Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Avbildning av biologisk vev ved Desorpsjon Elektrospray Ionization massespektrometri

Published: July 12, 2013 doi: 10.3791/50575
Automatic Translation
*1, *1, 1
1School of Chemistry and Biochemistry, Georgia Institute of Technology
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

Desorpsjon electrospray ionisering massespektrometri (DESI-MS) er en ambient metode der prøvene, inkludert biologisk vev, kan avbildes med minimal prøveopparbeidelse. Ved rastering prøven under ionisering sonde, gir denne spray-basert teknikk tilstrekkelig romlig oppløsning til å skjelne molekylære funksjoner av interesse innenfor vev seksjoner.

Abstract

Massespektrometri imaging (MSI) gir vilkårlige molekylær informasjon med høyest spesifisitet og romlig oppløsning for å undersøke biologiske vev på hundrevis til titalls mikrometer skala. Når arbeidet er utført under vanlige betingelser, blir prøven forbehandling unødvendig, og dermed forenkle den protokoll og samtidig opprettholde den høye kvaliteten på informasjon innhentet. Desorpsjon electrospray ionisering (DESI) er en spray-baserte ambient MSI teknikk som gir mulighet for direkte prøvetaking av overflater i friluft, selv in vivo. Når den brukes med et programvarestyrt prøven stadium, prøven rastered under desi ionisering sonde, og gjennom den tid-domene, er m / z informasjon korreleres med det kjemiske stoff 'romlig fordeling. Den riktighet av desi-MSI utgang er avhengig av kilde orientering og posisjonering i forhold til prøvens overflate og massespektrometer innløp. Heri, gjennomgår vi hvordan å forberede vevsdelene for DESI jegmaging og flere eksperimentelle forhold som direkte påvirker bildekvaliteten. Konkret beskriver vi protokollen for avbildning av rottehjernevev deler av DESI-MSI.

Introduction

Vilkårlige bildebehandling ved massespektrometri forenkler oppkjøpet av kjemisk informasjon for oppdagelse og hypotese-genererende applikasjoner. Målsøkt billeddannende av en kjent kjemisk av interesse, på den annen side, kan lette økt følsomhet og selektivitet gjennom spesifikk metode utvikling. Massespektrometri imaging (MSI) er oftest utført på vev ved hjelp MALDI, en sekundær ion massespektrometri (SIMS), 2 og ambient ionisering teknikker, inkludert desorpsjon electrospray ionisering (DESI), 3 laser ablasjon-electrospray ionisering (LAESI), 4, 5 og væske mikro-junction-overflate prøvetakingssonde (LMJ-SSP). 6. I MALDI og SIMS, prøvene må fjernes fysisk fra prøven, og må være flat og tynn, slik de blir analysert ved høy-vakuum. MALDI krever belegg av prøven med en stråling-absorberende matrise, og legger til en ekstra og tungvint skritt til prøveopparbeidelse. SIMShar den høyeste lateral oppløsning, men bombardement med svært energiske partikler forårsaker omfattende molekylære fragmentering. Derfor MSI av omgivende metoder fylle en nisje hvor myk analyse med minimal prøveopparbeidelse er ønskelig. Men til dags dato, er alle metoder fremdeles begrenset av kravet om flate prøvenes overflater.

Desi anvender en pneumatisk assistert ladet oppløsningsmiddel spray rettet mot sampeloverflaten å desorbere og ionisere analytter. Syv arbeidsmodell for desorpsjon og påfølgende ionisering av Desi er kjent som "dråpe pick-up-modellen". 8-10 De ladede dråper primære produsert av desi sonde kolliderer med overflaten-, fukte-det og danner en tynn film i hvilken analytten er oppløst ved en faststoff-væske microextraction mekanisme 8. Etterfølgende dråpe kollisjoner resultat i impulsoverføringen og letting av sekundære dråper som inneholder det materialet ekstrahert fra overflaten . 9,10 syvende og gassfase ioner antas å bli produsert gjennom ESI-lignende prosesser etter ion fordampning, charge rester modeller eller andre modeller, 11 men den nøyaktige ion dannelsesprosessen i Desi ennå ikke er bevist eksperimentelt. 12. Desi følsomhet er sterkt avhengig av løseligheten av analytten i spray løsningsmiddel, som desorpsjon er avhengig av den lokaliserte microextraction. 13.

