Summary
뇌 염증 반응의 복잡성에 새로운 통찰력을 얻을 수있는 방법이 제공됩니다. 우리는 국소 허혈의 마우스 모델에서 미세 아교 세포 / 대식 세포 표현형 마커의 공동 발현 패턴을 조사하기 위해 삼차원 촛점 분석 하였다 면역 형광 기반 프로토콜을 설명한다.
Abstract
뇌 스트로크 미세 아교 세포 / 대 식세포 후 (M / M)가 새로운 표면 항원의 발현 및 축적되어 염증 반응을 유지하는 매개체의 생산을 포함 극적인 형태 및 표현형의 변화와 급속한 활성화를 받고있다. 신흥 증거는 M / M은 급성 뇌 손상 후 클래식 (M1) 염증성 또는 다른 항 염증 (M2) 활성화를 가정 할 수있다 높은 플라스틱 셀 있음을 나타냅니다. 그러나 부상 뇌의 M / M 표현형 마커 표현, 자신의 colocalization을 시간적 진화의 전체 특성은 아직 행방 불명입니다.
구체적으로는 M / M 활성화의 관련 마커를 염색 면역 프로토콜은 허혈성 뇌에서 수행 될 수있다. 여기에서 우리는 현지화와 같은 M / M 표현형 마커의 공동 발현의 패턴을 조사 할 수있는 강력한 방법으로 세 가지 차원 공 촛점 분석 한 다음 면역 형광 기반의 프로토콜을 제시CD11b를, CD68, YM1, 중대 뇌동맥 (pMCAO)의 영구적 인 폐쇄에 의해 유도 된 국소 허혈의 마우스 모델에서. 오염 된 곳의 두 가지 차원의 분석은 각각의 마커가 정의 된 M / M의 형태에 관련된 및 허혈성 병변에 지정된 현지화를 가지고 있는지 알 수있다. M / M 표현형 마커의 공동 발현의 패턴은 허혈 영역에서 입체 공 촛점 이미징에 의해 평가 될 수있다. 이미지가 비쳐 영향을 최소화하고, 파장 중복을 피하기 위해 순차 주사 모드 (180 X 135 X 10 ㎛의 부피에 해당하는 10 ㎛ Z 축 및 0.23 μm의 스텝 사이즈) 정의 된 볼륨에서 취득 할 수있다. 이미지이어서 Imaris 소프트웨어에 의해 입체 렌더링을 얻기 위해 처리된다. 세 가지 차원 렌더링의 단단한보기는 세포의 클러스터에있는 마커 식의 정의를 할 수 있습니다. 우리는 M / M은 병변 사이트 및 TI의 위치에 따라, 표현형의 다수쪽으로 분화하는 능력을 가지고 있음을 보여나 부상 후.
Introduction
급성 뇌 손상 후, 미세 아교 세포가 빠르게 활성화 극적인 형태 적 형질 1-3을 변경 받아야합니다. 이 내장 함수는 응답은 부상 뇌 실질 4.5으로 마이그레이션 혈액 태생의 대 식세포의 모집에 연결되어 있습니다. 항원 적으로 구별되지 않는 미세 아교 세포 및 대식 세포의 역할은 뇌 손상에서 여전히 논의된다 (이제부터 M / M라고한다). 연구의 증가는 유사 주변 식세포에 대해 설명한 것과, 미세 아교 세포와 뇌가 대식 세포는 그 극단 (M1) 고전적인 염증성 독성이나 항 염증 보호 (M2) 표현형에 해당하는 서로 다른 표현형을 가정 할 수 모집을 나타냅니다. 프로 또는 항 염증 인자의 분비를 포함하여 다른 활성 상태는, 신경 영양 분자와 리소좀의 활동 자료는 그 발현 시간에 따라 표현형 마커의 특정 패턴을 특징으로한다주변 환경의 진화. 손상된 뇌의 이러한 M / M의 표현형의 특성은 여전히 빈약하다. 우리는 뇌졸중 후 M / M 발현과 진화를 분석하는 pMCAo의 잘 확립 된 쥐 모델을 사용했다. 여기에 제시된 면역 형광 기반의 프로토콜은 특정 M / M 표현형 마커, 현지화 및 허혈성 지역에서 휴대 공동 식의 모양에 대한 통찰력을 얻기를 목표로하고 있습니다. 우리는 다른 활성화 상태 또는 표현형에 관련된 몇 가지 분자를 조사, 즉 CD11b를, 백혈구 및 M / M의 활성화 / 모집 6-8의 널리 사용되는 마커로 표시되는 표면 마커 CD68 리소좀 6,7 및 YM1 분비의 마커 단백질을 선택적으로 활성화 (M2) 대 식세포에 의해 표현 및 복구 기능 복원 9-10에 관련된.
