Summary
thermophoresis microscale (MST) יכול להיות בשימוש נרחב לקביעת זיקה מחייבת ללא טיהור של חלבון המטרה מlysates התא. הפרוטוקול כולל ביטוי יתר של החלבון ה-GFP-התמזגו, תמוגה תא שבאינו denaturing תנאים, וזיהוי של אות MST בנוכחות ריכוזים שונים של ליגנד.
Abstract
אפיון כמותי של אינטראקציות חלבון חיוני כמעט בכל תחום של מדעי חיים, ובמיוחד גילוי סמים. רוב השיטות הקיימים כיום של נחישות D K דורשים גישה למטוהרי חלבון של עניין, דור אשר יכול להיות זמן רב ויקר. פיתחנו פרוטוקול המאפשר לקביעת זיקה מחייבת ידי thermophoresis microscale (MST) ללא טיהור של חלבון המטרה מlysates התא. השיטה כרוכה בביטוי יתר של החלבון ה-GFP, התמזגו ותמוגה תא שבאינו denaturing תנאים. יישום השיטה לSTAT3-GFP transiently מתבטא בתאי HEK293 אפשרו לקבוע בפעם הראשונה את הזיקה של גורם השעתוק למד היטב לoligonucleotides עם רצפים שונים. הפרוטוקול הוא פשוט, ויכול להיות מגוון רחב של יישומים לחקר אינטראקציות של חלבונים עם מולקולות קטנות, פפטידים, DNA, RNA, ו-proteins.
Introduction
אפיון כמותי של זיקה של אינטראקציות מולקולאריים חשוב בתחומים רבים של המחקר ביו. מחייבים ניתוק קבוע (K ד ') הוא חיוני לא רק בגילוי סמים, אבל הוא גם פרמטר חשוב באפיון של כל אינטראקציה בינארי בכל מערכת ביולוגית. שיטות המשמשות לזיהוי ביוכימיים של אינטראקציות בין חלבונים, כגון immunoprecipitation ושמרי מסכי שני היברידיים, לא להודיע לנו על כמה חזק הן אינטראקציות אלה, תוך זיקה מגדירה אם מורכב מסוים זה קיים בתנאים שניתנו in vivo. בתהליך גילוי תרופות, פיתוח assay מחייב הוא אחד ולעתים קרובות יש צורך בצעדים שדורשים זמן רב ביותר. שיטות נפוצות ביותר של נחישות D K כוללות קיטוב הקרינה, טכנולוגית 1 plasmon פני תהודה (SPR), 2 radioligand מחייב, 3 קלורימטריה טיטרציה איזוטרמי, 4 equilibriאום הדיאליזה (ED), 5 ultrafiltration (UF), 5 וultracentrifugation (UC). 6 כל אחד מהם דורשים כמויות משמעותיות של חלבון המטרה מטוהר. thermophoresis microscale (MST) הוא שיטה המתפתחת במהירות שמזהה תנועה בבימויו של מולקולות בשיפוע טמפרטורה מיקרוסקופית. כל שינוי של מעטפת הלחות של ביומולקולות תוצאה בשינוי יחסי של תנועה לאורך שיפוע הטמפרטורה. 7 MST משמש כדי לקבוע זיקות מחייבות ויושם ללימוד יגנד מחייב לחלבוני שכותרתו fluorescently או ligands ניאון לחלבון המטרה. 8, 9 MST מאפשר מדידה של אינטראקציות ישירות בפתרון ללא צורך בקיבוע למשטח (טכנולוגיה ללא קיבוע). למעשה, כל מחייב מלווה בשינוי בMST אות, אם כי גודלו של השינוי שונה ממערכת למערכת באופן משמעותי. לצורך זיהוי של תנועת מולקולה על ידי MST, הם צריכים להיות לזרוחNT. מגבלה העיקרית של השיטה זו ניתן להפוך ליתרון. אם חלבון מתבטא כהיתוך GFP בכל מערכת, זה יהיה רק מולקולת ניאון ובכך ניתן ללמוד ללא בידוד ממערכת ביטוי חופשי תא lysate התא או. הדור של lysates התא המאפשרים תנאים מחייבים עם ממצאים מינימאליים הוא האתגר הגדול. כאן אנו מתארים פרוטוקול של הכנת תא lysate וניסוי MST שיכול לשמש להרבה חלבונים מסיסים וקרום.
חלבוני STAT טמונים גורמי שעתוק cytoplasmic מופעלים על ידי זירחון טירוזין בתגובה לאותות תאיים, והם מעורבים בתהליכים ביולוגיים רבים, כולל חסינות, hematopoiesis, דלקת, ופיתוח. -10 ביונקים, משפחת STAT מורכבת מ1 STAT, 2, 3, 4 , 5A, 5B, ו -6. כל הנתונים הסטטיסטיים המופעלים ידועים להיקשר לאותו רצף ה-DNA, שנקרא כך מוטיב גז, IFN-גמא הופעל רצף. עם זאת, transcriהשפעות ptional של נתונים סטטיסטיים שונות הן שונים מאוד. 11 למרות המעורבות בתהליכים פתולוגיים רבים ומחקרים מקיפים מניב מעל 17,000 פרסומים, D K של אינטראקציות STAT עם רצפי DNA שונים לא נקבע. רק זיקה היחסית של נתונים סטטיסטיים שונים לגרסות שונות של מוטיב גז התאפיינה. 11 קשיים בביטוי חלבון וטיהור הם המכשולים העיקריים באפיון של ה-DNA המחייב סלקטיביות 'הסטטיסטיקה. על אף שרוב המחקרים התמקדו בתפקידו של סטטיסטיקה "מופעלת", שהפך לשם נרדף לגורם שעתוק Tyr-phosphorylated, התפקיד של נתונים סטטיסטיים שאינו phosphorylated (U-stats) ברגולציה של שעתוק מתגלה במהירות. 12 עם זאת, מנגנונים אלה הם הבינו היטב, ולא היה ברורים אם U-STATS ממש להיקשר לדנ"א או לפעול באמצעות אינטראקציות עם גורמי שעתוק אחרים. הראנו לאחרונה כי U-STAT3 יכול להיקשר ל-DNA sequenיש CES שונה ממוטיבי גז עם זיקה גבוהה אף יותר. 13 הממצא השלכות משמעותיות על ההבנה של התפקודים הביולוגיים של חלבון חשוב זה שלנו. יש לנו ליישם thermophoresis microscale לקבוע זיקות יחסיות של STAT3 לגז ו-AT עשיר oligonucleotide S 100 (איור 4). פרוטוקול כמעט זהה שימש במשך נחישות D K עבור קשירה של ליגנד STAT3 שונה, מעכב lipopeptide. 14 לא מחייב לגורם שעתוק קשור, ה-GFP-STAT1 ששימש כביקורת שלילית ניתן היה לזהות וכך אישר את הסלקטיביות של אינטראקציה. 14
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת lysate התא
פרוטוקול זה מיועד לתאים חסיד מבטאים כל חלבון ה-GFP-התמזגו. מספר תא צורך יכול לנוע בין נמוכה כמו 10 6 לרבים כמו 20 x 10 6 תאים, תלוי ברמת ביטוי חלבון. לדוגמה, lysate של HEK תאי overexpressing GFP-STAT3 הוכן על ידי טיפול בתאים שגודלו 10 T75 צלוחיות ליד 70% confluency עם מאגר תמוגה 1 מ"ל. עם זאת, lysate הזה היה צריך להיות מדולל של פי 150 על מנת לספק רמה אופטימלית של הקרינה לניסוי MST. פרוטוקול תמוגה תא תלוי בחום על המאפיינים והלוקליזציה תאית של החלבון נחקר. אם אתם משתמשים בחומרי ניקוי אינו רצוי בגלל חוסר יציבות חלבון, sonication מתואר להלן, יכול להיות הבחירה הטובה ביותר. ניתן להוסיף תוספים שונים למאגר תמוגה כדי למנוע תגובות שינוי חלבון: EDTA מונע זרחון, vanadate נתרן מעכב phosphatases חלבון טירוזין, כךפלואוריד dium הוא מעכב של phosphatases Ser / Thr.
- הכן מאגר תמוגה. לחלבוני cytoplasmic קלים כדי לחלץ-ההרכב הבא עובד היטב: 25 מ"מ טריס HCl, pH 8.0, ומעכבי פרוטאז קוקטייל מדולל פי 100 (סיגמא אולדריץ P2714, בהיקף של 2 מ"מ AEBSF, 0.3 מיקרומטר Aprotinin, bestatin מיקרומטר 130, 1 mM EDTA, 14 מיקרומטר E-64, leupeptin 1 מיקרומטר). לחלופין, לחלבונים פחות מסיסים, אפשר להשתמש חיץ Ripa מסחרי עם פרוטאז קוקטייל מעכבים וחומרי ניקוי שאינו denaturing. שמור על החיץ על קרח.
- שטוף תאים לזמן קצר עם PBS קר כקרח באמצעות 10 מ"ל של חיץ לכל בקבוק T75. שמרו את התאים על קרח במשך 5 דקות, או עד שתאים מתחילים ניתוק מהבקבוק. לגרד תאים עם תא מגרד לנתק במידת צורך.
- תאי Resuspend ב 10 מיליליטר הקרח הקר PBS ולהעביר צינור prechilled 14 מיליליטר סיבוב תחתון צנטריפוגה.
- גלולה תאים על ידי צנטריפוגה ב400-600 XG ב 4 ° C למשך 5 דקות. שלב את התאים ממספר צלוחיות בשלב זה אניF צורך.
- הסר PBS supernatant וresuspend גלולה ב 200 μl של חיץ תמוגה קר כקרח, העברת השעיה לטרום מקורר 1.5 צינור Eppendorf מ"ל.
- שמור את התאים על קרח כדי למזער את התחממות יתר מקומית. Lyse תאים עם 10 פעימות 3x שניות של sonication ב30% משרעת, באמצעות 2-3 מ"מ טיפ מראש צונן. שמור את הקצה מתחת לפני השטח כדי למזער את הקצף. השמט צעד זה בעת שימוש בחומרי ניקוי המכיל חיץ ולדגור על קרח למשך 30 דקות במקום.
- תקן את פתרון lysate להכיל ריכוז מלח פיסיולוגי (100 מ"מ NaCl) במידת צורך באמצעות 5 M NaCl.
- לאסוף lysates על ידי צנטריפוגה בכ -26,000 XG ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
- לקבוע את דילול lysate האופטימלי (כפי שמתואר בסעיף 3 להלן), והסכום של lysate הדרוש לטיטרציה אחד (בדרך כלל סביב 300 μl של lysate מראש בדילול מלא).
- Aliquot lysate ולאחסן בטמפרטורה מתאימה לחלבון תחת חקירה (-80 מעלות צלזיוס, ברוב המקרים). </ Ol>
- מאז את אינטראקציות חלבון ליגנד תלויות בתנאי חיץ, חיץ הרכב MST נבחר בהתבסס על המאפיינים של מערכת מסוימת. זה בדרך כלל יתרון לבדיקה לפחות שני מאגרים שונים.
- להכין 2 מאגרי MST 5x. היו לנו חוויות טובות עם שתי יצירות הבאות: HEPES (250 HEPES מ"מ, pH 7.4, 25 מ"מ MgCl 2; 500 מ"מ NaCl, 0.25% NP-40) וטריס HCl (250 מ"מ טריס HCl, pH 7.4, 750 מ"מ NaCl, 50 מ"מ MgCl 2; 0.05% Tween-20). תוספת של BSA (5% בתערובת המחייבת הסופית) יכולה לסייע במניעת הידבקות של חלבונים לצינורות פלסטיק וזכוכית נימים. יכול גם להיות כלול NaN 3 (0.5 מ"מ) כדי למנוע צמיחה של מיקרואורגניזמים.
- בחר את מקור עירור LED עם אורך גל λ = 470 nm על מכשיר MST.
- טען נימים עם cell לחלץ דילול 2 ו10x עם חיץ MST.
- לבצע את הפעולה "מצא את הנימים" בתוכנת בקרה של מכשיר MST. טווח הקרינה האופטימלי בlysate המדולל הוא מ400 עד 1,500 יחידות הקרינה.
- הריכוז הגבוה ביותר של ליגנד צריך להיות לפחות 20x גבוה מקבוע דיסוציאציה הצפויה.
- הריכוז הנמוך ביותר יגנד צריך להיות נמוך יותר מאשר ריכוז טוחנת של חלבון פלואורסצנטי.
- הנח מתלה צינור עם מספר דרוש (בדרך כלל 10-16) של 0.5 צינורות צנטריפוגה LoBind מ"ל על קרח. פיפטה μl 25 של חיץ MST לחלק התחתון של צינור אחד. הוסף 25 μl של פתרון מניות יגנד לאמבטיה הראשונההדואר (# 1, הריכוז הגבוה ביותר יגנד) ולבצע דילול כפול סידורי של ליגנד באמצעות שאר צינורות. שמור על המדף עם דגימות יגנד על קרח.
- תא הפשרת lysate לאט על קרח.
- לדלל lysate תא עם חיץ MST כדי לספק את הרמה האופטימלית של חלבון מטרת הניאון בתגובות מחייבות. ריכוז חלבון סופי צריך להיות קרוב הצפוי K D או נמוך יותר. זה צריך להיות מותאם להשגת מספר דרוש של ספירת הקרינה בפתרון הסופי. לקביעת ריכוז ה-GFP-STAT3 בlysate, המכשיר כויל עם עזרה של העמסה. הריכוז הטוחנת של ה-GFP בlysate נקבע באמצעות היחס בין תשואות קוונטי EGFP ההעמסה ו, 0.85 ו 0.61 בהתאמה. 15
- בחר את מקור עירור LED עם λ = 470 nm על מכשיר MST.
- 0.5 צינורות LoBind מ"ל מקום בtUbe מדף מול צינורות עם דגימות דילול סדרת יגנד. להוסיף 15 μl של lysate התא בזהירות לתחתית צינור אחד. נסה לא לגעת קירות צינור כדי למנוע אובדן מדגם.
- הוסף 15 μl של מדגם יגנד עם הריכוז הגבוה ביותר (מס '1) לצינור המקביל # 1 עם lysate התא. מערבבים היטב ולשנות קצה פיפטה. חזור על פעולה זו עם שאר הצינורות מלבד אחרון, שאמור להכיל לא יגנד.
- הוסף 15 μl של חיץ MST לצינור האחרון ומערבבים היטב.
- מלא כ 2/3 מהנימים ראשונה עם התערובת המחייבת מצינור # 1, להטות אותו כדי להעביר את הפתרון לכיוון המרכז, ומניח על מגש נימי הנימים לעמדת המס '1 (העמדה הקרובה ביותר לפתיחת המגש) . חזור על פעולה זו עם שאר הנימים. קצות הנימים יכולים להיות מחוברים בשעווה לניסויים ארוכים יותר.
- מניחים את המגש בתוך מכשיר MST ולסגור את הדלת של המכשיר.
- מבצע "מצא את הנימים"הפקודה לתת למכשיר למצוא עמדות של הנימים מדויקות ולמדוד את הקרינה של הדגימות.
- המבוסס על עוצמת אות הקרינה, להתאים את כוח LED (10-100%) כדי להביא אותו למרווח יחידות 400-1,500.
- לחץ על הכפתור "התחל" כדי לבצע את ניסוי thermophoresis. יותר מפעם אחת כוח IR-לייזר יכול להיות שנבחר לניסוי על מנת למצוא את שיפוע הטמפרטורה האופטימלי למערכת המסוימת. איסוף נתונים 2-3 ריצות לאותה הקבוצה של נימי דם על מנת להבטיח את שחזור של מדידות. זה לוקח 10-12 דקות כדי להפעיל קבוצה אחת של 16 נימים.
- פתח את תוכנת ניתוח.
- טען את תיקיית הפרויקט. במציג מידע הפעלה הופיע בחר נגבים בעקומות ספציפיות IR לייזר כוח thermophoretic. יש אפשרות לפתוח את כל עקבות thermophoretic נאספו בתנאים שונים, כגון כוח לייזר אינפרא אדום, LED עמ 'ower, טמפרטורה, ריכוז, וכו '. בפעם אחת ולאחר מכן בחירת עקומות כלשהן לניתוח על ידי החלפה אותם לסירוגין (לחץ על שמו של הניסוי).
- בחלון גרף הנקודות ההערכה, בחר thermophoresis או thermophoresis עם T-קפיצה. ודא שקווים כחולים ואדומים ממוקמים בצורה נכונה. כדי להשיג את הנקודות הממוצעות עם סטיות תקן, בחר "שימוש ממוצע" או "להבחין פועל" לריצות נפרדות.
- כדי להתוות כושר קבוע דיסוציאציה, בחר "שימוש ממוצע", להיכנס ולתקן את ערך ריכוז המולקולה המסומן (סימון הריבוע "הריכוז" בתפריט חלון התאמה), ולהתאים את העקומה. ערך K D עם סטיית התקן שלה מופיע בחלון קופץ מידע נפרד. כדי להתוות לנכון להשתמש בשיטת היל, בחר "ממוצע", שיטת היל, ולאחר מכן להתאים את העקומה. ערך EC 50 הזיקה עם סטיית התקן שלה מוצג במקרה זה. התכונה של "גבול" K D או היל גם יכולה להיות מנוצל כאשר הרוויהבמצב הנכנס הוא לא הגיע.
- שמור את נתוני הכושר הממוצעים בקובץ טקסט ולהעביר ל-Excel.
- נורמת עלילת F (הקרינה מנורמלת), ΔF נורמה (הבדל בקרינה מנורמלת אם ניסויים שונים בהשוואה), או כל חלק קשור (ראה בנוסחה הבאה) כפונקציה של הריכוז ללא תווית המולקולה (טיטרציה).
2. בחירת מאגר MST והכנה
3. נחישות של דילול lysate האופטימלי
4. קביעת טווח הריכוז האופטימלי ליגנד
עיין בכלי Finder ריכוז טכנולוגיות NanoTemper להערכת טווח הריכוז ליגנד.
5. הכנת lysate התא ודילולי יגנד
6. Microscale מחקרים מחייבים thermophoresis
7. ניתוח נתונים thermophoresis microscale
שבריר Bound (חלק של מולקולות מורכבות ב) = (Therm (C), לא מאוגד) / (מאוגד-מאוגד), שבו Therm (ג) הוא thermophoresis נמדד C הריכוז, לא מאוגד הוא thermophoresis למדינה לא מאוגדת (כאשר מולקולות לא במתחם), וכרוך הוא thermophoresis למדינה מחויבת לחלוטין.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מדידת הזיקה של חלבון STAT3 הלא phosphorylated מחייב oligonucleotides.
HEK293 תאים לבטא STAT3-GFP שמשו כמקור STAT3 כותרתו fluorescently לassay מחייב ה-DNA. lysates התא הוכן באמצעות Ripa חיץ (20x10 6 תאים / מ"ל). ללימודים מחייבים, את lysates דוללו 150X עם חיץ ה-DNA מחייב MST כדי לספק את הרמה האופטימלית של החלבון פלואורסצנטי בתגובה המחייבת (כ -20 ננומטר). HEK293 תאים ללא transfected היו בשימוש כדי להעריך את הקרינה רקע, אשר התבררה להיות לא להבחין גם בlysate אינו מדולל. עם זאת, הקרינה רקע יכולה להיות משמעותית יותר במערכות ביטוי אחרות, ולכן יש להיות במעקב. סדרה בהיקף של 11 טיטרציה תערובות מחייבות ומדגם lysate ללא יגנד כבר מוכנה. כל דגימה הכילה 15 μl של lysate תא המדולל ו15 μl של פתרונות oligonucleotides של משתנה concentratיונים. הרכב חיץ סופי כלל 25 HEPES מ"מ, pH 7.2, 50 מ"מ NaCl, 2.5 מ"מ MgCl 2; ו0.025% NP-40. המדידות נלקחו בנימים סטנדרטית טופלו במכשיר מונולית NT.115 באמצעות 50% כוח IR-לייזר ומקור עירור LED עם λ = 470 nm בטמפרטורת הסביבה. עקידת oligonucleotides הטעון הביאה לשינויים משמעותיים בSTAT3 ניידות בשיפוע טמפרטורה (איור 2). באיור 3, אות thermophoretic היא להתוות כפונקציה של ריכוז oligonucleotide. כל נקודת נתונים מייצגת את הממוצע של שלוש מדידות. תוכנת NanoTemper ניתוח 1.2.20 שימש כדי להתאים את הנתונים ולקבוע את ערכי D K לכאורה. קבועי דיסוציאציה לכאורה היו 37.9 ± 1.0 מיקרומטר ו23.3 ± 0.6 מיקרומטר לגז ו-S 100, בהתאמה (איור 4). החלפה של A-ל-G הביאה לירידה דרמטית בזיקה של 100 S mut # 1 (איור 4), ואילו MUS TANT mut 100 # 2 לא הראה מחייב גילוי מחייב וכך אישר רצף סלקטיבית של STAT3 לS 100. באופן מפתיע, רצפי 100 S מוצגים מעט הדוק יותר מחייב מאשר גז בשלוש חזרות מדידה.
איור 1. תכנית כוללת של הניסוי. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
איור 2. תא מדולל נתונים thermophoresis לא מעובדים שנוצרו לאינטראקציה של ה-GFP-STAT3 עם oligonucleotide AT-עשיר. lysate containi ננומטר 20 ng-GFP STAT3 היה מהול בכמויות הולכות וגדלות של oligonucleotide פעמיים תקוע (5'-AAAACAAAACGAAACAAACAAACTA) מניב הריכוזים המפורטים של ליגנד. הנתונים נאספו ב 50% כוח לייזר ו100% LED.
איור 3. עקומה מחייבת שנוצרה על ידי תוכנת NanoTemper ניתוח 1.2.231. מנורמל הקרינה (הקרינה הקרינה / ראשונית חמה) הוא להתוות כפונקציה של ריכוז oligonucleotide. החלבון מראה על עלייה בקרינה במאוגדת בהשוואה למצב שלא מאוגד. הנתונים מצוידים בשיטת משוואת היל שולבה בתוכנת ניתוח NanoTemper.
0541fig4highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50541/50541fig4.jpg "/>
איור 4. STAT3 מדידות מחייבות oligonucleotides עם רצפים שונים. Microscale thermophoresis מחייב של STAT3-GFP לגז (K D = 37.9 ± 1.0 מיקרומטר), S 100 (K D = 23.3 ± 0.6 מיקרומטר), 100 S מוטציה 1 (K D = 740 ± 21 מיקרומטר), ו-S 100 מוטציה 2 (לא מחייב). ריכוז STAT3-GFP נשמר קבוע בכ -20 ננומטר, והריכוז של oligonucleotides מגוון 666-0.650 מיקרומטר. ההבדל בקרינה מנורמלת [‰] הוא להתוות כפונקציה של ריכוז oligonucleotide, ועקומות מצוידות בשיטת היל של תוכנת ניתוח NanoTemper. ברים שגיאה מייצגים סטיית תקן של 3 מדידות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ביטוי חלבון וטיהור הוא צעד מייגע ויקר, שהוא, לעומת זאת, יש צורך להגדרה של "אינטראקציות K D על ידי שיטה הנפוצה ביותר כיום. יישום של MST מאפשר הימנעות טיהור חלבון ובכך לפשט באופן משמעותי ומאיץ אפיון כמותי של אינטראקציות. הוא מציג יתרונות משמעותיים במיוחד במקרה של לבטא-קשים ולטהר את חלבונים, כגון חלבונים בממברנה וגורמי שעתוק.
המגבלה העיקרית והדרישה של MST היא היכולת להביע את חלבון כאיחוי עם חלבון פלואורסצנטי ירוק. עם זאת, את המבנים לביטוי של רוב התמזגו-GFP חלבונים אנושיים ועכבר זמינים מסחרי. חלבוני ה-GFP, התמזגו גם נמצאים בשימוש נרחב לסחר ומחקרי השפלה, ובכך יכולים לשמש "חובות כפולים" בשילוב עם לימודי MST.
בנוסף לחוסר צורך בעמ 'החלבוןurification, שימוש חסכוני מאוד של כל חומרים כימיים ואי הרגישה לשינויים קלים ביצירות חיץ, MST מציע יתרונות נוספים בהשוואה לשיטות מסורתיות של קביעות D K. בניגוד למשטח התהודה plasmon, ניסויים מבוססי MST לקחת פחות מ 2 שעות, לאפשר להגדרה של K D בטווח רחב יותר ואינם סובלים מחפצי immobilization פני שטח. לדוגמה, אנחנו לא יכולים לקבוע K D עבור STAT3 מחייב לoligonucleotides ידי SPR, למרות שאנחנו השקענו כמות משמעותית של כספים לרכישה של מטוהרים STAT3 חלבון. K D של האינטראקציה היה גבוה מדי, וזה לעתים קרובות את המקרה לגורמי שעתוק, ונפל מחוץ לטווח הריכוז של SPR הניסוי.
קלורימטריה טיטרציה עובדת רק עבור אינטראקציות המלוות בשינויים באנתלפיה. מגבלה זו אינה כוללת מקרים רבים. בינתיים, שינויים בניידות, למרות שאין thermophoretic שונים הרבה בערכים עבור diמערכות fferent, מתרחשות עבור רוב מכריע של אינטראקציות. אחד היתרונות הגדולים ביותר של MST הוא שזה עובד במגוון רחב של מאגרים וסובל את נוכחותם של חומרי ניקוי, micelles, וbicelles במערכת. מאפיין זה מאפשר ליישם אותו לחלבונים בממברנה, כי הם כמעט בלתי אפשריים ללמוד באמצעים אחרים. עם זאת, יש להשתמש בזהירות, כדי למנוע את השינויים בחומר ניקוי ותוכן ובהרכב מיצלות במהלך טיטרציה עם ליגנד.
זה צריך להישמר גם בחשבון בעת שימוש בתמציות סלולריים שהחלבון הנחקר עשוי להתקיים בצורתו המקורית שלו, שהוא לעתים קרובות מורכב עם חלבונים אחרים, חומצות גרעין, וcofactors. לפיכך, זיקה מחייבת עשויה להיות שונה מזה לחלבון מבודד לא היה מעורב בכל תצורות מורכבות. ביטוי יתר לעתים קרובות מאפשר titrating את שותפי האינטראקציה עוזבים רוב המולקולות של החלבון הנחקר במדינה שאינה מאוגדת. זוהי סיבה נוספת למנסה achieve רמות ביטוי גבוהים מאוד של החלבון ה-GFP, התמזגו עם transfection תאים. הפרמטר קשה לשליטה השנייה הוא שינויי posttranslational שיכול גם להוסיף ההטרוגניות משמעותית למערכת. מגבלה נוסף היא לימוד מחייב לחלבונים ומולקולות קטנות אשר נמצאות בlysates התא בכמויות גדולות או מולקולות עם סגוליות רחבות וזיקה נמוכה שיכולים לקיים אינטראקציה עם חלבונים רבים הנמצאים בlysate. Wienken, CJ, et al. מצאו כי K D נקבע על ידי MST בE. תמצית coli הייתה יותר מבסדר גודל גבוה יותר מאשר בחיץ לאינטראקציה של אינטרפרון גאמא עם נוגדנים 9. ההשפעה יכולה להיות בחלקו בשל proteolysis מאז לתמצית לא מעכבי פרוטאז. מולקולה קטנה מחייבת לאלבומין בסרום נמצא גם לשנות K D במחקרי אינטראקציות על ידי MST 9.
היעילות של מיצוי יכולה גם להיות שונה עבור differeחלבוני nt בהתאם ללוקליזציה תאית ומאפיינים פיסיקלי כימיים. לכן, כדאי לנסות כמה תמוגה תא ותנאי הפקת חלבון. לחלבוני cytoplasmic, תוך שימוש בחומרי ניקוי לא, רק אולטרסאונד לתא שיבוש בתדירות גבוהה מייצר תשואות ונתונים טובות מאוד. בינתיים, חלבונים בממברנה דורשים הקרנה נרחבת יותר של תנאי חילוץ עם ריכוזים וטיבם של חומרי ניקוי, micelles שומנים בדם, או bicelles שונים. יש בו תוכן חומר ניקוי כדי להישמר למינימום, כדי למנוע השפעה על זיקה מחייבת.
