.25in "fo: src =" / files/ftp_upload/50531/50531fig2highres.jpg "/>
Figur 2. Sphingomyelinase tillegg omgår behovet for Ca 2 + i plasmamembranen reparasjon. HeLa-celler behandlet med kontroll siRNA ble såret med SLO i fravær av Ca 2 + og tilstrømningen av den lipofile fargestoff FM1-43 ble fotografert ved en ramme / 3 sek for fire min. FM1-43 intracellulære fluorescens ble kvantifisert ved hjelp av Volocity programvare og uttrykt som ganger økning i fluorescens-intensitet over tid. (A) Mangelen på plasmamembranen forsegles som normalt sees i cellene skadet med SLO i fravær av Ca 2 + reverseres ved eksogen tillegg lave doser av sphingomyelinase. 18-31 celler ble analysert i hver tilstand, feilfelt tilsvarer gjennomsnittet + / - SEM (B) Valgt tidsrammer av filmen analysert i A.. Barer, 9 mikrometer.g2large.jpg "target =" _blank "> Klikk her for å se større figur.
Figur 3. Prosedyre tidslinje. Tidslinje for de eksperimentelle skritt involvert i prosedyren. Klikk her for å se større figur .
| Ca2 +-tilstand | Ca2 +-fri tilstand | SLO toksin | Varm Solution A | Varm Løsning B | Sphingomyelinase | Prosedyre Trinn |
| + | - | - | + | - | - | 3.2 |
| - | + | - | - | + | - | 3.7 |
| + | - | + | + | - | - | 3,8 |
| - | + | + | - | + | - | 3,8 |
| + | - | - | + | - | - | 3,9 |
| - | + | - | - | + | - | 3,9 |
| + | - | + | + | - | - | 3,9 |
| - | + | + | - | + | - | 3,9 |
| - | + | + | - | + | + | 3.10 |
| + | - | + | + | - | + | 3.10 |
Tabell 1. Sammensetning av løsninger som brukes i den eksperimentelle prosedyre. Prøvene som er beskrevet i fremgangsmåten er listet i rekker. Kolonner betegne nærvær (+) eller fravær (-) av den navngitte komponent (oligo, Ca2 + eller Ca2 +-fritt medium, SLO, løsning A eller B, sphingomyelinase). De eksperimentelle trinn der disse prøvene er først brukes til live-cell imaging i Procedure § 3 er indikert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tidligere studier på mekanisk skade og plasma membran reparasjon stolt på ulike mekanismer for å skade celler, alt fra slippe glassperler, micropipetting, klipping, riper eller skraper. Avlesning av alle disse analysene var kvalitativ snarere enn kvantitativ, og ikke gi presis informasjon om kinetikken av reparasjonsmekanismen. Muligheten av celler for å forsegle deres plasma membran etter at disse former for skade ble målt i nærvær eller fravær av sporstoff tilsatt i ekstracellulær væske i cytoplasma, gjennomtrengning av membranen ugjennomtrengelig fargestoffer, tap av cytosoliske enzymer, ATP-nivåer, eller langvarig cellular overlevelse. Selv om flere av disse analysene kan utføres kvantitativt, en stor hindring i disse studiene var det problemer med å synkronisere såret hendelsen, mens raskt vurdere kinetikken av forsegles på celle-nivå.
Utvikling og bruk av UV-laser skade av muskelfibre Followed ved påvisning av tilstrømningen av lipofile fargestoff FM1-43 var et stort fremskritt i disse studiene 17,20. I stedet for den brutto skade påført til hele cellepopulasjon ved skraping eller lignende mekaniske organer for skade disse assays innført en mer definert måte å vikles celler som tillot enkeltcelleanalyse. Imidlertid forble flere problemer i slike assays. Størrelsen av laser-induserte lesjoner er stort og ganske variabel avhengig av laserintensitet, og meget forskjellige i karakter enn de former for membranskade som oppstår under fysiologiske betingelser. Et annet problem er at bare én celle eller muskel fiber kan bli såret på en gang ved hjelp av mikroskop-forbundet lasere, redusere antall forsegles hendelser som kan følges, og dermed statistisk signifikans av resultatene. Disse problemer med reproduserbarhet og sampling sterkt redusert nytten av laserskade som en metode for å undersøke mekanismer for plasma membran reparasjon.