Når den brukes med et programvarestyrt prøven stadium, prøven er skannet ensrettet med stepping kjørefelt under desi ionisering sonde, og gjennom den tid-domene, er m / z informasjon korreleres med det kjemiske stoff 'romlig fordeling (figur 1). Siden den første bevis på prinsippet DESI-MSI eksperiment rapportert av Van Berkel og Kertesz i 2006, har 14 teknikken modnet betraktelig, 15 med rapporterte søknader i analysen av lipider, 3,16 narkotika metabolitter, 17,18 diseaSE biomarkører, 19 hjernevev, 3,18,20 lungevev, 18 nyrevevet, 18 testikkel vev, 18 binyrene, 17 tynnskiktkromatografi plater, 21 og alger overflater. 22. Rutinen oppløsningen på bilder fremstilt ved DESI-MSI er 100-200 mikrometer, som er i siste instans bestemt av den effektive arealet trekkes ut av spray, men oppløsninger så lavt som 40 mikrometer er rapportert. 23-25 ​​Slike oppløsning og enkel analyse gjør DESI-MSI hensiktsmessig for rask og enkel analyse av biologiske vevsprøver med flater i 0,5-5 cm to utvalg, slik at anskaffelse av verdifull romlig informasjon for å forstå biologiske prosesser 26. Her, som et eksempel på en typisk DESI-MSI søknaden, vurderer vi de prosessuelle detaljene for å gjennomføre et vellykket eksperiment med avbildning av lipider i rotte hjernen vev. De to mest kritiske trinnene i protokollen, er detvevspreparat 27 og Desi ionekilde optimalisering, som beskrevet nedenfor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

En. Tissue Seksjonering

  1. Store flash-frossen, hel vev i -80 ° C fryser til alt er klart for seksjonering.
  2. Tillat den vevsprøve for å nå temperaturen i cryomicrotome før snitting (30 min). Sett kniven og prøven temperaturen til -30 ° C.
  3. Når vevet har nådd den temperatur, håndtering av prøven med pinsett, skjære-eller baksiden av hjerne avhengig av hvilken del av hjernen som er av interesse for tilstrekkelig monteringsoverflaten (dvs. hvis fronten av hjernen er av primær betydning, monteres bak på hjerne klemmer).
    1. Påfør ~ 0,5 ml Optimal Cutting Temperatur Compound (OCT, Tissue-Tek, Sakura) til chuck i sentrum og ved hjelp av pinsett, holder prøven på plass i oktober før den stivner. Når oktober er helt frossen, mount chuck i prøven holderen.
    2. En minimal mengde av oktober brukes til å montere prøven er foretrukket (i motsetning til montering av prøven i en blokk av oktober slik som vanligvis gjøres i andre histologiske prosedyrer) for å minimalisere forurensning av prøven. Forurensning av prøven ved oktober er skadelig for DESI og bildebehandling prosess på grunn av ion undertrykkelse.
  4. Typiske vevssnitt nødvendig for avbildning MS spekter 12-18 mikrometer i tykkelse. § vev på ønsket tykkelse innenfor det anbefalte området. Tine-montere hver seksjonert vev ved lett berøring et rom-temperatur mikroskop glass gli over seksjonen. Når en prøve er montert, må du være forsiktig så du ikke berører vev delen som det vil endre de kjemiske distribusjoner og komposisjoner.

Merk: Vi anbefaler montering av to deler per lysbilde, ved hjelp av en seksjon for optimalisering, og den andre for bildebehandling. Hvis delene er ikke for umiddelbar bildebehandling, lagre lysbilder i -80 ° C fryser i et lysbilde boksen til den er klar for analyse.

  1. Hvis analysere lagret seksjoner, fjerne lysbilde fra fryseren, umiddelbart overføre til vakuum eksikkator, og la ~ 15-20Min å tine. Leaving prøven i eksikkator lenger vil tørke prøven og redusere DESI effektivitet. Optimalisering av DESI ionekilden vil bli gjort med vevsprøve når det har tint, men av hensyn til tid, serverer den perioden som utvalget er tining som en ideell tid for initialisering av utstyret.
    1. Ved hjelp av acetonitril med 1% eddiksyre som desi oppløsningsmiddel, slå på sprøytepumpe med en strømningshastighet på 5 mL / min. En lavere strømningshastighet vil redusere virkningen flekk siden av DESI spray og effektiv pixel størrelse, men en høyere flow rate kan være nødvendig for tilstrekkelig følsomhet. Derfor er strømningshastigheten (typisk 1-5 mL / min) bør være optimalisert for hver anvendelse og den ønskede følsomhet og oppløsning. Sørg for at sprøyten inneholder nok væske til komplett optimalisering og bildebehandling ved gitt strømningshastighet.
    2. Når løsemiddel vises drypper ut av kilden spissen, slå på nitrogen Nebulizing gass med pressure av 160 psi.
    3. Slå på høyspent strømforsyning koblet til ionekilde bruke 3600 V.
  2. Monter lysbildet på bevegelse scenen og begynne ionekilde og MS optimalisering