למרות המגבלות הרשומות למסחר, מצאנו מחקרי MST של חלבוני ה-GFP-התמזגו אינם מטוהרים להיות נוח מאוד לquantitation של זיקות מחייבות לחלבונים רבים וסוגי יגנד. אין ספק ששימוש רחב יותר של השיטה במעבדות רבות יאפשר להרחיב עוד יותר את היישומים של מחקרים מחייבים המבוססים על חלבוני MST.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים. התוכן של פרסום זה לא בהכרח משקף את הדעות או מדיניות של מחלקת בריאות ושירותי אנוש, ואין אזכור של שמות מסחריים, מוצרים מסחריים, או ארגונים מצביע על תמיכה על ידי ממשלת ארה"ב.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי תכנית המחקר העירונית של NIH, המכון לאומי לסרטן, מרכז לחקר הסרטן; הסכם המחקר משותף בין NCI וTherapeutics Calidris; האגודה האמריקנית לסרטן מענק IRG 97-152-17 לOT; וכספים פדרליים מ המכון לאומי לסרטן, NIH, תחת HHSN26120080001E החוזה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RIPA buffer | Millipore | 20-188 | Other manufacturer's buffers work as well |
| Protease inhibitors cocktail | Sigma-Aldrich | P2714 | |
| Monolith NT.115 | NanoTemper Technologies GmbH | G008 | |
| Monolith NT.115 Capillary Tray | NanoTemper Technologies GmbH | T001 | |
| Monolith NT.115 Standard Treated Capillaries | NanoTemper Technologies GmbH | K002 | |
| NT Control software | NanoTemper Technologies GmbH | 2.0.2.29 | |
| NT Analysis software | NanoTemper Technologies GmbH | 1.4.27 | |
| Table-top refrigerated centrifuge | Eppendorf | 5417R | Other microtube refrigerated centrifuges providing |
| Protein LoBind Tube 0.5 ml | Eppendorf | 22431064 |
References
- Lea, W. A., Simeonov, A. Fluorescence polarization assays in small molecule screening. Expert. Opin. Drug Discov. 6, 17-32 (2011).
- Willander, M., Al-Hilli, S. Analysis of biomolecules using surface plasmons. Methods Mol. Biol. 544, 201-229 (2009).
- Hulme, E. C., Trevethick, M. A. Ligand binding assays at equilibrium: validation and interpretation. Br. J. Pharmacol. 161, 1219-1237 (2010).
- Ghai, R., Falconer, R. J., Collins, B. M. Applications of isothermal titration calorimetry in pure and applied research--survey of the literature from 2010. J. Mol. Recognit. 25, 32-52 (2012).
- Vuignier, K., Schappler, J., Veuthey, J. L., Carrupt, P. A., Martel, S. Drug-protein binding: a critical review of analytical tools. Analytical and Bioanalytical Chemistry. , 398-3953 (2010).
- Lebowitz, J., Lewis, M. S., Schuck, P. Modern analytical ultracentrifugation in protein science: a tutorial review. Protein Sci. 11, 2067-2079 (2002).
- Duhr, S., Braun, D. Why molecules move along a temperature gradient. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 19678-19682 (2006).
- Zillner, K., Jerabek-Willemsen, M., et al. Microscale thermophoresis as a sensitive method to quantify protein: nucleic acid interactions in solution. Methods Mol. Biol. 815, 241-252 (2012).
- Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis. Nat. Commun. 1, 100 (2010).
- Stark, G. R., Darnell, J. E. The JAK-STAT pathway at twenty. Immunity. 36, 503-514 (2012).
- Ehret, G. B., Reichenbach, P., et al. DNA binding specificity of different STAT proteins. Comparison of in vitro specificity with natural target sites. J. Biol. Chem. 276, 6675-6688 (2001).
- Yang, J., Stark, G. R.
- Timofeeva, O. A., Chasovskikh, S., et al. Mechanisms of unphosphorylated STAT3 transcription factor binding to DNA. J. Biol. Chem. 287, 14192-14200 (2012).
- Timofeeva, O. A., Tarasova, N. I., et al. STAT3 suppresses transcription of proapoptotic genes in cancer cells with the involvement of its N-terminal domain. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , (2013).
- Patterson, G., Day, R. N., Piston, D.