To løse disse problemene, har vi utviklet en ny live cell imaging analyse for å presist måle reparasjonskinetikk av plasma membran lesjoner forårsaket av bakterielle poredannende giftstoffer. Dette er en form for skade som forekommer ofte i naturen, siden mange mikrober besitter en rekke giftstoffer som er i stand til å permeabilizing membranen av eukaryote celler. Denne assay kan bli nøyaktig synkronisert ved pre-inkubering av cellene med toksinet ved lave temperaturer, og tillater et stort antall av celler i en mikroskopisk felt som skal analyseres for tilstrømningen av FM1-43, ettersom temperaturen økes for å utløse poredannelse.
Den nøyaktige synkronisering av pore-dannelse oppnås med denne analysen tillater reproduserbare målinger av plasma membran reparasjon kinetikk, som kan kvantifiseres samtidig i flere enkeltceller innen det mikroskopiske feltet. En viktig teknisk faktor i disse assays er kvaliteten på mikroskopobjektivlinsen som skal brukes for avbildning. THan 40X NA 1,3 (Nikon) objektiv brukt i våre analyser gir en tilstrekkelig prøvetaking av celler i en befolkning uten å miste bildeoppløsning. Bytte til en 10X objektiv ville tillate et større utvalg av cellen befolkningen, men oppløsningen som er oppnådd er utilstrekkelig for riktig kvantifisering av intracellulær FM1-43. Et kritisk trinn for levende celle avbildning assay er bruken av PerfectFocus eller en lignende anordning for å korrigere for termisk drift. Vår fremgangsmåte krever pre-binding av bakteriell pore-dannende toksiner til cellene på is og deretter forskyve temperaturen raskt til 37 ° C i levende celle avbildning. Denne temperaturjustering vil føre aksiale fokus svingninger i bildeinnhentingsperioden, og må korrigeres. PerfectFocus eller en lignende enhet vil løse dette problemet slik at live-cell imaging av et valgt fokusplan over lengre tid, og dermed gir presis kvantifisering av plasma membran reparasjon kinetikk.
En nøkkel tilsuksessen med denne analysen er å alltid titer forskjellige konsentrasjoner av den pre-forming toksin for å bestemme repareres og ikke-reparerbare doser, siden dette kan variere for hver gruppe med toksin brukt. Aktiviteten av flere giftstoffer, og av SLO i særdeleshet, er temperaturfølsom, og flere fryse-tiner sykluser er til skade for dens aktivitet. Men titreringer utført sammen i hvert forsøk tillate riktig toksin dose å være nøyaktig bestemt i bare noen få minutter av gangen-lapse bildebehandling.
Denne analysen er avhengig av deteksjon av tilstrekkelig intracellulær FM1-43 fluorescens etter plasma membran skade. Dette kan være begrensende under visse forutsetninger. Etter å ha satt inn i membraner SLO former porer med en diameter på omtrent 30 nm, slik at for sterk Ca 2 +-innstrømning og en hurtig plasma membran reparasjonsrespons i eukaryote celler. Imidlertid pore-dannende toksiner som danner mindre lesjoner, slik som aerolysin og lysenin som har porediametere på omtrent1-3 nm 23 til 25 mai ikke være tilstrekkelig for denne analysen fordi de kan resultere i utilstrekkelig Ca 2 + og FM1-43 tilstrømningen.
