Summary
We beschrijven de ontleding van het zenuwstelsel van het mariene zeehaas
Abstract
De marine buikpotigeweekdier Aplysia californica heeft een eerbiedwaardige geschiedenis als een model van de werking van het zenuwstelsel, met bijzondere betekenis in studies van leren en geheugen. De typische voorbereidingen voor dergelijke studies zijn die waarin de sensorische en motorische zenuwcellen intact worden gelaten in een minimaal ontleed dier, of een technisch ingewikkelde neuronale co-cultuur van individuele sensorische en motorische zenuwcellen. Minder vaak voorkomende is de geïsoleerde neuronale preparaat waarin kleine clusters van nominaal homogene neuronen kunnen worden gescheiden in afzonderlijke cellen in korte termijn cultuur. Dergelijke geïsoleerde cellen zijn bruikbaar voor de biofysische analyse van ionen stromen met patch clamp technieken en doelgerichte modulatie van deze geleidingen. Een protocol voor het bereiden van dergelijke culturen wordt beschreven. Het protocol maakt gebruik van de gemakkelijk te herkennen glutamatergic sensorische neuronen van de pleura en buccale ganglia, en beschrijft hun dissociatie en minimaal onderhoud in cultuur voor meerdere dagen zonder serum.
Introduction
De marine opistobranch weekdier, Aplysia, is een nuttig neurobiologische model voor vele decennia. Het is het best bekend als een model van gewenning en klassieke conditionering 7, 8. Studies over leren en geheugen in dit model won de Nobelprijs voor de Fysiologie of Geneeskunde in 2000 voor Eric R. Kandel, in een prijs die hij met Arvid Carlsson en Paul Greengard 10 gedeeld. Deze onderzoeken met elektrische opnames van verminderde preparaten, waarbij elementen van het zenuwstelsel van de invertebrate worden ontleed uit het dier met zenuwen en spieren laat zitten, hebben geholpen verduidelijken de rol van individuele neuronen in Aplysia. Identificatie van precieze moleculaire mechanismen die leren in Aplysia vormen echter vaak gebruikt een andere techniek, langdurige co-kweken van een sensorisch neuron en een motorisch neuron, verkregen een voor een individuele donor dieren mogen een synaps vormen in de kweekschaal 21 .
Wij en anderen 1, 3, 6, 14, 15, 16 hebben het gemak waarmee geïdentificeerde neuronen kan worden gericht in dit model en de duurzaamheid op lange termijn experimenten gedissocieerde korte termijn kweken clusters van nominaal homogene neuronen benut waarin bestuderen we ionenstromen onder spanning klem in de patch clamp configuratie. Veel Aplysia neuronen opstaan om herhaalde rondes van patch klemmen om tijd te geven voor een langdurige experimentele manipulaties. De techniek is nuttig voor neuronen zoals neuro-zak cellen van de abdominale ganglion en de sensorische neuronen van de pleurale buccale ganglia waarvan dissociatie hier bedoeld maar niet voor zeer grote neuronen> 60 urn diameter, zoals L7 of R2 van de buik ganglion. We hebben geen gebruik Aplysia serum in onze culturen, in tegenstelling tot de sensorische motoneuron co-kweken elders beschreven. De meeste neuronen verkregen met deze werkwijze zal worden zonder processen thij voor het eerst 48 uur in de cultuur, het vergemakkelijken van whole cell voltage-opname, maar zal dan ontkiemen en uitwerken axonen en andere processen gedurende ongeveer 14 dagen alvorens te sterven door gebrek aan voedingsstoffen en / of groeifactoren.
Deze techniek produceert primaire culturen van 50-100 neuronen per gerecht uit fysiologisch gedocumenteerde regio's van de buccale en pleura ganglia. Dit protocol is nuttig voor onderzoekers bestuderen aspecten van enkele cel fysiologie in experimenten die vereisen talrijke experimentele duplo's per dier. Het produceert twee dezelfde culturen vanwege de anatomische scheiding van doelcellen in linker en rechter hemiganglia, waardoor studies die profiteren matched behandeling en controle culturen.
Het protocol richt buccale S cluster (BSC) neuronen van de buccale ganglion, en pleurale ventrocaudale (PVC) neuronen van de pleura ganglion. Deze cellen zijn een geschikte grootte voor gehele cel spanning opnamen en weergave Robust glutamatergic reacties. De besproken werkwijze is geschikt voor de meeste ganglia in het Aplysia zenuwstelsel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cell Preparation
- Op dag 1, wegen en verdoven van dieren.
- Weeg 30 g a-1 kg dier. Verdoven van 5-10 dieren volumes 01:01 zeewater: isotone MgClz. 6H 2 0 gedurende 1 uur onder beluchting zoals elektrische aquarium luchtpomp met aangehechte luchtsteentje.
- Bereid dissectie benodigdheden.
- Monteer schone dissectie lade met roestvast stalen rechte pennen, zoals stof pinnen. Monteer meerdere platen met kunstmatig zeewater (ASW; zie tabellen 1 en 3) + penicilline / streptomycine (P / S).
- Heb klaar een laag vermogen microscoop. Hebben schone dissectie instrumenten klaar, zoals geribde neus en fijne chirurgische pincet, en fijne en grote chirurgische schaar. Spray de instrumenten met 70% isopropol alcohol voor gebruik en laten drogen.
- Positie dier op dissectie lade.
- Dier positie ventrale zijde naar beneden in de dissectie lade. Pin dierdoor de randen van het lichaam muur en parapodial grenzen, maar staart en hoofd te vermijden, om het dorsale oppervlak bloot te leggen en de genitale groef
- Spoel het dorsale oppervlak in slow-running koud leidingwater. Breng een lichte stroom van 70% isopropol alcohol uit een knijpfles langs de genitale groove en over de bovenkant van het hoofd.
- Maak de eerste incisie.
- Met behulp van een laag vermogen microscoop (zie tabel 2) en gereflecteerd licht op het punt waar de genitale groef is afkomstig van de voorste schelp marge in acht, strak houden met geribde-neus tang een plooi van weefsel aan de linkerkant van deze oorsprong, terwijl snipping een ondiepe gat helemaal door het gladde, vlakke gebied van het lichaam muur net rechts van de genitale groef met een fijne schuine schaar.
- Hemolymph moeten worden geobserveerd te gieten uit het gat, soms dragen daarmee ook de buik ganglion en maag.
- Vouw de incisie.
- Gebruik grote schaar om th breidene incisie anterieur naar een punt tussen de rhinophores, terwijl boven te trekken met het ondermes voorkomen knikken de darm. De inwendige organen worden nageleefd om morsen van de incisie.
- Verwijder de ganglia.
- Plaats de lade en te heroriënteren de microscoop op het hoofd regio.
- Met behulp van schone tang en fijne schaar, verwijder de kop ganglia door doorsnijden op een gegeven moment de zenuwen die het hoofd ganglia vormen tot een ring rond de slokdarm naar pleura-pedaal en hersenzenuwknopen verwijderen als groep.
- Verwijder de buccale ganglion die voldoet aan de ventrale zijde van de slokdarm.
- Verwijder de buik ganglion door het snijden van de 4 grote zenuw connectieven die kwestie uit deze ganglion.
- Isoleer ganglia van belang.
- Trim hoofd ganglia elkaar, op een lengte van connectoren aan elk ganglion plaats die overeenkomt met ten minste de diameter van de ganglion, dit enzym vertraagt over-digestievan de cellen van belang in de volgende stap.
- Zet elke doelgroep ganglion door 2 spoelingen van ASW + P / S, bewegen tussen spoelingen met schone pincet.
- Indien gericht op de PVC-cellen, laat de rechter pleura hemiganglion aan de rechter pedaal hemiganglion, en op dezelfde wijze laat de linker pleura hemiganglion bevestigd aan de linker pedaal hemiganglion.
- Gooi ongewenste ganglia en de rest van het dier volgens de gangbare onderzoekspraktijk.
- Enzymatisch verteren de ganglia.
- Voor elk ganglion, bereiden 1 ml enzym oplossing bestaande uit 3,75 mg dispase, 1 mg hyaluronidase en 0,3 g collagenase soort XI per ml ASW + P / S in een 15 ml polypropyleen conische buis.
- Plaats gespoeld ganglia in enzymoplossing en bevestig de dop stevig vast. Plaats de buis op zijn kant op een roterende schudder (zie tabel 2) bij een lage snelheid voor 13-5 uur 's nachts bij ongeveer 23 ° C (kamertemperatuur).
- Bereid decultuur gerechten.
- Voordat microdissection (Dag 2), bereiden poly-D-lysine (PDL)-gecoate cultuur gerechten in een weefselkweek kap. Voeg -0,5 ml PDL (0,2 mg / ml steriel water) naar het midden van een 35 mm schotel voor ~ 25 minuten.
- Spoel PDL 3x met steriel water. Laten drogen. UV-steriliseren van de platen.
- Dag 2 Isoleer neuronen.
- Vul het centrum van 35 mm gerechten die PDL-gecoate en UV gesteriliseerd met ongeveer 0,5 ml ASW + P / S om een eiland van media in de anders droge gerecht te creëren waren. Dit kan worden gedaan op de bank, buiten de weefselkweek kap. Een gerecht moet worden opgesteld voor elk cluster cel afkomstig van een hemiganglion.
- Heb klaar een 100 mm diameter dissectie schaal door Sylgard-coating en uitharding een 5 mm diep dissectie oppervlak, uitgerust met fijne dissectie kunnen van verschillende formaten worden gebruikt als pennen en probes (zie tabel 3). Spoel dit gerecht met 70% isopropol alcohol, daarna met ASW + P / S, en tenslotte fill het met ASW + P / S.
- Bereid microdissection van verteerd ganglia.
- Giet het enzym oplossing die de verteerde pleura-pedaal en buccale ganglia in de dissectie schotel.
- Plaats de schotel op het podium van de microscoop tegen een zwarte ondergrond onder gereflecteerd licht.
- Met behulp van de bijgevoegde bindweefsel, vastpinnen elk pleura-pedaal hemiganglion dorsale kant naar boven. De weefsels worden zacht en intolerant stretching.
- Microdissect PVC neuronen.
- Met behulp van 2 paar schone fijne tang, en met een fijne dissectie pin in een pincet als een probe, isoleren van de PVC-cellen van een pleurale hemiganglion. Enzymdigestie zullen verwijderd of gebroken elkaar het bindweefsel mantel die de cluster PVC, maar de cellen aan elkaar hechten.
- Met de probe aan deze cellen los van het pedaal-pleurale verbindende 18, laat de cel cluster vallen op de bodem van de dissectiegerecht.
- Overdragen neuronen aan cultuur schotel.
- Breng de cluster cel om een voorbereide 35 mm cultuur schotel door voorzichtig zuigen de cluster in de punt van een licht vuur gepolijste besteedbaar glas Pasteur pipet, dan doseren het langzaam in de media eiland in een cultuur schotel, en voorzichtig om te voorkomen dat er luchtbellen in de pipet. Herhaal isolatie van de PVC-cluster van de andere hemiganglion en plaats in een aparte cultuur schotel.
- Microdissect en overbrengen BSC neuronen.
- Pin uit de buccale ganglion ventrale zijde naar boven, met zorg om de cellen van belang sparen. Herhaal stap 1.12 met de 2 BSC cel clusters van de buccale ganglion 10.
- Isolatie van pvc en BSC neuronen zal produceren 4 kweekschaaltjes daarin neuron clusters: 2 platen met BSC clusters en 2 schotels met PVC-clusters. Gooi de rest van de ganglia en de vernietiging van het 100 mm dissectie schotel.
- DissocIATE de cel clusters.
- Plaats een cultuur schotel met cellen op het podium van de laag vermogen microscoop en verwijder het deksel.
- Distantiëren de cluster PVC door voorzichtig flicking de bodem van de kweekschaal naast de cluster cel met een fijne dissectie pin gehouden tang. Flicking graaft de punt van de pen in het plastic van de bodem van de schaal, alsof proberen uit te graven een vlek van plastic. Wanneer wrijving met de plastic releases van de pen punt, is een percussie golf geproduceerd door het medium dat uit elkaar breekt de nabijgelegen klompje cellen.
- 5-10 films kan nodig zijn om vrijwel volledig de cellen dissociëren, maar het is beter om kleine clusters van cellen laten plaats van flick teveel opdat de cellen worden vernietigd door mechanische pure.
- Deksel en herhaal met de andere cultuur gerechten.
- Slaan celculturen.
- Plaats de kweekschalen bevattende media eilanden in hun centra met gedissocieerde cellen ineen grote container die luchtcirculatie, zoals een 150 x 25 mm ronde plastic petrischaal maakt, en plaats deze schotel in een incubator ingesteld op 17 ° C.
- Installeer de kamer een open schaal van water als een bron van vocht. Verlaat ongestoord overnachten. De cellen hechten aan de poly-D-lysine coating in het midden van de schotel.
- Vloed cultuur gerechten.
- Op dag 3, voorzichtig overspoelen de gerechten met 2,5 ml van ASW + P / S. Onderzoeken en tel de cellen met behulp van een omgekeerde celcultuur microscoop. Bewaren in de 17 ° C incubator.
2. Elektrofysiologie
De methode is standaard patch klemmen die is beschreven in talrijke teksten (bijvoorbeeld Neher en Sakmann, 1995) 16. Dit protocol zal werken op cellen ≤ 100 pF condensator, of cellen <60 micrometer diameter tijdens dag 3 en 4 van het protocol. Cellen zonder processen optimaal voor opname. De volgende speciale ONDERZOEKionen van toepassing:
- Grotere cellen kunnen worden ondergebracht met de configuratie-instelling op de Axopatch 200B versterker ingesteld op β = 0,1. Activering van zeer grote stromen kunnen veroorzaken cellen voltage clamp ontsnappen. ASW oplossingen vervangen zoutgehalte (bijvoorbeeld een fractie van de NaCl gesubstitueerd met ondoorlaatbare N-methyl-D-glucamine chloride) worden gebruikt om hele cellen stroomamplitude verminderen.
- Vezelgevulde borosilicaat patch pipetten trok een pipet trekker en halverwege opgevuld met intracellulaire oplossing (ICS) bestaande uit 450 mM KCl en andere zouten (zie tabel 1) zijn geschikt, en moeten weerstand van 0,5-1 Mohm hebben. Als isolatie van specifieke ionische stromen gewenst is, bijvoorbeeld Na +-stromen in afwezigheid van K stromen, K + in deze oplossing kan worden vervangen door andere ionen zoals Cs +. Cl - vervanging van ICS met een impermeant anion is ook gerechtvaardigd als een meer natuurlijke ICS is gewenst9.
- De cellen zijn robuust bij> 1 uur durende opnamen mogelijk op kamertemperatuur. Opname is optimaal op dag 3 en 4 van het protocol, overeenkomend met 24-48 uur in de cultuur. Na 48 uur is er moeilijkheden die Gigaohm verbindingen, misschien vanwege uitwerking van een glycocalyx op het celoppervlak, en ruimte klem veroorzaakt door proces uitgroei. De cellen zijn echter nuttig voor niet-patch clamp studies, zoals toxicologie, dat <14 d kunnen worden voltooid.
- ASW en andere oplossingen worden vrijgesteld van de zwaartekracht gevoede oplossing apparaat, alsmede intracellulaire oplossing, worden gefiltreerd door een injectiespuit gemonteerde 0,2 um Acrodisk filter (Tabel 3) om fijne deeltjes die interfereren met Gigaohm afdichting vorming elimineren.
- Desensibilisatie treedt bij gebruik van agonisten zoals D-aspartaat (D-Asp), dus ~ 1-2 min tussen toepassingen van agonisten wordt aanbevolen. Omgekeerd wordt potentiëring vaak waargenomen met snelle herhaalde toepassingcatie van agonisten zoals L-glutamaat (L-Glu).
- Agonist geactiveerde stromen zoals L-Glu kan worden onderzocht door toepassing van agonisten met picospritzer pipet. Deze pipet is hetzelfde als de patch pipet getrokken en bevat agonist ASW. Wanneer de punt van de pipet wordt gepositioneerd onder de afvoerpijp van de zwaartekracht gevoede oplossing apparaat en op een 45 ° hoek van de afvoerpijp (figuur 2F), wordt agonist snel weggewassen uit de cel en desensibilisatie wordt geminimaliseerd. De pipet agonist dient een hoek van 90 ° of meer ten opzichte van de patch pipet creëren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De locaties van de sensorische neuronen in de ganglia die bij een dergelijk protocol worden de BSC en PVC neuronen in figuur 1. De BSC neuronen bevinden zich in 2 symmetrische ovale clusters aan de buikzijde van de buccale ganglion, de oppervlakte die is afgekeerd van de buccale massa in de intacte ganglion (Figuur 1A). De PVC-neuronen vormen bilaterale, V-vormige clusters die rond het dorsale oppervlak van de pleura ganglion naar de centrale as (Figuur 1B). Deze sensorische neuronen hebben het voordeel van een stereotiepe locatie binnen de ganglia, hoewel rechts of links cluster ontbreekt in individuele dieren in ongeveer 1% van de gebeurtenissen. De BSC en PVC neuron clusters geïdentificeerd door de donkeroranje kleur van de celmembraan en kleinere omvang in vergelijking met nabijgelegen cellen, zoals in de grote cirkel omtrek van figuur 1A.
In cultuur, dezeneuronen zijn vaak zonder processen de dag na plating (Figuur 2A) en zijn ideaal voor patch klemmen die dag, en een dag later. Soms is het mogelijk om voldoende ruimte klem bereiken zelfs wanneer de cellen blijken proces uitgroei (figuur 2F) hebben, suggereert dat niet alle kiemen die lijkt te gaan van het cellichaam deel van de cel. Als het hanteren na enzymatische afbraak zacht is geweest, cellen komen in de cultuur met een aantal processen intact, en deze processen te groeien met de tijd (figuur 2B-2E). Dergelijke cellen zijn niet geschikt voor patch clamping maar intracellulaire opname mogelijk.
Whole cell patch clamp stromen door voltage gated Na + en Ca 2 + uitgevoerd worden gemakkelijk opgenomen van PVC en BSC neuronen in korte termijn cultuur 6, en beide celtypen vertonen een gemengd K stroom. BSC neuronen ook reageren op acetylcholine, serotonine en NMDA 4 (Figuur 3C) Met prikkelende stromen, terwijl zowel BSC en PVC neuronen reageren op L-Glu en Asp-D 3 (figuren 3A en 3B) met prikkelende stromen. De farmacologische eigenschappen van L-Glu-en D-Asp-inductiestromen in deze neuronen zijn beschreven 4.
Figuur 1. Microfoto's waarop de plaats van de glutamaat sensorische neuronen van de buccale en pleura ganglia (rode cirkels) A. De buccale S cluster (BSC) neuronen,. Herkenbaar aan hun donkere oranje kleur (grote cirkel op links hemiganglion) en de overeenkomstige positie in de rechts hemiganglion (kleinere cirkels). B. V-vormig, donkeroranje pleurale ventrocaudale (PVC) cell cluster rechts pleurale hemiganglion (links hemiganglion niet getoond).
Figuur 2. Microfoto van glutamaat sensorische neuronen in cultuur A. Cellen van het PVC-cluster 24 uur na plating in cultuur schotel met 2 sensorische neuronen en andere cellen;. Andere PVC cellen uit afzonderlijke culturen op 24 uur worden weergegeven als inzetstukken B, C.. Een BSC neuron in de cultuur bij 24 uur en hetzelfde neuron op 96 uur, respectievelijk. D, E. Een PVC neuron in de cultuur bij 24 uur en hetzelfde neuron op 96 uur, respectievelijk. F. Een PVC neuron op 48 uur in een patch clamp experiment. De patch pipet wordt de cel in contact van de rechterrand, terwijl de picospritzer pipet onderaan. De grote donkere schaduw zichtbaar aan de linkerkant van de cel is de opening van het stromende bad pipet. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.
Figuur 3. Glutamaat stromen in whole cell patch clamp opnamen van BSC en PVC neuronen. A. Hele cel stroom in een BSC neuron in reactie op druk toepassing van L-Glu (1 mM, 100 msec). B. Hele cel stroom in een PVC neuron in onder druk toepassing van D-Asp (1 mM, 100 msec). C. hele cel NMDA stroom in dezelfde BSC cel in A (1 mM, 100 msec).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De dissociatie hier beschreven technieken opleveren sensorisch neuron kweken die 50-100 geïsoleerde neuronen afgewisseld met kleine aantallen glia en andere niet-geïdentificeerde cellen. De meest kritische stappen in het protocol zijn de tijd de ganglia blijven enzymoplossing en vegen, de dissociatie van de gedigereerde cel clusters splitsen de cluster in individuele cellen. Enzym digestie (stap 1.8) moet worden geoptimaliseerd op beschikbare temperatuur. Bij 23 ° C onder langzaam schudden 13 uur is voldoende voor digestie van de BSC clusters while15 uur is optimaal voor PVC clusters. Low cel opbrengsten in de kweekschaal te wijten aan onvoldoende tijd enzym of teveel mechanisch afbreken tijdens hetzij de celoverdracht stap (1.11 en 1.12) of tijdens het vegen stap (1.13). Falen van de cellen naar beneden te houden aan de cultuur substraat, evenals korte overleving in cultuur is meestal te wijten aan te veel mechanische verstoring. Verontreiniging van de culturen kunnen ook optreden, en het best worden aangepakt door ervoor te zorgen dat de verdoofde dier goed wordt gespoeld, dat de dissectie instrumenten schoon zijn, en dat de ganglia van belang worden gebracht door middel van meerdere keren wordt gespoeld in ASW + P / S. Het kan nodig zijn om wassen en alcohol-clean instrumenten tussen verschillende delen van de dissectie procedure of voldoende instrumenten aanpassen zodat schone kan worden gebruikt voor elke stap.
Aplysia neurobiologische studies worden meestal uitgevoerd op verminderde voorbereidingen die zenuw verbindingen tussen neuronen en tussen neuronen en spieren 2, 18 te behouden. Deze preparaten vergemakkelijken de overdracht van de controle van gespierde processen om specifieke neuronen en neuronale circuits en ook toestaan dat studies van de versterking en vergemakkelijking van repetitieve reflexen. Intact voorbereidingen zijn niet geschikt voor bepaalde soorten spanningsklem protocollen en de studie van de effecten van agonisten die snel ongevoelig hun receptoren.
De langdurige neuronale co-cultuur is een extra instrument voor versterking en facilitering studeren onder zeer gecontroleerde omstandigheden. Lange termijn lenen zich co-culturen ook biochemische studies over enkele neuronen. Het succes van de co-cultuur preparaat wordt vaak toegeschreven aan de toevoeging van maximaal 50% Aplysia hemolymfe aan kweken 17. Het succes van deze benadering is vaak afhankelijk van partij tot partij variabiliteit van de hemolymfe.
De gedissocieerde celkweek voorbereiding hier beschreven, breidt het gebruik repertoire van de Aplysia model. Gedissocieerde celkweken zijn niet geschikt voor het afleiden neurale circuits of met gebruikmaking van intacte synaps zoals de werkwijzen die hierboven vermeld doen. De gedissocieerde celkweek voorbereiding heeft zijn grootste nut bij de bevestiging van het bestaan van specifieke ionische conductances en hun kinetische en farmacologische eigenschappen in enkele cel voltage clamp experimenten. Sevmene unieke stromingen zijn ontdekt enkelvoudige celpreparaten, waaronder een prikkelende kation stroom in cellen zak 19 en de D-Asp receptor stroom in neuronen BSC 4. Studies over Aplysia zelden richten op de ionische stromen van individuele cellen, mede door de vaak logge formaat van dergelijke cellen en de aanwezigheid van talrijke andere geschikte model celtypen die zich goed lenen voor patch clamp technieken. Hierdoor wordt het bestaan van bepaalde stromen in Aplysia, zoals geactiveerd door alfa-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazool-propionzuur (AMPA) gewoonlijk afgeleid uit blok vermoedelijke AMPA receptor (R) gerelateerd gedrag van AMPAR antagonisten toegepast op de bereiding verminderde zenuw, in plaats van rechtstreeks opgenomen. Dus verificatie van het bestaan van bepaalde stromingen ontbreekt. Isolatie van gekweekte neuronen glutamaat en single cell voltage clamp methode biedt een directe test voor de aanwezigheid vanverschillende L-GluR kanalen van dit model organisme.
Een ander gebruik van Aplysia neuronen in cel patch clamp experimenten ontleden in second messenger cascades. Aplysia neuronen zijn bijzonder goed geschikt voor studies tweede messenger geïnduceerde aanpassing omdat ze stabiel zijn gedurende langere opname bij kamertemperatuur 3, 12, 20, 21 , en zijn voldoende robuust dat individuele cellen na opname kan worden opgeslagen en geregistreerd vanaf opnieuw na 24 uur 5. Deze buccale en pleura sensorisch neuron clusters gunstig opbrengst een paar geëvenaard culturen van elkaar ganglion, zodat een gerecht van een controle cultuur kan worden aangewezen, terwijl zijn partner een behandeling ontvangt.
Een bijkomend voordeel van dit preparaat in studies van de morfologische toestand van individuele neuronen. Zo ontdekten we dat de cellichamen van Aplysia neuronen uit senescent dieren waren larger dan die van jongere dieren, maar wist niet celprocessen uitweiden na enkele dagen in de cultuur 6. Deze geïsoleerde neuron preparaten studies met vitale kleurstoffen niveaus van intracellulair Ca 2, pH, reactieve zuurstof species, mitochondriale membraanpotentiaal en andere fysiologische kenmerken die dan wordt vergeleken met neurofysiologische van de afzonderlijke cellen te beoordelen ook gemakkelijker. Hoewel sommige van deze benaderingen zijn in intacte of co-cultuur preparaten van toepassing, het verzamelen van gegevens is veel eenvoudiger met behulp van geïsoleerde neuronen in deze makkelijk kweeksysteem. In de toekomst hopen we deze cellen te gebruiken voor enkele cel moleculaire profilering 13.
De gedissocieerde korte termijn cultuur biedt ideale materiaal voor onderzoek naar fundamentele neurofysiologische processen, en kan een bijzonder krachtig hulpmiddel te bieden bij gebruik in combinatie met studies met verminderde of co-cultuur voorbereidingen. De gedissocieerdeAplysia neuron cultuur breidt het nut van deze eerbiedwaardige diermodel om nieuwe en interessante gebieden van de neurowetenschappen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Gefinancierd door NIH P40 OD010952, de Korein Foundation, een universiteit van Miami Fellowship naar SLC en een Maytag fellowship aan ATK. De auteurs zeer erkentelijk voor het personeel van de National Resource voor Aplysia, evenals Lauren Simonitis en Hannah Peck, die microfoto van een cijfer voorzien.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Artificial seawater ASW | Sigma-Aldrich | assorted | (mM): 417 NaCl, 10 KCl, 10 CaCl2 (2 H2O), 5MgCl2 (6H2O), 15 HEPES-NaOH, pH 7.6 |
| Intracellular solution | Sigma | assorted | (mM): 450 KCl, 2.9 CaCl2 (2 H2O), 2.5 MgCl2 (6 H2O), 5 Na2ATP, 10 EGTA, and 40 HEPES-KOH, pH 7.4 |
| Poly-D-lysine | Sigma | P6407 | |
| penicillin/streptomycin added to ASW at 1:100 | Lonzo Walkersville, Inc. | 17-603E | 5,000 Units/ml penicillin plus 5,000 mg/ml streptomycin |
| Neutral dispase II | Roche Diagnostics | 10165859001 | |
| hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H4272 | |
| collagenase type XI | Sigma-Aldrich | C9407 | |
| L-Glutamate (L-Glu) | Sigma-Aldrich | 49601-100G | |
| D-Aspartate (D-Asp) | Sigma-Aldrich | 11200-10G | |
| N-methyl-D-aspartate (NMDA) | Biomol | 100002-268 | |
| L-Asp | Sigma | A6683-25G | |
| alpha-amino-3-hydroxyl-5-methyl-4-isoxazole-propionic acid (AMPA) | Sigma | A6816-5MG | |
| L-Glu R antagonists | various | various | |
| agar | |||
| kynurenate | Sigma-Aldrich | 61250 | |
| APV | Sigma-Aldrich | A5282 | |
| DL-2-Amino-5-phosphonopentanoic acid (NMDAR antagonist) | |||
| 2-propanol | VWRSP | BDH1133 | |
| Chloriding solution | Sigma | assorted | 25 g FeCl3 + 25 ml concentrated HCl + 50 ml H2O |
| Sylgard silicone 2-part polymer | World Precision Instruments (WPI) | SYL184 | Provides pin-out surface for small dissection dishes |
| 0-40x zoom magnification microscope for dissections | Wild | ||
| Techniquip 150 Watts Fiber Optic Illuminator | Microoptics of Florida | TQ FOI-150 | |
| RotoMix 50800 orbital mixer | |||
| Nikon Diaphot inverted phase-contrast microscope with 4x, 20x (optional) & 40x objectives | SR Research Ltd. | Eyelink II | |
| Tektronix digital oscilloscope | SR Research Ltd. | ||
| pClamp 10 data acquisition and analysis software | Molecular Devices | ||
| PC with Windows XP or higher operating system | PC Solutions | Thinkserver with solid state hard drives (80GB) and low noise monitors | |
| Flaming/Brown P87 micropipette puller | Sutter Instruments, Novato, CA | ||
| Axon Instruments Axopatch 200B clamp amplifier with a capacitance compensation range of 1-1000 pF; preamplifier | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | ||
| Axon instruments electrode holder assembly for Axopatch 200B preamplifier | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | CV203BU | |
| Digidata 1200 A/D converter | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | ||
| Picospritzer, powered by N2 adjustable for pressure and duration | Parker Hannifin, Cleveland, OH | ||
| TMC Micro-G Vibration isolation table | Ametek | ||
| Faraday cage | custom manufacture | ||
| Burleigh Piezoelectric Clamshell Micromanipulators | Burleigh Instruments; Thorlabs | presently PCS-5000; -6000 series + mounts | |
| Narishige M-152 manual manipulators (for perfusion system and picospritzer) | Narishige USA | ||
| Filament pipette glass,1.5 mm OD, 0.84 mm ID - | WPI | 1B150-3 | |
| 3 inch length | |||
| Ag/AgCl half cell | WPI | EP4 | |
| 15 ml centrifuge tubes, 35-2097 BD Falcon* Centrifuge Tubes | VWRSP | 21008-918 | |
| Angled Scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | |
| Dumostar Fine forceps | Fine Science Tools | 11295-00 | |
| 35 mm falcon tissue culture dishes | VWRSP | 25382-064 | |
| falcon 150 x 25 mm tissue culture dishes; 1013 | VWRSP | 1013 | also can be made into small dissection dishes with sylgard |
| sylgard | WPI | SYL184 | |
| animal dissection tray | various | ||
| 15 ml centrifuge tubes, 35-2097 BD Falcon | VWRSP | 21008-918 | For 6-bore gravity-fed perfusion system |
| Aluminum clips with screw hole ends | hardware store | For perfusion system | |
| 23 gauge needles (manually file off points) | VWRSP | For perfusion system | |
| Polyethylene tubing 0.022"ID x 0.042"OD; 427411 | Becton-Dickinson | For perfusion system | |
| H-7 pipette stand/holder for microcap perfusion array | Narishige USA | For perfusion system | |
| one-way valves | For perfusion system | ||
| Drummond Microcaps 1 μl | VWRSP | For perfusion system | |
| 18 gauge needles for suction (filed off points) | |||
| Polyethylene tubing | Cole Parmer | 4.27436E+11 | |
| fine dissection pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| capillary tubes | Kimble 71900-100 | fire-polished and U-shaped in a Bunsen burner flame and filled with 3% agar in ECS | |
| modeling clay | craft store | ||
| dish holder for microscope stage with isolated ground bath | Custom manufacture | ||
| pasteur pipettes | VWRSP | 14672-412 | |
| pipette bulbs | VWRSP | 53283-911 | |
| acrodisk syringe filters | VWRSP | 28144-040 | |
| thick-walled 1.5 mm diameter borosilicate filament glass | WPI | 1B150F-3 | |
| High purity nitrogen cylinder and bifurcating regulator | |||
Tables 1-3. Lists of Reagents, Materials, and Equipment. |
|||
References
- Buttner, N., Siegelbaum, S. A. Antagonistic modulation of a hyperpolarization-activated Cl(-) current in Aplysia sensory neurons by SCP(B) and FMRFamide. J. Neurophysiol. 90 (2), 586-598 (2003).
- Byrne, J. H., Castellucci, V. F., Kandel, E. R. Contribution of individual mechanoreceptor sensory neurons to defensive gill-withdrawal reflex in Aplysia. J. Neurophysiol. 41 (2), 418-431 (1978).
- Carlson, S. L., Fieber, L. A. Physiological evidence that D-Aspartate activates a current distinct from ionotropic glutamate receptor currents in Aplysia californica. J. Neurophysiol. 106 (4), 1629-1636 (2011).
- Carlson, S. L., Kempsell, A. T., Fieber, L. A. Pharmacological evidence that D-Aspartate activates a current distinct from ionotropic glutamate receptor currents in Aplysia californica. Br. Behav. 2 (4), 391-401 (2012).
- Fieber, L. A. Characterization of Na+ and Ca2+ currents in bag cells of sexually immature Aplysia californica. J. Exp. Biol. 201 (5), 745-754 (1998).
- Fieber, L. .A., Carlson, S. L., Capo, T. R., Schmale, M. C. Changes in D-Aspartate ion currents in the Aplysia nervous system with aging. Br. Res. 1343, 28-36 (2010).
- Glansman, D. L. Habituation in Aplysia: The Cheshire Cat of neurobiology. Neurobiol. Learn. Mem. 92, 147-154 (2009).
- Hawkins, R. D., Abrams, T. W., Carew, T. J., Kandel, E. R. A Cellular Mechanism of Classical Conditioning in Aplysia: Activity-Dependent Amplification of Presynaptic Facilitation. Science, New. 219 (4583), 400-405 (1983).
- Ichinose, M., Sawada, M., Maeno, T., McAdoo, D. J. Effect of acetylcholine on ventrocaudal sensory neurons in the pleural ganglia of Aplysia. Cell Mol. Neurobiol. 9, 233-245 (1989).
- Kandel, E. R. Cellular basis of behavior. , W.H. Freeman. New York. (1976).
- Kandel, E. R. The molecular biology of memory storage: a dialog between nerves and synapses. Science. 294 (5544), 1030-1038 (2001).
- Kupfermann, I., Castellucci, V., Pinsker, H., Kandel, E. Neuronal correlates of habituation and habituation of the gill-withdrawal reflex in Aplysia. Science. 167 (3926), 1743-1745 (1970).
- Magoski, N. S. Regulation of an Aplysia bag-cell neuron cation channel by closely associated protein kinase A and a protein phosphatase. J. Neurosci. 24 (30), 6833-6841 (2004).
- R, E. Neuronal transcriptome of Aplysia: neuronal compartments and circuitry. Cell. 127, 1453-1467 (2006).
- Nick, T. A., Kaczmarek, L. K., Carew, T. J. Ionic currents underlying developmental regulation of repetitive firing in Aplysia bag cell neurons. J. Neurosci. 16 (23), 7583-7598 (1996).
- Single-channel recording. Sakmann, B., Neher, E. , Plenum Press. NY. (1995).
- Tam, A. K., Geiger, J. E., Hung, A. Y., Groten, C. J., Magoski, N. S. Persistent Ca2+ current contributes to a prolonged depolarization in Aplysia bag cell neurons. J. Neurophysiol. 102 (6), 3753-3765 (2009).
- Schacher, S., Proshansky, E. Neurite regeneration by Aplysia neurons in dissociated cell culture: modulation by Aplysia hemolymph and the presence of the initial axonal segment. J. Neurosci. 3 (12), 2403-2413 (1983).
- Walters, E. T., Byrne, J. H., Carew, T. J., Kandel, E. R. Mechanoafferent neurons innervating tail of Aplysia. I. Response properties and synaptic connections. J. Neurophysiol. 50 (6), 1522-1542 (1983).
- Wilson, G. F., Richardson, F. C., Fisher, T. E., Olivera, B. M., Kaczmarek, L. K. Identification and characterization of a Ca(2+)-sensitive nonspecific cation channel underlying prolonged repetitive firing in Aplysia neurons. J. Neurosci. 16 (11), 3661-3671 (1996).
- White, B. H., Nick, T. A., Carew, T. J., Kaczmarek, L. K. Protein kinase C regulates a vesicular class of calcium channels in the bag cell neurons of Aplysia. J. Neurophysiol. 80 (5), 2514-2520 (1998).
- Wilson, G. F., Magoski, N. S., Kaczmarek, L. K. Modulation of a calcium-sensitive nonspecific cation channel by closely associated protein kinase and phosphatase activities. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95 (18), 10938-10943 (1998).
- Zhao, Y., Wang, D. O., Martin, K. C. Preparation of Aplysia sensory-motor neuronal cell cultures. J. Vis. Exp. (28), e1355 (2009).