2. DESI Optimization

  1. Desi-systemet består av en kilde probe (se figur 2), en sprøyte og pumpe eller alternativt oppløsningsmiddel leveringssystem, komprimert nitrogen, oversettelse prøven stadium og montere. Fortsett med DESI kilde optimalisering når massespektrometer har blitt innstilt for den aktuelle massen rekkevidde og analyser av interesse.
    1. Hvis kildekode-komponenter ikke har vært slått på ennå, se avsnitt 1.5.1-3 for veibeskrivelse.
    2. Variablene som diskuteres i disse avsnittene er anbefalt for avbildning av biologiske vev. Men disse variablene skal være optimalisert for forskjellige typer vev eller prøve. Alternative løsemidler, flyt priser, Nebulizing gasstrykk og spenninger er blitt rapportert for imaging av biologiske vev. 16-18
  2. Sørg for at utgangspunktet DESI kilden ikke berører glass slide, og ikke rettet mot noen del av vevet delen. Dette vil sikre at sonden ikke er skadet i den innledende optimaliseringsprosessen og vil ikke forurense noen del av den er satt opp ved å komme i kontakt med vevet prøven.
    1. En god startposisjon er med spissen 3 mm fra sampeloverflaten og 5 mm fra MS kapillær innløp, med sonden i en vinkel på 55 ° i forhold til sampeloverflaten. Den indre kapillære av desi sonde bør strekke ~ 1 mm utover den ytre kapillarrør. Alle disse parameterne er optimert.
  3. Den MS grensesnitt kapillar bør ha en samling vinkel på ~ 15 ° i forhold til sampeloverflaten for optimal overføring av ioner. Juster takhøyde slik at MS kapillære svever over prøven overflaten, den kapillære bør være <1 mm fra overflaten, så nær som muliguten å berøre.
  4. Juster desi sonde i x-dimensjon i forhold til MS-kapillær innløpet slik at de er direkte på linje.
  5. Juster Y og Z posisjoner av desi kilde for optimal følsomhet ved hjelp av ekstra vevsdeler. Legg merke til at etter hvert som desi sonde er rettet mot en prøveflate, vil det til slutt desorbere og ioniserer alle de analytter i det området, og signalet vil gradvis avta etter hvert som dette skjer. Utfører dette trinnet så raskt som mulig er viktig.
    1. Derfor, i løpet av optimaliseringsprosessen, trenger den prøven som skal beveges under sprøytehodet for å sikre at fersk prøve blir analysert og at eventuelle endringer i signalet skyldes kilde optimalisering, ikke prøven trykkavlastning. Men tatt i betraktning at den kjemiske sammensetningen av varierte forskjellige regioner av vev, er en direkte sammenligning av ion intensitet over hele vevsdeler ikke helt nøyaktig. Thalamus av hjernen gir en forholdsvis stor størrelse område medmer ensartet kjemisk sammensetning, men likevel ikke helt ensartet. Alternativt kan en merking av rød tusj, som inneholder fargestoffet rhodamin 6G ([M] +, m / z 443), på den glass-slide bort fra prøven gir en sterk ms av Desi og kan også benyttes for optimalisering, men gitt annet utvalg form og analytten, kan disse forholdene fortsatt ikke relateres til en ideell oppsett for biologisk vev.
    2. Anbefalt y skille mellom kilde tips og kapillær innløp: ~ 4 mm, anbefales z skille mellom tips og prøven overflaten: ~ 1,5 mm. Selv om disse parametrene vil være litt forskjellig for hver eksperimentelle oppsett.
    3. Tatt i betraktning den geometri og vinkelen av sonden, ta hensyn til at y-og z-dimensjon stillinger er innbyrdes beslektet med hensyn til den effektive overføring av løsemiddel og analytt-inneholdende dråper. En endring i en variabel vil kreve en etterfølgende endring i den annen for å opprettholde den samme posisjon og spray innvirkningsin overføring vinkler.
  6. Juster avstanden de indre kapillære extrudes fra den ytre kapillarrør av kilden for maksimal følsomhet, og minimal påvirkning punktstørrelse. Forsiktig: Kontroller at den høye spenningen er OFF mens du gjør denne justeringen.
  7. Kilden geometri vil bli vurdert optimal når den maksimale signal er observert.
    1. Variablene optimalisert i avsnitt 2.5 til 2.6 er inter-relatert derfor justering av det ene vil iboende krever ny innstilling av den annen for å opprettholde den nødvendige kilde-sample-innløp geometri, eller justering av betingelsene omtalt i avsnitt 1.5.1- 3.
  8. I tillegg kan et varme-element som omgir kapillarrøret overføring til massespektrometeret forbedre følsomheten ved å tilrettelegge desolvation av de ladede analyttkonsentrasjoner dråper produseres under Ioniseringsprosessen. Her bruker vi et tau varmeapparat kveilet rundt overføringen kapillær satt til 100 ° C.

3. Tissue Imaging

  1. Under bildebehandling prosessen, beveger prøven scenen prøven under DESI probe og MS innløp kapillær og alle andre komponenter forblir i ro. Bevegelses-parametrene av stadiet bør velges basert på Desi innvirkning plume størrelse og optimal følsomhet.
    1. En større effekt plume vil resultere i en høyere intensitet ion, gitt at flere prøven blir desorbert, men for avbildning, vil det også resultere i et større antall piksler og dermed dårligere oppløsning.
  2. Oversettelsen fase anvendt i dette forsøk er inn-bygget og styres av en LabView program som gjør det mulig for kontroll av rastering hastighet og linjeavstanden for et bilde av gitte dimensjoner. Scenen bevegelseskontroll VI brukt i dette forsøket er tilgjengelig på omnispect.bme.gatech.edu. Alternativt kan en kommersielt tilgjengelig kilde Desi og stadium benyttes slik som den 2D automatisert Omni Spray kilde fra Prosolia Inc. (Indianapolis, IN USA).
    1. For hjernen vev entypisk bilde størrelsen er 10 x 15 mm, og gitt scenen motion parametre brukt, vil bildet ta ca 3 timer.
      1. Programmer LabView VI eller tilsvarende programvare for ønsket bildebehandling forhold, ved hjelp av en scene skannehastighet på 80 mikrometer / sek, og linjeavstand mellom rader med 200 mikrometer. Ved bruk av Omni Spray kilde, bør motion parametrene for en skanning hastighet på 100-200 mikrometer / sek og en linjeavstand på 200 mikrometer. Legg merke til at disse bevegelses parametere endres avhengig av antall ønskede piksler i hver dimensjon og nødvendige følsomhet.
        1. En mindre linjeavstanden har vist seg å forbedre bildekvaliteten, med skannehastighet som har en mindre effekt. 25. Det er imidlertid viktig å merke seg at dette ikke nødvendigvis er og forbedret bildeoppløsning, som det er svært avhengig av virkningen flekk størrelse. En langsommere skannehastighet og mindre linjeavstand vil i betydelig grad øke tiden for analyse, og må derfor være optimaliseringzed for hver type vev eller prøve.
      2. Med MS spektral anskaffelse satt til en skann / sek, og bildet som skapes som en piksel / scan, definerer fasen hastighet bildepunktstørrelsen i x-dimensjonen, mens linjeavstanden bestemmer piksel størrelsen på Y-dimensjonen. Selv om den sanne piksler for det bildet er større enn denne på grunn av spray sprer seg, tillater langsommere bevegelse mer tid for desorpsjon og påvisning av analytter.
    2. Gi katalogen banen og filnavnet for posisjon og tid filer som skal lagres under bildene innen LabView VI.
  3. Som forberedelse til massespektralanalyse datainnhenting, beregne den totale tid som kreves for avbildning. Den LabVIEW program som brukes av vår gruppe gir automatisk denne verdien, men hvis alternative scenen kontroll er brukt, er denne beregningen er nødvendig for MS datainnsamling innstillinger.
    1. Ved bruk av en Omni Spray automatisert kilde og fase, blir hver linje i bildet som ervervet iindivid går. Klokka-per-linje og antall linjer som er nødvendige for gitte bildebehandling dimensjoner er beregnet ved hjelp av Omni Spray kontroll programvare for å være innspill til massespektrometer programvare.
  4. Kontroller at massespektrometer skannehastighet er en spektrum / sek, og sette instrumentet oppkjøpet tid til å matche den totale tiden beregnes.
    1. Sett spektral scan hastighet til en spektrum / sek.
    2. Skaffe data i PROFIL-modus og sørge for at m / z serien er hensiktsmessig for de arter av interesse. Husk at DESI produserer også formere ladede analytter, som i ESI.
    3. Sett oppkjøpet tid til å matche total image tid gitt av LabView.
  5. Plasser spray innvirkning plass i topp-venstre i området som skal avbildes.
  6. Begynn kjøpet av MS data og scene bevegelse samtidig.
  7. Ved avslutningen av datainnsamling, tilbake massespektrometer til Standby modus.
  8. Slå av høy spenning på DESI kilde.
  9. Slå off nitrogengass.
  10. Slå av sprøytepumpe.

4. Bildebehandling

  1. Massespektralverdier data, må i kombinasjon med scene tid og posisjonsdata lagres som tekstfiler gjennom LabView bli "kastet" inn i et 2D-bilde samkjøre koordinater av piksler med tilsvarende spektra. Bildene som presenteres her ble behandlet ved hjelp av Matlab-basert programvare som er fritt tilgjengelig på: omnispect.bme.gatech.edu. Hvis data er anskaffet ved hjelp av Omni Spray kilde, er Firefly data konvertering programvare som brukes til å lage data kuben for bilde visualisering i BioMAP (www.maldi-msi.org).
  2. For data innhentet på Jeol AccuTOF massespektrometer, må registreres kromatogrammet skal eksporteres i. Cdf format for videre analyse.
    1. Bruke DataManager innen MassCenter, først konvertere innsamlede dataene til centroided data (Verktøy → Konverter oppkjøp data til Tyngdepunktet). Deretter eksportere data i. Cdf format ved hjelp av tastekombinasjonen Ctrl + Shift + E folfulgt av Verktøy → Export.
  3. Last opp de rå. CDF massespektralverdier data og de to tekstfiler, posisjon og tid, til OmniSpect nettstedet. Firefly-behandlet imaging data kan visualiseres i BioMAP.
    1. Videre behandling av data, inkludert statistisk analyse av ikke-negativ Matrix Faktorisering eller plotting av ett enkelt ion av interesse kan utføres direkte på nettsiden.
    2. Alternativt kan den rå data kuben bli eksportert til analyse i Matlab.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 3 viser et representativt spektrum oppnådd fra en ubehandlet rotte hjerne seksjon. I den positive modus blir massespektrum dominert av fosfatidylcholiner grunn av sin høye effektivitet ionisering (tilskrives den positivt ladede kvaternær ammoniumgruppe). Den totale ion bildet av vevsdeler er også vist i figur 3, som viser rikelig signal på tvers av hele hjernen delen. Viktige lipider detekterte er identifisert i tabell 1 gjennom litteratur sammenligninger.

Den romlige fordeling av eksempler på lipider (figur 4) viser hvordan de relative overflod av forskjellige phosphatidylcholine arter varierer mellom grå og hvit substans i hjernen. For eksempel [PC 34:1 + K] +, m / z 798,5364, viser økt intensitet i lillehjernen cortex (grå materie), mens [PC 36:1 + K] +, m / z 826,5558, viser økt intensitet i lillehjernen peduncle (white saken). Den sammensatte bildet oppnås for de to ioner (figur 4c) fremhever kontrasten i lipid fordeling tvers over vevsdeler. Den romlige fordelingen av andre viktige lipider i hjernen er også oppført i tabell 1. Disse distribusjonene er enig med tidligere studier. 28-30

Figur 1
Figur 1. Skjematisk av desi-MSI avbildingsprosessen. Desi (a) benyttes til overflaten analyse av vev, og når prøven er rastered i en kontrollert bevegelse (b) nedenfor kilden, masse-spektraldata, intensitet vs m / z (c ), som en funksjon av tid (d) erverves. Disse dataene blir så korrelert gjennom tidsdomenet med bevegelsen parametere for å danne et bilde kjemisk(E). Klikk her for å se større figur .

Figur 2
Figur 2. Skjematisk av DESI kilde.

Figur 3
Figur 3. Gjennomsnittlig hel-vev spektrum med mer rikelig m / z-verdier som er merket (a) og total ion bilde (b) ervervet av Desi-MSI i positiv ion-modus.

Figur 4 Figur 4. Valgt ion bilder av viktige phosphocholines i rottehjernevev kjøpt opp av DESI-MSI i positiv ion modus; (a) [PC 34:1 + K] +, m / z 798,5364, (b) [PC 36:1 + K] + , m / z 826.5558, (c) sammensatt bilde av m / 798 z, blå og 826, red.

Arter m / z Lokalisering (materie)
[PC 32:0 + Na] + 756.5335 Gray
[PC 32:0 + K] + 772.5165 Gray
[PC 36:4 + H] + 782.5477 Hvit
[PC 34:1 + K] + 798.5364 Gray
[PC 38:4 + H] + Hvit
[PC 36:1 + K] + 826.5558 Hvit

Tabell 1. Viktige lipid identiteter og lokalisering i hjernen delen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Optimalisering av DESI kilde geometri er avgjørende for vellykkede MSI eksperimenter. De mange variabler som bidrar til justering av systemet direkte påvirke følsomhet og oppløsning. Dersom det under optimalisering, har experimenter vanskeligheter med å få signal, anbefaler vi at du bruker rød tusj flekk trukket på lysbildet som en målestokk, fargestoff, rhodamine 6G, m / z 443, gir et sterkt signal i positiv ion modus, og kan brukes til initial optimalisering. I tillegg er løsemiddel seleksjon for Desi avgjørende for følsomhet, som analytt overføring og ionisering avhenger av ekstraksjon av analytten fra overflaten inn i den tynne film dannes. 13. Mange elektrospray ionisering-kompatible oppløsningsmidler og blandinger kan brukes for å hjelpe til i desolvation og ioniseringen prosess avhengig av klassen av forbindelsen av interesse i løpet av analysen.

Som tidligere nevnt, oppløsningen på DESI-MS image depends primært på kilden geometri. Bildeoppløsning på rekkefølgen av 200 mikrometer blir jevnlig innhentet av DESI-MSI, selv om dette er høyere enn laser-basert og / eller under vakuum imaging metoder som kan variere fra ~ 10-150 mikrometer. 5,31 oppløsning så høyt som 40 mikrometer Det er rapportert om bruk DESI, 24 derimot, er 200 mikrometer for rutinemessig bildebehandling tilstrekkelig for analyse av store biologiske vev seksjoner. Kvaliteten av det indre av kapillarrøret av smeltet silisiumdioksyd desi kilden vil også påvirke bildekvalitet og oppløsning. Den anbefalte indre diameter av kapillar er 50 mikrometer, så stor id kapillærer produsere større spray og større oppløsning. 25. Dersom dette ikke er kuttet kapillær holdent eller er sprukket, vil sprayen ikke være konisk som resulterer i uregelmessig formet innvirkning flekk, dårlig kvalitet og uforklarlige bilder.

Ikke bare påvirker kilden geometri oppløsningen av DESI-MSI, spiller det også en betydelig rolle i følsomhetav fremgangsmåten. Derfor geometrien må optimaliseres og holdt konstant gjennom hele prosedyren. Hvis prøven ikke er plan, eller ikke er montert helt vannrett, vil kilden geometri endres, og dermed endre responsen og skape en gjenstand i bildet. 23. Selv DESI-MSI er begrenset til planar prøver, er 3D avbildning av biologiske vev laget mulig gjennom 2D-avbildning av serielle vevssnitt som deretter stables i et tredimensjonalt bilde. 32. Denne fremgangsmåten kan også anvendes for andre MSI metoder, bl.a. SIMS, MALDI, LAESI, etc. 33 Tredimensjonal massespektrometri bilder kan også skapt av den gradvise fjerning av lag av materiale, med laserpulser for eksempel, og reimaging. 34.

Den positive mode analyse av rotte hjernen vev letter vellykket avbildning av fosfatidylcholiner og noen legemidler og metabolitter. 18. For å komplettere denne analysen, bildebehandling i negative modusen gir et spektrum med et større mangfold av klasser av lipider, 28,35 og kan brukes til å gi en omfattende analyse av de vevssnitt. I tilfeller hvor mer enn en lipid art kan tilskrives en bestemt m / z-verdien, kan tandem massespektrometri brukes til identifisering. Tandem massespektrometri fungerer også som en ekstra metode for lipid identitet bekreftelse. 35.

Ambient massespektrometri avbildning av Desi har vist seg å være effektive i den avbildning av lipid art i rottehjernevev. Informasjon oppnås gjennom MSI eksperimenter kan gi innsikt i sykdommer forbundet med endrede nivåer av fosfolipider som Alzheimers sykdom, Downs syndrom, og diabetes, blant andre. 36-38 Gitt den høye mengde av lipider og deres rolle i biologiske prosesser, mange biologiske systemer eksisterer som ville ha nytte av informasjon som er innhentet via massespektrometri bildebehandling. Med mange potensielle metoderå avbilde biologiske prøver ved hjelp av massespektrometri, ambient ionisering metoder, DESI spesielt, et middel til å gjøre det med redusert prøveopparbeidelse og økt enkel analyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Dette arbeidet støttes av Arra NSF MR Instrument Development stipend # 0923179 til FMF. Vi takker Aqua Asberry, Lab koordinator for Parker H. Petit Institutt for bioteknologi og biovitenskap histologi Core for å få hjelp med vev snitting.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Tissue-Tek O.C.T. Compound Sakura-Finetek 4583 http://www.sakuraeu.com/products/showitem.asp?cat=11&subcat=48
Acetonitrile EMD AX0156-6 OmniSolv, LC-MS Grade
Acetic Acid Sigma Aldrich 695092-500 ml
Equipment
Cryostat microtome Thermo Scientific CryoStar* NX70 Any available microtome can be used for tissue sectioning http://www.thermoscientific.com/ecomm/servlet/productsdetail?productId=13958375&groupType=PRODUCT&searchType=0&storeId=11152&from=search&ca=cryostar
Omni Spray®DESI Spray Head Prosolia Inc. Can also use the 2-D Omni Spray® Source kit instead of assembling components of imaging experiment http://www.prosolia.com/sources.php
High Voltage Power Supply Stanford Research Systems, Inc. PS350/5000V-25W http://www.thinksrs.com/products/PS300.htm
Rope heater, RTD, controller Omega http://www.omega.com/toc_asp/subsectionSC.asp?subsection=M02&book=Heaters
Labview National Instruments Version 7.1
Translational stage Prior Scientific Optiscan II http://www.prior.com/productinfo_auto_motorized_optiscan.html
AccuTOF Mass Spectrometer JEOL JMS-T100LC Can use any mass spectrometer equipped with an extended capillary atmospheric pressure interface

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Caprioli, R. M., Farmer, T. B., Gile, J. Molecular Imaging of Biological Samples: Localization of Peptides and Proteins Using MALDI-TOF MS. Anal. Chem. 69, 4751-4760 (1997).
  2. Pacholski, M. L., Winograd, N. Imaging with Mass Spectrometry. Chem. Rev. 99, 2977-3006 (1999).
  3. Wiseman, J. M., Ifa, D. R., Song, Q., Cooks, R. G. Tissue Imaging at Atmospheric Pressure Using Desorption Electrospray Ionization (DESI) Mass Spectrometry. Angew. Chem. Int. Ed. 45, 7188-7192 (2006).
  4. Nemes, P., Laser Vertes, A. Laser Ablation Electrospray Ionization for Atmospheric Pressure, in Vivo, and Imaging Mass Spectrometry. Anal. Chem. 79, 8098-8106 (2007).
  5. Nemes, P., Vertes, A. Atmospheric-pressure Molecular Imaging of Biological Tissues and Biofilms by LAESI Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (43), e2097 (2010).
  6. Van Berkel, G. J., Kertesz, V., Koeplinger, K. A., Vavrek, M., Kong, A. -N. T. Liquid microjunction surface sampling probe electrospray mass spectrometry for detection of drugs and metabolites in thin tissue sections. J. Mass Spectrom. 43, 500-508 (2008).
  7. Takáts, Z., Wiseman, J. M., Gologan, B., Cooks, R. G. Mass Spectrometry Sampling Under Ambient Conditions with Desorption Electrospray Ionization. Science. 306, 471-473 (2004).
  8. Venter, A., Sojka, P. E., Cooks, R. G. Droplet Dynamics and Ionization Mechanisms in Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry. Anal. Chem. 78, 8549-8555 (2006).
  9. Costa, A. B., Cooks, R. G. Simulation of atmospheric transport and droplet-thin film collisions in desorption electrospray ionization. Chem. Commun. , 3915-3917 (2007).
  10. Costa, A. B., Graham Cooks, R. Simulated splashes: Elucidating the mechanism of desorption electrospray ionization mass spectrometry. Chem. Phys. Lett. 464, 1-8 (2008).
  11. Konermann, L., Ahadi, E., Rodriguez, A. D., Vahidi, S. Unraveling the Mechanism of Electrospray Ionization. Anal. Chem. 85, 2-9 (2012).
  12. Kebarle, P., Verkerk, U. H. Electrospray: From ions in solution to ions in the gas phase, what we know now. Mass Spectrom. Rev. 28, 898-917 (2009).
  13. Green, F. M., Salter, T. L., Gilmore, I. S., Stokes, P., O'Connor, G. The effect of electrospray solvent composition on desorption electrospray ionisation (DESI) efficiency and spatial resolution. Analyst. 135, 731-737 (2010).
  14. Van Berkel, G. J., Kertesz, V. Automated Sampling and Imaging of Analytes Separated on Thin-Layer Chromatography Plates Using Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry. Anal. Chem. 78, 4938-4944 (2006).
  15. Ifa, D. R., Wu, C., Ouyang, Z., Cooks, R. G. Desorption electrospray ionization and other ambient ionization methods: current progress and preview. Analyst. 135, 669-681 (2010).
  16. Eberlin, L. S., Ferreira, C. R., Dill, A. L., Ifa, D. R., Cooks, R. G. Desorption electrospray ionization mass spectrometry for lipid characterization and biological tissue imaging. Biochim. Biophys. Acta. 1811, 946-960 (2011).
  17. Wu, C., Ifa, D. R., Manicke, N. E., Cooks, R. G. Molecular imaging of adrenal gland by desorption electrospray ionization mass spectrometry. Analyst. 135, 28-32 (2010).
  18. Wiseman, J. M., et al. Desorption electrospray ionization mass spectrometry: Imaging drugs and metabolites in tissues. Proc. Natl. Acad. Sci. 105, 18120-18125 (2008).
  19. Eberlin, L. S., et al. Classifying Human Brain Tumors by Lipid Imaging with Mass Spectrometry. Cancer Res. 72, 645-654 (2012).
  20. Wiseman, J. M., Ifa, D. R., Venter, A., Cooks, R. G. Ambient molecular imaging by desorption electrospray ionization mass spectrometry. Nat. Protocols. 3, 517-524 (2008).
  21. Van Berkel, G. J., Ford, M. J., Deibel, M. A. Thin-Layer Chromatography and Mass Spectrometry Coupled Using Desorption Electrospray Ionization. Anal. Chem. 77, 1207-1215 (2005).
  22. Lane, A. L., et al. Desorption electrospray ionization mass spectrometry reveals surface-mediated antifungal chemical defense of a tropical seaweed. Proc. Natl. Acad. Sci. 106, 7314-7319 (2009).
  23. Kertesz, V., Van Berkel, G. J. Scanning and Surface Alignment Considerations in Chemical Imaging with Desorption Electrospray Mass Spectrometry. Anal. Chem. 80, 1027-1032 (2008).
  24. Kertesz, V., Van Berkel, G. J. Improved imaging resolution in desorption electrospray ionization mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 22, 2639-2644 (2008).
  25. Campbell, D., Ferreira, C., Eberlin, L., Cooks, R. Improved spatial resolution in the imaging of biological tissue using desorption electrospray ionization. Anal. Bioanal. Chem. 404, 389-398 (2012).
  26. Chaurand, P., Cornett, D. S., Angel, P. M., Caprioli, R. M. From Whole-body Sections Down to Cellular Level, Multiscale Imaging of Phospholipids by MALDI Mass Spectrometry. Mol. Cell. Proteomics. 10, (2011).
  27. Dill, A., Eberlin, L., Costa, A., Ifa, D., Cooks, R. Data quality in tissue analysis using desorption electrospray ionization. Anal. Bioanal. Chem. 401, 1949-1961 (2011).
  28. Jackson, S. N., Wang, H. -Y. J., Woods, A. S. Direct Profiling of Lipid Distribution in Brain Tissue Using MALDI-TOFMS. Anal. Chem. 77, 4523-4527 (2005).
  29. Jackson, S. N., et al. MALDI-ion mobility-TOFMS imaging of lipids in rat brain tissue. J. Mass Spectrom. 42, 1093-1098 (2007).
  30. Wang, H. -Y. J., Post, S. N. J. J., Woods, A. S. A minimalist approach to MALDI imaging of glycerophospholipids and sphingolipids in rat brain sections. Int. J. Mass Spectrom. 278, 143-149 (2008).
  31. Wu, B., Becker, J. S. Imaging of elements and molecules in biological tissues and cells in the low-micrometer and nanometer range. Int. J. Mass Spectrom. 307, 112-122 (2011).
  32. Eberlin, L. S., Ifa, D. R., Wu, C., Cooks, R. G. Three-Dimensional Vizualization of Mouse Brain by Lipid Analysis Using Ambient Ionization Mass Spectrometry. Angew. Chem. Int. Ed. 49, 873-876 (2010).
  33. Seeley, E. H., Caprioli, R. M. 3D Imaging by Mass Spectrometry: A New Frontier. Anal. Chem. 84, 2105-2110 (2012).
  34. Nemes, P., Barton, A. A., Vertes, A. Three-Dimensional Imaging of Metabolites in Tissues under Ambient Conditions by Laser Ablation Electrospray Ionization Mass Spectrometry. Anal. Chem. 81, 6668-6675 (2009).
  35. Pulfer, M., Murphy, R. C. Electrospray mass spectrometry of phospholipids. Mass Spectrom. Rev. 22, 332-364 (2003).
  36. Han, X., Holtzman, D. M., McKeel, D. W. Plasmalogen deficiency in early Alzheimer's disease subjects and in animal models: molecular characterization using electrospray ionization mass spectrometry. J. Neurochem. 77, 1168-1180 (2001).
  37. Murphy, E. J., Schapiro, M. B., Rapoport, S. I., Shetty, H. U. Phospholipid composition and levels are altered in down syndrome brain. Brain Res. 867, 9-18 (2000).
  38. Han, X., et al. Alterations in Myocardial Cardiolipin Content and Composition Occur at the Very Earliest Stages of Diabetes: A Shotgun Lipidomics Study. Biochemistry. 46, 6417-6428 (2007).

Tags

Bioteknologi Molecular Biology Biomedical Engineering kjemi biokjemi biofysikk fysikk cellebiologi molekylær avbildning massespektrometri MS MSI Desorpsjon electrospray ionisering DESI Ambient massespektrometri vev seksjonering biomarkør bildebehandling

Erratum

Formal Correction: Erratum: Imaging of Biological Tissues by Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry
Posted by JoVE Editors on 02/13/2014. Citeable Link.

A correction was made to Imaging of Biological Tissues by Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry. There was an error with an author's name. The author's surname was appended with a missing character:

Rachel V. Bennett

instead of:

Rachel V. Bennet

Avbildning av biologisk vev ved Desorpsjon Elektrospray Ionization massespektrometri
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bennett, R. V., Gamage, C. M.,… More

Bennett, R. V., Gamage, C. M., Fernández, F. M. Imaging of Biological Tissues by Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (77), e50575, doi:10.3791/50575 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter