Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Beeldvorming van biologische weefsels door desorptie electrospray ionisatie massaspectrometrie

Published: July 12, 2013 doi: 10.3791/50575
Automatic Translation
*1, *1, 1
1School of Chemistry and Biochemistry, Georgia Institute of Technology
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

Desorptie electrospray ionisatie massaspectrometrie (DESI-MS) is een ambient methode waarbij monsters, met inbegrip van biologische weefsels, kunnen worden afgebeeld met een minimale monstervoorbereiding. Door rastering het monster onder de ionisatie-elektrode, deze spray-gebaseerde techniek voldoende ruimtelijke resolutie om moleculaire kenmerken van belang te onderscheiden binnen coupes.

Abstract

Massaspectrometrie imaging (MSI) geeft ongerichte moleculaire informatie met de hoogste specificiteit en de ruimtelijke resolutie voor het onderzoeken van biologische weefsels aan de honderden tot tientallen microns schaal. Wanneer deze wordt uitgevoerd onder omgevingsomstandigheden, monstervoorbehandeling wordt overbodig, waardoor het protocol te vereenvoudigen met behoud van de hoge kwaliteit van de verkregen informatie. Desorptie electrospray ionisatie (DESI) is een spray-based ambient MSI techniek die voor de directe bemonstering van oppervlakken in de open lucht, zelfs in vivo. Bij gebruik met een softwaregestuurde monsterstellage, wordt het monster onder de gerasterde DESI ionisatie, en door het tijdsdomein wordt m / z gegevens gecorreleerd met de chemische species ruimtelijke verdeling. De betrouwbaarheid van het DESI-MSI uitvoer afhankelijk van de oriëntatie bron en positionering ten opzichte van het monsteroppervlak en massaspectrometer inlaat. Hierin bespreken we hoe weefselplakjes voorbereiden DESI imaging en aanvullende experimentele omstandigheden die rechtstreeks van invloed beeldkwaliteit. Specifiek, het protocol voor de beeldvorming van de rat hersenweefsel secties door DESI-MSI beschrijven we.

Introduction

Ongerichte beeldvorming door massaspectrometrie vergemakkelijkt de overname van chemische informatie voor de ontdekking en hypothese-genererende toepassingen. Gerichte beeldvorming van een bekende chemische plaats, anderzijds, kan verhoogde gevoeligheid en selectiviteit omdat specifieke methode ontwikkeling. Massaspectrometrie imaging (MSI) wordt meestal uitgevoerd op weefsels met behulp van MALDI, 1 secundaire ionen massaspectrometrie (SIMS), 2 en ambient ionisatie technieken, waaronder desorptie electrospray ionisatie (DESI), 3 laser ablatie-elektrosprayionisatie (LAESI), 4, 5 en vloeibare micro-junction-oppervlak bemonsteringssonde (LMJ-SSP). 6 In MALDI en SIMS, monsters moeten fysiek worden verwijderd uit het monster, en moeten plat en dun, als zij worden geanalyseerd onder hoog-vacuüm. MALDI vereist bekleding van het monster met een straling absorberende matrix, toevoegen van een extra en omslachtige stap de monstervoorbereiding. SIMSheeft de hoogste laterale resolutie, maar bombardement met hoogenergetische deeltjes veroorzaakt uitgebreide moleculaire fragmentatie. Daarom MSI door omgevingslicht methoden vullen een niche waar zachte analyse met minimale monstervoorbereiding wenselijk is. Echter, tot op heden, alle methoden zijn nog steeds beperkt door de eis van platte monster oppervlakken.

DESI maakt gebruik van een pneumatisch-assisted opgeladen oplosmiddel spuiten gericht op het monster oppervlak te desorberen en ioniseren analyten. 7 Het werkmodel voor desorptie en daaropvolgende ionisatie door DESI staat bekend als de "druppel pick-up-model". 8-10 De geladen primaire druppeltjes door de DESI probe botsen met het oppervlak nat te maken en vormen van een dunne film waarin de analyt wordt opgelost door een vaste stof-vloeistof microextraction mechanisme 8 latere druppel botsingen leiden impulsoverdracht en start secundaire druppeltjes met de uit het oppervlaktemateriaal . 9,10 Uiteindelijk gasfase ionen verondersteld worden geproduceerd door middel van ESI-achtige processen na verdamping ion, lading residu modellen of andere modellen, 11 maar de precieze ionenvorming werkwijze DESI is nog niet experimenteel aangetoond. 12 DESI gevoeligheid sterk afhankelijk van de oplosbaarheid van de analyt in de spray oplosmiddel, zoals desorptie afhankelijk van de lokale micro-extractie 13.

