Summary
يوفر شبكية العين الفئران حديثي الولادة نموذجا الفسيولوجية تتميز كذلك من الأوعية الدموية، والذي يسمح التحقيقات عن دور الجينات المختلفة أو الأدوية التي تعدل الأوعية الدموية في
Abstract
الأوعية الدموية هي عملية معقدة من جديد تشكيل الأوعية الدموية التي يحددها تنتشر الأوعية الدموية الجديدة من شبكة الأوعية الموجودة من قبل. الأوعية الدموية تلعب دورا رئيسيا ليس فقط في التطور الطبيعي للأعضاء وأنسجة، ولكن أيضا في كثير من الأمراض التي تشكل الأوعية الدموية هو dysregulated، مثل السرطان والعمى والأمراض الدماغية. في حياة الكبار، والأوعية الدموية هي هادئة عموما حتى الأوعية الدموية هو هدف هام لتطوير العقاقير الرواية في محاولة لتنظيم تشكيل السفينة الجديدة وتحديدا في المرض. من أجل فهم أفضل الأوعية الدموية، ووضع استراتيجيات ملائمة لتنظيم ذلك، يطلب من النماذج التي تعكس بدقة الخطوات البيولوجية المختلفة التي ينطوي عليها. يوفر شبكية العين حديثي الولادة الماوس نموذجا ممتازا من الأوعية الدموية بسبب الشرايين والأوردة والشعيرات الدموية تطوير لتشكيل الضفيرة الوعائية خلال الأسبوع الأول بعد الولادة. يحتوي هذا النموذج أيضا الاستفادة من وجود اثنين من ديmensional (2D) هيكل صنع تحليل بسيط مقارنة مع التشريح المعقدة 3D من شبكات الأوعية الدموية الأخرى. من خلال تحليل الشبكية الوعائية الضفيرة في أوقات مختلفة بعد الولادة، فمن الممكن لمراقبة مراحل مختلفة من الأوعية الدموية تحت المجهر. توضح هذه المقالة إجراءات واضحة لتحليل الأوعية الدموية من شبكية العين باستخدام الماوس تلطيخ الفلورسنت مع الأجسام المضادة المحددة isolectin والأوعية الدموية.
Introduction
الأوعية الدموية هي عملية معقدة التنموية التي حددها تشكيل الأوعية الدموية الجديدة من شبكة الأوعية الموجودة مسبقا ويتم تنظيمها من قبل عدة مسارات الإشارات. وأبرز هذه هو الطريق VEGF. يتم تحريرها من قبل خلايا VEGF الدماغية ويؤدي إلى بدء عائية تنتشر في الأوعية الدموية المجاورة. الخلية البطانية الرائدة من الأوعية الدموية الجديدة تنبت هو 'غيض' الخلية، التي تنتج أرجل كاذبة خيطية التي تصل إلى نحو مصدر VEGF، وتبعتها تكاثر الخلايا البطانية "ساق". في هذه الطريقة، تنشيط الخلايا البطانية وتهاجر تتكاثر نحو المنطقة اوعائية حيث أنها تشكل أنابيب الأوعية الدموية الجديدة. من أجل تحقيق الاستقرار في هذه الأنابيب لدعم تدفق الدم، والخلايا البطانية التفاعل مع pericytes وخلايا العضلات الملساء، التي تحيط الأوعية الدموية الجديدة 1. تكوين الأوعية الدموية ضروري لالأوعية الدموية للجنين والأنسجة المتنامية. ومع ذلك، فإنه يساهم أيضا في العديد من pathologiاضطرابات كال مثل السرطان، في حين ترتبط عيوب في الأوعية الدموية مع الأمراض الدماغية. وبالتالي فإن تطوير علاجات فعالة المخدرات لتنظيم الأوعية الدموية كوسيلة لعلاج المرض هو من مصلحة كبيرة. على سبيل المثال، سوف العوامل المضادة للعائية فعالة لحد من نمو السرطان، في حين استراتيجيات الموالية للعائية يمكن أن تستخدم لعلاج الأمراض الدماغية. وهكذا، ونماذج من الأوعية الدموية ضرورية لفهم أفضل لتنظيم تشكيل سفينة جديدة وتطوير استراتيجيات علاجية جديدة لتعزيز نمو الأوعية الدموية أو نقصان.