Selv bruker en gift som genererer store porer som SLO, er det viktig å huske på at dette bildebehandling analysen ikke tillater absolutt kvantifisering av fluorescens intensitet, men snarere relativ fluorescens. Således, er det kritisk at avbildning utføres innenfor intrascene dynamiske område for det digitale kameraet. Siden fluorescensintensiteten påvirkes av laserkraft, eksponeringstiden, og kamera forsterkning, er det viktig å sette disse tre parametre ved begynnelsen av hvert forsøk, ved å utføre innledende avbildning av celler behandlet med FM1-43 og SLO i både reparasjons-og non -reparasjon forhold (Ca 2 + eller Ca 2 +-free medium). Dette gjør at valg av bilde kjøp innstillinger som gjør at fluorescens deteksjon ved tid null (før SLO tillegg), men ikke fører til detektoren metning (som determstilt ved bruk av programvare avlesning) ved slutten av anskaffelses under ikke-reparasjons-forhold.
Ved hjelp av denne analysen, var vi i stand til å demonstrere at SLO porene er fjernet fra plasma membran av pattedyrceller på mindre enn 30 sekunder, noe som viser at denne prosessen har en rask kinetikk som ligner på reparasjon av mekaniske sår 16. Senere studier viste at lysosomalenzymet ASM er nødvendig for plasma membran reparasjon, og i stand til å gjenopprette forsegles da lagt ekstracellulært til ASM-mangelfull celler 19. I den foreliggende undersøkelse har vi benyttet følsomheten til FM1-43 tilstrømningen assay for å vise, for første gang, kan den plasma membran reparasjon også forekomme i fravær av ekstracellulær Ca 2 +. Eksponering av sårede celler til rekombinant sphingomyelinase var tilstrekkelig til å fremme forsegles i cellene permeabilized av SLO i Ca 2 + gratis medium, en tilstand som normalt ikke ettergivende for plasma membran reparasjon. Interessant, ferdigstiltføringen av plasmamembranen reparere kapasitet ble ikke observert etter eksponering for høye konsentrasjoner av sphingomyelinase, noe som tyder på at mengden av ceramid som genereres av dette enzymet på den ytre paknings av plasmamembranen er en viktig determinant av lesjonen fjerningen. Dette funnet viser at Ca 2 + er nødvendig for å utløse lysosomal eksocytose trinn, men er ikke nødvendig for sphingomyelinase-indusert endocytose som er ansvarlig for sår internalisering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer de har ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av NIH tilskudd R37 AI34867 og R01 GM064625 til NWA Vi takker Dr. R. Tweten fra University of Oklahoma for SLO ekspresjonsplasmid.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| HeLa 229 cell line | ATCC | CCL2-1 | |
| DMEM High Glucose | Invitrogen | 11965 | |
| DMEM High Glucose No Calcium | Invitrogen | 20168 | |
| FM1-43 | Invitrogen | T3163 | |
| Optimem Reduced Serum | Invitrogen | 31985 | |
| Lipofectamine RNAiMax | Invitrogen | 13778 | |
| Control medium GC content RNAi oligo | Invitrogen | 12935300 | |
| SMPD1 RNAi oligo | Invitrogen | HSS143988 | |
| Fetal Bovine Serum Heat-inactivated | Gemini-Bioproducts | 100-106 | |
| Sphingomyelinase from Bacillus cereus | Sigma | S7651 | |
| 35 mm-glass bottom dishes | MatTek | P35G-0-14 | |
| Material | |||
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| Camera | Hamamatsu Photonics | C9100-50 | |
| Spinning disk confocal microscope | PerkinElmer | UltraViewVoX | |
| Software analysis software | PerkinElmer | Volocity Suite | |
| Environmental chamber | Pathology Devices | LiveCell System Chamber | |
References
- Heilbrunn, L. The dynamics of living protoplasm. , Academic Press. (1956).
- Chambers, R., Chambers, E. Explorations into the nature of the living cell. , Harvard University Press. (1961).
- Bi, G. Q., Alderton, J. M., Steinhardt, R. A. Calcium-regulated exocytosis is required for cell membrane resealing. J. Cell Biol. 131, 1747-1758 (1995).
