Summary
ここでは、イメージサイトメトリー、培養中の宿主細胞に対応付けて病原性真菌の定量に使用することができる方法を示す。この技術は、CFU列挙の代替として使用することができる。
Abstract
例えば、 カンジダ·アルビカンス 、 ヒストプラスマカプ 、およびクリプトコッカス·ネオフォルマンスなどの病原性酵母の細胞病原性機構の研究は、一般に、単位分析またはフローサイトメトリーを形成するコロニーを用いて酵母定量化に続いて、哺乳動物宿主又は宿主細胞（ すなわち、マクロファージ）の感染を用いる。コロニー形成単位の列挙は、フィールドで最も一般的に使用される方法であったが、この技術は成長を比較するときに特に懸念される固体培地および低および/または可変メッキ効率、上のいくつかの真菌種のゆっくりとした成長を含めて、不利な点と制限があります野生型および変異株である。フローサイトメトリーは、酵母の生存率に関する迅速な定量的情報を提供することができるが、病原性酵母のフローサイトメトリー検出の適用は、その高コスト及び生物学的安全性の考慮を含む実用的な理由の数が限られている。ここでは、イメージベースのデモンストレーションマクロファージとの共培養中の生存病原性酵母の定量化のためのCellometerビジョン（バイオサイエンスNexcelom、LLC）を使用してフローサイトメトリーの方法論。 2人間の真菌病原体の検出に関する我々の研究の焦点： ヒストプラスマカプとカンジダH.。カプはマクロファージファゴソーム内で複製することによって肺胞マクロファージコロニーを形成し、ここで、我々は定量H.の成長を評価するイメージサイトメトリーと組み合わせて、アクリジンオレンジ/ヨウ化プロピジウム染色を用いてRAW 264.7マクロファージにおけるカプ酵母。我々の忠実方法従来のコロニー形成単位の列挙によって測定された反復するの成長傾向が、大幅に増加した感度。さらに、我々は直接Cの GFP発現株でライブマクロファージの感染性を評価アルビカンス 。我々の方法論は、アソシエーションのウィットに重要なヒトの真菌病原体の検出および定量のために、迅速、正確、かつ経済的な手段を提供しています時間宿主細胞。
Introduction
彼らのホストおよび/または宿主細胞に伴う病原性真菌の研究は、多くの場合、時間経過を介して、または別の感染条件下で実行可能な真菌細胞の定量化を必要とする。コロニー形成単位（CFU）の列挙は、生菌数を測定したが、この手法はいくつかの欠点と限界を有することによって標準的な方法である。まず、多くの真菌種は成長が遅いです。固体培地上に見えるコロニーの成長が著しく、研究のペースを遅くする、1〜2週間かかる場合があります。いくつかの希釈がコロニーの可算数を確保するためにメッキしなければならないので、第二に、CFUメッキ中にサンプルの操作は、骨の折れるプロセスです。メッキ効率がよく、100％を下回っているので、第三に、CFU数が蒔い生菌の数よりも一般的に低くなっています。例えば、二形真菌病原体ヒストプラスマカプするめっき効率は90％と高いよいが、日常的な限り低くすることができ30％とは、関連する真菌dimorphのParacoccidioidesのパラゴムノキ 1、2のために（10％）であっても低くなっています。 カンジダ用めっき効率も変動3の対象となります。最後に、固体培地上で成長を確立することができる唯一のライブと活発に分裂する細胞のためのCFU分析アカウントは、多くの状況で、一方、それは死んで、および/または代謝的に不活性な細胞の存在と濃度を決定することは有用であろう。
以前は、いくつかの病原性真菌種の定量化のためのフローサイトメトリーの方法は4-6に記載されている。ただし、共有フローサイトメーター上のバイオセーフティレベル2（BSL2）またはBSL3レベルの病原体の使用に関わるバイオセーフティ封じ込めの問題のために、この手法の採用が限定されている。フローサイトメトリーのように、イメージサイトメトリーは、細胞の定量化の感度かつ迅速な方法である。しかし、画像サイトメトリーを同等の結果7と数分の一のコストで行うことができます-11。ここでは、宿主細胞に伴って病原性真菌のイメージサイトメトリーを実行するための方法が記載されている。我々は2つの人間の真菌病原体を使用して、私たちの方法を実証： ヒストプラスマカプとカンジダをH.。カプは、呼吸器疾患を引き起こす二形真菌病原体であり、ヒトでは、出芽酵母として成長し、肺胞マクロファージ内で複製カンジダは時折カンジダ症の原因となる人間の共生種である。我々は、画像メトリが可視化機能と一緒に、これらの酵母の迅速な定量化を可能にすることを示している。
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Protocol
1。 H.とマクロファージの感染カプスラーツム、C.アルビカンス
- 16感染前にHR、24ウェルプレート中で所望の密度でシードマクロファージ。このプロトコルでは、ウェル3.0×10 5細胞の密度/を使用した。
- 感染の所望多重度（MOI）で対数増殖期における真菌細胞を追加します。このプロトコルは、MOI（ - 5.0 0.2）の範囲を収容することができます。 H.とRAW264.7マクロファージの感染カプスラーツム 、私たちは、MOI 0.2を使用していました。
- 食作用を可能にするために1.5時間後に、細胞外の菌を除去するためにPBSでマクロファージを三回洗浄する。
- 試料分析の前に、所望の数の時間インキュベートする。 （我々の実験では0.2）、低MOIで感染したマクロファージ細胞は数日間生存したままで、そしてサンプルは、およそ12〜24時間を分析することができる。
2。マクロファージ溶解
- マクロファージ細胞から真菌を解放するには、メディアを取り出し、PBSで3回洗浄し、0.5ミリリットル滅菌水を追加します。これらの条件下では、マクロファージが溶解され、真菌細胞は、そのまま残ります。
- 室温で5分間インキュベートする。
- 滅菌チューブにライセートを移し、氷上に保つ。
- 別のチューブに20μlのライセートを移し、その後20μlのAO / PIソリューションを追加します。ステップ5に直接進んでください： "画像サイトメトリー分析のためのサンプルの準備"
3。 CFUメッキ
- メディアにおける溶解物の10倍希釈（ステップ2.3から）実行します。
- HMM-アガロースプレート上重複の各希釈のプレートを100μl、、。 7-8日、5％CO 2で37℃で加湿チャンバー内のプレートをインキュベートする。
- 手動で100の最小値と1,000異なるコロニーの最大値を表示するプレート上のコロニーを数える。
4。ライブマクロファージ内の菌の可視化
- ライブマクロファージを収集するには、PBSで細胞を3回洗浄する。 4℃で30分、0.5 mlのPBSとインキュベートを追加
- 組織培養ウェルからマクロファージを削除するには、軽く数回上下にピペッティングし。滅菌チューブに液体を移し、氷上に保つ。
- 別のチューブに20μlのサンプルを転送し、次に20μlのAO / PIソリューションを追加します。 "画像サイトメトリー分析のためのサンプルの準備"：ステップ5に直接進んでください。
5。画像サイトメトリー分析のためのサンプル調製
- 徹底的にターゲットサンプルをピペットで、その後使い捨て細胞計数室にサンプルを20μlを移す。
- 細胞は、30秒のためにチャンバー内に定住することができます。
- 画像サイトメーターにカウントチャンバーを挿入します。
6。 Cellometer機器設定
- システムにVB-535から402とVB-660から502まで、それらが所定の位置にロックされていることを確認してください：蛍光光学モジュールを挿入します。
- VB-535から402（475 nmで励起、535 nmでの発光）がアクリジンオレンジおよびGFPの検出に用いられる。
- VB-660から502（excitati上で540nmで、660nmの放射）を、ヨウ化プロピジウムの検出に用いられる。
- 画像サイトメーターの電源を入れ、付属のソフトウェアを開きます。
7。 Cellometerソフトウェアのセットアップ
- プリセット "アッセイタイプ"とアッセイドロップダウンメニューで "セルの種類"を選択します。
- 生存率については、アッセイは、アクリジンオレンジおよびヨウ化プロピジウム検出のために最適化されている。
- カンジダ·アルビカンス感染の検出のために、アッセイはGFP検出のために最適化される。
- 上部の "オプション"を選択し、 "を取る背景画像"をクリックし、操作を完了することができます。
- "プレビュー明視野像"をクリックしてください。
8。画像の取得手順
- 画像サイトメーターに準備試料室に挿入します。
- フォーカスノブを使用して、フォーカスを調整します。
- 一度ピントで、 "カウント"をクリックし、画像取得操作を完了することができます。
- レモ使い捨てカウンティングチャンバーをもらって適切に処分する。
9。画像データ解析
- 濃度及び生存率測定
- カウントが完了すると、標的細胞の濃度及び生存率を結果ページに表示される。
- カンジダ·アルビカンス感染実験におけるGFPの細胞集団の解析のためにFCSエクスプレス4にデータをエクスポートするには、 "エクスポート"をクリックしてください。
- カンジダ感染細胞のFCSエクスプレス分析
- FCSエクスプレス4へ "。NXDAT"ファイルをインポートし、蛍光ヒストグラムの結果をプロットします。
- カンジダ·アルビカンス感染細胞の集団のパーセンテージを決定するためにヒストグラムに細胞集団ゲートを適用する。
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Representative Results
我々は、H.の成長を監視するCellometerビジョン画像サイトメーターを用いマクロファージ細胞内カプスラーツム 。 RAW 264.7細胞はH.に感染していたカプ酵母細胞及び様々な時点で、サンプルは画像ベースのサイトメトリー解析に続いAO / PI染色を行った。並行して、サンプルは、従来のCFU列挙によって分析した。各時点において、サンプルは、マクロファージを溶解するために水でインキュベートし、遊離した酵母細胞をCellometerビジョンソフトウェア（ 図1aおよび1b）で同定した。各時点（ 図1c）での画像ベースのサイトメトリー分析およびCFU列挙体によって検出された私たちは、実行可能な酵母の濃度で高度に匹敵する傾向を観察します。予想通り、AO / PI染色によって検出し、ライブ酵母の絶対数は、符号を強調し、CFU分析によって評価した固体培地上のコロニー形成が可能な酵母の数よりも常に高かった実行可能な、非耕作細胞のificant番号。
ライブマクロファージ内の真菌細胞の視覚化は、GFPを発現する酵母株を用いて達成することができる。骨髄由来マクロファージ（BMDM）を感染させたC. ADH1プロモーター12（図2a）の制御下で緑色蛍光タンパク質（GFP）を発現するカンジダ酵母細胞。 GFP-CとBMDMの感染0.1〜10に至るまでの感染多重度（MOI）でのカンジダ酵母は、感染したマクロファージ内でGFP強度の増分増加（図2a）と同様に、感染したマクロファージの合計割合（図2b）に対応していた。
図1。 CFUに画像ベースのサイトメトリー分析の比較 H.の列挙RAW 264.7マクロファージのインビトロでの感染時のカプ 。（）RAW 264.7マクロファージH.に感染していたMOI 0.2でカプスラーツム酵母。感染後24時間間隔で、マクロファージを溶解し、実行可能な酵母はCFUの列挙を並列にAO / PI染色によって評価した。（b）の代表明（BR）とFL1/FL2（緑/赤）AO / PI染色されたHの合成画像。カプは、溶解したRAW 264.7マクロファージから放出された。大PI染色RAW 264.7マクロファージ（赤色）が除外されている間にセグメント化アルゴリズムは、蛍光像で唯一のAOおよびPI陽性の酵母を数えた。画像は、10倍の倍率で撮影された。酵母増殖の（c）の直接比較はAO / PI染色およびCFU列挙体によって評価される。 CFUとCellometer分析収量によって測定されるような成長トレンドの線形回帰分析R 2 = 0.9927。/ files/ftp_upload/50599/50599fig1large.jpg "ターゲット=" _blank ">より大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください。
図2。 C.のGFP発現株によるBMDM感染の定量アルビカンス 。（）明（BR）（上）とGFP-Cの蛍光灯（中央）の画像をキャプチャアルビカンスは MOI増加でBMDMsに感染。蛍光強度のヒストグラムは、C.数の増加を表してMOIが増加するにつれてGFP蛍光強度の増加を示すアルビカンスは BMDM細胞（下）に関連付けられている。ソフトウェアは、非感染対照群（MOI = 0）で表示されるベースライン蛍光強度における線形マーカーの適用に基づいて、感染しBMDMsを同定した。（b）の割合infectionのMOI、MOIが増加すると感染BMDMsの増加を示している。の関数としてより大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください 。
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Discussion
イメージサイトメトリーにより、ユーザは高品質の画像をキャプチャし、特殊なソフトウェアを使用して、細胞の迅速な定量化を行うことができる。病原微生物学分野における画像メトリーの適用つの潜在的課題は、カウントされる微生物は、哺乳動物宿主細胞を含む細胞の混合集団中に存在することである。ここでは、イメージサイトメトリーをin vitroマクロファージ感染中に生存可能な病原性酵母の定量に使用することができることを実証している。我々の方法論は、in vitroでマクロファージ感染アッセイ間に観察真菌の増殖と生存に忠実に再現するの動向だけでなく、伝統的なCFUアッセイ13に比べて改善された感度を表示するだけでなく。
酵母細胞の定量化のためのCFU列挙またはフローサイトメトリーのいずれかと比較した場合、画像メトリは、いくつかの実用的な利点があります。 CFUのをメッキすると、研究室の労働者はいくつかのプレートdilutマスト非常に労働集約的なことができ、各プレート上の細胞の可算数を確保するためのイオン。イメージサイトメトリーは、複数の希釈液の必要性を排除する。先に、我々はイメージサイトメトリーにかかわらず、濃度13細胞の列挙を可能にする一方で、固体培地上のコロニー形成は、しばしば変数であり、非常に低い濃度で真菌が全くコロニーを形成するために失敗する可能性が示されている。非常に低い濃度で真菌を検出し、計数する能力は、低用量の感染の初期段階で非常に有用であり得る、または手続き中、数字、生存時に検出の縁にあってもよい。コロニーが見えるようになるまでに数日かかる場合があり、一方また、画像サイトメトリーによって生成されたデータは、即座に利用可能です。多くの真菌種は、フローサイトメトリーにより検出することができるが、クロスコンタミネーションの可能性は、共有施設で懸念される。それはdisposabあるとして本研究で使用したカウントチャンバーは、バイオセーフティの観点から重要な利点を提供していますルと自己完結。さらに、画像メトリが小さく研究所11のために重要になることが、従来のフローサイトメトリー、と比べて低価格、小型フットプリントの実用的な利点を提供しています。
その実用的な利点に加えて、酵母細胞のイメージサイトメトリーは、CFUの列挙ができないという情報を提供します。まず、CFUの列挙は正確に、リアルタイムでの感染実験で存在する生存菌の数を表していないことが選択された媒体にコロニーの成長を確立することである真菌を検出することができるだけです。また、実験的なバイアス14と、これらの隠されたバイアスの源となり得る菌の野生型及び変異株を比較する際に固体培地上のコロニー増殖が異なる可能性が確立する能力は、イメージサイトメトリーおよびCFUの定量化との比較によって明らかにされてもよい野生型および変異株。特定の株の動作は、BOことを特徴いったん番目のCFUの列挙と画像メトリ、私たちはそのイメージサイトメトリーは、真菌定量化の代替手段として使用することができると信じています。
一般に、画像サイトメトリーの一つの制限は、フローサイトメトリーできるだけ多くのデータポイントの収集を許容しないことである。画像サイトメーターは、撮像画像の限られた数の定量的なデータを導出するため、システムは、サンプル当たりのセル数千から数百万、数百のデータを収集することは困難である。ただし、この制限は、フローサイトメーターと同様のデータ·ポイントに到達するために分析用のデータの1つのセットに複数のサンプルをグループ化することによって回避することができる。また、ここで使用されるAO / PI染色法は、細胞生存率を測定する1つの方法を示し、必ずしもセルラ活力および/または任意の所与の試料中の固形培地上での増殖を確立する能力を示すものではないことを強調しておきたい。したがって、我々の方法は、それを酵母のライブ/死者定量化の容易な方法を提供しながら、また、FUN-1 15と、細胞の代謝指標と組み合わせて画像サイトメトリーの使用を調査するのは興味深いだろう。
イメージサイトメトリーソフトウェアを識別及び計数する目的の細胞を大きさや形状に基づいており、したがって、これらのパラメータの値は、各実験中に慎重に設定されていることが絶対不可欠である。新しい酵母株で画像サイトメトリーを行う際に、我々は1つが最初のパラメータは、ソフトウェアが区別できるように設定されていることを確認するために、酵母を加えた宿主細胞の混合物を計数から生成されたデータに純粋な酵母培養液から生成されたデータを比較することを示唆している2種類の細胞。
将来的には、この作品はイメージサイトメトリーを介して微生物を検出し、定量化する手法のさらなる発展のための基礎となる。例えば、臓器ホモジネート内菌を検出するための画像サイトメトリー法の開発は、フィールドで大いに役立つでしょう。別の今後の課題は、Dになりますイメージサイトメトリーの方法、それは細菌細胞の定量に使用することができるようなソフトウェアをevelopと絞り込む。光学系は、デジタルカメラ、濃度及び生存率又は活力測定のためのより迅速な方法を提供することができる分野における蛍光汚れ多種多様な能力画像および細菌集団を分析する画像サイトメータで実施することができる、との進歩CFU又は光学濃度の方法と比較した。要約すると、ここで紹介する作品は、イメージサイトメトリーは、病原性酵母の定量化のための感度の高い方法であることを示す概念実証である。画像ベースのサイトメトリー解析ソフトウェアの高度化は、高度に定量的に宿主細胞および病原性真菌の間の相互作用を分析する機会を提供しています。この技術は、真菌病原性の分野における研究課題の範囲に対処するために適合させることができる。
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Disclosures
作家レオ李英ちゃんとベンジャミンパラディはNexcelomバイオサイエンスLLCの従業員です。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| DMEM | Life Technologies | 11965-084 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 16000044 | |
| AO/PI Solution | Nexcelom Bioscience | CSK-0102 | |
| Disposable Counting Chamber | Nexcelom Bioscience | CHT4-SD100 | |
| EQUIPMENT | |||
| Cellometer Vision | Nexcelom Bioscience | ||
| Cellometer Vision Software | Nexcelom Bioscience | ||
References
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