ومن العناصر الأساسية للبحث الأوعية الدموية هو اختيار نموذج الأوعية الدموية المناسبة. وقد تم العديد من نماذج في المختبر يهدف إلى إعادة إنتاج الخطوات الأساسية لتكوين الأوعية الدموية مثل هجرة الخلايا البطانية، وانتشار وبقاء 2،3. A المستخدمة بشكل متكرر في المختبر فحص هو تشكيل شبكة متفرعة من الخلايا البطانية على مصفوفة Matrigel، على الرغم من ربلاده ليست محددة لخلايا بطانة الأوعية الدموية، كما أنها لا تتضمن عادة بدعم من pericytes أو خلايا العضلات الملساء. تقييم تنتشر الأوعية الدموية خارج الجسم باستخدام الماوس ثقافة الجهاز مثل فحص الجسم مضغي الشكل، ومقايسة حلقة الأبهر وفحص مشط القدم الجنين يسمح للتحليل من الأوعية الدموية من الخلايا البطانية في سياق خلايا داعمة إضافية. ومع ذلك، فإن القيود الرئيسية من هذه المقايسات تشمل نقص تدفق الدم والانحدار من السفن على مر الزمن، وإعطاء نافذة محدودة للتحليل. لذلك، لفهم تنظيم الأوعية الدموية على نحو أدق، في النماذج الحية مطلوبة مثل تلك التي وضعت في الماوس باستخدام الإسفنج مزروع تحت الجلد أو المقابس matrigel، وكذلك هند أطرافهم نموذج نقص التروية. ومع ذلك، فإن هذه النماذج تشكل تحديا لتحليل ويرجع ذلك إلى بنية معقدة 3D من neovessels. في المقابل، فقد ثبت أن الجنين الزرد نموذجا ممتازا لتصور الأوعية الدموية في كاملالكائن الحي 4. ومع ذلك، فإن الفأر هو متعلق تطويريا أكثر من ذلك بكثير عن كثب إلى الإنسان من الزرد، مما يجعل الماوس على النموذج المفضل في كثير من الحالات. وبالتالي تكوين الأوعية الدموية في شبكية العين الماوس بعد الولادة يمثل طريقة تتسم جيدا من خيار للأبحاث الأوعية الدموية. لأنه لا يوفر بيئة الفسيولوجية، ولكن أيضا 2D الضفيرة الوعائية التي يمكن تصور بسهولة باستخدام البقع الفلورسنت المناسب. الهندسة المعمارية للشبكة سفينة، وانتشار البطانية، تبرعم، تجنيد خلية حول الأوعية وإعادة عرض السفينة يمكن لجميع يتم التحقيق باستخدام هذه التقنية.
في شبكية العين الماوس حديثي الولادة، وتطوير الأوعية الدموية في شبكية العين يحدث في الأسبوع الأول من الحياة بعد الولادة. الفئران، على عكس البشر، ولدوا مكفوفين وشبكية العين تصبح أوعية دموية فقط بعد الولادة. تنشأ الأوعية الشبكية من وسط إغلاق الشبكية إلى العصب البصري في يوم ما بعد الولادة 0 (P0)، وتطوير من قبل الأوعية الدموية لتشكيل تنظيم للغايةد الضفيرة الوعائية التي تصل إلى محيط الشبكية بنحو P8 5. الأوعية الدموية تطوير بطريقة مميزة مع الضفيرة الشعرية متزايد تدريجيا نحو الخارج من القرص البصري نحو المحيط الخارجي لتوليد نمط بالتناوب العادية من الشرايين والأوردة مع شبكة الشعرية التدخل. يوفر الأوعية الدموية في شبكية العين وهو نموذج مثالي لدراسة الأوعية الدموية والأوعية ويمكن التعرف عليها بسهولة لأنها تنمو في ما هو في الأساس طائرة 2D، مما يجعل من السهل نسبيا لفحص الأوعية الدموية في شبكية العين في الاستعدادات مسطحة جبل 5. وتم الإبلاغ عن طريقة لعزل شبكية العين الولدان الماوس لتحليل استجابات الخلايا البطانية طرف على مدى عدة ساعات خارج الجسم 6. بدلا من ذلك، تحقيقا أكثر تفصيلا من الأوعية الدموية في شبكية العين بأكملها وعلامات الأوعية الدموية المرتبطة بها يتطلب المناعية من العينات الشبكية الثابتة في مراحل مختلفة من التنمية.
هنا نقدموصفا مفصلا لطريقة موثوقة وتقنيا على التوالي إلى الأمام التي نستخدمها لكامل تلطيخ جبل من الفئران الشبكية الوعائية الضفيرة، من قلع الأولي من العين بعد الولادة (انظر أيضا 7) من خلال بروتوكولات تلطيخ إلى التصوير النهائية تحت المجهر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
يتم تنفيذ جميع الخطوات في درجة حرارة الغرفة، ما لم يرد خلاف ذلك.
1. قلع والتثبيت من العيون بعد الولادة
- ضع مؤشر الفأرة قتل إنسانية الجرو على جانبها، وإزالة الجلد الذي يغطي العين مع مقص.
- استخدام مقص وملقط لاستأصل العين.
- مكان مقص تحت العين منزوعة النواة، وقطع العصب البصري والأنسجة المحيطة بها واخراج العين. نقل إلى لوحة 24 أيضا تحتوي على امتصاص العرق 4٪ (PFA) تتكون في 2X PBS في درجة حرارة الغرفة.
- تسمح كل عين لإصلاح لمدة 10 - 15 دقيقة، ثم نقل إلى 2X الباردة برنامج تلفزيوني على الجليد لمدة 5 - 10 دقيقة. فمن الأفضل لارباك enucleations والتثبيت لاحقة لضمان درجة من التثبيت تساوي لكل عين.
2. تشريح الفئران شبكية العين بعد الولادة
- عيون نقل إلى طبق بتري تحتوي على 2X PBS باستخدام ماصة باستير البلاستيك التي تم قطع لتوسيع الفتحة ومكان تحت ديسيهcting المجهر.
- إزالة أي دهون حول العين باستخدام ملقط ومقص.
- بيرس حافة القرنية مع مقص حاد وقطع حول القرنية والقزحية وتجاهل.
- إدراج ملقط بين شبكية العين والصلبة وإزالة الصلبة مع الحرص على عدم تمزق شبكية العين. ويمكن أيضا أن إزالة طبقة المشيمية، ولكن إذا كان هناك خطر من تلف في الشبكية التي تحدث خلال هذه الخطوة، يمكن أن تترك طبقة المشيمية على ما ينبغي أن لا تؤثر تأثيرا كبيرا على نوعية المناعية.
- إزالة العدسة والنكتة الزجاجي باستخدام ملقط.
- إزالة السفن hyaloids عن طريق جمع بعضهم البعض في وسط العين مع ملقط غرامة ثم سحب بسرعة بعيدا عن مركز الشبكية (بدلا من قص في قاعدة السفن الجسم الزجاجي مع مقص غرامة).
- شطف شبكية العين على شكل كوب مع برنامج تلفزيوني في طبق بيتري نظيفة.
- جعل 4-5 شقوق شعاعي التوصل إلى ما يقرب من 2/3 من دائرة نصف قطرها من شبكية العين باستخدام الربيع scissoRS لإنشاء شكل "البتلة".
- رسم قبالة PBS باستخدام ماصة باستور لشد شبكية العين، ثم قم بإزالة أي برنامج تلفزيوني الزائدة مع قطعة صغيرة من ورقة ماصة.
- ببطء ماصة البارد (-20 ° C) قطرة قطرة الميثانول على سطح شبكية العين حتى تغطيها تماما ثم الفيضانات مع الميثانول إضافية. هذا سوف يساعد على إصلاح شبكية العين وسيسهل permeabilization. سوف تتحول شبكية العين البيضاء.
- نقل إلى أنبوب مل 2 باستخدام ماصة باستير البلاستيك التي تم قطع لتوسيع الفتحة.
- ترك شبكية العين في الميثانول البارد لمدة 20 دقيقة على الأقل قبل الشروع في المناعية. من الأجسام المضادة المستخدمة هنا، لا يمكن أن تستخدم فقط VE كادهيرين بنجاح على شبكية العين الثابتة الميثانول. في هذه الحالة تحتاج إلى شبكية العين والمضي قدما على التوالي لالمناعية بعد الخطوة 9.
- إذا لزم الأمر، ويمكن تخزين شبكية العين في الميثانول عند درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى عدة أشهر قبل تلطيخ.
3. المناعية / تلطيخ isolectin من Vascu الشبكيةlature
- إزالة بعناية / صب قبالة الميثانول وشطف بلطف شبكية العين لفترة وجيزة في برنامج تلفزيوني (في هذه المرحلة شبكية العين لا يزال في نفس أنبوب 2 مل من الخطوة 11 أعلاه).
- إزالة برنامج تلفزيوني وتغطية شبكية العين مع 100 ميكرولتر من بيرم / كتلة الحل (PBS + 0.3٪ تريتون + 0.2٪ BSA) + 5٪ من المصل المناسب (انظر الجدول 1) ويهز بلطف لمدة 1 ساعة.
- إزالة بيرم / كتلة واحتضان شبكية العين مع لطيف تهتز بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية مع 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية المحددة (انظر الجدول 1) و / أو IsolectinB4، جميع عن طريق تمييع في بيرم / كتلة استعداد.
- إزالة الأجسام المضادة / isolectin وغسل شبكية العين 4 × 10 دقيقة في برنامج تلفزيوني + 0.3٪ تريتون (PBSTX).
- في بعض الحالات، على سبيل المثال تلطيخ التالية مع IsolectinB4-Alexa488 أو الأجسام المضادة الأولية مترافق مباشرة، غير مطلوب الأجسام المضادة الثانوية، ويمكن تركيبه شبكية العين مباشرة (الخطوة 7). عندما تم استخدام الأجسام المضادة الأولية اللامقترن في الخطوة 3، ثم 100 ميكرولتر من فلور المناسبةيتم إضافة الأجسام المضادة الثانوية escent (مخفف 1/200 في PBSTX) وتترك لاحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية أو لمدة 4 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- إزالة الأجسام المضادة الثانوية وغسل شبكية العين 4 × 15 دقيقة في 2 مل PBSTX.
- نقل شبكية العين على الشرائح باستخدام البلاستيك تتحمل واسعة باستور ماصة وإزالة الأنسجة الزائدة مع PBSTX ماصة لل. جبل شبكية العين عن طريق إضافة 50 ميكرولتر من إطالة مرس على ساترة والموقف برفق فوق الشبكية.
- نقل الشرائح إلى الثلاجة بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية، وضمان أن تكون مسطحة ومحمية من الضوء، للسماح للإطالة مرس لتعيين.
- شبكية العين صورة باستخدام مجهر متحد البؤر المجهر أو epifluorescence.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
بعد تشريح الشبكية يجب أن تبدو وكأنها زهرة شقة (الشكل 1). باستخدام بروتوكول، المشار إليها أعلاه، يمكن اعتبار الخلايا البطانية باستخدام isolectin تلطيخ B4-Alexa488 ودعم خلايا العضلات الوعائية هي تصور استخدام الألغام المضادة للأكتين العضلات الملساء ألفا (الشكل 2). وجهة النظر الطاقة المنخفضة باستخدام الهدف 5X في الشكل 2 يسمح لمحة عامة عن المنظمة الأوعية الدموية في شبكية العين. أيضا، باستخدام مجموعة مختلفة من الأجسام المضادة الواردة في البروتوكول أعلاه، يمكن اعتبار الخلايا البطانية استخدام الألغام المضادة للCD31 المناعية وينظر pericytes دعم باستخدام الأجسام المضادة ضد NG2 (الشكل 3) أو desmin (الشكل 4). تلطيخ المضادة للdesmin مفيد لتصور الاصبع مثل العمليات من pericytes وتحديد ما إذا كانت ترتبط بشكل وثيق مع الخلايا البطانية. في المقابل، تلطيخ المضادة للNG2 يحدد نوى كل خلية حوطية، وهو أمر مفيد عندماتحديد عدد الخلايا خلية حوطية على الأوعية الدموية. وسوف يتم ذلك من خلال إحصاء عدد الخلايا في مجال الرؤية باستخدام الطاقة العالية (مثل 60X) هدف. إذا لزم الأمر، تركيبات بديلة من الأجسام المضادة يمكن أن تستخدم أيضا (انظر الجدول 1)، على سبيل المثال، ومكافحة الكولاجين الرابع هو مفيد لتصور الغشاء القاعدي الأوعية الدموية. شبكية العين التي تم ملطخة عن الخلايا البطانية ويمكن تحليلها عن الملامح الرئيسية الأوعية الدموية مثل تطور الأوعية الدموية من مركز نحو حافة الشبكية، وكثافة الأوعية الدموية والأوعية تردد المتفرعة.