Bij gebruik met een softwaregestuurde monsterstellage, wordt het monster unidirectioneel gescand lane stappen onder het DESI ionisatie, en door het tijdsdomein wordt m / z gegevens gecorreleerd met de chemische species ruimtelijke verdeling (figuur 1). Sinds de eerste proof of principle DESI-MSI experiment gerapporteerd door Van Berkel en Kertesz in 2006, heeft 14 van de techniek aanzienlijk gerijpt, 15 met meldde toepassingen in de analyse van de lipiden, 3,16 drugmetabolieten, 17,18 disease biomarkers, 19 hersenweefsel, 3,18,20 longweefsel, 18 nierweefsel, 18 testis weefsel, 18 bijnieren, 17 dunnelaagchromatografie platen, 21 en algen oppervlakken. 22 De routine resolutie van beelden verkregen door DESI-MSI is 100-200 urn, die uiteindelijk wordt bepaald door het effectieve oppervlak geëxtraheerd door de spray, maar resoluties laag als 40 urn gemeld. 23-25 ​​Deze resolutie en het gemak van analyse met DESI-MSI geschikt voor een snelle en eenvoudige analyse van biologisch weefsel monsters met oppervlakte gebieden in de 0,5-5 cm 2 bereik, waardoor het verkrijgen van waardevolle ruimtelijke informatie beter te begrijpen biologische processen 26. Hier, als een voorbeeld van een typische DESI-MSI applicatie, bespreken we de procedurele bijzonderheden van het voeren van een geslaagd experiment met beeldvorming van lipiden in hersenweefsel van ratten. De twee meest kritische stappen in het protocol zijnweefselvoorbereiding 27 en DESI bron ion optimalisatie, zoals hieronder beschreven.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Tissue Snijden

  1. Store flash-bevroren, in gehele weefsel in -80 ° C vriezer tot klaar voor het snijden.
  2. Laat het weefselmonster om de temperatuur vooraf te bereiken in de cryomicrotoom te snijden (30 min). Stel het lemmet en monster temperatuur tot -30 ° C.
  3. Zodra het weefsel temperatuur bereikt, de behandeling van de specimen met een pincet, gesneden voor-of achterkant van de hersenen afhankelijk van welk deel van de hersenen plaats voldoende montagevlak is (de voorzijde van de hersenen van primair belang monteren achterzijde hersenen op chuck).
    1. Solliciteer ~ 0,5 ml Optimal Cutting Temperatuur Compound (oktober, Tissue-Tek, Sakura) om chuck in het centrum en, met behulp van een pincet, houdt monster op zijn plaats in oktober tot het stolt. Zodra oktober is volledig bevroren, zet chuck in monsterhouder.
    2. Een minimale hoeveelheid oktober gebruikt om het monster te monteren voorkeur (in tegenstelling tot het monteren van de specimen in een blok oktober zoals gewoonlijk wordt gedaan in andere histologische procedures) om de verontreiniging van het monster te minimaliseren. Verontreiniging van het monster door het oktober is schadelijk voor de DESI en imaging proces wegens ion onderdrukking.
  4. Typische weefselplakjes nodig is voor MS beeldvorming range 12-18 micrometer dik. Sectie weefsels op de gewenste dikte binnen het aanbevolen bereik. Dooi-mount elke doorsnede weefsel door licht aanraken van een kamer-temperatuur microscoop glasplaatje boven sectie. Zodra een monster is gemonteerd, gebruik voorzichtig het gedeelte weefsel niet aan te raken als het de chemische distributie en de samenstelling zal veranderen.

Opmerking: Wij raden je aan twee secties per slide, met behulp van een sectie voor optimalisatie, en de andere voor de beeldvorming. Indien delen zijn niet voor onmiddellijke beeldvorming, slaan dia's in -80 ° C vriezer in een dia doos tot klaar voor analyse.

  1. Als de analyse opgeslagen secties, verwijdert dia uit diepvries, onmiddellijk over te dragen aan vacuümexsiccator, en laat ~ 15-20min te ontdooien. Het verlaten van het model in de exsiccator langer zal het monster drogen en te verminderen DESI efficiëntie. De optimalisering van de DESI ionenbron wordt gedaan met het weefselmonster eenmaal ontdooid is echter in het belang van de tijd, de periode waarin het monster ontdooien is een ideale tijd voor het initialiseren van het apparaat.
    1. Toepassing van acetonitril met 1% azijnzuur als oplosmiddel DESI, zet de injectiespuit pomp met een stroomsnelheid van 5 ul / min. Een lager debiet zal de impact spot kant van de DESI spray en effectieve pixelgrootte te verminderen, maar een hoger debiet kan nodig zijn voor voldoende gevoelig zijn. Daarom is de stroomsnelheid (typisch 1,5 ul / min) moet worden geoptimaliseerd voor elke toepassing en de gewenste gevoeligheid en resolutie. Zorg ervoor dat de spuit bevat voldoende oplosmiddel voor volledige optimalisatie en beeldvorming bij gegeven debiet.
    2. Nadat het oplosmiddel verschijnt druipend uit de bron tip, zet de stikstof vernevelen gas met een druk gezete van 160 psi.
    3. Schakel de hoogspanning voeding is aangesloten ionenbron toepassen 3.600 V.
  2. Monteer de schuif over de motie podium en beginnen ionenbron en MS-optimalisatie

2. DESI Optimalisatie

  1. De DESI systeem bestaat uit een bron sonde (zie figuur 2), een spuit en pomp of alternatieve oplosmiddeltoevoersysteem, samengeperste stikstof, proefvertaling podium en mount. Doorgaan met DESI bron optimalisatie zodra de massaspectrometer is afgestemd voor de juiste massabereik en bepalen analyten.
    1. Als de bron componenten niet zijn aangezet nog, zie sectie 1.5.1-3 voor een routebeschrijving.
    2. De variabelen die in deze gedeelten worden aanbevolen voor beeldvorming van biologische weefsels. Maar deze variabelen moeten worden geoptimaliseerd voor verschillende typen weefsel of monster. Alternatieve oplosmiddelen, debieten, vernevelen gasdruk en voltages zijn gemeld voor verbeeldingng biologische weefsels. 16-18
  2. Zorg ervoor dat de aanvankelijk DESI bron niet raakt glasplaatje en niet gericht op een deel van de weefselsectie. Dit zorgt ervoor dat de sonde niet wordt beschadigd in het eerste optimalisatieproces verschijnt niet verontreinigen deel van de set door in contact komt met het weefselmonster.
    1. Een goede uitgangspositie met de punt 3 mm van het monsteroppervlak en 5 mm vanaf de MS capillaire inlaat van de sonde in een hoek van 55 ° ten opzichte van het monsteroppervlak. De binnenste capillair van de DESI sonde moet verlengen ~ 1 mm buiten de buitenste capillair. Al deze parameters worden geoptimaliseerd.
  3. De MS-interface capillair moet een verzameling hoek van ~ 15 ° hebben wat betreft het monster oppervlak voor optimaal transport van ionen. Stel de fase hoogte zodat de MS capillaire zweeft over het oppervlak, het capillair <1 mm moet worden van het oppervlak, zo dicht mogelijkzonder te raken.
  4. Lijn de DESI probe in de x dimensie ten opzichte van de MS capillaire inlaat zodat deze direct in lijn.
  5. Stel de y en z posities van de DESI bron voor optimale gevoeligheid met behulp van de sectie extra weefsel. Merk op dat als de DESI sonde is gericht op een monster gebied, zal het uiteindelijk desorberen en ioniseren alle van de analyten in dat gebied en het signaal zal geleidelijk afnemen als dit gebeurt. Deze stap zo snel mogelijk belangrijk.
    1. In de hele optimalisatieproces, moet het monster onder de sproeikop worden verplaatst zodat vers monster wordt geanalyseerd en dat veranderingen in signaal zijn door source optimalisatie niet sample uitputting. Echter, gezien het feit dat de gevarieerde chemische samenstelling van de verschillende regio's van het weefsel, een directe vergelijking van ion-intensiteit over de hele sectie weefsel is niet geheel juist. De thalamus van de hersenen een redelijk groot formaat metconsistentere chemische samenstelling, maar niet perfect uniform. Alternatief razmetki rode Sharpie, waarin de kleurstof rhodamine 6G bevat ([M] +, m / z 443), op het glaasje uit het monster vormt een sterke reactie van MS DESI en kan ook gebruikt worden voor de optimalisatie, maar gezien de verschillende voorbeeldformulier analyt en kunnen deze condities nog niet correleren met een ideale set-up voor biologische weefsels.
    2. Aanbevolen y scheiding tussen bron tip en capillaire inlaat: ~ 4 mm, aanbevolen z scheiding tussen tip en sample oppervlak: ~ 1.5 mm. Hoewel deze parameters zal iets anders voor elke experimentele set-up.
    3. Gezien de geometrie en de hoek van de sonde, er rekening mee dat de y-en z-afmeting posities zijn onderling verbonden met betrekking tot de effectieve overdracht van oplosmiddel en analyt-bevattende druppeltjes. Een verandering in een variabele een latere wijziging in de andere vereisen om dezelfde spuit botspositie handhaven enzijn transmissie hoeken.
  6. Stel de afstand van de binnenste capillair extrudeert uit de buitenste capillaire van de bron voor maximale gevoeligheid en minimale impact spotgrootte. Let op: Zorg ervoor dat de hoogspanning uit is, terwijl het maken van deze aanpassing.
  7. De bron geometrie wordt als optimaal beschouwd als het maximale signaal wordt waargenomen.
    1. De variabelen geoptimaliseerd paragrafen 2.5-2.6 zijn met elkaar verbonden, dus de aanpassing van de ene zal inherent verlangen dat de bijstelling van de andere om de nodige source-sample-inlaat geometrie, of aanpassing van de voorwaarden besproken in paragraaf 1.5.1-onderhouden 3.
  8. Bovendien kan een verwarmingselement rond de capillaire overdracht naar de massaspectrometer gevoeligheid verbeteren door desolvatie van de geladen druppeltjes analyt die tijdens het ionisatieproces. Hier gebruiken we een touw kachel opgerold rond de overdracht capillaire ingesteld op 100 ° C.

3. Tissue Imaging

  1. Tijdens de beeldvorming proces, het monster podium beweegt het monster onder de DESI sonde en MS inlaat capillaire en alle andere componenten blijven stilstaan. De motie parameters van het podium moet worden geselecteerd op basis van DESI invloed pluim grootte en optimale gevoeligheid.
    1. Een groter effect pluim zal resulteren in een hogere ion intensiteit, aangezien meer monster wordt gedesorbeerd, maar voor weergave, zal het ook resulteren in een grotere pixelgrootte en dus slechter beeldresolutie.
  2. De translatietrap in dit experiment zelfgebouwde en gecontroleerd door een LabView programma dat zorgt voor de controle van rastering snelheid en regelafstand voor een afbeelding van gegeven afmetingen. De fase motion control VI bij dit experiment is beschikbaar op omnispect.bme.gatech.edu. Als alternatief zou een in de handel verkrijgbaar DESI bron en het podium worden gebruikt, zoals de 2D geautomatiseerde Omni Spray bron van Prosolia Inc (Indianapolis, IN USA).
    1. Voor hersenenweefsels eentypische beeldformaat is 10 x 15 mm, en gezien de bewegingsparameters podium gebruikt, wordt het beeld ongeveer 3 uur duren.
      1. Programma de LabView VI of gelijkwaardig control software voor de gewenste beeldvorming omstandigheden, met behulp van een podium scansnelheid van 80 um / sec, en regelafstand tussen de rijen van 200 micrometer. Bij gebruik van de Omni Spray bron, moet bewegingsparameters worden ingesteld voor een scan snelheid van 100-200 um / sec en een regelafstand van 200 micrometer. Merk op dat deze beweging parameters kunnen worden aangepast afhankelijk van het gewenste aantal pixels in elke dimensie en noodzakelijke gevoeligheid.
        1. Een kleinere regelafstand is aangetoond dat de beeldkwaliteit te verbeteren, met de scansnelheid met minder van een effect. 25 Het is echter belangrijk op te merken dat dit niet hoeft te duiden en een verbeterde resolutie, als die sterk afhankelijk is van invloed spot grootte. Een langzamere scansnelheid en kleinere regelafstand zal aanzienlijk toenemen tijde van de analyse en moet dus het optized voor elk type weefsel of monster.
      2. Met stellen de MS spectrale acquisitie op 1 scan / sec, en het beeld geschapen als 1 pixel / scan, het podium snelheid bepaalt de pixelgrootte in de x dimensie, terwijl de regelafstand bepaalt de pixelgrootte in de y dimensie. Hoewel de ware pixelgrootte van de afbeelding groter is dan dit te wijten aan spuiten verspreiden, langzamere beweging maakt meer tijd voor desorptie en detectie van analyten.
    2. Geef directory pad en de bestandsnaam voor positie en tijd bestanden die moeten worden opgenomen tijdens de afbeeldingen in het LabView VI.
  3. Ter voorbereiding massaspectra acquisitie Bereken het totale benodigde tijd voor beeldvorming. De Labview programma wordt gebruikt door onze groep biedt deze waarde automatisch, maar als alternatieve stadium controle wordt gebruikt, deze berekening is noodzakelijk voor de MS acquisitie instellingen gegevens.
    1. Bij gebruik van een Omni Spray geautomatiseerde bron en het podium, wordt elke regel van het beeld verworven individu loopt. De tijd-per-lijn en het aantal lijnen die nodig zijn voor bepaalde beeldvorming dimensies worden berekend met behulp van de Omni Spray besturingssoftware moet worden ingevoerd in de massaspectrometer software.
  4. Zorg ervoor dat de massaspectrometer scansnelheid is 1 spectrum / sec, en zet het instrument overname tijd om de totale tijd berekend overeen.
    1. Stel spectrale scansnelheid tot 1 spectrum / sec.
    2. Verwerven van gegevens in de modus PROFILE en ervoor zorgen dat de m / z serie is geschikt voor de soort van belang zijn. Vergeet niet dat DESI produceert ook meervoudig geladen analyten, zoals in de ESI.
    3. Stel overname tijd tot totale beeld van de tijd gegeven door LabView overeenkomen.
  5. Positioneer de spray effect plek in de top-links van het gebied af te beelden.
  6. Begin overname van MS-gegevens en het podium beweging tegelijkertijd.
  7. Bij het sluiten van de data-acquisitie, terug massaspectrometer naar stand-bymodus.
  8. Schakel hoogspanning van DESI bron.
  9. Turn off stikstofgas.
  10. Schakel de injectiepomp.

4. Beeldverwerking

  1. Massaspectrumgegevens, in combinatie met stadium tijd en positiegegevens opgeslagen als tekstbestanden via LabView worden "gevouwen" in een 2D beeld correlerende coördinaten van pixels met de bijbehorende spectra. De beelden hier gepresenteerde werden verwerkt met behulp van Matlab-gebaseerde software die is vrij beschikbaar op: omnispect.bme.gatech.edu. Als de gegevens zijn verkregen met behulp van de Omni Spray bron, wordt het Firefly data conversie software die wordt gebruikt om de gegevens kubus voor het visualiseren in BioMAP (www.maldi-msi.org) te creëren.
  2. Voor gegevens verkregen over de Jeol AccuTOF massaspectrometer, moet de geregistreerde chromatogram worden geëxporteerd in. Cdf formaat voor verdere analyse.
    1. Met behulp van de DataManager binnen MassCenter, eerst verkregen gegevens te centroided gegevens (Extra → Acquisition gegevens converteren naar Zwaartepunt) zetten. Exporteren vervolgens gegevens in. CDF-formaat met behulp van het toetsenbord combinatie Ctrl + Shift + E folgevolgd door Extra → Exporteren.
  3. Upload het rauwe. Cdf massaspectrumgegevens en de twee tekstbestanden, positie en tijd, om de OmniSpect website. Firefly-verwerkte beeldvorming gegevens kunnen worden gevisualiseerd in BioMAP.
    1. Verdere verwerking van de gegevens met inbegrip van statistische analyse van niet-negatief matrixfactorizatie of plotten van een enkel ion van belang kan direct worden uitgevoerd op de website.
    2. Als alternatief kan de ruwe data cube worden geëxporteerd voor analyse in Matlab.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figuur 3 toont een representatief spectrum verkregen van een onbehandelde rat hersenpreparaat. In de positieve modus, wordt het massaspectrum gedomineerd door fosfatidylcholinen vanwege hun hoge ionisatie efficiëntie (toegeschreven aan de positief geladen quaternaire ammoniumgroep). De totale ion beeld van het weefsel deel wordt ook getoond in figuur 3, met overvloedige signaal over de gehele sectie hersenen. Belangrijkste lipiden gedetecteerd worden in tabel 1 door middel van literatuur vergelijkingen.

De ruimtelijke verdeling van voorbeeld lipiden (Figuur 4) laten zien hoe de relatieve abundantie van verschillende fosfatidylcholine species varieert tussen grijze en witte stof van de hersenen. Bijvoorbeeld, [PC 34:1 + K] +, m / z 798,5364, toont toegenomen intensiteit in de cerebellaire cortex (grijze materie), terwijl [PC 36:1 + K] +, m / z 826,5558, toont toegenomen intensiteit in de cerebellaire steel (white materie). Het samengestelde beeld verkregen voor de twee ionen (Figuur 4c) benadrukt het contrast in de distributie lipide over de sectie weefsel. De ruimtelijke verdelingen van andere belangrijke lipiden in de hersenen worden ook vermeld in tabel 1. Deze distributies het eens met eerdere studies. 28-30

Figuur 1
Figuur 1. Schema van de DESI-MSI beeldvormingsproces. DESI (a) wordt gebruikt voor de oppervlakte-analyse van weefsels, en wanneer het monster wordt gerasterd in een gecontroleerde beweging (b) in de bron, massaspectra, intensiteit vs m / z (c ), als functie van de tijd (d) wordt verkregen. Deze gegevens worden vervolgens gecorreleerd door het tijdsdomein met de motie parameters om chemische beeld te vormen(E). Klik hier voor een grotere afbeelding te bekijken .

Figuur 2
Figuur 2. Schematische voorstelling van DESI bron.

Figuur 3
Figuur 3. Gemiddeld hele-weefsel spectrum met overvloediger m / z waarden bestempeld (a) en image totale ionen (b) overgenomen door DESI-MSI in positieve ion-modus.

Figuur 4 Figuur 4. Geselecteerde ionen beelden van belangrijke fosfocholinen bij rat hersenweefsel overgenomen door DESI-MSI in positieve ion-modus, (a) [PC 34:1 + K] +, m / z 798,5364; (b) [PC 36:1 + K] + , m / z 826.5558, (c) samengesteld beeld van m / z 798, blauw en 826, rood.

Soorten m / z Lokalisatie (materie)
[PC 32:0 + Na] + 756.5335 Grijs
[PC 32:0 + K] + 772.5165 Grijs
[PC 36:4 + H] + 782.5477 Wit
[PC 34:1 + K] + 798.5364 Grijs
[PC 38:4 + H] + Wit
[PC 36:1 + K] + 826.5558 Wit

Tabel 1. Belangrijkste lipiden identiteiten en lokalisatie binnen de sectie hersenen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De optimalisatie van de geometrie DESI bron kritisch is voor succesvolle MSI experimenten. De meerdere variabelen die bijdragen tot de aanpassing van het systeem rechtstreeks van invloed op de gevoeligheid en beeldresolutie. Indien tijdens optimalisatie, de experimentator heeft moeilijkheden met het verkrijgen van het signaal, raden we u aan rode Sharpie plek getrokken op de dia als benchmark, de kleurstof, rhodamine 6G, m / z 443, geeft een sterk signaal in de positieve ion-modus en kan gebruikt worden voor eerste optimalisering. Bovendien, het oplosmiddel selectie voor DESI cruciaal voor de gevoeligheid, het uitzenden en ionisatie analyt afhankelijk van de extractie van het analyt van het oppervlak in de dunne film gevormd. 13 Vele electrospray ionisatie-verenigbare oplosmiddelen en mengsels kunnen worden gebruikt als hulpmiddel bij de desolvatie en ionisatie-proces, afhankelijk van de klasse van de verbinding van belang tijdens de analyse.

Zoals eerder vermeld, de resolutie van de DESI-MS afbeelding depeNDS eerste op de bron geometrie. Beeldresolutie in de orde van 200 micrometer wordt regelmatig verkregen door DESI-MSI, maar dit is hoger dan de laser-gebaseerde en / of in vacuüm beeldvormende methoden die kan variëren van ~ 10-150 micrometer. 5,31 resolutie zo hoog als 40 pm gerapporteerd middels DESI, 24 echter 200 urn voor routinematige beeldvorming voldoende is voor analyse van grote biologische weefselcoupes. De kwaliteit van de innerlijke fused silica capillaire van de DESI bron zal ook van invloed op de beeldkwaliteit en resolutie. De aanbevolen binnendiameter van het capillair 50 urn, zo groot id capillairen produceren sprays grotere en grotere beeldresolutie. 25 Wanneer dit punt wordt niet vierkant gesneden of gescheurd, de spray niet conisch zijn resulteert in onregelmatige vorm effect spot, slechte kwaliteit en reproduceerbare beelden.

Niet alleen de bron geometrie beïnvloeden de resolutie van DESI-MSI, maar speelt ook een belangrijke rol in de gevoeligheidvan de werkwijze. Derhalve de geometrie moet worden geoptimaliseerd en constant gehouden gedurende de procedure. Als het monster niet vlak of valt niet horizontaal gemonteerd, zal de bron geometrie te veranderen, waardoor het veranderen van de reactie en het creëren van een artefact in het beeld. 23 Hoewel DESI-MSI beperkt tot vlakke monsters, 3D-beeldvorming van biologische weefsels gemaakt mogelijk door de 2D beeldvorming van seriële coupes die vervolgens worden gestapeld in een driedimensionaal beeld. 32 Deze benadering kan ook worden gebruikt voor andere MSI methoden, waaronder SIMS, MALDI, LAESI, etc. 33 Drie-dimensionale massaspectrometrie beelden kunnen ook worden door de geleidelijke verwijdering van materiaallagen, door laserpulsen bijvoorbeeld en reimaging 34.

De positieve modus analyse van hersenweefsel van ratten faciliteert succesvolle beeldvorming van fosfatidylcholines en sommige geneesmiddelen en metabolieten. 18 Om deze analyse te vullen, beeldvorming in negative modus produceert een spectrum met een grotere diversiteit aan soorten lipiden, 28,35 en kunnen worden gebruikt om een uitgebreide analyse van de weefselcoupes verschaffen. Wanneer meerdere soorten lipiden kan worden toegeschreven aan een bepaalde m / z waarde, kan tandem massaspectrometrie worden gebruikt voor identificatie. Tandem massaspectrometrie dient ook als een extra methode van lipide identiteit bevestiging. 35

Ambient massaspectrometrie beeldvormend DESI is effectief gebleken bij de beeldvorming van soorten lipiden in rattenhersenen weefsel zijn. Verkregen door MSI experimenten informatie kan inzicht verschaffen in ziekten geassocieerd met een veranderde fosfolipiden zoals Alzheimer, syndroom van Down, en diabetes, onder anderen. 36-38 Gezien de grote dichtheid van lipiden en hun rol in biologische processen, veel biologische systemen bestaan die zouden profiteren van de verkregen via massaspectrometrie imaging informatie. Met vele mogelijke methodesop de foto biologische monsters met behulp van massaspectrometrie, ambient ionisatie methoden, DESI in het bijzonder, een middel om dat te doen met beperkte monstervoorbereiding en verhoogd gemak van de analyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

Acknowledgments

Dit werk wordt ondersteund door ARRA NSF MRI Instrument Development subsidie ​​# 0923179 te FMF. Wij danken Aqua Asberry, Lab Coördinator voor de Parker H. Petit Instituut voor Biotechniek en Biosciences Histologie Core, voor hulp met weefsel snijden.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Tissue-Tek O.C.T. Compound Sakura-Finetek 4583 http://www.sakuraeu.com/products/showitem.asp?cat=11&subcat=48
Acetonitrile EMD AX0156-6 OmniSolv, LC-MS Grade
Acetic Acid Sigma Aldrich 695092-500 ml
Equipment
Cryostat microtome Thermo Scientific CryoStar* NX70 Any available microtome can be used for tissue sectioning http://www.thermoscientific.com/ecomm/servlet/productsdetail?productId=13958375&groupType=PRODUCT&searchType=0&storeId=11152&from=search&ca=cryostar
Omni Spray®DESI Spray Head Prosolia Inc. Can also use the 2-D Omni Spray® Source kit instead of assembling components of imaging experiment http://www.prosolia.com/sources.php
High Voltage Power Supply Stanford Research Systems, Inc. PS350/5000V-25W http://www.thinksrs.com/products/PS300.htm
Rope heater, RTD, controller Omega http://www.omega.com/toc_asp/subsectionSC.asp?subsection=M02&book=Heaters
Labview National Instruments Version 7.1
Translational stage Prior Scientific Optiscan II http://www.prior.com/productinfo_auto_motorized_optiscan.html
AccuTOF Mass Spectrometer JEOL JMS-T100LC Can use any mass spectrometer equipped with an extended capillary atmospheric pressure interface

