Summary
Im Jahr 2001 beschrieben Forscher an der UCLA die Isolierung einer Population von adulten Stammzellen, sogenannte Fettgewebe gewonnene Stammzellen oder ASC, aus dem Fettgewebe. Dieser Artikel beschreibt die Isolierung des ASC aus lipoaspirates mit einem manuellen, enzymatische Verdauung mit Kollagenase-Protokoll.
Abstract
Im Jahr 2001, Forscher an der University of California, Los Angeles, beschrieben die Isolierung einer neuen Population von adulten Stammzellen aus Fettgewebe liposuctioned, die sie anfangs genannt Verarbeitete Lipoaspirate Cells oder PLA-Zellen. Seitdem haben diese Stammzellen aus Fettgewebe gewonnenen Stammzellen oder ASC umbenannt und gegangen auf einer der beliebtesten adulten Stammzellen-Populationen in den Bereichen Stammzellforschung und der regenerativen Medizin zu werden. Tausende von Artikeln werden nun die Verwendung von ASC in einer Vielzahl von Tiermodellen regenerative, einschließlich der Knochenregeneration, periphere Nervenreparatur und Herz-Kreislauf-Engineering. Aktuelle Artikel haben begonnen, die Vielzahl von Anwendungen für ASC in der Klinik zu beschreiben. Die in diesem Artikel gezeigten Protokoll beschreibt das grundlegende Verfahren für manuell und enzymatisch ASC Isolierung von großen Mengen von lipoaspirates von kosmetischen Verfahren erhalten. Dieses Protokoll kann leicht nach oben oder unten skaliert werden, um Unterkunftsaß das Volumen der lipoaspirate und kann auf ASC aus dem Fettgewebe durch abdominoplasties ähnlichen Verfahren erhalten zu isolieren.
Introduction
Im Jahr 2001 wurde eine mutmaßliche Bevölkerung von multipotenten Stammzellen aus Fettgewebe in der Zeitschrift Tissue Engineering 1 beschrieben. Diese Zellen wurden die Namen Verarbeitete Lipoaspirate-oder PLA-Zellen aufgrund ihrer Ableitung aus verarbeitet lipoaspirate Gewebe durch kosmetische Chirurgie erhalten gegeben. Die in diesem Artikel beschriebenen Isolationsmethode wurde auf bestehende enzymatische Strategien für die Isolierung des Stroma-Kreislauf-Fraktion (SVF) aus dem Fettgewebe 2 basiert. Die SVF wurde als minimal verarbeiteten Population von roten Blutzellen, Fibroblasten, Endothelzellen, glatten Muskelzellen, Perizyten und Präadipozyten, die noch nicht zu einem Gewebekultur-Substrat 2, 3 haften definiert. Kultivierung dieser SVF über die Zeit wird vorgeschlagen, beseitigen viele dieser kontaminierenden Zellpopulationen und führen zu einer haftenden, Fibroblastenpopulation. Diese Fibroblasten wurden in der Literatur für die letzten 40 Jahre nicht als zuvor identifiziert wordenAdipozyten. Allerdings zeigten unsere Forschungsgruppe, dass diese Zellen besaß mesodermalen Multipotenz und als PLA Zellen umbenannt haft SVF Bevölkerung. Nachfolgende Studien von zahlreichen anderen Forschungsgruppen haben auf dieses Potential gegeben, was darauf hindeutet, sowohl endodermale und ektodermalen Potentiale (für eine Übersicht siehe 4). Seit dieser Zeit wurden zahlreiche zusätzliche Bedingungen für diese Zellen in der Literatur erschienen. Um irgendeine Art von Konsens zu schaffen, wurde der Begriff Fettgewebe gewonnene Stammzellen oder ASC in der 2. Jahres IFATS Konferenz angenommen. Als solche wird der Begriff ASC in diesem Artikel verwendet werden.
Die in diesem Artikel beschriebenen Protokoll ist ein relativ einfaches Verfahren, das Standard-Laborausrüstung erfordert und verwendet einfache Reagenzien wie Phosphor-Kochsalzlösung, Standard-Gewebekulturmedien und Reagenzien Kollagenase. Es kann abhängig von der Menge des Ausgangs Fettgewebe Volumen und anschließende c eine große Anzahl von ASCs erzeugenulture Zeit. Jedoch kann die Verarbeitung solcher großen Mengen von Fettgewebe einige physikalische Probleme, die bis zu einem Grad unter Verwendung dieses Protokolls begrenzt werden könnten präsentieren. Darüber hinaus hat dieses Protokoll erfordern sterile Gewebekultureinrichtungen und genehmigt Biosicherheit Hauben, wodurch die Verwendung eines zugelassenen Gewebekultur-Anlage erforderlich. Diese Anforderung kann auch den Nutzen der Bevölkerung zu verringern ASC in der klinischen Anwendung, sofern sie nicht in der guten Herstellungspraxis (GMP) zugelassenen Anlagen zur Isolierung und Ausdehnung von Materialien für den klinischen Einsatz konzipiert isoliert werden. Als Alternative würde automatisierte Systeme, die ASC in einem geschlossenen System im Operationssaal zu isolieren, können diese Schlüsselfrage zu vermeiden und ermöglichen den sofortigen Einsatz von ASC, ohne dass für die anschließende In-vitro-Expansion. Bisher gibt es sechs automatisierten Systemen, die für die Isolation von Zellen aus menschlichem Gewebe sind im Handel erhältlich. Diese Systeme können machen es möglich, ein isolierenerhebliche Anzahl von ASC von großen Mengen an Fettgewebe unmittelbar nach ihrer Ernte. Diese ASC konnte dann in den Patienten für eine Vielzahl von regenerativen Zwecken ohne dass der Patient jemals den Operationssaal verlassen wieder eingeführt werden. Zusätzlich zu diesem Protokoll die manuelle Trennung der ASC beschreibt, ist ein Protokoll für die automatisierte Isolierung von ASC mit dem Celution-System auch in einem Begleitartikel gegeben.
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Protocol
Die hier gezeigte Protokoll beschreibt die manuelle Trennung der ASC aus lipoaspirates durch kosmetische Eingriffe mit enzymatische Verdauung und Differenz Zentrifugation erhalten. Dieses Protokoll wurde zunächst in der Zeitschrift Tissue Engineering im Jahr 2001 ein, veröffentlicht in der die resultierenden Zellen wurden verarbeitet Lipoaspirate Cells-oder PLA-Zellen aufgrund ihrer Isolation von lipoaspirates genannt. Allerdings hat der Begriff PLA Zelle nun mit dem Begriff Fettgewebe gewonnene Stammzellen oder ASC, um das Feld eine Art von Übereinstimmung in Bezug auf die Nomenklatur geben ersetzt. Die Zellen durch dieses Protokoll isoliert wurden von vielen gezeigt, dass mesodermalen Potenzial sowohl in vitro als auch in vivo besitzen (für eine Übersicht siehe 4). Darüber hinaus haben die ektodermalen und endodermalen Potentiale der ASC ebenfalls erforscht 4 ist. Die Isolationstechnik ist einfach und unkompliziert und erfordert etwa eine Stunde in Anspruch. Die resultierende Zells werden unter Standardgewebekulturbedingungen kultiviert. Mit Kultur der Zeit wird der ASC Bevölkerung homogener, von Fibroblasten, die sich leicht erweitern und zeigen eine gute Rentabilität über den langfristigen in der Kultur zusammen.
Hinweis: Die folgenden Teile der Ausrüstung, die benötigt werden, werden am Ende dieses Artikels aufgelistet. Alle Glaswaren, Medien und Reagenzien werden durch Autoklavieren sterilisiert oder durch 0,22 um-Filter gefiltert werden. Aseptische Gewebekulturtechniken müssen immer beachtet werden. Um dies zu gewährleisten, sollten alle in der biologischen Sicherheitsschrank gestellt Materialien durch Besprühen mit einer 70% igen Ethanollösung und Abwischen mit Papiertüchern sauber sterilisiert werden.
1. Vor der Ernte, bereiten Sie die folgenden:
- Sterile 1X phospho-gepufferter Salzlösung (PBS) zum Waschen der lipoaspirates. Vorbereitung etwa 1 l 1x PBS auf 100 ml lipoaspirate. Autoklavieren des PBS und alleow auf Raumtemperatur abkühlen. Optional kann Antibiotikum / Antimykotikum in einer Endkonzentration von hinzugefügt: 100 IU / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin und 2,50 &mgr; g / ml Amphotericin B, sobald die PBS abgekühlt.
- Sterile von 0,075 bis 0,1% Collagenase Typ IA (von Clostridium histolyticum) für die enzymatische Verdauung der lipoaspirate. Dh Rohöl vs gereinigt - Konzentration wird auf die Qualität und Herkunft des Collagenase ab. Andere Kollagenase Typen verwendet (zB Collagenase Typ II oder IV) bei ähnlichen Konzentrationen werden. Planen in 1x PBS und Sterilfilter mit einer 1000 ml-Filtersystem mit einem 0,22 &mgr; m-Filter (Fig. 1A). Jedoch können sterile Glasflaschen mit Flaschenaufsatzfilter versehen, verwendet werden. Vorbereitung und Verwendung bei Raumtemperatur. Kollagenase-Lösungen können für die kurzfristigen bei 4 ° C gelagert, bis sie benötigt werden. Frieren Sie die Collagenase-Lösung, wie es seine Aktivität verringern.
- Sterile Control-Medium (CM) für Kollagenase Inaktivierung und Kultivierung des ASC Bevölkerung. Für 500 ml CM, kombinieren Sie die folgenden: 500 ml DMEM (4,5 g / l Glucose, mit L-Glutamin), 50 ml fetales Rinderserum (hitzeinaktiviert), 5 ml Penicillin / Streptomycin (10.000 IE Penicillin, 10.000 ug / ml Streptomycin). Als Option kann 5 ml Amphotericin B (250 &mgr; g / ml Amphotericin B) zugesetzt werden. Sterilfiltration dieses Mediums ist erforderlich, wenn nicht-sterile Reagenzien verwendet werden. Platzieren des CM in einem 37 ° C Wasserbad 30 Min. vor der Verwendung, um das Medium zu erwärmen.
- Sterile Glas-und Plastik zur Isolation. Autoklav einen 1.000 ml-Becherglas und auf Raumtemperatur abkühlen. Darüber hinaus haben die folgenden Kunststoffprodukte bereit: aseptische serologischen Pipetten (5 ml, 10 ml und 25 ml), 50 ml Zentrifugenröhrchen, und Gewebekultur-behandelten Kulturschalen.
2. Isolierung von ASC von Lipoaspirates
Die meisten lipoaspirates in einer Bestrebung Behälter (siehe Fig. 1B) gesammelt und kann aus drei unterschiedlichen Schichten aufgebaut sein: 1) eine obere Schicht von Öl durch die Lyse der reifen Adipozyten, 2) eine mittlere Schicht aus Fettgewebe, und 3) Boden, flüssige untere Phase enthält Kochsalzlösung und verunreinigen Zelltypen, wie rote Blutkörperchen (Erythrozyten). Die obere Ölschicht nicht in signifikanten Mengen vorhanden sein. Falls vorhanden, sollte es angesaugt werden, wie Ölverschmutzung der resultierenden ASC Kultur könnte die Lebensfähigkeit der Kultur beeinflussen. Der Boden untere Phase sollte vor der Verarbeitung entfernt werden, um eine Kontamination der Kulturen mit ASC RBCs minimieren. Dies wird in der Mitte, Fettgewebe Schicht, die dann gewaschen werden und enzymatisch verdaut, um ihre Mobilfunk-, Stroma-Kreislauf-Fraktion (SVF) befreien lassen.
- Waschen des lipoaspirate: Öffnen Sie die lipoaspirate Container in der Gewebekultur hood und sorgfältig dekantiert die lipoaspirate in eine sterile 1 L Becherglas. Damit die lipoaspirate Schichten zu trennen, bis das Fettgewebe Schicht auch getrennt (Fig. 1B).
- Absaugen der Ölschicht (falls vorhanden) mit einer sterilen Glaspipette und die Bodensalz untere Phase mit einer 10 ml serologische Pipette. Dies wird die überwiegende Mehrheit der verunreinigenden roten Blutzellen und Kochsalzlösung zu entfernen.
- Bewerten Sie die Volumen der resultierenden Fettgewebe Schicht und fügen sterilen 1x PBS bei gleichem Volumen. Rühren Sie die absaugen mit der Pipette zum Ansaugen, um die lipoaspirate mit dem PBS mischen verwendet. Lassen Sie die beiden Schichten zu begleichen. Wie oben erwähnt, kann die 1x PBS mit Antibiotika / Antimykotika ergänzt werden.
- Saugen Sie die untere Phase mit einer 10 ml serologische Pipette.
- Fahren Sie mit dem Fettgewebe Bruch waschen, wie in Schritt 2.1.2 beschrieben. und 2.1.3. bis die Fettschicht hat eine gelb / gold Farbe. Saugen Sie the untere Phase ein letztes Mal, so dass die Fettgewebe-Fraktion in das Becherglas. Um eine ausreichende Entfernung der untere Phase zu gewährleisten, damit die Schichten lipoaspirate 5 min nach dem letzten Waschen und vor dem letzten Aspiration zu begleichen.
- Enzymatische Verdauung des lipoaspirate: Vorbereiten sterile Kollagenase 1A Lösung, wie oben in einer Filtereinheit beschrieben. Vorbereitung ein Volumen gleich dem der Fettfraktion und Sterilfilter.
- Nach der Filtration des Collagenase-Lösung, entsorgen Sie die obere Filtereinheit vorsichtig gießen gewaschen Fettfraktion in die Collagenase-Lösung und die Flasche fest zu schließen.
- Platzieren Sie die Kollagenase / Fettmischung in einem 37 ° C Wasserbad und verdauen bei 37 ° C für 30 min. Schwenken Sie die Kollagenase / Fettmischung alle 5-10 min und legen wieder im Wasserbad. Das Fettgewebe Schicht sollte auf eine "glattere" Aussehen (Figur nehmenE 1B), wie die Verdauung abläuft. Weitere Aufschlusszeiten (dh bis zu 2 Stunden) können verwendet werden, wenn das Fettgewebe Schicht scheint immer noch feste Stücke von Fett in sich haben.
- Isolierung von ASC: Legen Sie die Kollagenase verdaut / Fettmischung wieder in den Biosicherheitswerkbank. Seien Sie sicher, dass die Filtereinheit mit 70% Ethanol vor der Platzierung wieder in den Schrank zu sterilisieren.
- Je 25 ml-Aliquots der untere Phase, die das SVF in sterile 50 ml Zentrifugenröhrchen.
- 25 ml CM in jedes Röhrchen. Damit das CM die Kollagenase durch Inkubation bei Raumtemperatur in dem Schrank für 5 min inaktiviert.
- Zentrifugieren für 10 min bei 1.200 × g, um die SVF als Pellet gesammelt.
- In der biologischen Sicherheitsschrank, saugen Sie den Überstand aus jedem Röhrchen. Achten Sie darauf, die obere Ölschicht und alle schwimmenden Fettzellen werden mit diesem Überstand abgesaugt (
- Vereinige die SVF Pellets in ein Zentrifugenröhrchen unter Verwendung von 30 ml CM und teilen gleichmäßig über zwei neue 50 ml Zentrifugenröhrchen. Zentrifuge nach Schritt 2.3.3. und saugen die Überstände aus den zwei SVF-Pellets (in Fig. gezeigt).
Optional: Wenn RBC-Lyse gewünscht, resuspendieren SVF jedes Pellet in 10 ml einer RBC-Lyse-Puffer (160 mM NH 4 Cl) und Inkubieren bei Raumtemperatur für 10 min. Zentrifuge nach Schritt 2.3.3. und saugen Sie die Überstände, die SVF-Pellets (in der Abbildung dargestellt) ergeben.- Kombinieren der beiden SVF Pellets in einem neues Zentrifugenröhrchen mit 5-10 ml CM (Fig. 1B).
- Um herauszufiltern, größere Gewebepartikel, pipettieren resuspendiert SVF Pellet auf einen 100 um Sieb-Filter auf einem neuen 50 ml Zentrifugenröhrchen gegeben und lassen Sie durch Schwerkraft filtern.
- Pipette Aliquots der resuspendierten(Und gefiltert) SVF Pellet, das die ASC auf Gewebekultur behandelt Kulturschalen. Nachtrag jedes Gericht mit einem entsprechenden Volumen von CM.
- Kultur der Zellen in CM für 3-4 Tage bei 37 ° C, 5% CO 2 ohne Medienwechsel.
- Vereinige die SVF Pellets in ein Zentrifugenröhrchen unter Verwendung von 30 ml CM und teilen gleichmäßig über zwei neue 50 ml Zentrifugenröhrchen. Zentrifuge nach Schritt 2.3.3. und saugen die Überstände aus den zwei SVF-Pellets (in Fig. gezeigt).
Nach dieser ersten Kulturperiode kann das Kulturmedium abgesaugt werden und alle verunreinigenden roten Blutzellen leicht durch Waschen mit sterilem 1 × PBS entfernt. Ersetzen Sie mit CM und Kultur weiterhin die ASC nach Bedarf. Die Art der Gewebekulturschale verwendet wird und wie das resuspendierte Pellet SVF unter diesen Schalen verteilt sich auf die Anzahl der Zellen nach herkömmlichen Gewebekultur gewünschten abhängen.
3. Charakterisierung des ASC Bevölkerung: Durchflusszytometrie und multilineärer Differenzierung
Nach der Isolierung sollte Charakterisierung des ASC Bevölkerung durchgeführt werden. Konventionelle Ansätze dafür sind Fluss Zytometrie, die Zelloberflächenantigen CD-Profil der Zellen zu charakterisieren und in vitro Differenzierung der multilineare Differenzierungsfähigkeit zu bestätigen. Während mehrere Linien in ASC beurteilt werden, dieses Protokoll beschreibt die Differenzierung der ASC in Zellen des adipogene, osteogenen und chondrogenen Linien als Mittel zur Bestätigung multilineage mesodermalen Potenziale 5.
In-vitro-Multi-Linien-Differenzierung von ASC
- Osteogene Differenzierung von ASC: Vor der Induktion, bereiten osteogenen Medium (OM) wie folgt: Um eine 500 ml Flasche DMEM (4,5 g / ml Glucose) 25,0 ml FBS (5,0% Endkonzentration) und 5,0 ml Penicillin / Streptomycin (10.000 IU / ml und 10.000 mg / ml Endkonzentration, beziehungsweise). Dazu fügen Sie die folgenden osteogenen Induktionsmittel, um die angegebenen Endkonzentrationen: Dexamethason (0,1 uM endg.), L-Ascorbinsäure-2-Phosphat (50,0 uM final) Und β-Glycerophosphat (10,0 mM final).
- Vor der Induktion, der Ernte und der Platte der kultivierten ASC in die gewünschte Gewebekulturschale, so dass eine Konfluenz von ca. 50% erreicht wird. Für jeden experimentellen Schale ausplattiert, die Platte eine zusätzliche Schale für eine nicht-induzierte Kontrolle. Kultur über Nacht in CM.
Hinweis: 50% Konfluenz wird empfohlen, um für die weitere Verbreitung zu ermöglichen, die im Laufe der Induktion auftreten können - Am Tag der Induktion, entfernen Sie das Medium, und fügen Sie die folgenden Schritte aus: OM auf die gewünschten osteogenen Versuchsbrunnen und CM an den Steuer Brunnen. Das Volumen der verwendeten Medien wird auf die Größe des Gewebekulturschale ab. Für 12-Well-Platten, 1,0 ml Medium pro Vertiefung ausreichend. Für 6-Well-Platten, 2,0 ml Medium pro Vertiefung ausreichend. Für 100-mm-Schalen, sollte 10,0 ml Medium pro Schale verwendet werden.
- Kultur die Zellen für mindestens 14 Tage mit Änderungen der entsprechenden Medium alle 3-4Tagen. Sehr osteogenen ASC Populationen können Zeichen der extrazellulären Mineralabscheidung so früh wie 7 Tage Induktion zu zeigen.
- Osteogene Differenzierung (dh extrazellulären Mineralabscheidung) unter Verwendung eines von Kossa histologische Färbung für Calciumphosphat bestätigt werden. Dieser Fleck wird ein schwarzbrauner Niederschlag Identifizieren der Anwesenheit von extrazellulären Calciumphosphat (siehe Fig. 2) zu erzeugen.
Um mit von Kossa Reagenz Fleck:- Entfernen Sie die OM aus den experimentellen Zellen und die CM von den Kontrollzellen
- Fix die Zellen für 60 min in 4,0% Paraformaldehyd in 1x PBS hergestellt.
- Mit 1x PBS waschen Zellen zweimal.
- Inkubieren der Zellen mit 2,0% Silbernitrat (in Wasser) in der Dunkelheit für 30 min.
- Entfernen Sie das Silbernitrat, waschen zweimal mit destilliertem Wasser und an der Luft trocknen die Zellen.
- Expose die Zellen mit UV-Licht für 60 min, um die cal entwickelnphat Niederschlag.
- Mit 1XPBS Waschen Sie die Zellen mehrmals.
- Gegenfärbung der Zell mit Hämatoxylin, wenn gewünscht.
- Vor der Induktion, der Ernte und der Platte der kultivierten ASC in die gewünschte Gewebekulturschale, so dass eine Konfluenz von ca. 50% erreicht wird. Für jeden experimentellen Schale ausplattiert, die Platte eine zusätzliche Schale für eine nicht-induzierte Kontrolle. Kultur über Nacht in CM.
- Adipogenen Differenzierung von ASC: Vor der Induktion, bereiten adipogenen Mittel (AM) wie folgt: Um eine 500 ml Flasche DMEM (4,5 g / ml Glucose) hinzufügen, 50,0 ml FBS (10,0% Endkonzentration) und 5,0 ml Penicillin / Streptomycin (10.000 IU / ml bis 10.000 &mgr; g / ml Endkonzentration, beziehungsweise). Dazu fügen Sie die folgenden adipogene Induktionsmittel, um die angegebenen Endkonzentrationen: Dexamethason (1,0 uM endg.), 3-Isobutyl-1-Methylxanthin (IBMX - 0,5 mM final), Indometacin (0,2 mM final) und Insulin (10,0 uM final ).
- Vor der Induktion, der Ernte und der Platte der kultivierten ASC in die gewünschte Gewebekulturschale, so dass eine Konfluenz von ca. 80% erreicht wird. Für jeden experimentellen Schale plattiert, Platte einen Zusatzal Schale für eine nicht-induzierte Kontrolle. . Kultur über Nacht in CM Hinweis: adipogenen Differenzierung der ASC zu sein scheint effizienter mit erhöhten Konfluenz.
- Am Tag der Induktion, entfernen Sie das Medium, und fügen Sie die folgenden: AM auf die gewünschten osteogenen Versuchsbrunnen und CM an den Steuer Brunnen. Das Volumen der verwendeten Medien wird auf die Größe des Gewebekulturschale ab. Für 12-Well-Platten ist 1.0.ml Medium pro Mulde ausreichend. Für 6-Well-Platten, 2,0 ml Medium pro Vertiefung ausreichend. Für 100-mm-Schalen, sollte 10,0 ml Medium pro Schale verwendet werden.
- Kultur die Zellen für mindestens 14 Tage mit Änderungen der entsprechenden Medium alle 3-4 Tage. Sehr adipogene ASC Populationen können Zeichen der Lipid Vakuolenbildung so früh wie 7 Tage Induktion zu zeigen.
- ASC zogen adipogene Differenzierung wird mehrere Lipid-Vakuolen, die leicht unter dem Lichtmikroskop sichtbar gemacht werden können, zu entwickeln. Zusätzlich kann adipogenen Differenzierungmit einem Oil Red O histologische Fleck, die in diesen Vakuolen ansammeln wird (siehe Abbildung 2) bestätigt werden.
Um mit Oil Red O Fleck:- Entfernen Sie die Medien aus den Versuchs-und Kontrollzellen und lösen für 60 min mit einer 10% formalen Kalzium Fixiermittel. Um dieses Fixiermittel vorzubereiten, kombinieren die folgende: 1,0 g CaCl 2, 25,0 ml 16% Paraformaldehyd (4,0% endg.) und 75,0 ml destilliertem Wasser.
- Mit 1x PBS Waschen Sie die Zellen zweimal.
- Mit 70% Ethanol Waschen Sie die Zellen kurz.
- Inkubieren der Zellen bei Raumtemperatur für 5 min mit Oil Red O-Lösung. Um die Oil Red O-Lösung löst hierzu 2,0 g Oil Red O-Pulver in 50,0 ml 70% Ethanol und 50,0 ml Aceton.
- Mit Leitungswasser waschen Sie die Zellen mit 70% Ethanol und dann.
- Visualisieren Sie die Zellen bald nach Färbung durch Ausbleichen der Färbung mit der Zeit.
- Chondrogene Differenzierung von ASCs: chondrogene Differenzierung wird durch ein High-Density-Kultur-Technik als "Mikromassenkultur" bezeichnet erreicht. Vor Kultur, bereiten Chondrogene Medium (CHM) wie folgt: Um eine 500 ml Flasche DMEM (4,5 g / ml Glucose) 5,0 ml FBS (1% Endkonzentration) und 5,0 ml Penicillin / Streptomycin (10.000 IE / ml und 10.000 &mgr; g / ml Endkonzentration, beziehungsweise). Dazu fügen Sie die folgenden chondrogene Induktion Mittel, um die angegebenen Endkonzentrationen: L-Ascorbinsäure-2-Phosphat (50,0 pg / ml final), Insulin (6,25 ug / ml final), Transferrin (6,25 ug / ml final) und TGF &bgr; 1 (10,0 ng / ml).
- Ernte der ASCs und Zentrifuge für 5 min bei 1.200 × g, um die Zellen zu pelletieren. Zählen der Zellen, um die Dichte der Zellsuspension zu bestimmen.
- Um die Micromass-Pellets herzustellen, bereiten zwei Zellsuspensionen: eine in ChM bei einer Dichte von 1 x 10 7 Zelle hergestellt experimentellen Suspensions / ml und eine in cm bei einer Dichte von 1 x 10 7 Zellen / ml hergestellt Kontrollsuspension.
- Platzieren 10,0 ul "Tröpfchen" der Zellsuspension in einzelne Vertiefungen einer Multi-Well-Platte. Ermöglichen, für 2-3 Stunden bei 37 ° C anhaften
- Vorsichtig überlagern die plattierten Tröpfchen entweder mit ChM oder CM man aufpassen, nicht, um die Zellen zu distanzieren.
- Kultur die Zellen für bis zu 14 Tage im ChM oder CM mit Veränderungen in Medium alle 3-4 Tage. Zellen in ChM kultiviert wird in dieser Zeit zu kondensieren, um eine mit hoher Dichte Micropellets mit wenig bis gar keine Zellen in einer Monoschicht umgibt. Kontrollzellen gezüchtet werden diesen kondensieren, und viele werden als Monoschicht gefunden werden.
- Um Chondrogenese bestätigen, korrigieren die Pellets für 15 min in 4,0% Paraformaldehyd (in 1x PBS) bei Raumtemperatur. Fleck auf die Anwesenheit von sulfatierten Proteoglykanen Verwendung eines histologischen Alcianblau-Färbung.
Um Flecken mit Alcianblau:- Waschen Sie die paraformaldehyde fest Pellets einmal in 1x PBS.
- Inkubieren der Pellets in 0,1 N HCl (pH 1,0) für 5 min auf ihre pH-Wert abzusenken.
- Entfernen Sie die HCl und fügen 1% Alcianblau Reagenz (in 0,1 N HCl, pH 1,0) hergestellt. Inkubation für 30 min bei Raumtemperatur.
- Entfernen Sie die Alcianblau Reagenz und waschen Sie die Pellets mit 0,1 N HCl (pH 1,0), um überschüssigen Farbstoff zu entfernen.
- Zusätzliche Waschanlagen mit Leitungswasser verwendet werden, um Hintergrundfärbung zu reduzieren.
- Als Alternative können die Micropellets geerntet werden über Nacht in 10% Formalin fixiert, in Paraffin eingebettet und die Abschnitte für Alcianblau angefärbt.
4. Durchflusszytometrische Charakterisierung von ASC
Charakterisierung der Zelloberflächenantigen CD-Profil kann durch konventionelle Durchflusszytometrie erfolgen.
- Vorbereitung der ASC für die Durchflusszytometrie: VorAnalyse, bereiten eine Durchflusszytometrie Buffer (FCB) wie folgt zusammen: 1,0% BSA, 2,0% FBS und 0,025% Saponin in PBS 1x vorbereitet.
- Ernten Sie die ASC und Zentrifugieren der Zellen für 5 min bei 1.200 xg, um ein Pellet zu produzieren.
- Resuspendieren der Zellen in sterile 1XPBS und zählen Sie die Zellen mit einer Zählkammer. Bestimmung der Zelldichte der Suspension.
- Teilen Sie die Suspension bis in Aliquots von 5 x 10 5 Zellen Gesamt-und Zentrifuge pelletieren.
- Entfernen Sie den Überstand PBS und fixieren die Zellen für 60 min bei -20 ° C mit einem Überschuss von eiskaltem 70% Ethanol. Falls erforderlich, können diese Zellen in diesem 70%-igem Ethanol in einem -20 ° C-Gefrierschrank gelagert, bis sie benötigt werden.
- Nach der Fixierung, sorgfältig absaugen Ethanol und vorsichtig waschen das Pellet zweimal mit einem Überschuss von FCB. Zum Waschen:
- In einem Überschuß des FCB und sanft das Pellet.
- Zentrifugieren für 5 min bei 1.200 xg, um die Zellen zu sammeln einsa Pellets.
- Vorsichtig absaugen FCB Stand.
- Wiederholen.
- Entfernen des endgültigen FCB Waschüberstand aus jedem Aliquot und Resuspension in 100 &mgr; l des FCB. Fügen Sie die gewünschten Fluorochrom-konjugierte primäre Antikörper mit vom Hersteller empfohlenen Verdünnung. Die Zellen auf Eis inkubieren mit dem Antikörper 30 min.
Hinweis: Wenn Fluorochrom-konjugierte primäre Antikörper nicht verfügbar sind, können nicht-konjugierte primäre Antikörper verwendet werden. - Für jedes Fluorochrom (zB FITC, PE), Inkubation eines Aliquots der Zellen mit 100 ml enthält FCB Isotyp-IgG als Negativkontrolle.
- Inkubieren eines Aliquots in 100 ml FCB enthält keine Antikörper als zusätzliche Kontrolle.
- Zwei Mal waschen jedem Aliquot Zelle mit FCB wie in Schritt 4.1.5 beschrieben. Nach dem letzten Wasch resuspendieren Aliquots in 100 ml des FCB und fahren Sie mit Flussanalyse.
Hinweis: Wenn nicht konjugierten Primärantikörper wurden verwendet: Danach Waschschritt bebrüten die Aliquots auf Eis für 20 min mit dem FCB ergänzt mit der entsprechenden Fluorochrom-konjugierten sekundären Antikörper mit vom Hersteller empfohlenen Verdünnung. Waschen zweimal wie in Schritt 4.1.5 beschrieben.
- Flussanalyse von ASC: Für Flow-Analyse, sollte ein Minimum von 10.000 Ereignisse gezählt werden. Ungefärbt und Isotyp-Kontrollen sollten verwendet werden, um Tore durch Vorwärtsstreuung (FSC) und Seitenstreuung (SSC) eingestellt werden. Zu diesem Zweck sollte die keine Antikörper Kontrollen (dh ungefärbt) von Schritt 4.1.8 um Schmutz und tote ASCs beseitigen verwendet werden. Die Isotyp-IgG Kontrollen von Schritt 4.1.7. sollte verwendet werden, um Bereiche der positive Fluoreszenz einzurichten.
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Representative Results
Das Protokoll Umriss oben beschrieben, eine manuelle, enzymatische Verfahren zur Isolierung eines SVF aus einem großen Volumen lipoaspirate Probe. Innerhalb dieses SVF gibt zahlreiche Zellpopulationen, einschließlich der ASC. Zahlreiche Studien schlagen vor, dass die Kultivierung dieses SVF unter Standard-Zellkulturbedingungen für eine haft Fibroblasten-Bevölkerung, die hauptsächlich aus der ASC-Typ zusammengesetzt werden soll. In Übereinstimmung damit haben wir gezeigt, mittels Durchflusszytometrie und Immunfluoreszenz, dass kultivierte SVF Pellets werden im Wesentlichen frei von den wichtigsten verunreinigenden Zelltypen, nämlich Erythrozyten, glatten Muskelzellen und Zellen der endothelialen Linie ein. Die resultierende ASC Bevölkerung in Erscheinung relativ homogen und von Fibroblasten-ähnlichen Zellen besteht (Abbildung 2). Diese adhärenten ASC wachsen gut in Kultur unter Standard-Zellkulturbedingungen und zeigen eine moderate Populationsverdopplungszeit 1 so dass sie für eine Vielzahl von molekularen und zell b geeignetiology Studien in vitro und in vivo Studien regenerative. In Anbetracht der heterogenen Natur der isolierten SVF Jedoch ist die Validierung der ASC Population erforderlich. Zahlreiche Studien haben die Durchflusszytometrie, um die CD-Antigenprofils von kultivierten ASC als mögliches Mittel zur Identifizierung dieser Zellen in vitro und in vivo zu charakterisieren 5-9 verwendet. Tabelle 1 faßt die Ergebnisse von vielen dieser Studien. Während die Expression von einigen dieser CD-Antigene bleibt umstritten, ist es allgemein anerkannt, dass kultiviert ASC sind CD13, CD29, CD34, CD44, CD49d, CD54, CD90 und CD140a positiv. Die Abwesenheit von zahlreichen hämatopoetischen CD-Antigene, wie CD31 und CD45, ist konsistent mit der mesodermalen Ursprungs der ASCs, obwohl die Expression von spezifischen Markern wie hämatopoetische CD34 ungelöst bleibt zu diesem Zeitpunkt. Kürzlich ASC antigenen Profile, wie Durchflusszytometrie bestimmt, wurden verwendet, um spezifische subpop wählenschriften 10-12 in der Hoffnung, Herstellung ASC mit erweiterten Kapazitäten Differenzierung.
Wie der beliebtesten Mittel der Validierung in vitro Induktion der ASC Bevölkerung mit definierten Kulturbedingungen Ergebnisse in ihrer Differenzierung zu mesodermalen, ektodermalen und endodermalen Linien (für eine Übersicht siehe 4) (Abbildung 2). Während in vitro Tri-Keimschicht Potenzial in der Nutzung von ASC für eine Vielzahl von regenerativen Modellsysteme, die Differenzierung in osteogene führte, ist adipogene und chondrogenen Zellen in der Regel ausreichend, um den ASC identifizieren und bestätigen die Multipotenz. In unseren Händen, die adipogene Differenzierung von ASC Ergebnisse in Zellen mit hellen Lipidvakuolen, die mit Oil Red O 5 färben. Osteogene Differenzierung Ergebnisse der alkalischen Phosphatase-positiven Zellen und die extrazelluläre Akkumulation von Mineral, das unter Verwendung eines Calciumphosphat-Von-Kossa-Färbung 5 färbt.Chondrogene Differenzierung unter High-Density-Micromass-Bedingungen produziert Pellets, die sulfatierte Proteoglykane (erfasste mit einem Alcianblau-Färbung) enthalten und exprimieren Kollagen Typ-2-5. Sowohl der Skelettmuskulatur und der glatten Muskulatur Differenzierung kann mit ASC-Färbung für Skelettmuskel-Myosin und MyoD1 und Glattmuskelaktin 5, 13, 14 gesehen werden. Differenzierung in die ektodermalen Linie durch die Annahme eines neuronalen Morphologie durch induzierte ASCs und die Expression von zahlreichen neuronalen Marker, einschließlich der NeuN, einer neuronalen Transkriptionsfaktor 5 vorgeschlagen. Schließlich Induktion von ASC zu einer Leber / endodermale Linie basierend auf festgelegten Bedingungen 15 Ergebnisse in Zellen, dass die Expression Alpha-Fetoprotein, ein bekannter Marker der Leber Hepatozyten. Diese Marker, zusammen mit zahlreichen anderen in den letzten 10 Jahren veröffentlicht legt nahe, dass die ASC eine pluripotente Stammzellpopulation, die leicht aufrechterhalten werden kann, undin vitro vermehrt und Zellen in Richtung der drei embryonalen Keimlinien induziert. Ihre regenerative Potentiale in vivo (für eine Übersicht siehe 4) gekoppelt ist, kann die ASC eine leistungsstarke Ergänzung zu den Werkzeugen einer regenerativen Forscher oder Kliniker sein.
Fig. 1 ist. Handbuch, enzymatische Isolierung von humanen ASC aus lipoaspirate Proben. A. Herstellung der Isolation vor der Isolierung die folgenden Komponenten sollten darauf vorbereitet werden: 1) 1x PBS (ohne Calcium oder Magnesium), über Autoklavieren sterilisiert, 2) eine Lösung von 0,075 bis 0,1% Collagenase Typ IA, in 1x PBS hergestellt und sterilisiert durch Filtration mit einem 0,22 &mgr; m-Filtereinheit, 3) Steuer Medium (CM) für die nachfolgende Kultur der ASC Bevölkerung. B. Isolierung von ASCs: Eine Schritt-für-Schritt-Anleitung für die Isolierung der Stroma-Kreislauf-Fraktion (SVF) von lipoaspirates gezeigt. Schritte umfassen das Waschen der lipoaspirate mit sterilem 1x PBS, Verdauung mit Kollagenase Typ IA, Sammlung des SVF durch Zentrifugation und Filtration SVF. Nachfolgende Kultivierung des SVF in einer haft Fibroblasten-Bevölkerung, die den ASC Bevölkerung führen. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen.
2. Multi-Linien-Differenzierungspotenzial der Haft ASC Bevölkerung. Cultured SVF Zellen führen zu einer relativ homogenen Bevölkerung von Haft-, Fibroblasten-ASC. Die Induktion des ASC Bevölkerung unter definierten Bedingungen zu Zellen des adipogene, osteogene, chondrogene, Skelett myogenen und glatt myogenen Linien.Darüber hinaus kann auch ASC in Zellen des ektodermalen Linie unterschieden werden, zum Ausdruck NeuN, einem Marker von Neuronen und Alpha-Fetoprotein (AFP) eine etablierte Marker der endodermale / Leberzelllinie. Einige Histologie und Immunfluoreszenz-Bilder werden aus bisher veröffentlichten Ergebnisse 1,5,6,7,8,9 übernommen. Differenzierung Linie zusammen mit der histologische, immunhistologische oder Fluoreszenzfarbstoff gezeigt. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen.
| Expressionsprofil | ||
| positiven Ausdruck | negativen Ausdruck | |
| CD9, CD10, CD13, CD29, CD34, CD44, CD49a, CD49b, CD49d, CD49e, CD51, CD54, CD55, CD59, CD61, CD63, CD71, CD73, CD90, CD105, CD138, CD140a, CD146, CD166, HLA-ABC, STRO-1 | CD11a, CD11b, CD11c, CD14, CD16, CD18, CD31, CD41a, CD49f, CD45, CD50, CD56, CD62E, CD62L, CD62P, CD104, CD106, CD133, CD144, CD146, HLA-DR, SMA, ABCG2 | |
| vorgeschlagen Phänotyp der ASC (Common zwischen zwei oder mehr Studien) | CD10, CD13, CD29, CD34, CD44, CD49d, CD54, CD90, CD140a, HLA-ABC, STRO-1 | CD11a, CD11b, CD11c, CD14, CD31, CD45, CD106, CD144 |
| umstritten Marker in ASC (Differenz Ergebnisse über mehrere Studien) | CD105, CD117, CD140b, CD146, CD166, SMA, HLA-DR | |
| Stroma-cell Marker | CD29, CD44, CD73, CD90, CD166 | |
| hämatopoetischen Marker | CD31, CD34, CD45, ABCG2 | |
| Marker, die gemeinsam zwischen zwei oder mehr fett dargestellt Studien SMA = Glattmuskelaktin HLA = Human-Leukozyten-Antigen ABCG2 = Multi-Drug-Transporter-Protein G2 | ||
Tabelle 1. Zelloberflächenexpressionsprofile der menschlichen ASC.
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Discussion
Fettgewebe für die Isolierung von ASC kann in vielen Formen: von festen Stücken von Gewebe durch Resektion oder Fettabsaugen, um kleinere Stücke entweder durch Extraktion oder Spritze Saug-assistierte Fettabsaugung (Liposuktion dh) erhalten wird. Ob mehr SVF Zellen (und damit ASC) aus resezierten oder Fettgewebe abgesaugt Proben erhalten werden, ist unklar, wie widersprüchliche Studien vorgestellt wurden 16, 17. Es ist möglich, dass entweder Form von Fettgewebe ist mehr als geeignet für die Isolierung von Zellen und SVF ASC, solange der Betreiber ist kompetent in ihrer Isolationstechnik. Allerdings ist Fettabsaugung halten einen Vorteil gegenüber der Resektion, dass es weniger invasiv und erfordert deutlich weniger post-operative Betreuung. Während die Arten der Fettabsaugung sind in den letzten zehn Jahren gestiegen, einschließlich der Techniken, wie Ultraschall-gestützte, Servo und Laser-Liposuktion 18, bleibt die häufigste Tumeszenz-Liposuktion,in dem die Fettkammer ist mit großen Mengen von steriler Kochsalzlösung, Anästhetika und Vasokonstriktoren vor Aspiration 19 überflutet. Die Wahl der Technik kann von Chirurgen, Chirurg variieren. , Während die Mittel zur Extraktion unwichtig für den Forscher scheinen, ist es jedoch wichtig zu erkennen, dass die Technik kann eine Auswirkung auf ASC Anzahl und Lebensfähigkeit haben. Beispielsweise können zunehmende Fettabsaugung Vakuum beeinträchtigen SVF Zellausbeute 20. Darüber hinaus nimmt im ASC-Proliferation haben auf Ultraschall-Liposuktion 17 gemessen worden.
Allerdings erhalten, sollte die absaugen schnell verarbeitet werden, wie Lagertemperaturen kann SVF Lebensfähigkeit und eventuelle ASC Ertrag auswirken. Studien von Matsumoto et al. Haben gezeigt, dass ASC Ausbeute nimmt ab, wenn Aspirat wird bei Raumtemperatur für mehr als 24 h 21 gespeichert. Falls erforderlich, kann 24-stündiger Lagerung bei 4 º C ohne nachteilige Wirkung verwendet werden,s auf die biologischen Eigenschaften des ASC Population, aber wiederum kann die Lebensfähigkeit der Zellen zu verringern, wenn dieser Lagerzeit wird über diesen Punkt hinaus erhöht. Die Leichtigkeit der Verarbeitung lipoaspirate direkt mit dessen Gesamtvolumen bezogen. Kleinere Volumina, durch Spritzen Extraktion erhalten werden, sind relativ leicht zu verarbeiten. Jedoch auch größere Volumen saugt, durch Fettabsaugung erhalten, körperliche Herausforderungen. Zum Beispiel kann etwas so einfaches Übertragen des Fett aus der Aspiration Behälter, so dass sie gewaschen werden kann Probleme darstellen, wenn das Ansaugvolumen ist groß. Die in diesem Artikel beschriebenen Protokoll ist dazu gedacht, einige dieser Probleme zu lindern.
Im großen und ganzen ist die Isolierung von ASC-Populationen aus lipoaspirates mit der in diesem Artikel beschriebenen enzymatischen Verfahren hat sich nicht wesentlich in den letzten 10 Jahren verändert hat. Es gibt zahlreiche Protokolle über PubMed, die in ihrer Beschreibung der Isolation der ASC aus lipoaspirates hervorragend sind. MOST von ihnen skizzieren ein sehr ähnliches Protokoll mit kleinen Änderungen. Grundsätzlich ist die lipoaspirate von Verunreinigungen gewaschen, enzymatisch verdaut, um das SVF und SVF freizugeben, welche die ASC Population wird durch Zentrifugation gesammelt. Die meisten großen Volumen lipoaspirates kommen in einer Art Vakuum-Behälter - die Konfiguration kann von dem Chirurgen, Chirurg variieren. Dieses Protokoll empfiehlt die Entfernung des absaugen in einem großen, sterilen Becher vor dem Waschen, da der Behälter selbst kann eine Quelle von Verunreinigungen sein, wenn nicht richtig, bevor sie in der biologischen Sicherheitshaube gereinigt. Ein Top-, Öl-Schicht, die aus der Lyse von reifen Adipozyten, einem mittleren Fettschicht und einer unteren Schicht aus Kochsalzlösung und verunreinigen roten Blutzellen führt: Einmal überführt und durch die Schwerkraft zu regeln, wird das absaugen in drei Schichten zu trennen. Die Ölschicht entfernt werden sollte, wie wir bemerkt haben, dass es möglicherweise toxisch auf die resultierende Zellkulturen (unveröffentlichte Beobachtungen) sein. Auch dieses Protocol empfiehlt, dass die untere Phase von Kochsalzlösung und Erythrozyten wird vor der ersten Wäsche, um die potenzielle Anzahl von verunreinigenden Erythrozyten einmal die ASC kultiviert verringern entfernt. Eine Studie von Francis et al. Wurde vorgeschlagen, dass diese untere Phase kann auch eine Quelle von ASCs 22 sein. Die Verwendung einer serologischen 10 ml-Pipette ermöglicht die Entfernung dieses untere Phase relativ einfach. Was bleibt, ist die Fettschicht, die dann einfach mit sterilem PBS gewaschen werden kann, oder, falls gewünscht, sterilem PBS, ergänzt mit Antibiotika und Antimykotika, die Wahrscheinlichkeit einer Kontamination 23-25 abnehmen. Nach dem Waschen wird das Fettgewebe enzymatisch unter Verwendung einer sterilen Lösung von Collagenase Typ IA verdaut. Die Verwendung einer Filtereinheit, wie die in diesem Video gezeigt Millipore Einheit verbindet ein bequemes Mittel zum aseptischen Filtrieren der Kollagenase in einem geschlossenen Behälter, an dem das gewaschene Fettgewebe für nachfolgende Wasserbad Verdauung bei 37 ° C zugegeben werden
Die Art der Kollagenase verwendet wurde, von Gruppe zu Gruppe mit Kollagenase Typ IA scheint zu sein, die häufiger 1, 24, 25 variiert. Allerdings gibt es über 11 verschiedene Typen von Kollagenase kommerziell erhältlich, die jeweils mit der Verdauung Affinitäten für bestimmte Gewebe. Für die Verdauung von Fettgewebe, Unternehmen wie Sigma Aldrich empfehlen Kollagenase Typ I und II und die beiden Typen sind in der heutigen Literatur 1, 24-27 vertreten. In ihrer ursprünglichen Artikel, Zuk et al. Verwenden Kollagenase Typ IA aus Rinderquellen in einer Konzentration von 0,075% 1 erhalten. Allerdings sind die meisten kommerziellen Quellen von Kollagenase Typ IA nun aus der anaeroben Bakterien Clostridium histolyticum oder E. erhaltene coli genetisch modifiziert mit C. histolyticum Gene. Viele Unternehmen bieten zahlreiche Präparate von Kollagenase Typ IA, aus rohem, um diejenigen, die durch Ammoniumsulfat-Fällung hergestellt. DieProtokoll in diesem Artikel beschrieben JoVE verwendet eine grobe Vorbereitung des Typs IA Kollagenase, die nicht nur Kollagenase-Aktivitäten enthält, sondern auch nicht-spezifische Protease, Clostripain und Trypsin-enzymatischen Aktivitäten. Während diese zusätzliche Enzyme sind entscheidend für die Effizienz der Verdauung 28, gibt es diejenigen, die viel zu berichten, viel Variabilität mit rohem Collagenase Typ IA 28, 29 verbunden und erhöhen ihre Konzentrationen der Kollagenase bis zu 0,2% auf effiziente Verdauung 23 zu erhalten. Diese Gruppen mit rohen Collagenase Typ IA, um die Leistung des Enzyms zu verbessern und in der Fettmatrix erhöhen die Stabilität der Zellen empfehlen auch seine Ergänzung mit Rinderserumalbumin (0,1 bis 1,0% BSA). Dies kann jedoch nicht nötig sein, da das Protokoll in diesem Artikel beschrieben verwendet Kollagenase ohne Ergänzung ohne nachteilige Wirkung auf die Verdauung Effizienz.
Für diejenigen, die eine definierte Kollagenase-Layout verwendenosition, sind nun kommerziellen Quellen enthält hochgereinigtes Kollagenase zusammen mit einer präzise Mischung von Proteasen zur Verfügung. Diese Präparate zu reinigen Clostridien-Kollagenase Typ I und II zu hohe Aktivität und kombinieren sie mit bekannten neutralen Protease-Aktivitäten wie Dispase und Thermo. Effiziente Fettgewebe Verdauung mit Kollagenase und Thermo wurde von Zachar et al. 27 berichtet. In Übereinstimmung mit dieser Arbeit Pilgaard et al. Berichten auch 30 hervorragende Verdauung Effizienz mit mehreren Mischungen von Kollagenase und Thermo. Allerdings haben sie die besseren Verdauung Effizienz mit Zubereitungen von Kollagenase und Dispase.
Aufschlusszeiten für die Isolierung von Zellen aus dem Fettgewebe kann von Studie zu Studie variieren. Viele veröffentlichten Protokollen empfehlen Aufschlusszeiten von 1-2 Stunden 27, 30. Es ist jedoch wichtig zu erkennen, dass eine übermäßige Aufschlusszeiten Letztlich kann die Anzahl der lebensfähigen ASCs und deren Stammzellphänotyp. Pilgaard und Kollegen haben festgestellt, dass 2 Stunden Verdauung bei 37 ° C bietet die beste Balance zwischen Gewebedissoziation Funktionalität und ASC 30 mit Zachar et al. Empfehlen, dass die Verdauung, letzten 45 min, alle 15 min bis 2 h maximale beobachtet werden kann, mit der Verdauung gestoppt, sobald das Fettgewebe nimmt eine homogenere Optik 27. Wir stimmen mit dieser Empfehlung. Allerdings ist es unsere Erfahrung, dass die meisten Kollagenase Typ IA Vorbereitungen auf 0,075-0,1% sind in der Lage große Mengen an verdauen lipoaspirates in 30-45 min und dass diese Zeiten ausreichen, um eine ausreichende Anzahl von Zellen zu befreien sind. Daher empfiehlt dieses Protokoll eine Verdauungszeit von 30 min. Wird mehr Zeit benötigt, sollte die Konsistenz des lipoaspirate überwacht werden und die Verdauung beendet, wenn die lipoaspirate nimmt eine "cremig" oder "soupy" Erscheinung (Fig. 1).
Sobald thE Verdauung abgeschlossen ist, die Isolierung der frei SVF wird einfach mit Zentrifugation durchgeführt. Jedoch, wie Aspiration Druck, die physikalischen Effekte der Zentrifugation kann Auswirkungen auf die Lebensfähigkeit SVF und der Anzahl der ASC für die Kultur zur Verfügung. Eine Studie von Kurita und Kollegen haben gezeigt, dass 31 Geschwindigkeiten von über 3.000 xg die ASC beschädigen. Allerdings sollte Geschwindigkeiten signifikant genug, um ausreichende Pelletierung der SVF zu gewährleisten. In der Regel werden die meisten Protokolle, einschließlich der vorliegenden, empfehlen eine Zentrifugation Geschwindigkeit von 1.200-1.500 g x. Sorgfalt sollte der Forscher zu achten, dass sie verstehen, das die Beziehung zwischen der Zentrifugalkraft (gemessen in g) und Zentrifugation Geschwindigkeiten (gemessen als Umdrehungen pro Minute), als das Verhältnis ist abhängig von der spezifischen Zentrifugenrotor. Jedoch in der Regel niedriger Zentrifugalkraft, wie 1.200 x g, oft äquivalent Zentrifugation Geschwindigkeit und kann sicher austauschbar verwendet werden.
Nach Spinnen, mehrere dieine obere Schicht aus Öl und "fluffy" weißen Fettzellen, einer mittleren Schicht und einer Kollagenase-Zellpellet: Instinkt Schichten sind in dem Zentrifugenröhrchen (Fig. 1) beobachtet. Das Pellet selbst kann zwei verschiedene Schichten: eine obere Schicht aus roten Blutkörperchen und eine untere weiß SVF-Pellet, das die ASC. Dieses Protokoll empfiehlt die sorgfältige Aspiration von der Öl-und Fettzellen, so kann das Öl giftig für die Zellkultur und Fettzellen haben gezeigt, dass in der Lage ist Dedifferenzierung zurück zu einer primitiven Zelle Typ 32 sein. Jedoch können diese Adipozyten zu diesem Zeitpunkt, falls gewünscht geerntet werden. Aufgrund dieser Verunreinigungen empfiehlt dieses Protokoll eine zusätzliche Waschschritt, um ihre adäquate Entfernung zu gewährleisten. Dieser Schritt ermöglicht es dem Forscher, mehrere SVF-Pellets für die anschließende einfache Filtration zu kombinieren. Filtration ist wahrscheinlich notwendig sein, aufgrund der Anwesenheit von großen Stücken von fibrotischen Material und Zellaggregaten, die nach Aufschluss. Diese Materialien sind leicht zu entfernendurch einfache Schwerkraft-basierten Filtration durch 70 oder 100 um Maschenfilter. Ein Aliquot des Filtrats kann, um die Zahl der kernhaltigen Zellen, wenn gewünscht, und das verbleibende Filtrat zur Einhaltung ASC und Expansion plattiert rücksichtigt werden.
Trotz sorgfältiger Versuche, so viele Erythrozyten wie möglich zu entfernen, wird kein ASC Vorbereitung ganz ohne RBC Verunreinigungen sein. In unserem ursprünglichen Artikel haben wir vorgeschlagen, die Entfernung dieser Erythrozyten durch Resuspension des Pellets in einer hypotonischen Lösung von 160 mM NH 4 Cl. Die Mehrheit der anschließende Isolierung Artikel enthalten diesen Schritt, und empfehlen die Verwendung von NH 4 Cl-basierte Lösungen oder sterilem Wasser 22-24, 27, 33, obwohl darauf zu achten, ob unter Verwendung von sterilem Wasser genommen werden, um die Zeit die SVF Zellen ausgesetzt sind, zu minimieren zu dem hypotonischen Lösung 27. Jedoch kann dieser Schritt nicht erforderlich, da RBCs sind eine nicht-adhärenten Zellpopulation und kann leicht nach einer Übernachtkultur entfernt werdenASC Bevölkerung. Darüber hinaus, während allenfalls anekdotische erscheinen diese Erythrozyten, um die anfängliche Expansion der resultierenden adhärenten Zellen (Zuk, unveröffentlichte Beobachtungen) zu verbessern. Als solcher macht dieses Protokoll die RBC-Lyse und schlägt vor, dass die anfänglichen ASC Kulturen erlaubt, in der Gegenwart dieser Erythrozyten für die ersten 3-4 Tage zu erweitern, ohne eine Änderung des Kulturmediums werden. Der Grund für diese Beobachtung kann durch irgendeine Art von Signalisierungs parakrine sein verunreinigen Blutkörperchen oder kann einfach durch bessere Lebensfähigkeit unter Ausschluß von der RBC-Lyse-Schritt. Anschließend kann das Kulturmedium durch sanftes Waschen der Platten mit sterilem 1x PBS abgesaugt und in der Mehrzahl von RBCs entfernt. Mit der Zeit werden die verbleibenden Erythrozyten und sterben schließlich aus der Kultur entfernt werden.
Studien von Zachar und Boquest haben geschätzt, dass 25-50% des resuspendierten Pellet SVF haftet auf Kunststoff-Gewebekultur 23, 27. Die daraus resultierende "Passage 0" ASC cultures sind heterogen, von kleinen, runden Zellen gedacht, ASC und unregelmäßig geformte Zellen vorgeschlagen endothelialen Ursprungs zu sein besteht. Während Studien von vielen Gruppen einschließlich dieses Modell haben die Abwesenheit von kontaminierenden Zelltypen, wie SMC, hämatopoetischen Zellen und Fibroblasten in Kulturen ASC 1 bestätigt wird, kann die Anwesenheit von zusätzlichen Zelltypen nicht ausgeschlossen werden. . Tatsächlich hat Tallone et al Passage 0 Kulturen geprägt und vier unterschiedliche Populationen beobachtet: 1) kleine, runde, schnell erneuern Zellen, 2) spindelförmige Fibroblasten gedacht, um die ASC sein, 3) langsam replizieren große Zellen mit einer mehr eingeschränkt Potential (dh vor der Adipozyten) und 4) quaderförmigen Endothelzellen, die mit Durchgang 34 verloren. Nachfolgende Studien haben gezeigt, dass die runde, rasch erneuern Zellpopulation besitzt die höchste multipotentiality und Express typischen Stammzellmarker 35, 36. Darüber hinaus können sie "Sphäroide" infolge bildenihre rasche Verbreitung und werden oft von spindelförmigen Fibroblasten umgeben. Als solches ist es möglich, daß die oben vorgeschlagenen spindelförmige ASC Population kann aus diesen Zellen stammen. Nach dem erstmaligen Ausbau dieser Passage 0 ASC Kulturen, wird angenommen, dass die weitere Kultivierung der Zeit wählt für den ASC, mit den resultierenden Kulturen unter der Annahme einer mehr Fibroblasten, homogene Zusammensetzung. Allerdings, Reste von verunreinigenden Zellen kann nicht völlig ausgeschlossen werden kann, und daher sollte der ASC Bevölkerung immer noch als heterogener werden.
Während das in diesem Artikel beschriebene Protokoll ist einfach, preiswert ist und keine Teile der Ausrüstung, die normalerweise in einer Gewebekulturanlage gefunden erfordern, hat es den Nachteil, dass eine solche Anlage erfordert. Zahlreiche Studien haben die translationale Anwendungen der ASC durch Tiermodellen untersucht und klinische Studien mit dem ASC haben damit begonnen, erscheinen (für eine Übersicht siehe 4.
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Disclosures
Die Autoren dieser Handschrift sind Miterfinder auf einem Patent von The Regents der Universität von Kalifornien und Cytori Therapeutics lizenziert gehört.
Acknowledgments
Die Autoren möchten zu erkennen und zu danken, diese zusätzliche Mitarbeiter in der Forschung, die zur Entwicklung der beschriebenen Protokoll und seine Isolierung von ASC, einschließlich beigetragen: Dr. H. Peter Lorenz, MD, Dr. Hiroshi Muzuno, MD, Dr. Jerry Huang, MD Dr. Adam Katz, MD, Dr. William Futrell, MD, Dr. Rong Zhang, DDS, PhD, Dr. Larissa Rodriguez, MD, Dr. Alfonso Zeni, PhD, und Dr. John Fraser, PhD. Die vorgestellten Ergebnisse wurden finanziert, zum Teil durch Forschungsstipendien von den National Institutes of Health, einschließlich der NIAMS und NIDCR Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| DMEM (Dulbecco’s Modification of Eagle’s Medium) | Mediatech Cellgro | 10-013-CV | with 4.5 g/ml glucose, L-glutamine, sodium pyruvate |
| Penicillin/Streptomycin | Mediatech Cellgro | 30-002-CI | 10,000 IU/ml penicillin/10,000 μg/ml streptomycin |
| Amphotericin B | Mediatech Cellgro | 30-003-CF | 250 μg/ml amphotericin B |
| 10X PBS (Phospho-buffered Saline) | Mediatech Cellgro | 25-053-CI | without calcium, without magnesium |
| Trypsin/EDTA | Mediatech Cellgro | 20-031-CV | 0.25 % trypsin/2.21mM EDTA |
| Collagenase type IA (from Clostridium histolyticum) | Sigma | C2674 | crude preparation; <125 collagen digestion units/mg solid |
| FBS (Fetal Bovine Serum) heat inactivated | Gemini Bioproducts | 100106 | USDA source, heat inactivated |
| 10 ml serological pipettes | Genesee Scientific | 12-104 | |
| 25 ml serological pipettes | Genesee Scientific | 12-106 | |
| 50 ml polypropylene centrifuge tubes | Genesee Scientific | 21-106 | |
| 100 mm tissue culture dishes | Genesee Scientific | 25-202 | |
| 150 mm tissue culture dishes | Genesee Scientific | 25-203 | |
| 500 ml Stericup Filter Units | Millipore | SCGPU05RE | PES membrane, 0.22 μm pore |
| Cell strainers | FisherBrand | 22-363-549 | 100 μm nylon mesh |
| dexamethasone - water soluble | Sigma | D-2915 | |
| L-ascorbic-acid 2 phosphate | Sigma | A-8960 | |
| β-glycerophosphate disodium salt | Sigma | G-9422 | also known as glycerophosphate |
| insulin | Sigma | I-6634 | made from bovine pancreas |
| indomethacin | Sigma | I-7378 | |
| apo-transferrin | Sigma | T-4382 | |
| TGFβ1 | R&D Systems | 240-B-002 | recombinant human |
| Oil Red O | Sigma | O-0625 | |
| Alcian Blue | Sigma | A-5268 | |
| Silver nitrate | Sigma | S-0319 | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 30525-89-4 | supplied as a 16 % stock |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment Needed | |||
| Class II A/B Biosafety hood | Thermo Scientific | ensure hood has vacuum lines for aspiration | |
| Benchtop centrifuge | Hermle Labnet | Z383 | Swing-out rotor for 50 ml tubes required, capable of 1200xg |
| Water bath | Fisher Scientific Isotemp | S52602Q | 5-10L capacity, capable of 37C |
| Automated Pipette Aids | Drummond Pipette Aid XL | 4-000-105 | |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | Forma 310 | direct heat or water jacketed |
References
- Zuk, P. A., et al. Multi-lineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Engineering. 7 (2), 211-226 (2001).
- Rodbell, M.
- Poznanski, W. J., Waheed, I., Human Van, R. fat cell precursors. Morphologic and metabolic differentiation in culture. Lab Invest. 29 (5), 570-576 (1973).
- Zuk, P. A. Adipose-derived Stem Cells in Tissue Regeneration: A Review. ISRN Stem Cells. , in press (2012).
- Zuk, P. A., et al. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Mol. Biol. Cell. 13, 4279-4295 (2002).
- Mitchell, J. B., et al. Immunophenotype of human adipose-derived cells: temporal changes in stromal-associated and stem cell-associated markers. Stem Cells. 24 (2), 376-385 (2006).
- Oedayrajsingh-Varma, M. J., et al. Phenotypical and functional characterization of freshly isolated adipose tissue-derived stem cells. Stem Cells Dev. 16 (1), 91-104 (2007).
- Yoshimura, K., et al. Characterization of freshly isolated and cultured cells derived from the fatty and fluid portions of liposuction aspirates. J Cell Physiol. 208 (1), 64-76 (2006).
- Zannettino, A. C., et al. Multipotential human adipose-derived stromal stem cells exhibit a perivascular phenotype in vitro and in vivo. J Cell Physiol. 214 (2), 413-421 (2008).
- Chung, M. T., et al. CD90 (Thy-1) Positive Selection Enhances Osteogenic Capacity of Human Adipose-Derived Stromal Cells. Tissue Eng Part A. , (2012).
- Li, H., et al. Adipogenic potential of adipose stem cell subpopulations. Plast Reconstr Surg. 128 (3), 663-672 (2011).
- Rada, T., Reis, R. L., Gomes, M. E. Distinct stem cells subpopulations isolated from human adipose tissue exhibit different chondrogenic and osteogenic differentiation potential. Stem Cell Rev. 7 (1), 64-76 (2011).
- Heydarkhan-Hagvall, S., et al. Human Adipose Stem Cells: A Potential Cell Source for Cardiovascular Tissue Engineering. Cells Tissues Organs. 187 (4), 263-274 (2008).
- Jack, G. S., et al. Processed lipoaspirate cells for tissue engineering of the lower urinary tract: implications for the treatment of stress urinary incontinence and bladder reconstruction. J Urol. 174 (5), 2041-2045 (2005).
- Banas, A., et al. Rapid hepatic fate specification of adipose-derived stem cells and their therapeutic potential for liver failure. J Gastroenterol Hepatol. 24 (1), 70-77 (2009).
- Schreml, S., et al. Harvesting human adipose tissue-derived adult stem cells: resection versus liposuction. Cytotherapy. 11 (7), 947-957 (2009).
- Oedayrajsingh-Varma, M. J., et al. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cell yield and growth characteristics are affected by the tissue-harvesting procedure. Cytotherapy. 8 (2), 166-177 (2006).
- Ahmad, J., Eaves, F. F., Rohrich, R. J. 3rd, Kenkel, J. M. The American Society for Aesthetic Plastic Surgery (ASAPS) survey: current trends in liposuction. Aesthet Surg J. 31 (2), 214-224 (2011).
- Tierney, E. P., Kouba, D. J., Hanke, C. W. Safety of tumescent and laser-assisted liposuction: review of the literature. J Drugs Dermatol. 10 (12), 1363-1369 (2012).
- Mojallal, A., Auxenfans, C., Lequeux, C., Braye, F., Damour, O. Influence of negative pressure when harvesting adipose tissue on cell yield of the stromal-vascular fraction. Biomed Mater Eng. 18 (4-5), 193-197 (2008).
- Matsumoto, D., et al. Influences of preservation at various temperatures on liposuction aspirates. Plast Reconstr Surg. 120 (6), 1510-1517 (2007).
- Francis, M. P., Sachs, P. C., Elmore, L. W., Holt, S. E. Isolating adipose-derived mesenchymal stem cells from lipoaspirate blood and saline fraction. Organogenesis. 6 (1), 11-14 (2010).
- Boquest, A. C., Shahdadfar, A., Brinchmann, J. E., Collas, P. Isolation of stromal stem cells from human adipose tissue. Methods Mol Biol. 325, 35-46 (2006).
- Bunnell, B. A., Flaat, M., Gagliardi, C., Patel, B., Ripoll, C. Adipose-derived stem cells: isolation, expansion and differentiation. Methods. 45 (2), 115-120 (2008).
- Dubois, S. G., et al. Isolation of human adipose-derived stem cells from biopsies and liposuction specimens. Methods Mol Biol. 449, 69-79 (2008).
- Mosna, F., Sensebe, L., Krampera, M. Human bone marrow and adipose tissue mesenchymal stem cells: a user's guide. Stem Cells Dev. 19 (10), 1449-1470 (2010).
- Zachar, V., Rasmussen, J. G., Fink, T. Isolation and growth of adipose tissue-derived stem cells. Methods Mol Biol. 698, 37-49 (2011).
- Williams, S. K., McKenney, S., Jarrell, B. E. Collagenase lot selection and purification for adipose tissue digestion. Cell Transplant. 4 (3), 281-289 (1995).
- Wang, H., Van Blitterswijk, C. A., Bertrand-De Haas, M., Schuurman, A. H., Lamme, E. N. Improved enzymatic isolation of fibroblasts for the creation of autologous skin substitutes. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 40 (8-9), 268-277 (2004).
- Pilgaard, L., Lund, P., Rasmussen, J. G., Fink, T., Zachar, V. Comparative analysis of highly defined proteases for the isolation of adipose tissue-derived stem cells. Regen Med. 3 (5), 705-715 (2008).
- Kurita, M., et al. Influences of centrifugation on cells and tissues in liposuction aspirates: optimized centrifugation for lipotransfer and cell isolation. Plast Reconstr Surg. 121 (3), 1033-1041 (2008).
- Poloni, A., et al. Human dedifferentiated adipocytes show similar properties to bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells. 30 (5), 965-974 (2012).
- D'Andrea, F., et al. Large-scale production of human adipose tissue from stem cells: a new tool for regenerative medicine and tissue banking. Tissue Eng Part C Methods. 14 (3), 233-242 (2008).
- Tallone, T., et al. Adult human adipose tissue contains several types of multipotent cells. J Cardiovasc Transl Res. 4 (2), 200-210 (2011).
- De Francesco, F., et al. Human CD34/CD90 ASCs are capable of growing as sphere clusters, producing high levels of VEGF and forming capillaries. PLoS One. 4 (8), e6537 (2009).
- Haasters, F., et al. Morphological and immunocytochemical characteristics indicate the yield of early progenitors and represent a quality control for human mesenchymal stem cell culturing. J Anat. 214 (5), 759-767 (2009).