الشكل 1. مظهر الشبكية حديثي الولادة مباشرة بعد تشريح وبالإضافة إلى ذلك من الميثانول. يتم أخذ هذه الصورة باستخدام زايس STEMI SV6 وAxiocam HR كاميرا ج.
الشكل 2. المناعية من جبل بأكمله شبكية العين (العمر P7) مع Isolectin B4-Alexa488 (الأخضر) (A)، وتؤخذ مكافحة ألفا أكتين العضلات الملساء-CY3 (أحمر) (B) أو المدمجة (C). هذه الصور مع axioimager زايس و الكاميرا إدارة الموارد البشرية Axiocam باستخدام الهدف 5X. لاحظ نمط بالتناوب من الشرايين والأوردة. يتم التعرف على الشرايين عن طريق المنطقة الحرة الشعرية التي تحيط بهم على الفور، والمغلفة مع خلايا العضلات الملساء التي وصمة عار إيجابية (الحمراء) لسلسة ألفا أكتين العضلات. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .
load/50546/50546fig3highres.jpg "SRC =" / files/ftp_upload/50546/50546fig3.jpg "/>
الشكل 3 المناعية مزدوجة من جبل بأكمله شبكية العين (العمر P6) مع الأجسام المضادة الأولية مكافحة CD31 (الكشف مع مكافحة الفئران مفتش مترافق إلى Alexa488، أخضر، A)؛. والأجسام المضادة الأولية المضادة للNG2، الكشف مع المضادة للأرنب مفتش مترافق إلى اليكسا 594 (أحمر، B). وقد أخذت هذه الصور متحد البؤر باستخدام الهدف 60X الجمع بين المسح الصور ليزر من 13 Z شرائح، كل من سماكة 0.47 ميكرون. تراكب الصور في C تظهر الخلايا البطانية إيجابية CD31 (الخضراء) وpericytes إيجابية NG2 (الحمراء). انقر هنا لعرض أكبر شخصية .
الشكل 4 المناعية مزدوجة من جبل بأكمله شبكية العين (العمر P6) مع الأجسام المضادة الأولية مكافحة CD31 (الكشف مع مكافحة الفئران مفتش مترافق إلى Alexa488، أخضر، A)؛. والأجسام المضادة الأولية المضادة للdesmin، الكشف مع المضادة للأرنب مفتش مترافق إلى اليكسا 594 (أحمر، B). وقد أخذت هذه الصور متحد البؤر باستخدام الهدف 60X الجمع بين المسح الصور ليزر من 21 شرائح Z، كل من سماكة 0.24 ميكرون. تراكب الصور في C تظهر الخلايا البطانية إيجابية CD31 (الخضراء) وpericytes إيجابية desmin (الحمراء). انقر هنا لعرض أكبر شخصية .