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Caprioli, R. M., Farmer, T. B., Gile, J. Molecular Imaging of Biological Samples: Localization of Peptides and Proteins Using MALDI-TOF MS. Anal. Chem. 69, 4751-4760 (1997).
  2. Pacholski, M. L., Winograd, N. Imaging with Mass Spectrometry. Chem. Rev. 99, 2977-3006 (1999).
  3. Wiseman, J. M., Ifa, D. R., Song, Q., Cooks, R. G. Tissue Imaging at Atmospheric Pressure Using Desorption Electrospray Ionization (DESI) Mass Spectrometry. Angew. Chem. Int. Ed. 45, 7188-7192 (2006).
  4. Nemes, P., Laser Vertes, A. Laser Ablation Electrospray Ionization for Atmospheric Pressure, in Vivo, and Imaging Mass Spectrometry. Anal. Chem. 79, 8098-8106 (2007).
  5. Nemes, P., Vertes, A. Atmospheric-pressure Molecular Imaging of Biological Tissues and Biofilms by LAESI Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (43), e2097 (2010).
  6. Van Berkel, G. J., Kertesz, V., Koeplinger, K. A., Vavrek, M., Kong, A. -N. T. Liquid microjunction surface sampling probe electrospray mass spectrometry for detection of drugs and metabolites in thin tissue sections. J. Mass Spectrom. 43, 500-508 (2008).
  7. Takáts, Z., Wiseman, J. M., Gologan, B., Cooks, R. G. Mass Spectrometry Sampling Under Ambient Conditions with Desorption Electrospray Ionization. Science. 306, 471-473 (2004).
  8. Venter, A., Sojka, P. E., Cooks, R. G. Droplet Dynamics and Ionization Mechanisms in Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry. Anal. Chem. 78, 8549-8555 (2006).
  9. Costa, A. B., Cooks, R. G. Simulation of atmospheric transport and droplet-thin film collisions in desorption electrospray ionization. Chem. Commun. , 3915-3917 (2007).
  10. Costa, A. B., Graham Cooks, R. Simulated splashes: Elucidating the mechanism of desorption electrospray ionization mass spectrometry. Chem. Phys. Lett. 464, 1-8 (2008).
  11. Konermann, L., Ahadi, E., Rodriguez, A. D., Vahidi, S. Unraveling the Mechanism of Electrospray Ionization. Anal. Chem. 85, 2-9 (2012).
  12. Kebarle, P., Verkerk, U. H. Electrospray: From ions in solution to ions in the gas phase, what we know now. Mass Spectrom. Rev. 28, 898-917 (2009).
  13. Green, F. M., Salter, T. L., Gilmore, I. S., Stokes, P., O'Connor, G. The effect of electrospray solvent composition on desorption electrospray ionisation (DESI) efficiency and spatial resolution. Analyst. 135, 731-737 (2010).
  14. Van Berkel, G. J., Kertesz, V. Automated Sampling and Imaging of Analytes Separated on Thin-Layer Chromatography Plates Using Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry. Anal. Chem. 78, 4938-4944 (2006).
  15. Ifa, D. R., Wu, C., Ouyang, Z., Cooks, R. G. Desorption electrospray ionization and other ambient ionization methods: current progress and preview. Analyst. 135, 669-681 (2010).
  16. Eberlin, L. S., Ferreira, C. R., Dill, A. L., Ifa, D. R., Cooks, R. G. Desorption electrospray ionization mass spectrometry for lipid characterization and biological tissue imaging. Biochim. Biophys. Acta. 1811, 946-960 (2011).
  17. Wu, C., Ifa, D. R., Manicke, N. E., Cooks, R. G. Molecular imaging of adrenal gland by desorption electrospray ionization mass spectrometry. Analyst. 135, 28-32 (2010).
  18. Wiseman, J. M., et al. Desorption electrospray ionization mass spectrometry: Imaging drugs and metabolites in tissues. Proc. Natl. Acad. Sci. 105, 18120-18125 (2008).
  19. Eberlin, L. S., et al. Classifying Human Brain Tumors by Lipid Imaging with Mass Spectrometry. Cancer Res. 72, 645-654 (2012).
  20. Wiseman, J. M., Ifa, D. R., Venter, A., Cooks, R. G. Ambient molecular imaging by desorption electrospray ionization mass spectrometry. Nat. Protocols. 3, 517-524 (2008).
  21. Van Berkel, G. J., Ford, M. J., Deibel, M. A. Thin-Layer Chromatography and Mass Spectrometry Coupled Using Desorption Electrospray Ionization. Anal. Chem. 77, 1207-1215 (2005).
  22. Lane, A. L., et al. Desorption electrospray ionization mass spectrometry reveals surface-mediated antifungal chemical defense of a tropical seaweed. Proc. Natl. Acad. Sci. 106, 7314-7319 (2009).
  23. Kertesz, V., Van Berkel, G. J. Scanning and Surface Alignment Considerations in Chemical Imaging with Desorption Electrospray Mass Spectrometry. Anal. Chem. 80, 1027-1032 (2008).
  24. Kertesz, V., Van Berkel, G. J. Improved imaging resolution in desorption electrospray ionization mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 22, 2639-2644 (2008).
  25. Campbell, D., Ferreira, C., Eberlin, L., Cooks, R. Improved spatial resolution in the imaging of biological tissue using desorption electrospray ionization. Anal. Bioanal. Chem. 404, 389-398 (2012).
  26. Chaurand, P., Cornett, D. S., Angel, P. M., Caprioli, R. M. From Whole-body Sections Down to Cellular Level, Multiscale Imaging of Phospholipids by MALDI Mass Spectrometry. Mol. Cell. Proteomics. 10, (2011).
  27. Dill, A., Eberlin, L., Costa, A., Ifa, D., Cooks, R. Data quality in tissue analysis using desorption electrospray ionization. Anal. Bioanal. Chem. 401, 1949-1961 (2011).
  28. Jackson, S. N., Wang, H. -Y. J., Woods, A. S. Direct Profiling of Lipid Distribution in Brain Tissue Using MALDI-TOFMS. Anal. Chem. 77, 4523-4527 (2005).
  29. Jackson, S. N., et al. MALDI-ion mobility-TOFMS imaging of lipids in rat brain tissue. J. Mass Spectrom. 42, 1093-1098 (2007).
  30. Wang, H. -Y. J., Post, S. N. J. J., Woods, A. S. A minimalist approach to MALDI imaging of glycerophospholipids and sphingolipids in rat brain sections. Int. J. Mass Spectrom. 278, 143-149 (2008).
  31. Wu, B., Becker, J. S. Imaging of elements and molecules in biological tissues and cells in the low-micrometer and nanometer range. Int. J. Mass Spectrom. 307, 112-122 (2011).
  32. Eberlin, L. S., Ifa, D. R., Wu, C., Cooks, R. G. Three-Dimensional Vizualization of Mouse Brain by Lipid Analysis Using Ambient Ionization Mass Spectrometry. Angew. Chem. Int. Ed. 49, 873-876 (2010).
  33. Seeley, E. H., Caprioli, R. M. 3D Imaging by Mass Spectrometry: A New Frontier. Anal. Chem. 84, 2105-2110 (2012).
  34. Nemes, P., Barton, A. A., Vertes, A. Three-Dimensional Imaging of Metabolites in Tissues under Ambient Conditions by Laser Ablation Electrospray Ionization Mass Spectrometry. Anal. Chem. 81, 6668-6675 (2009).
  35. Pulfer, M., Murphy, R. C. Electrospray mass spectrometry of phospholipids. Mass Spectrom. Rev. 22, 332-364 (2003).
  36. Han, X., Holtzman, D. M., McKeel, D. W. Plasmalogen deficiency in early Alzheimer's disease subjects and in animal models: molecular characterization using electrospray ionization mass spectrometry. J. Neurochem. 77, 1168-1180 (2001).
  37. Murphy, E. J., Schapiro, M. B., Rapoport, S. I., Shetty, H. U. Phospholipid composition and levels are altered in down syndrome brain. Brain Res. 867, 9-18 (2000).
  38. Han, X., et al. Alterations in Myocardial Cardiolipin Content and Composition Occur at the Very Earliest Stages of Diabetes: A Shotgun Lipidomics Study. Biochemistry. 46, 6417-6428 (2007).

Tags

Biotechniek Moleculaire Biologie Biomedische Technologie Chemie Biochemie Biofysica Natuurkunde Cellular Biology Molecular Imaging massaspectrometrie MS MSI desorptie elektrosprayionisatie DESI Ambient massaspectrometrie weefsel snijden biomarker imaging

Erratum

Formal Correction: Erratum: Imaging of Biological Tissues by Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry
Posted by JoVE Editors on 02/13/2014. Citeable Link.

A correction was made to Imaging of Biological Tissues by Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry. There was an error with an author's name. The author's surname was appended with a missing character:

Rachel V. Bennett

instead of:

Rachel V. Bennet

Beeldvorming van biologische weefsels door desorptie electrospray ionisatie massaspectrometrie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bennett, R. V., Gamage, C. M.,… More

Bennett, R. V., Gamage, C. M., Fernández, F. M. Imaging of Biological Tissues by Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (77), e50575, doi:10.3791/50575 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter