Summary
Beeldvorming van levende cellen blootgesteld aan de lipofiele kleurstof FM1-43 maakt nauwkeurige bepaling van de kinetiek waarmee poriënvormende toxines worden verwijderd uit de plasmamembraan. Dit is een gevoelige test die kan worden gebruikt om vereisten voor Ca 2 +, sphingomyelinase en andere factoren plasmamembraan reparatie beoordelen.
Abstract
Plasmamembraan letsel is een frequente gebeurtenis en wonden snel worden gerepareerd cellulaire overleven. Instroom van Ca2 + is een belangrijke signalerende gebeurtenis die de reparatie van mechanische wonden veroorzaakt op het plasmamembraan binnen ~ 30 sec. Recente studies toonden aan dat zoogdiercellen hun plasmamembraan sluit ook na permeabilisatie met porievormende toxinen in een Ca2 +-afhankelijk proces dat exocytose van het lysosomale enzym zure sphingomyelinase gevolgd door endocytose poriën omvat. Hier beschrijven we het gebruik aan te tonen dat het opnieuw afdichten van de cellen permeabel gemaakt door het toxine streptolysine O is snel en afhankelijk van Ca2 + influx methodologie. Het testontwerp kan synchronisatie van de schade gebeurtenis en een nauwkeurige kinetische meting van het vermogen van cellen om plasmamembraan integriteit herstellen door beeldvorming en kwantificeren van de mate waarin de liphophilic kleurstof FM1-43 intracellulaire membranen bereikt. Deze live test ALSo kan een gevoelige beoordeling van het vermogen van exogeen oplosbare factoren zoals sphingomyelinase toegevoegd FM1-43 influx remt, die het vermogen van cellen om hun plasmamembraan herstellen. Deze test liet ons te tonen voor de eerste keer dat sphingomyelinase handelt stroomafwaarts van Ca2 +-afhankelijke exocytose, omdat extracellulaire toevoeging van het enzym bevordert opnieuw afdichten van de cellen permeabel in afwezigheid van Ca2 +.
Introduction
Het is bekend voor enkele tientallen jaren dat plasmamembraan herstel na mechanische letsel is een Ca 2 +-afhankelijk proces 1,2. Latere studies toonden aan dat Ca2 + influx door de wond veroorzaakt een krachtig proces van exocytose intracellulaire blaasjes op de plaats van letsel, die nodig is voor het opnieuw afdichten 3,4. Het verlies van een fluorescente kleurstof in het cytoplasma van cellen opgeladen werd gebruikt om de snelheid van herstel beoordelen en concludeerde dat opnieuw afdichten is binnen <30 sec na verwonding 5. Twee modellen werden in eerste instantie voorgesteld om de eis voor exocytose in plasmamembraan reparatie uit te leggen: 1) de "patch"-model, dat suggereerde dat Ca 2 + influx door het letsel veroorzaakt aanvankelijk homotypische fusie van intracellulaire blaasjes, de vorming van een grote "patch" Dat zou vervolgens toegepast op het plasmamembraan naar de wond 6 en 2) de spanning verminderen model, dat dat membraan Adde voorgestelde sluitd door Ca2 +-afhankelijke exocytose in de nabijheid van de wond zou plasmamembraan spanning te verminderen, vergemakkelijken opnieuw afdichten van de bilaag 7. De rol van Ca2 +-geactiveerd exocytose bij plasmamembraan reparatie werd verder versterkt door studies die aantonen dat lysosomen bevatten Ca 2 + sensor molecule, synaptotagmin VII, waarin hun exocytose en plasmamembraan reparatie beschadigde cellen vergemakkelijkt 8,9,10,11 .
Echter aanvullend bewijs aangegeven dat exocytose niet voldoende was om plasmamembraan kan herstellen. Naast mechanische tranen op het plasmamembraan, frequente vorm van celbeschadiging is permeabilisatie door poriënvormende toxinen geproduceerd door bacteriën 12,13 of immuuncellen 14,15. In tegenstelling tot mechanische tranen, porievormende eiwitten plaatst zichzelf op de plasmamembraan de vorming van een stabiele,-eiwit gevoerde porie die niet zomaar kunnen worden afgesloten door een membraan "patch" of door verminderinging membraan spanning. Intrigerend studies blijkt dat zoogdiercellen een efficiënt mechanisme om hun plasmamembraan herstellen na permeabilisatie met porie-vormende eiwitten, en dit proces vereist ook de aanwezigheid van extracellulair Ca 2 + 12. Deze bevinding de vraag opgeworpen of transmembraan porie verwijdering uit het celoppervlak was ook een snel proces, zoals waargenomen met mechanische wonden 5. Verrassenderwijs onze recente studies aangetoond dat het opnieuw afdichten van de cellen permeabel gemaakt met poriënvormende toxinen zeer vergelijkbare eigenschappen aan de reparatie van mechanische wonden: het proces vereist extracellulair Ca 2 +, en is binnen ~ 30 sec. Onderzoeken deze werkwijze nader we onlangs vernomen dat naast Ca 2 +-gereguleerde exocytose van lysosomen, plasmamembraan reparatie omvat een snelle vorm van endocytose, die wordt veroorzaakt door de afgifte van lysosomale enzym zure sphingomyelinase (ASM) en is essentieel niet alleen voor ee verwijdering van transmembraan poriën, maar ook voor het herstel van mechanische wonden 16.