| الأجسام المضادة الأولية | تخفيف العمل | عرقلة الحل (المصل + بيرم / بلوك) | الأجسام المضادة الثانوية |
| مكافحة NG2 (شوندرويتين كبريتات بروتيوغليكان) 1:250 | مصل الماعز 5٪ | الماعز المضادة أرنب اليكسا 594 | |
| مكافحة GFAP | 1:500 | مصل الماعز 5٪ | الماعز المضادة الماوس اليكسا 488 |
| مكافحة Desmin | 1:500 | مصل الماعز 5٪ | الماعز المضادة أرنب اليكسا 594 |
| مكافحة الكولاجين IV | 1:200 | مصل الماعز 5٪ | الماعز المضادة أرنب اليكسا 594 |
| مكافحة الإندوجلين الموجود | 1:100 | مصل الماعز 5٪ | الماعز المضادة الفئران اليكسا 594 |
| مكافحة CD31 | 1:500 | مصل الماعز 5٪ | الماعز المضادة الفئران اليكسا 488 |
| مكافحة VE كادهيرين | 01:10 | مصل الماعز 5٪ | الماعز المضادة الفئران اليكسا 594 |
| مكافحة Alk1 | 01:25 | 5٪ المصل حمار | حمار المضادة الماعز اليكسا 594 |
| مكافحة ASMA-Cy5 | 1:100 | <TD> بلوك بيرم فقطN / A |
الجدول 1. أمثلة على الأجسام المضادة الأولية لتلطيخ مناعي من شبكية العين كلها جبل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الطريقة المعروضة هنا يوفر وسيلة بسيطة وفعالة للحصول على صور من التحضيرات الملون جبل بأكمله من شبكية العين الماوس حديثي الولادة، مما يجعلها نموذجا للقياس الكمي بسهولة وذات الصلة من الناحية الفسيولوجية من الأوعية الدموية. في البداية، يمكن للعين الماوس يكون من الصعب جدا لتشريح نظرا لصغر حجم وشكل العالم، لذلك هناك حاجة لبعض الممارسات وأدوات تشريح جيد للنتائج موثوقة. تشريح عيون أعدت في تركيز 2X من برنامج تلفزيوني مهم لأن هذا يؤدي إلى كمية صغيرة من فقدان الماء من العين ويقلل من الضغط داخل المداري، مما يسهل تشريح. التحضير الجيد للشبكية مهم لعدة أسباب. لأول مرة يحافظ على سلامة الأوعية الدموية. ثانيا، إذا لم يتم إزالة الجسم الزجاجي الأوعية الدموية جيدا أنه يقلل من كفاءة تلوين الأجسام المضادة، مما يؤدي إلى مستويات عالية من خلفية وانخفضت القرار. قد تحدث هذه المشكلة أيضا إذا كان الوقت تثبيت PFA من شبكية العين طويل جدا. ومع ذلك،قبل تلطيخ والتخزين على المدى الطويل تصل إلى عدة شهور في الميثانول في الفريزر -20 درجة مئوية مناسبة قبل تلطيخ isolectin وبالنسبة لمعظم الأجسام المضادة في الجدول 1. على الرغم من تلطيخ isolectin نادرا ما يكون مشكلة، فإنه لا الضامة وصمة عار بالإضافة إلى الخلايا البطانية. لالمناعية جيدة من جبل بأكمله شبكية العين، واختيار من الأجسام المضادة أمر بالغ الأهمية، ويجب أن تتكيف بروتوكول تلطيخ وفقا لخصوصية الأجسام المضادة وتركيز، والتي قد تختلف بين دفعات عندما تستخدم الأجسام المضادة. وعادة ما يمكن أن تخفض خلفية عالية عن طريق خفض تركيز الأجسام المضادة، وزيادة وقت غسل أو إضافة المزيد من المنظفات لغسل الخطوات. يتم aliquoted الأجسام المضادة لدى وصوله وتخزينها على النحو المشار إليه من قبل الشركة المصنعة. لتلك التي يتم تخزينها في -20 درجة مئوية، ويتم الاحتفاظ قسامة العمل في الثلاجة لتجنب دورات متكررة من تجميد ذوبان الجليد. إذا تظهر بقع الفلورسنت الساطع على عينة الملون، خاصة إذا كان هذا موجود أيضافي المنطقة المحيطة الأنسجة، وهذا يشير إلى المجاميع عجلت من الأجسام المضادة موجودة التي ينبغي إزالتها في جميع التجارب اللاحقة بواسطة الطرد المركزي الأجسام المضادة ل 10،000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق قبل الاستخدام. بعض الأجسام المضادة المستخدمة حاليا من قبل مختبرات لدينا هي في لائحة المواد مع التخفيف المناسبة (الجدول 1). اختيار مزيج من الأجسام المضادة متوافقة مهم جدا لتجنب رد فعل غير مرغوب فيها عبر بين الأجسام المضادة الأولية والثانوية. انتشار الخلايا يمكن رصدها عن طريق حقن الفئران بمحلول مكون من BrdU ما يقرب من ساعتين قبل حصاد الأنسجة. يتم دمج هذه التماثلية الثايمين إلى تكاثر الحمض النووي ويمكن الكشف باستخدام الأجسام المضادة لمكافحة BrdU محددة، كما هو موضح سابقا 8.
كل شبكية العين هي هشة للغاية، ولكن يمكن أن تكون ملطخة عن علامات الأوعية الدموية المختلفة عن طريق معالجة الأنسجة بلطف بينما تعمل من خلال بروتوكول. وهناك عدد من الضوابط فيكل تجربة لإظهار خصوصية تلطيخ. سوف شبكية العين دون علاج تكشف عن درجة من تألق ذاتي في الأنسجة، والتي ينبغي أن تكون ضئيلة. وسوف أي سيطرة الأجسام المضادة الأولية تسمح تحديد غير محددة وملزمة من الأجسام المضادة الثانوية للأنسجة. يمكن شبكية العين التي تمزقت بطريق الخطأ أثناء تشريح الأنسجة مفيدة لتوفير الضوابط. بعد تصاعد مستمر، ويتم الاحتفاظ تلطيخ الفلورسنت لعدة أيام طالما يتم تخزين الشرائح في 4 درجات مئوية في الظلام. تم تحسين التصوير بواسطة المجهر epifluorescent عن طريق استخدام لapotome، الذي يزيل من ضوء التركيز. بدلا من ذلك، الفحص المجهري متحد البؤر يوفر دقة التصوير خلية محددة (الشكلان 3 و 4).
هذه الطريقة لها العديد من التطبيقات الممكنة. ويمكن تطبيقه على الفئران التي تنضب الجينات الرئيسية التي تنظم الأوعية الدموية، بما في ذلك العمل الذي يستخدم محرض جنة المساواة العرقية، loxP الوراثة 8-10. وبدلا من الأوعية الدموية في شبكية العين يمكن أن تكونتسليم علاجات دوائية التالية استجوابه إما بشكل منتظم أو داخل ocularly للتحقيق الموالية أو المعارضة عائية آثارها 11. ومن الممكن أيضا للاستفادة من الأدوات المتاحة المعدلة وراثيا واستخدام GFP أو طلب تقديم العروض الفئران المعدلة وراثيا لتصور العناصر الرئيسية في الأوعية الدموية في شبكية العين 11،12. (لاحظ أن تثبيت باستخدام PFA 4٪ في برنامج تلفزيوني لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة ويستخدم في مكان من الميثانول للخطوة 2.12 من البروتوكول قبل التصوير الذاتية GFP أو طلب تقديم العروض في شبكية العين من الفئران المعدلة وراثيا.) وعلاوة على ذلك، من أجل دراسة الإشارات الجزيئية آليات، فمن المفيد أن تصور التعبير مرنا من جينات معينة في الضفيرة شبكية العين باستخدام التهجين في الموقع 13 في.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.
Acknowledgments
وقد تم تمويل هذا العمل من قبل ويلكوم ترست ومؤسسة القلب البريطانية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Plastic pipettes 3 ml | Scientific Laboratory Supplies | PIP4210 | Remove tip with scissors to create a wide bore |
| BD Falcon 24-well plates | Scientific Laboratory Supplies | 353226 | |
| Select Petri dishes TV 90 mm | Scientific Laboratory Supplies | SLS2002 | |
| Histobond slides | VWR | 631-0624 | |
| Coverslips 22 x 22 mm | VWR | 631-1336 | |
| Dumont Tweezers #5 | World precision instruments | 14095 | |
| Spring scissors 10.5 cm long, with straight 8 mm blades | World precision instruments | 501235 | Used for enucleation |
| Vannas scissors 8.5 cm long, with straight 7 mm blades, and 0.025 x 0.015 mm superfine tips | World precision instruments | 500086 | Used for dissecting retina |
| Superfine vannas scissors 8 cm long with straight 3 mm blades, and 0.015 x 0.015 mm superfine tips | World precision instruments | 501778 | Used for dissecting retina |
| crystal clear’ tubes 2 ml | Starlab | E1420-2000 | |
| Reagents | |||
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S0876 | PBS reagent |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P5655 | PBS reagent |
| Sodium chloride | Sigma | S9625 | PBS reagent |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Make up in 2x PBS and store at -20 °C |
| BSA | Sigma | A7638 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
| Donkey serum | Sigma | D9663 | |
| Goat serum | Vector | S-1000 | |
| Prolong Gold anti-fade reagent | Invitrogen | P36930 | Mounting reagent |
| Isolectin GS-IB4-alexa 594 | Invitrogen | I21413 | Use at 1:200 dilution |
| Isolectin GS-IB4-alexa 488 | Invitrogen | I21411 | Use at 1:200 dilution |
| Primary Antibodies | |||
| Anti-NG2 (rabbit polyclonal ) | Millipore | AB5320 | Detects pericytes |
| Anti-GFAP (clone GA5, mouse monoclonal) | Millipore | MAB360 | Detects astrocytes |
| Anti-Desmin (clone Y66, rabbit monoclonal) | Millipore | 04-585 | Detects pericytes |
| Anti-Collagen IV (rabbit polyclonal ) | Chemicon | AB756P | Detects vascular basement membrane |
| Anti-alpha smooth muscle actin-Cy3 (clone 1A4, mouse monoclonal) | Sigma | C6198 | Detects vascular smooth muscle cells. |
| Anti-Endoglin (clone MJ7/18, rat monoclonal) | BD Pharmingen | 550546 | Detects endothelial cells |
| Anti-CD31 (clone MEC13.3, rat monoclonal) | BD Pharmingen | 553370 | Detects endothelial cells |
| Anti-VE-Cadherin (clone 11D4.1, rat monoclonal) | BD Pharmingen | 550548 | Detects endothelial cell junctions |
| Anti-Alk1 (goat polyclonal) | R&D Systems | AF770 | Detects endothelial cells |
| Secondary Antibodies | |||
| Goat anti-rabbit-Alexa594 | Invitrogen | A11012 | All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C. |
| Goat anti-rat-Alexa488 | Invitrogen | A11006 | All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C. |
| Goat anti-rat-Alexa594 | Invitrogen | A11007 | All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C. |
| Goat anti-mouse-Alexa488 | Invitrogen | A11029 | All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C. |
| Donkey anti-goat-Alexa594 | Invitrogen | A11058 | All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C. |
| Microscopes | |||
| Dissection microscope | Zeiss | Stemi SV6 | |
| Camera | Zeiss | Axiocam HRc | Camera for dissection microscope |
| Epifluorescent Microscope | Zeiss | Axioimager with Apotome | |
| Camera | Zeiss | Axiocam HRm | Camera for Axioimager |
| Confocal Microscope | Nikon | A1R | |
References
- Carmeliet, P., Jain, R. K. Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis. Nature. 473 (7347), 298-307 (2011).
- Staton, C. A., et al. Current methods for assaying angiogenesis in vitro and in vivo. Int J. Exp. Pathol. 85 (5), 233-248 (2004).
- Goodwin, A. M. In vitro assays of angiogenesis for assessment of angiogenic and anti-angiogenic agents. Microvasc. Res. 74 (2-3), 172-183 (2007).
- Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Dev. Biol. 248 (2), 307-318 (2002).
- Fruttiger, M.
- Sawamiphak, S., Ritter, M., Acker-Palmer, A. Preparation of retinal explant cultures to study ex vivo tip endothelial cell responses. Nat. Protoc. 5 (10), 1659-1665 (1038).
- Mahajan, V. B., Skeie, J. M., Assefnia, A. H., Mahajan, M., Tsang, S. H. Mouse eye enucleation for remote high-throughput phenotyping. J. Vis. Exp. (57), e3184 (2011).
- Pitulescu, M. E., Schmidt, I., Benedito, R., Adams, R. H. Inducible gene targeting in the neonatal vasculature and analysis of retinal angiogenesis in mice. Nat. Protoc. 5 (9), 1518-1534 (2010).
- Allinson, K. R., Lee, H. S., Fruttiger, M., McCarty, J., Arthur, H. M. Endothelial expression of TGFbeta type II receptor is required to maintain vascular integrity during postnatal development of the central nervous system. PLoS One. 7 (9), e39336 (2012).
- Mahmoud, M., et al. Pathogenesis of arteriovenous malformations in the absence of endoglin. Circ. Res. 106 (8), 1425-1433 (2010).
- Lebrin, F., et al. Thalidomide stimulates vessel maturation and reduces epistaxis in individuals with hereditary hemorrhagic telangiectasia. Nat. Med. 16 (4), 420-428 (2010).
- Pi, L., et al. Role of connective tissue growth factor in the retinal vasculature during development and ischemia. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52 (12), 8701-8710 (2011).
- Powner, M. B., et al. Visualization of gene expression in whole mouse retina by in situ hybridization. Nat. Protoc. 7 (6), 1086-1096 (2012).
