Summary
可广泛用于微型热泳（MST）无需纯化从细胞裂解液中的目标蛋白的结合亲和力的测定。该协议涉及过表达GFP融合蛋白，在非变性条件下的细胞裂解，MST信号检测在不同浓度的配体的存在下。
Abstract
蛋白质相互作用的定量表征是在几乎任何领域的生命科学，特别是药物发现至关重要。 K D测定所需要的现有的方法获得纯化的蛋白质，还代可以是费时和昂贵的。我们已经开发出一种测定结合亲和力的微尺度热泳（MST）协议，允许未经纯化的目标蛋白从细胞裂解液。该方法涉及过表达GFP的融合蛋白，在非变性条件下的细胞裂解。该方法应用到STAT3-GFP瞬时表达在HEK293细胞中的第一次，以确定具有不同序列的寡核苷酸的充分研究的转录因子的亲合性的。该协议是简单的，并且可以有各种不同的应用研究小分子，肽，DNA，RNA的蛋白质的相互作用，和对roteins。
Introduction
亲和力的分子间相互作用的定量表征是非常重要的生物医学研究在许多领域。约束力的解离常数（K D）是必不可少的，不仅在药物发现的，但也是一个重要的参数，表征任何生物系统中的任何二进制的相互作用。生化用于检测蛋白质-蛋白质相互作用的方法，如免疫沉淀和酵母双杂交筛选，不告知我们这些交互是多么紧张，而亲和定义，这是否存在特别复杂的给定条件下体内 。在药物发现过程中，结合法的发展是必要的，往往是最耗时的步骤之一。 杀敌测定最常用的方法包括荧光偏振，表面等离子体共振（SPR）技术，2放射配体结合，3温滴定量热平衡态，4透析（ED），超滤（UF），第5和超速离心（UC）。他们需要纯化的靶蛋白的数量显著。微量热泳（MST）是一个迅速发展的方法，该方法检测在一个微小的温度梯度定向的分子运动。任何更改的运动沿温度梯度的相对变化的生物分子导致的水合壳8，7 MST是用来确定结合亲和力，并已申请了荧光标记的蛋白质或荧光配体的配体结合研究靶蛋白。 9 MST允许直接在溶液中的相互作用的测量，而不需要固定到表面上（无固定技术）。实际上，任何有约束力的MST信号的变化是伴随着的大小变化，虽然从系统到系统的显着不同。对于检测MST分子运动，他们必须荧光NT。这种方法的主要限制，可以变成优势。如果在任何系统中作为GFP融合蛋白的表达，它是唯一的荧光分子，从而可以从细胞溶胞产物不经分离或无细胞表达系统研究。代约束条件允许以最少的文物的细胞裂解液中的主要挑战。在这里，我们描述了一个协议，可用于许多可溶性蛋白和膜蛋白的细胞裂解物的制备和MST实验。
STAT蛋白是潜在的胞质转录因子激活的酪氨酸磷酸化胞外信号响应和参与许多生物过程，包括免疫，造血，炎症，和发展10，在哺乳动物，STAT家族由STAT 1，2，3，4的，5A，5B，和6。所有激活的统计数据绑定到相同的DNA序列，所谓的气体图案，IFN-γ的激活序列。然而，transcri不同统计的ptional效果有很大的不同。11尽管在许多病理过程中的参与和广泛的研究，产生超过17,000出版物，K D STAT相互作用不同的DNA序列尚未确定。只有相对亲和力不同的统计变种天然气动机特点。11蛋白表达和纯化困难是表征统计的DNA结合选择性的主要障碍。虽然大多数研究都集中在“激活”的统计资料，这成了转录因子酪氨酸磷酸化，非磷酸化的统计（U-统计）转录调控作用的作用正在迅速崛起。 然而 ，这些机制的了解甚少，不清楚是否实际上U-统计与DNA结合，或通过与其他转录因子的相互作用行事。最近，我们已经表明，U-STAT3可以绑定到DNA顺序CES不同气图案具有更高的亲和力。13的发现具有重大意义，为我们理解这一重要蛋白质的生物学功能。我们应用微尺度热泳，确定相对亲和力STAT3气和AT丰富的寡核苷酸Ş+100（ 图4）。几乎相同的协议被用于不同的的STAT3的配位体，脂肽类抑制剂的结合在K D测定14否将关联的转录因子，作为阴性对照，使用GFP-STAT1结合从而证实选择性相互作用时，可检测到的。 14
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Protocol
1。细胞裂解液的制备
该协议的目的是，粘附细胞，任何GFP融合蛋白表达。所需的细胞数可以从低至10 6到多达20×10 6细胞，这取决于蛋白质表达的水平上。例如，裂解的HEK细胞过表达GFP-STAT3的准备处理10 T75烧瓶中生长的细胞裂解液用1毫升至70％附近汇合。然而，这种裂解液稀释150倍，以提供最佳的荧光水平MST实验。根据调查的性质和细胞内的蛋白质的本地化强烈地依赖于细胞裂解协议。超声描述如下，如果使用清洁剂，是不可取的，因为蛋白质的不稳定性，可能是最好的选择。不同的添加剂可以被添加到的裂解缓冲液中，以防止蛋白质修饰反应：乙二胺四乙酸防止磷酸化，钒酸钠抑制蛋白酪氨酸磷酸酶，所以dium氟化物是一种丝氨酸/苏氨酸磷酸酶抑制剂。
- 准备裂解液。对于下面的组合物易于提取胞浆蛋白效果很好的25mM三羟甲基氨基甲烷盐酸，pH值8.0，和蛋白酶抑制剂混合物稀释100倍（Sigma-Aldrich公司P2714，由2毫米AEBSF，0.3μM抑肽酶，130μM乌苯美司， 1 mM的EDTA，14微米E-64，1微米亮肽素）。另外，对于减可溶性蛋白，可以使用商业的RIPA缓冲液，蛋白酶抑制剂鸡尾酒和非变性洗涤剂。将缓冲区保持在冰上。
- 简要地用冰冷的PBS，用10毫升每T75烧瓶中的缓冲液洗涤细胞。细胞置于冰上5分钟，或直至细胞开始从烧瓶中分离。刮细胞与细胞刮刀，如果有必要分离。
- 悬浮细胞在10毫升冰冷的PBS和转移到预冷的14毫升圆底离心管。
- 沉淀细胞在4℃下以400〜600×g离心5分钟。结合细胞从几个瓶中，在这一点上我f需要。
- 删除PBS上清，加入200μl冰冷的裂解缓冲液重悬沉淀，将悬浮液转移到一个预先冷的1.5毫升的Eppendorf管。
- 细胞置于冰上，以减少局部过热。裂解细胞的3倍10秒的超声脉冲在30％幅度，用一个2-3毫米预冷尖。保持在表面之下的前端，以尽量减少起泡。使用洗涤剂时的缓冲区，并在冰上孵育30分钟，而不是省略这一步。
- 正确的裂解液，如果需要使用5 M氯化钠含有生理浓度盐（氯化钠100毫米）。
- 通过离心分离收集溶胞产物于4℃在26000×g离心10分钟。
- 确定最佳的溶胞产物稀释（在下面的第3节中所描述的）和所需的滴定（通常大约300μl的预稀释的溶胞产物）的细胞裂解液的量。
- 等分试样的溶胞产物和存储在温度适合接受调查的蛋白质（-80℃，在大多数情况下）。 </ OL>
- 由于蛋白 - 配体的相互作用依赖于缓冲液条件下，MST缓冲组合物的选择是基于一个特定系统的属性。它一般是有利的，至少两种不同的缓冲液进行测试。
- 准备5倍MST缓冲区。我们有很好的经验，这两种成分：的HEPES（250毫米HEPES，pH值7.4; 25毫米氯化镁2，500 mM氯化钠，0.25％NP-40）和三羟甲基氨基甲烷盐酸（250毫米三羟甲基氨基甲烷盐酸，pH值7.4，氯化钠750毫米，50毫米氯化镁2 0.05％吐温20）。此外，BSA（结合混合物在最后的5％）可以帮助防止粘连蛋白塑料管和玻璃毛细管。 NaN 3的（0.5毫摩尔），也可以包括在内，以防止微生物的生长。
- 选择LED的激励源，具有波长λ= 470nm的上MST仪器。
- 加载毛细血管与CE会提取稀释2倍和10倍，MST缓冲。
- 执行“查找毛细血管”的操作对MST仪器控制软件。在稀释的溶胞产物的最佳荧光范围是从400到1500荧光单位。
- 的配位体的最高浓度应该是至少20倍高于预期的解离常数。
- 最低的配位体的浓度应低于摩尔浓度的荧光蛋白。
- 将需要数（通常为10-16）0.5毫升低吸附离心管冰管架。移取25μl的的MST缓冲液每根管子的底部。股票的配位体溶液中加入25μl的第一桶ë键（＃1，配位体的最高浓度），并进行串行使用的管的其余部分的配位体的2倍稀释。保持机架配体冰样品。
- 慢慢地在冰上解冻细胞裂解液。
- 与MST缓冲液稀释的细胞裂解物的荧光靶蛋白的结合反应中，以提供最佳水平。最终蛋白质浓度应该是接近预期的K D或更低。最终的解决方案中，应调整，以取得必要数量的荧光计数。 GFP-STAT3的溶胞产物中的浓度的测定，该仪器校准的荧光素与帮助。绿色荧光蛋白的溶胞产物中的摩尔浓度测定使用荧光素和绿色荧光蛋白的荧光量子产率，0.85和0.61的比例分别为15。
- 选择LED激发源，λ= 470纳米在MST仪器。
- 地点0.5毫升低吸附管在TUBE机架对面配体连续稀释样品管。小心地加入15微升的细胞裂解物的每个管的底部。尽量不要接触管壁，避免样品损失。
- 的配位体的样品中加入15μl的最高浓度（＃1）到相应的管＃1与细胞裂解物。拌匀，改变枪头。重复此步骤，除了最后一个，这应该不含有配位体与管的其余部分。
- 最后一根试管中加入15μl的MST缓冲到拌匀。
- 填补约2/3的第一毛细管从管＃1的结合混合物，向中心倾斜移动至该溶液，并将其放置在毛细管的毛细管托盘＃1的位置（最近的位置的纸盒开口） 。重复此步骤，与其余毛细血管。毛细管两端可以插入较长的实验用蜡。
- 托盘放置里面MST仪器和关闭乐器的大门。
- 执行“查找毛细血管”命令让仪器的毛细血管，并找到准确的位置，测量荧光的样品。
- 的荧光信号强度的基础上，调整LED的功率（10-100％），使其到400-1,500个单位时间间隔。
- 点击“开始”按钮，执行热泳实验。可以选择一个以上的IR-激光功率的试验，以便找到特定的系统的最佳温度梯度。收藏毛细血管为同一组中的从2-3的运行数据，以确保测量的可重复性。它要花费10-12分钟运行一组16个毛细管。
- 打开分析软件。
- 加载的项目文件夹。在出现的信息运行浏览器，选择收集在一个特定的红外激光功率热泳曲线。有一个选项，收集各种条件下，如红外激光功率打开所有热泳的痕迹，LED p奥尔，温度，浓度等 。切换和关闭一次，然后选择任何曲线分析，实验的名称（点击）。
- 在的评价点数图“窗口中，选择T-跳热泳或热泳。确保正确定位，蓝色和红色的线条。要获得与标准偏差的平均点，选择“使用平均”或“区分运行”单独运行。
- 要绘制的解离常数合适的，选择“一般”，进入并修复标记的分子浓度值（检查一个合适的窗口“菜单中的”集中“广场），贴合的曲线。其标准差的K D值出现在一个单独的弹出信息窗口。山法绘制一个合适的，选择“一般”，希尔法，然后贴合的曲线。 EC 50的亲和力在这种情况下，其标准偏差值。 杀敌或山“边界”的特征时，也可以利用饱和在绑定状态没有达到。
- 保存在一个文本文件中，平均拟合数据传送到Excel。
- 剧情F 范数 （归一化荧光），ΔF 范数 （如果不同的实验进行比较，在归一化荧光的差异），或分数绑定（见下面的公式）作为分子浓度的未标记的（滴定）的函数。
2。 MST缓冲器选择和准备
3。优化裂解液稀释的测定
4。的优化配体的浓度范围的测定
请参阅配体浓度范围内估计的NanoTemper技术集中搜索工具。
5。细胞裂解液的制备和配体的稀释
6。微尺度热泳作用研究
7。微尺度的热泳数据分析
界的馏分（馏分在一个复杂的分子）=（千卡（C） - 未结合的）/（结合未结合的），其中，的千卡（C）是浓度C测定的热泳，未结合未结合的状态（当分子热泳在一个复杂的），并绑定是完全束缚态的热泳。
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Representative Results
测量非磷酸化STAT3的寡核苷酸结合蛋白的亲合性。
STAT3-GFP表达HEK293细胞，使用荧光标记的STAT3的DNA结合测定作为源。用RIPA缓冲液（20×10 6细胞/ ml）制备细胞裂解液。对于结合的研究，裂解物稀释150倍MST DNA的结合缓冲液中的荧光蛋白的结合反应（约20纳米），以提供最佳水平。未转染的HEK293细胞中已被用于评估的背景荧光，这被证明是不可探测的，即使在非稀释的溶胞产物。然而，背景荧光可更加显着，在其他表达系统，因而具有以被监视。滴定系列无配体组成的11约束力的混合物和裂解样品已经做好准备。每个样品中加入15μl稀释的细胞裂解液和15微升的寡核苷酸的解决方案不同concentrat离子。最终缓冲液的组成包括25毫米HEPES，pH值7.2，氯化钠50毫米，2.5毫米氯化镁2和0.025％NP-40。测量在标准治疗毛细血管上坝段NT.115仪器在室温下用50％的λ= 470 nm的红外激光功率和LED激发源。高电荷的寡核苷酸结合导致STAT3的温度梯度的流动性显着变化（ 图2）的。在图3中，热泳信号作为寡核苷酸的浓度的函数作图。每一数据点代表三次测量的平均值。 1.2.20的NanoTemper分析软件，以适应数据，并确定明显的K D值。的表观解离常数分别为37.9±1.0μM和23.3±0.6μMGAS和S 100（ 图4）。换人的A-to-G亲和力的S +100 MUT＃1（ 图4）急剧下降，而亩桑特小号+100 MUT＃2显示没有检测到的结合，从而确认序列选择性STAT3结合到S 100。令人惊讶的是，S +100序列显示稍微比天然气更严格的约束力在三个重复测量。
图1。实验的总体方案。 点击这里查看大图 。
图2。未处理的的GFP-STAT3的相互作用产生的热泳数据与AT富含寡核苷酸。稀释细胞裂解液里面比较纳克20 nM的GFP-STAT3的混合，与增加量的双链寡核苷酸（5'-AAAACAAAACGAAACAAACAAACTA）得到指定的配位体的浓度。数据的收集激光功率在50％和100％的LED。
图3。由可NanoTemper分析1.2.231软件生成的归一化荧光（热荧光/初始荧光）寡核苷酸浓度的函数绘制成结合曲线 。的蛋白质显示在绑定的荧光增加比未结合的状态。 Hill方程法纳入NanoTemper分析软件的数据都配使用。
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图4。 STAT3的结合不同序列的寡核苷酸。微尺度热泳结合测量STAT3-GFP燃气（K D = 37.9±1.0微米）（K D = 23.3±0.6微米），S 100，S +100突变体1（K D = 740±21μM）和S 2（没有约束力）100突变体。 STAT3-GFP的浓度保持恒定在约20纳米，和寡核苷酸的浓度从666变化到0.650μM。在归一化荧光的差异[‰]被描绘成的寡核苷酸的浓度的函数，以及曲线的的NanoTemper分析软件使用希尔法拟合。 3次测量误差棒代表标准错误。
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Discussion
蛋白表达和纯化是一个费 力和昂贵的步骤，然而，有必要由目前使用最多的方法测定相互作用的K D。 MST的应用可避免蛋白质纯化，从而大大简化和加快相互作用的定量表征。难以表达和纯化的蛋白质，如膜蛋白和转录因子的情况下特别显着的优点。
的主要限制和要求的MST是作为与绿色荧光蛋白融合的蛋白质的表达能力。然而，构建表达GFP融合人类和小鼠蛋白质的大多数是市售的。 GFP融合蛋白也广泛用于贩运和降解研究，从而可以MST研究与服务相结合的“双责”。
除了缺乏需要对蛋白P的urification，非常经济使用的所有试剂和缓冲组合物中的微小变化不敏感，MST提供等优点，相比传统方法杀敌决定。不像表面等离子体共振，基于MST的实验需要不到2小时，允许杀敌决心在更广泛的范围内，并不会受到表面固定工件。例如，我们无法确定K D STAT3的结合寡核苷酸SPR，虽然我们投入了大量的资金数额购买STAT3蛋白的纯化。 K D的相互作用是太高，这是经常出现的情况转录因子，并跌出的SPR实验的浓度范围。
滴定量热焓的变化都伴随着相互作用。这个限制不包括许多情况下。同时，改变在热泳流动，虽然做了很多不同值的二系统都不尽相同，绝大多数发生相互作用。的MST最大的优点之一是，它在各种缓冲液和容忍的洗涤剂，胶束，和bicelles系统中的存在。这个属性允许将它应用到膜蛋白，几乎是不可能通过其他方式学习。然而，必须谨慎使用，以避免清洁剂和胶束的含量和组成的变化，在滴定过程中与配位体。
还应该牢记，当使用所研究的蛋白的细胞提取物中可能存在的天然形式，这往往是一个复杂的与其它蛋白质，核酸，和辅因子。因此，结合亲和力可能是不同的，不涉及任何复杂的地层中的分离蛋白质。经常过度表达可滴定离开研究非绑定状态下的蛋白质分子的相互作用伙伴。这是试图实现的另一个原因细胞转染后，已经非常高的GFP融合蛋白的表达水平。其他难以控制的参数是翻译后修饰，也可以添加到系统的显着异质性。额外的限制是具有广泛的特异性和亲和性低，可以与多个蛋白的溶胞产物中存在大量或分子的细胞裂解物中存在的蛋白质和小分子的结合研究。 Wienken，CJ 等 。已经发现，K D由MST在大肠杆菌大肠杆菌提取物是超过一个数量级高于在一个缓冲区中的相互作用与IFN-γ与抗体9。效果可能被部分提取物的蛋白水解作用，因为并无蛋白酶抑制剂。小分子与血清白蛋白的结合也被发现改变相互作用研究杀敌 MST 9。
各色提取的功效也不同nt的蛋白质，根据细胞内的定位和物理 - 化学性质。因此，它是有帮助，尝试一些细胞裂解和蛋白的提取条件。细胞质的蛋白质，不使用洗涤剂，只是超声波细胞破碎经常产生非常好的产量和数据。同时，需要更广泛的膜蛋白提取条件的筛选与不同浓度和洗涤剂，脂肪胶束，或bicelles的的性质。洗涤剂含量减至最低，以避免影响亲和力。
尽管列出的限制，我们已经发现，MST研究的非纯化GFP的融合蛋白的许多蛋白质和配体类型的结合亲和力的定量是非常方便的。毫无疑问，在许多实验室的方法，广泛使用将有助于进一步拓宽了应用程序的基于MST-蛋白结合研究。
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Disclosures
作者宣称，他们有没有竞争经济利益。本出版物的内容并不一定反映卫生和人类服务部的观点或政策，也没有提及商号，商业产品，或组织由美国政府意味着赞同。
Acknowledgments
这部分工作是由院内研究项目由美国国立卫生研究院，美国国家癌症研究所癌症研究中心; NCI和黑腹滨鹬治疗之间的合作研究协议，美国癌症协会授予IRG 97-152-17 OT和联邦基金支持美国国家癌症研究所，美国国立卫生研究院，根据合同HHSN26120080001E。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RIPA buffer | Millipore | 20-188 | Other manufacturer's buffers work as well |
| Protease inhibitors cocktail | Sigma-Aldrich | P2714 | |
| Monolith NT.115 | NanoTemper Technologies GmbH | G008 | |
| Monolith NT.115 Capillary Tray | NanoTemper Technologies GmbH | T001 | |
| Monolith NT.115 Standard Treated Capillaries | NanoTemper Technologies GmbH | K002 | |
| NT Control software | NanoTemper Technologies GmbH | 2.0.2.29 | |
| NT Analysis software | NanoTemper Technologies GmbH | 1.4.27 | |
| Table-top refrigerated centrifuge | Eppendorf | 5417R | Other microtube refrigerated centrifuges providing |
| Protein LoBind Tube 0.5 ml | Eppendorf | 22431064 |
References
- Lea, W. A., Simeonov, A. Fluorescence polarization assays in small molecule screening. Expert. Opin. Drug Discov. 6, 17-32 (2011).
- Willander, M., Al-Hilli, S. Analysis of biomolecules using surface plasmons. Methods Mol. Biol. 544, 201-229 (2009).
- Hulme, E. C., Trevethick, M. A. Ligand binding assays at equilibrium: validation and interpretation. Br. J. Pharmacol. 161, 1219-1237 (2010).
- Ghai, R., Falconer, R. J., Collins, B. M. Applications of isothermal titration calorimetry in pure and applied research--survey of the literature from 2010. J. Mol. Recognit. 25, 32-52 (2012).
- Vuignier, K., Schappler, J., Veuthey, J. L., Carrupt, P. A., Martel, S. Drug-protein binding: a critical review of analytical tools. Analytical and Bioanalytical Chemistry. , 398-3953 (2010).
- Lebowitz, J., Lewis, M. S., Schuck, P. Modern analytical ultracentrifugation in protein science: a tutorial review. Protein Sci. 11, 2067-2079 (2002).
- Duhr, S., Braun, D. Why molecules move along a temperature gradient. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 19678-19682 (2006).
- Zillner, K., Jerabek-Willemsen, M., et al. Microscale thermophoresis as a sensitive method to quantify protein: nucleic acid interactions in solution. Methods Mol. Biol. 815, 241-252 (2012).
- Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis. Nat. Commun. 1, 100 (2010).
- Stark, G. R., Darnell, J. E. The JAK-STAT pathway at twenty. Immunity. 36, 503-514 (2012).
- Ehret, G. B., Reichenbach, P., et al. DNA binding specificity of different STAT proteins. Comparison of in vitro specificity with natural target sites. J. Biol. Chem. 276, 6675-6688 (2001).
- Yang, J., Stark, G. R.
- Timofeeva, O. A., Chasovskikh, S., et al. Mechanisms of unphosphorylated STAT3 transcription factor binding to DNA. J. Biol. Chem. 287, 14192-14200 (2012).
- Timofeeva, O. A., Tarasova, N. I., et al. STAT3 suppresses transcription of proapoptotic genes in cancer cells with the involvement of its N-terminal domain. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , (2013).
- Patterson, G., Day, R. N., Piston, D.