- Miyake, K., McNeil, P. L. Vesicle accumulation and exocytosis at sites of plasma membrane disruption. J. Cell Biol. 131, 1737-1745 (1995).
- Steinhardt, R. A., Guoqiang, B., Alderton, J. M. Cell membrane resealing by a vesicular mechanism similar to neurotransmitter release. Science. 263, 390-393 (1994).
- McNeil, P. L., Vogel, S. S., Miyake, K., Terasaki, M. Patching plasma membrane disruptions with cytoplasmic membrane. J. Cell Sci. 113, 1891-1902 (2000).
- Togo, T., Alderton, J. M., Bi, G. Q., Steinhardt, R. A. The mechanism of facilitated cell membrane resealing. J. Cell Sci. 112, 719-731 (1999).
- Rodriguez, A., Webster, P., Ortego, J., Andrews, N. W. Lysosomes behave as Ca2+-regulated exocytic vesicles in fibroblasts and epithelial cells. J. Cell Biol. 137, 93-104 (1997).
- Reddy, A., Caler, E., Andrews, N. Plasma membrane repair is mediated by Ca2+-regulated exocytosis of lysosomes. Cell. 106, 157-169 (2001).
- Jaiswal, J. K., Andrews, N. W., Simon, S. M. Membrane proximal lysosomes are the major vesicles responsible for calcium-dependent exocytosis in nonsecretory cells. J. Cell Biol. 159, 625-635 (2002).
- Chakrabarti, S., et al. Impaired membrane resealing and autoimmune myositis in synaptotagmin VII-deficient mice. J. Cell Biol. 162, 543-549 (2003).
- Walev, I., et al. Delivery of proteins into living cells by reversible membrane permeabilization with streptolysin-O. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 3185-3190 (2001).
- Iacovache, I., van der Goot, F. G., Pernot, L. Pore formation: an ancient yet complex form of attack. Biochim. Biophys. Acta. 1778, 1611-1623 (2008).
- Morgan, B. P., Campbell, A. K. The recovery of human polymorphonuclear leucocytes from sublytic complement attack is mediated by changes in intracellular free calcium. Biochem. J. 231, 205-208 (1985).
- Keefe, D., et al. Perforin triggers a plasma membrane-repair response that facilitates CTL induction of apoptosis. Immunity. 23, 249-262 (2005).
- Idone, V., et al. Repair of injured plasma membrane by rapid Ca2+-dependent endocytosis. J. Cell Biol. 180, 905-914 (2008).
- Bansal, D., et al. Defective membrane repair in dysferlin-deficient muscular dystrophy. Nature. 423, 168-172 (2003).
- McNeil, P. L., Miyake, K., Vogel, S. S. The endomembrane requirement for cell surface repair. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 4592-4597 (2003).
- Tam, C., et al. Exocytosis of acid sphingomyelinase by wounded cells promotes endocytosis and plasma membrane repair. J. Cell Biol. 189, 1027-1038 (2010).
- Weisleder, N., et al. Visualization of MG53-mediated cell membrane repair using in vivo and in vitro systems. J. Vis. Exp. (52), e2717 (2011).
- Tweten, R. K. Cholesterol-dependent cytolysins, a family of versatile pore-forming toxins. Infect. Immun. 73, 6199-6209 (2005).
- Zha, X., et al. Sphingomyelinase treatment induces ATP-independent endocytosis. J. Cell Biol. 140, 39-47 (1998).
- Buckley, J. T. Crossing three membranes. Channel formation by aerolysin. FEBS Lett. 307, 30-33 (1992).
- Parker, M. W., et al. Structure of the Aeromonas toxin proaerolysin in its water-soluble and membrane-channel states. Nature. 367, 292-295 Forthcoming.
- Yamaji-Hasegawa, A., et al. Oligomerization and pore formation of a sphingomyelin-specific toxin, lysenin. J. Biol. Chem. 278, 22762-22770 (2003).