Om de kinetiek van cel nieuwe sluiting na permeabilisatie met porievormende eiwitten te bepalen, in ons laboratorium hebben we aangepast een live imaging methode die eerder had gebruikt om opnieuw afdichten van geïsoleerde-laser gewond spiervezels 17 beoordelen. Deze test is gebaseerd op eigenschappen van de lipofiele kleurstof FM1-43, die stabiel intercaleert in de buitenste laag van lipide bilagen verhoging in fluorescentie-intensiteit. Wanneer de plasmamembraan dubbellaag verstoord extracellulaire kleurstof toegang krijgt tot intracellulaire membranen, die een gevoelige test voor plasmamembraan letsel detecteren en repareren 18,16,19,20. Om deze test te passen voor de beoordeling van de cel opnieuw sluiten na permeabilisatie met poriën vormende eiwitten, we pre-cellen geïncubeerd bij 4 ° C met bacteriële toxine streptolysine O (SLO), dat bindt aan cholesterol membraan 21. Synchrone celpermeabilisatie kan vervolgens eenvoudig worden bereikt door het verplaatsen van de cellen van ijs verwarmen medium in een verwarmde microscoop fase die de oligomerisatie en verandering in conformatie die leidt tot de vorming van transmembraan porie activeert. Een voordeel van deze benadering op de eerder gepubliceerde tests met laser verwonding is dat een groter aantal cellen tegelijk kan worden geanalyseerd in een microscopisch veld, betere bemonstering van de celpopulatie. Gezien de overeenkomsten tussen de mechanistische cel nieuwe sluiting proces gezien na mechanische verwonding en permeabilisatie met porievormende toxinen, de test hier beschreven verschaft een zeer veelzijdige en krachtige werkwijze voor het ontleden van factoren betrokken bij het fundamentele proces van plasmamembraan reparatie. Als voorbeeld wordt aangetoond dat het mogelijk is om deze test te gebruiken om Ca2 + afhankelijke en onafhankelijke stappen van het reparatieproces te identificeren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Transcriptionele silencing van ASM
- Zaad 1,5 x 10 5 HeLa-cellen in 2 ml DMEM kweekmedium (DMEM hoog glucose met 10% foetaal runderserum (FBS), 2 mM L-glutamine, 1% Penn-Strep) op 35 mm glazen bodem gerechten (MatTek) en incubeer overnacht bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator.
- Op de volgende dag, aspireren van de groei media en vervang deze door 2 ml DMEM gereduceerd serum medium (DMEM met 4% FBS), ten minste 1 uur voor het toevoegen van de siRNA transfectie mengsel.
- Bereid 4 buizen voor de siRNA oligo transfectie mengsel. In de buizen A en C, voeg 250 pl Optimem verlaagde serum en 4 pi Lipofectamine RNAiMax, per 35 mm schaal worden getransfecteerd. In buis B, voeg 250 ul van Optimem verminderde serum en 8 pi (160 pmol) of control medium GC inhoud oligo (Control siRNA), per 35 mm schaal worden getransfecteerd. In buis D, voeg 250 ul van Optimem verminderde serum en 8 pi (160 pmol) van SMPD1 oligo (asme), per 35 mm schaal to worden getransfecteerd. Incubeer de buizen bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
- Combineer buizen A en B om de transfectie complex voor controle siRNA, en buizen C en D voor de ASM siRNA vormen. Incubeer de reactie bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten.
- Voeg de controle siRNA en ASM siRNA transfectie reactiemengsels langzaam druppelsgewijs in de respectievelijke 35 mm glazen bodem gerechten en incubeer bij 37 ° C / 5% CO2. Op 24 uur na transfectie, Zuig voorzichtig uit de media en te vervangen door vers DMEM groeimedia. Voor een efficiënte ASM knockdown dient de vaat verder geïncubeerd bij 37 ° C / 5% CO2 gedurende 31 uur (totaal 55 uur) voor levende beeldvorming.
2. Bereiding van reagentia voor Live microscopie
- Bereid een oplossing van recombinant poriënvormende toxine streptolysine O (SLO) bij een concentratie van 100 ng / ul in koud 1x PBS zonder Ca2 + en Mg2 +. De SLO gebruikt in deze assays een constitutively actieve cysteïne mutant die niet vereist reductiemiddelen activiteit, vriendelijk verschaft door Dr Rod Tweten, University of Oklahoma. Het toxine werd uitgedrukt in E. coli BL21 DE3 en gezuiverd onder natieve omstandigheden, zoals hiervoor 16 beschreven.
- Bereid de FM1-43 stockoplossing: Hersuspenderen FM1-43 gevriesdroogd poeder in DMSO om een 25 mM oplossing te creëren.
- Bereid Oplossing A: Verdun de FM1-43 voorraadoplossing in koude DMEM met Ca2 + tot een eindconcentratie van 4 uM (1,5 ml nodig per MatTek schaal) en bewaar op ijs totdat het nodig is.
- Bereid Oplossing B: Verdun de FM1-43 voorraadoplossing in koude DMEM zonder Ca2 + en 10 mM EGTA (Ca 2 +-vrij DMEM) tot een uiteindelijke concentratie van 4 pM (1,5 ml nodig per MatTek schaal) en bewaar op ijs tot nodig.
- Voorverwarmen (37 ° C) 1 ml aliquots van oplossing A en oplossing B in Eppendorf buizen.
- Blijf op ijs oplossingen van DMEM met Ca 2 +, en C2 +-vrij DMEM.
3. Live cell imaging van FM1-43 Instroom in SLO behandelde en onbehandelde cellen
- Vul een middelgrote ondiepe metalen container met crushed ijs, keer het in een grote glazen bak met ijs, en voeg extra ijs waardoor alleen de onderkant van de metalen container blootgesteld. Leg een natte papieren handdoek op de blootgestelde metalen bodem te zorgen voor gelijkmatige warmtestroom.
- Neem een controle siRNA behandelde MatTek gerecht (monster 1) en plaats het op de koude natte papieren handdoek. Aspireren voorzichtig uit alle media en was 3x met koud Ca 2 +-vrij DMEM. Na de laatste wasbeurt, zuigen uit alle media in de schotel.
- Om het celgebonden FM1-43 in cellen zonder SLO verwonding (monster 1) in aanwezigheid van Ca2 +, voeg 180 ul koude oplossing B naar het centrum glazen dekglaasje van 35 mm glazen bodem schaal en incubeer gedurende 5 min op ijs (tabel 1). Plaats MatTek schotel op het podium van een confocale microscoop verwarmd tot 37 ° C en voorzien van een klimaatkamer (welke temperatuur, vochtigheid en CO2 vasthoudt). Zoek het gebied van cellen die zal worden afgebeeld die door een 40X NA 1.3 objectief (Nikon). Indien beschikbaar, zet PerfectFocus of een soortgelijk instrument om te corrigeren voor thermische drift.
- Voeg 1 ml voorverwarmde oplossing A zachtjes aan de zijkant van de 35-mm schaal en plaats cover van klimaatkamer (tabel 1).
- Acquire beelden gedurende 4 min bij 1 beeld per 3 seconden met behulp van geschikte imaging software (Volocity in de UltraView Vox Perkin Elmer draaiende schijf confocale microscopie-systeem). Excitatie van FM1-43 wordt bereikt met een 488 nm laser lijn met behulp van een dichroic filter met een 488 nm band pass, en discriminatie emissie wordt bereikt door gebruik van een 527 (W55) emissie-filter. Laservermogen niveaus en camera gevoeligheid ingesteld op de foto om de blootstelling van 100 msec bereiken.
- Herhaal stap 3,2-3,6 detecteren FM1-43 in control siRNA behandelde cellen zonder SLO verwonding (monster 2) in afwezigheid van Ca2 +, behalve dat in stap 3,5 Oplossing B worden toegevoegd (Tabel 1).
- Om FM1-43 instroom meten in controle siRNA behandelde cellen gewonden met SLO, hetzij in aanwezigheid (Monster 3) of afwezigheid van Ca 2 + (monster 4), voeg 180 ul van koude Oplossing B SLO naar het centrum glazen dekglaasje van de 35-mm glazen bodem schaal en incubeer gedurende 5 minuten op ijs zoals in stap 3.3. Herhaal stap 3,2 tot 3,6; passen voegen ofwel Oplossing A en Oplossing B bij stap 3.5 (tabel 1).
- Om de rol van ASM in plasmamembraan reparatie bepalen, herhaalt u de stappen 3,2-3,6 behulp van ASM-siRNA behandelde cellen voor alle omstandigheden (Monsters 5-8) (tabel 1).
- Om de rol van extracellulaire recombinant sphingomyelinase (SM) op het bepalenkinetiek van plasmamembraan reparatie (gereflecteerd door de remming in FM1-43-instroom) (Monsters 9-10), SM wordt toegevoegd (0-50 uE) om ofwel Oplossing A of Oplossing B in stap 3.5 en vervolgens aan cellen toegevoegd tijdens levende cellen beeldvorming in een totaal volume van 1 ml (tabel 1).
4. Kwantificering van FM1-43 Instroom in cellen
- Na films zijn verworven, het meten van de intracellulaire fluorescentie-intensiteit van FM1-43 met behulp van beeldanalyse-software (Volocity Suite, PerkinElmer). Teken een gebied van belang in het cytosolische gebied van elke cel in het veld en de software toepassing op de gemiddelde FM1-43 fluorescentie-intensiteit in alle frames van de video te bepalen.
- Om corrigeren voor variaties in de oorspronkelijke FM1-43 kleuring, de data voor elke video wordt uitgedrukt als voudige toename in fluorescentie-intensiteit in de tijd en uitgezet voor elke andere toestand. De voudige toename in fluorescentie van elk tijdspunt percel wordt berekend als F T / V 0, waarbij F T de gemiddelde fluorescentie op specifieke tijdpunt en F 0 is de gemiddelde fluorescentie bij t = 0 (figuren 1-2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Lage concentraties van bacteriële sfingomyelinase (SM) redding plasmamembraan reparatie in cellen waaruit lysosomale zuur sfingomyelinase.
De FM1-43 imaging test toonden eerder we cellen deficiënt voor het lysosomale enzym ASM en blootgesteld aan SLO verwonding in aanwezigheid van Ca2 + een plasmamembraan defect wordt gered door extracellulaire toevoeging van recombinant menselijk enzym 19. Aangezien de menselijke lysosomale ASM heeft een lage pH-optimum hebben we onderzocht of opnieuw afdichten kan ook worden hersteld voegen SM gezuiverd uit Bacillus cereus (Sigma), dat volledig actief bij neutrale pH. Zoals eerder aangetoond, cellen behandeld met controle siRNA of ASM siRNA oligo en blootgesteld aan SLO in afwezigheid van Ca2 + (voorwaarden niet tolerant voor reparatie) waren even gepermeabiliseerd, waaruit blijkt dat ASM uitputting niet interfereert met gevoeligheid voor het toxine (Figuur 1A ). Interessant is dat een volledige redding of het vermogen van ASM-deficiënte cellen sluit na blootstelling aan SLO werd waargenomen bij lage concentraties van SM, 5 en 7,5 uE / ml (Figuur 1B). Aangezien de enzymconcentratie toegevoegd aan het medium verhoogd, was er een geleidelijk verlies bij de redding fenotype - cellen blootgesteld aan 10 uE / ml uitsluitend gedeeltelijk verstopt de instroom van FM1-43 na blootstelling aan SLO en cellen blootgesteld aan 50 uE / ml toonde een sterke kleurstof instroom patroon, als gevolg van een volledig nieuwe sluiting defect vergelijkbaar met dat in-ASM uitgeputte cellen (figuren 1B en 1C). Dit resultaat suggereert dat endocytische verwijderd SLO poriën wordt strak gereguleerd door de ceramide niveaus de plasmamembraan die door SM - boven een bepaald niveau het proces niet normaal optreden, en cellen niet de laesies verwijdert.
Sfingomyelinase Bovendien omzeilt de eis voor Ca 2 + in plasmamembraan reparatie.
Opmerkelijk toevoeging van bacteriële SM cellen permeabel gemaakt door SLO in afwezigheid van Ca2 + (gewoonlijk een aandoening die cel opnieuw sluiten niet mogelijk) ook gered plasmamembraan reparatie. Zoals in cellen blootgesteld aan de poriënvormende toxine in aanwezigheid van Ca2 + (figuren 1B en 1C), slechts lage concentraties SM effectief in het blokkeren instroom van FM1-43 waren (Figuur 2A en 2B). Deze resultaten geven aan dat sphingomyelinase functies stroomafwaarts van de Ca2 +-afhankelijke stap plasmamembraan reparatie. Deze bevinding is volledig in overeenstemming met onze eerder voorgestelde model, waarin wordt gesteld dat Ca 2 + stroomt door transmembraan poriën triggers exocytose van lysosomen en ASM release, die splitst sphingomyelin op de buitenste laag van het plasmamembraan, het genereren van ceramide en het bevorderen poriën verwijdering door endocytose 22 , 19. Het feit dat toevoeging van gezuiverd SM omzeilt de noodzaak van Ca 2 + aanzienlijk versterkens dat onder fysiologische omstandigheden Ca 2 +-gereguleerde exocytose van lysosomen is de bron van de sphingomyelinase activiteit moeten endocytose bevorderen.
Figuur 1. Bacillus cereus sfingomyelinase (SM) kan het plasmamembraan reparatiedefect cellen zwijgen opgelegd voor expressie van zuur sfingomyelinase (ASM) gewond door de porievormende toxine streptolysine O (SLO). HeLa cellen behandeld met controle siRNA of ASM siRNA oligo's aanvullen werden gewond in de afwezigheid of aanwezigheid van Ca2 + influx en de lipofiele kleurstof FM1-43 is afgebeeld op 1 beeld / 3 seconden voor 4 minuten. FM1-43 intracellulaire fluorescentie werd gekwantificeerd middels Volocity software en uitgedrukt als voudige toename in fluorescentie-intensiteit in de tijd. (A) in Aangezien Ca2 +, zowel controle siRNA en ASM siRNA behandelde cellen werden gepermeabiliseerd door SLO. 18-27 cellen werden geanalyseerd in elke toestand;. Foutbalken overeen met het gemiddelde + / - SEM (B) in de aanwezigheid van Ca2 +, cellen behandeld met controle siRNA konden hun plasmamembraan sluit en stop kleurstof instroom, terwijl cellen behandeld met ASM siRNA niet opnieuw te verzegelen. Bovendien in aanwezigheid van Ca2 +, exogene toevoeging van lage doses van sphingomyelinase vult de plasmamembraan defect van ASM siRNA behandelde cellen. 18-62 cellen werden geanalyseerd in elke conditie; fout corresponderen met het gemiddelde + / - SEM (C) Geselecteerde tijd frames van de film in B geanalyseerd.. Bars, 9 micrometer. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
g "alt =" Figuur 2 "fo: content-width =" 3.25in "fo: src =" / files/ftp_upload/50531/50531fig2highres.jpg "/>
Figuur 2. Sphingomyelinase Bovendien omzeilt het vereiste van Ca2 + in plasmamembraan reparatie. HeLa cellen behandeld met controle siRNA gewonden met SLO in afwezigheid van Ca2 + influx en van de lipofiele kleurstof FM1-43 is afgebeeld op lijst 1/3 sec 4 min. FM1-43 intracellulaire fluorescentie werd gekwantificeerd middels Volocity software en uitgedrukt als voudige toename in fluorescentie-intensiteit in de tijd. (A) Het ontbreken van plasmamembraan opnieuw afdichten normaal gezien in cellen benadeeld SLO in afwezigheid van Ca2 + wordt omgekeerd door de exogene toevoeging van lage doses sfingomyelinase. 18-31 cellen werden geanalyseerd in elke conditie; fout corresponderen met het gemiddelde + / - SEM (B) Geselecteerde tijd frames van de film in A geanalyseerd.. Bars, 9 micrometer.g2large.jpg "target =" _blank "> Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.
Figuur 3. Procedure tijdlijn. Tijdlijn voor de experimentele stappen die betrokken zijn in de procedure. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
| Ca 2 +-toestand | Ca2-+ gratis conditie | SLO toxine | Warme oplossing A | Warm Oplossing B | Sfingomyelinase | Procedure Stap |
| + | - | - | + | - | - | 3.2 |
| - | + | - | - | + | - | 3.7 |
| + | - | + | + | - | - | 3.8 |
| - | + | + | - | + | - | 3.8 |
| + | - | - | + | - | - | 3.9 |
| - | + | - | - | + | - | 3.9 |
| + | - | + | + | - | - | 3.9 |
| - | + | + | - | + | - | 3.9 |
| - | + | + | - | + | + | 3.10 |
| + | - | + | + | - | + | 3.10 |
Tabel 1. Samenstelling van de oplossingen die in de experimentele procedure. Monsters zoals beschreven in de procedure worden vermeld in rijen. Kolommen duiden op de aanwezigheid (+) of afwezigheid (-) van de genoemde component (oligo, Ca 2 + of Ca 2 +-vrij medium, SLO, Solution A of B, sfingomyelinase). De experimentele stappen waarin deze monsters eerst worden gebruikt voor live cell imaging in de procedure Afdeling 3 zijn aangegeven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Eerdere studies op mechanische schade en plasmamembraan reparatie vertrouwd op diverse mechanismen van het verwonden van cellen, variërend van het laten vallen van glazen kralen, micropipetteren, scheren, krassen of schuren. Het uitlezen van al deze testen was kwalitatieve dan kwantitatieve, en heeft nauwkeurige informatie over de kinetiek van de reparatie-mechanisme niet geven. Het vermogen van cellen om hun plasmamembraan gesloten worden deze vormen van schade werd gemeten door de aanwezigheid of afwezigheid van tracers toegevoegd aan de extracellulaire vloeistof in het cytoplasma perforatie van membraan impermeabele kleurstoffen, verlies van cytosolische enzymen, ATP of langdurige cellulaire overleving. Hoewel verscheidene van deze testen kunnen kwantitatief worden uitgevoerd, een belangrijk obstakel in deze studies was het moeilijk synchroniseren van de verwonding gebeurtenis, terwijl snel beoordelen van de kinetiek opnieuw sluiten op enkele cel.
De ontwikkeling en toepassing van UV-laser letsel spiervezels volgende opwed door detectie van de instroom van de lipofiele kleurstof FM1-43 was een belangrijke stap vooruit in deze studies 17,20. In plaats van de bruto schade toegebracht aan de gehele celpopulatie door schrapen of op dergelijke mechanische wijze van verwonding, deze testen introduceerde een meer gedefinieerde manier om cellen die single cell analyse toegestaan wond. Echter, enkele problemen bleven dergelijke testen. De omvang van laser-geïnduceerde laesies is groot en zeer variabel, afhankelijk laserintensiteit en zeer verschillend van aard dan de vormen van membraan schade die tijdens fysiologische omstandigheden. Een ander probleem is dat slechts een cel of spierweefsel kan worden verwond tegelijk met-microscoop geassocieerde lasers, vermindering van het aantal opnieuw sluiten gebeurtenissen die kunnen worden gevolgd, en dus de statistische significantie van de resultaten. Deze problemen met reproduceerbaarheid en bemonstering sterk verminderd de bruikbaarheid van laser schade als methode om mechanismen plasmamembraan reparatie onderzoeken.
To aanpakken van deze problemen, ontwikkelden we een nieuwe live cell imaging test om de reparatie kinetiek van plasmamembraan letsels veroorzaakt door bacteriële porievormende toxines precies te meten. Dit is een vorm van schade die vaak voorkomt in de natuur, omdat veel microben bezitten talrijke toxines die kunnen permeabilisatie het membraan van eukaryote cellen. Deze test kan nauwkeurig worden gesynchroniseerd door vooraf incuberen van de cellen met het toxine bij lage temperaturen, en kan een groot aantal cellen in een microscopisch veld worden geanalyseerd op influx van FM1-43, als de temperatuur wordt verhoogd tot porievorming activeren.
De exacte synchronisatie van porie-vorming verkregen met deze assay maakt reproduceerbare metingen van de plasmamembraan reparatie kinetiek, die gelijktijdig kunnen worden gekwantificeerd in meerdere afzonderlijke cellen in het microscopische gebied. Een belangrijke technische factor in deze testen is de kwaliteit van de microscoop objectieflens wordt gebruikt voor de beeldvorming. Thij 40X NA 1,3 (Nikon) doelstelling in onze assays maakt een voldoende bemonstering van cellen in een populatie zonder verlies van resolutie. Omschakelen naar een 10X objectief zou een grotere steekproef van de celpopulatie toelaten, maar de resolutie die bereikt is onvoldoende voor kwantificering van intracellulaire FM1-43. Een kritische stap hiervoor live cell imaging test is het gebruik van PerfectFocus of een soortgelijke inrichting te corrigeren voor thermische drift. De procedure vereist pre-binding van bacteriële poriënvormende toxine cellen op ijs en vervolgens snel verschuiven van de temperatuur tot 37 ° C gedurende live cell imaging. Deze temperatuur aanpassing zal axiale aandacht schommelingen veroorzaken tijdens het beeld acquisitie periode, en moet worden gecorrigeerd. PerfectFocus of een soortgelijk apparaat zal dit probleem waardoor live cell imaging van een geselecteerde focal plane gedurende langere tijd te corrigeren, waardoor nauwkeurige kwantificering van de plasmamembraan reparatie kinetiek.
Een sleutel totHet succes van deze test is om altijd titer verschillende concentraties van de voorvormen toxine herstelbare en onherstelbare doses bepalen, aangezien dit kan variëren voor elke partij toxine gebruikt. De activiteit van vele toxinen, en SLO vooral temperatuurgevoelig is en meerdere vries-dooi cycli zijn schadelijk voor de activiteit. Echter, titraties uitgevoerd naast in elk experiment, zodat de juiste dosis toxine precies in slechts een paar minuten van time-lapse imaging worden bepaald.
Deze test berust op de detectie van voldoende intracellulaire FM1-43 fluorescentie na plasmamembraan letsel. Dit kan beperkend onder bepaalde omstandigheden. Na het plaatsen in membranen SLO vormen poriën met een diameter van ongeveer 30 nm, waardoor robuuste Ca2 + influx en een snelle plasmamembraan reparatiereactie in eukaryote cellen. Echter, porie-vormende toxinen dat kleinere letsels, zoals aerolysin en Lysenin die poriediameters van ongeveer een formulier1-3 nm 23-25 mei niet geschikt zijn voor deze test, omdat ze kan leiden tot onvoldoende Ca 2 + en FM1-43 instroom.
Zelfs met behulp van een toxine dat grote poriën zoals SLO genereert, is het belangrijk om in gedachten te houden dat deze beeldvorming test niet mogelijk voor absolute kwantificering van fluorescentie-intensiteit, maar relatieve fluorescentie. Het is dus essentieel dat beeldvorming wordt uitgevoerd binnen het intrascene dynamische bereik van de digitale camera. Omdat de fluorescentie-intensiteit wordt beïnvloed door laservermogen, belichtingstijd en camera krijgen, is het belangrijk dat deze drie parameters aan het begin van elk experiment door het uitvoeren van voorafgaande beeldvorming van cellen behandeld met FM1-43 en SLO zowel herstel als niet -reparatie voorwaarden (Ca 2 + of Ca 2 +-vrij medium). Dit maakt de keuze van beeldopname instellingen fluorescentiedetectie mogelijk op tijdstip nul (vóór SLO toevoeging) maar niet tot verzadiging detector (zo bepaald tenined door software uitlezing) aan het einde van de overname onder niet-reparatie voorwaarden.
Met deze test konden wij aantonen dat SLO poriën uit de plasmamembraan van zoogdiercellen in minder dan 30 seconden, waaruit blijkt dat deze werkwijze een snelle kinetiek vergelijkbaar met de reparatie van mechanische wonden 16. Latere studies toonden aan dat het lysosomale enzym ASM is nodig voor plasmamembraan reparatie, en kunnen herstellen opnieuw afdichten wanneer extracellulair toegevoegd aan ASM-deficiënte cellen 19. In deze studie hebben we geprofiteerd van de gevoeligheid van de FM1-43 influx assay tonen, voor het eerst, dat kan plasmamembraan Repair ook in afwezigheid van extracellulair Ca2 +. Blootstelling van gewonde cellen recombinant sfingomyelinase was voldoende om te bevorderen opnieuw sluiten in cellen permeabel door SLO in Ca 2 +-vrij medium, een voorwaarde normaal niet tolerant voor plasmamembraan reparatie. Interessant, compleuitvoering van het plasmamembraan herstelcapaciteit werd niet waargenomen na blootstelling aan hoge concentraties sphingomyelinase, wat suggereert dat de hoeveelheid ceramide geproduceerd door dit enzym op de buitenste laag van het plasmamembraan is een belangrijke determinant van de laesie verwijderingsproces. Deze bevinding toont aan dat Ca2 + moet de lysosomale stap exocytose veroorzaken, maar is niet noodzakelijk voor de sphingomyelinase geïnduceerde endocytose dat verantwoordelijk is voor wond internalisatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door NIH subsidie R37 AI34867 en R01 GM064625 naar NWA Wij danken dr. R. Tweten van de Universiteit van Oklahoma voor de SLO expressie plasmide.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| HeLa 229 cell line | ATCC | CCL2-1 | |
| DMEM High Glucose | Invitrogen | 11965 | |
| DMEM High Glucose No Calcium | Invitrogen | 20168 | |
| FM1-43 | Invitrogen | T3163 | |
| Optimem Reduced Serum | Invitrogen | 31985 | |
| Lipofectamine RNAiMax | Invitrogen | 13778 | |
| Control medium GC content RNAi oligo | Invitrogen | 12935300 | |
| SMPD1 RNAi oligo | Invitrogen | HSS143988 | |
| Fetal Bovine Serum Heat-inactivated | Gemini-Bioproducts | 100-106 | |
| Sphingomyelinase from Bacillus cereus | Sigma | S7651 | |
| 35 mm-glass bottom dishes | MatTek | P35G-0-14 | |
| Material | |||
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| Camera | Hamamatsu Photonics | C9100-50 | |
| Spinning disk confocal microscope | PerkinElmer | UltraViewVoX | |
| Software analysis software | PerkinElmer | Volocity Suite | |
| Environmental chamber | Pathology Devices | LiveCell System Chamber | |
References
- Heilbrunn, L. The dynamics of living protoplasm. , Academic Press. (1956).
- Chambers, R., Chambers, E. Explorations into the nature of the living cell. , Harvard University Press. (1961).
- Bi, G. Q., Alderton, J. M., Steinhardt, R. A. Calcium-regulated exocytosis is required for cell membrane resealing. J. Cell Biol. 131, 1747-1758 (1995).
- Miyake, K., McNeil, P. L. Vesicle accumulation and exocytosis at sites of plasma membrane disruption. J. Cell Biol. 131, 1737-1745 (1995).
- Steinhardt, R. A., Guoqiang, B., Alderton, J. M. Cell membrane resealing by a vesicular mechanism similar to neurotransmitter release. Science. 263, 390-393 (1994).
- McNeil, P. L., Vogel, S. S., Miyake, K., Terasaki, M. Patching plasma membrane disruptions with cytoplasmic membrane. J. Cell Sci. 113, 1891-1902 (2000).
- Togo, T., Alderton, J. M., Bi, G. Q., Steinhardt, R. A. The mechanism of facilitated cell membrane resealing. J. Cell Sci. 112, 719-731 (1999).
- Rodriguez, A., Webster, P., Ortego, J., Andrews, N. W. Lysosomes behave as Ca2+-regulated exocytic vesicles in fibroblasts and epithelial cells. J. Cell Biol. 137, 93-104 (1997).
- Reddy, A., Caler, E., Andrews, N. Plasma membrane repair is mediated by Ca2+-regulated exocytosis of lysosomes. Cell. 106, 157-169 (2001).
- Jaiswal, J. K., Andrews, N. W., Simon, S. M. Membrane proximal lysosomes are the major vesicles responsible for calcium-dependent exocytosis in nonsecretory cells. J. Cell Biol. 159, 625-635 (2002).
- Chakrabarti, S., et al. Impaired membrane resealing and autoimmune myositis in synaptotagmin VII-deficient mice. J. Cell Biol. 162, 543-549 (2003).
- Walev, I., et al. Delivery of proteins into living cells by reversible membrane permeabilization with streptolysin-O. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 3185-3190 (2001).
- Iacovache, I., van der Goot, F. G., Pernot, L. Pore formation: an ancient yet complex form of attack. Biochim. Biophys. Acta. 1778, 1611-1623 (2008).
- Morgan, B. P., Campbell, A. K. The recovery of human polymorphonuclear leucocytes from sublytic complement attack is mediated by changes in intracellular free calcium. Biochem. J. 231, 205-208 (1985).
- Keefe, D., et al. Perforin triggers a plasma membrane-repair response that facilitates CTL induction of apoptosis. Immunity. 23, 249-262 (2005).
- Idone, V., et al. Repair of injured plasma membrane by rapid Ca2+-dependent endocytosis. J. Cell Biol. 180, 905-914 (2008).
- Bansal, D., et al. Defective membrane repair in dysferlin-deficient muscular dystrophy. Nature. 423, 168-172 (2003).
- McNeil, P. L., Miyake, K., Vogel, S. S. The endomembrane requirement for cell surface repair. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 4592-4597 (2003).
- Tam, C., et al. Exocytosis of acid sphingomyelinase by wounded cells promotes endocytosis and plasma membrane repair. J. Cell Biol. 189, 1027-1038 (2010).
- Weisleder, N., et al. Visualization of MG53-mediated cell membrane repair using in vivo and in vitro systems. J. Vis. Exp. (52), e2717 (2011).
- Tweten, R. K. Cholesterol-dependent cytolysins, a family of versatile pore-forming toxins. Infect. Immun. 73, 6199-6209 (2005).
- Zha, X., et al. Sphingomyelinase treatment induces ATP-independent endocytosis. J. Cell Biol. 140, 39-47 (1998).
- Buckley, J. T. Crossing three membranes. Channel formation by aerolysin. FEBS Lett. 307, 30-33 (1992).
- Parker, M. W., et al. Structure of the Aeromonas toxin proaerolysin in its water-soluble and membrane-channel states. Nature. 367, 292-295 Forthcoming.
- Yamaji-Hasegawa, A., et al. Oligomerization and pore formation of a sphingomyelin-specific toxin, lysenin. J. Biol. Chem. 278, 22762-22770 (2003).