두 개의 마커가 동일한 셀에 의해,하지만 서로 다른 세포 내 구획으로 표현 될 때, 혼자 colocalization을 많이 INF하지 않을 수 있습니다ormative. 이 경우, 동시 발현의 분석은 하나의 평면 뷰를 사용하여 입체 렌더링에서 수행 될 수있다. 우리는 여기에서 마커 동시 발현의 철저한 입체 분석을 얻기 위해 프로토콜을 설명합니다.
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Protocol
1. 면역 형광
다음의 프로토콜은 (PBS에서 4 % 파라 포름 알데히드 식힌 50ml의 뒤에 PBS 20 ㎖, 0.1 몰 / 리터, pH가 7.4,) transcardially 관류 된 마우스로부터 얻은 뇌 관상 저온부에서 수행된다. 살포 후, 두뇌는 신중하게 제거하고 cryoprotection위한 4 ° C에서 하룻밤 PBS의 30 % 자당에 전송. 유리 병에 밀봉하여 -70 ° C에서 사용할 때까지에 저장되기 전에 3 분 동안 45 ° C - 뇌는 다음 빠르게에서 이소 펜탄에 담가 냉동. 코로나 뇌 저온부 (20 μm의)는 직렬로 잘라 면역 프로토콜 11, 6을 실시한다.
사용하기 전에 실온에 모든 시약 및 샘플을 가져와. 항체 혈청의 제시 작업 희석이 최적의 성능을 얻기 위해 만든 시험의 결과주의하시기 바랍니다. 다른 항체 및 혈청을 사용하는 경우, 프로토콜은 검증 될 필요가있다.
안티는 CD11b 및 안티 CD68 항체에 대한 최적의 희석은 조직의 유형에 따라 다를 수 있으며, 공동 라벨 프로토콜을 시작하기 전에 정의해야합니다.
- PBS로 두 번 뇌 저온부을 씻으십시오.
- 에O 2 (형광 증폭 고추 냉이 퍼 옥시 다제, 스트렙 타비 딘-HRP와 함께 배양을해야하므로 필요한 단계는 단계 1.12 참조) 1 % H 2를 포함하는 PBS에서 5 분 cubate 저온부.
- 세척 저온부 PBS로 2 배.
- 10 % NGS 0.3 % 트리톤을 포함하는 PBS에서 60 분 동안 저온부를 품어.
- PBS는 기본 AB 쥐 안티 CD11b를 [1:30,000], 10 % NGS 0.3 % 트리톤을 포함에 4 ° C에서 하룻밤 저온부를 품어.
- 세척 PBS로 2 배 (5 분) 저온부.
- 바이오틴 차 반대로 쥐 AB [1:200] 1 % NGS를 포함하는 PBS에서 60 분 동안 저온부를 품어.
- 세척 저온부 PBS로 2 배.
- TNT (0.1 M 트리스 - 염산, 산도 7.4, 0.15 M 염화나트륨, 0.05 % 트윈 20 트리스 - 염산, 염화나트륨, 트윈)와 저온부을 씻으십시오.
- TNB에서 1.5 시간 동안 저온부를 품어 (버퍼 트리스 - 염산 - 염화나트륨 블로킹 : 0.1 M 트리스 - 염산, 산도 7.4, 0.15 M 염화나트륨, 적절한 키트에서 0.5 % 차단 시약 (시약의 표 참조)).
- 씻어내는섹션은 TNT와 시간을 3 배.
- 스트렙 타비 딘-HRP [1:100]을 포함 TNB의 저온부를 품어.
- 세척 저온부는 TNT와 3 배.
- 시아닌 5 Tyramide [1:300]을 포함 증폭 희석제 8 분 저온부를 품어.
- 세척 저온부 PBS로 3 배.
- 10 % NGS 0.1 % 트리톤을 포함하는 PBS에서 60 분 동안 저온부를 품어.
- PBS는 기본 AB 쥐 항 CD68 [1:200], 3 % NGS 0.3 % 트리톤을 포함에 4 ° C에서 하룻밤 저온부를 품어.
- 세척 저온부 PBS로 3 배.
- fluorconjugated 차 AB 알렉사 546 안티 쥐 [1:500] 1 % NGS를 포함하는 PBS에서 60 분 동안 저온부를 품어.
- 세척 저온부 PBS로 3 배.
- 헥스 1 ㎍ / ㎖의를 포함하는 PBS에서 10 분 동안 저온부를 품어.
- 세척 저온부 PBS로 3 배.
- 머리말 골드에서 저온부를 탑재합니다.
2. 공 초점 현미경으로 3 차원 영상의 획득
- 흥분되는 형광 염료의 파장에 따라 여기 레이저를 선택 (Cy5에, CD11b를위한 그는 네브라스카 레드, Alexa546, CD68 및 훽스트, 핵에 대한 UV 다이오드 그는 네브라스카 녹색).
- 빛 신호 수집을위한 최적의 다이크로 익 미러의 조합을 선택합니다.
- 800 x 600 픽셀의 최소 이미지 해상도를 설정합니다.
- 에피 형광을 사용하여 점진적으로 40X 목적으로 배율을 증가하여 관심의 영역을 식별합니다.
- 레이저 스캐닝 현미경 (LSM) 양상으로 전환합니다.
- 광전자 증 배관 (PMT) 및 각 채널의 게인을 조정하는 반복적 인 검사를 실행합니다. 레이저는 셋업을 용이하게하기 위해 개별적으로 설정 될 수있다. 원치 않는 비특이적 신호를 피하기 위해 가능한 한 낮은 이득을 유지한다.
- REPE로titive 검사 실행, z 축 (총 z 축 길이 = 10 ㎛)의 하부 및 상부 극단을 정의하는 초점 제어를 이동합니다.
- 반복적 인 검사를 중지합니다.
- 스텝 크기를 정의합니다. 이는 Z-축 위에 표준 1시 1분 크기 비율을 구하기 픽셀 크기 (0.225 μM)에 가능한 한 가까워 야한다.
- 칼만 필터에게 최소한 2 회를 활성화합니다.
- 비쳐 효과를 피하기 위하여 순차 주사 모드를 활성화.
- 반쯤 Z-축을 따라 이동하여 XY 연속 스캔을 실행합니다. PMT의 설정 및 게인 (좋은 신호 / 노이즈 비율)을 확인합니다. 만족스럽지 않은 경우, 단계를 반복합니다 2.6.
- XYZ 인수를 실행합니다.
- multitiff 파일로 데이터를 내 보냅니다. 각 multitiff 파일은 일반적으로 3 색 채널 (파랑, 녹색, 빨강), 44 초점 비행기가 포함되어 있습니다.
3. 공 촛점 취득 및 입체 렌더링의 3 차원보기
Imaris 소프트웨어 multitiff 파일을 업로드하고 다음을 처리 :
- 공개 소프트웨어.
- 능가보기를 선택합니다.
- multitiff 파일을 업로드합니다.
- 각 채널에 대해 원하는 색상을 선택합니다.
- 디스플레이 조정 패널 최소값을 증가시킴으로써 배경으로부터 노이즈를 제거한다. 개별적으로 각 채널을 조정합니다.
- 섹션보기로 이동합니다. 공동 현지화 (노란색 픽셀)을 찾고 Z-축을 따라 이동합니다.
- colocalization을가 z 축 (즉, 고체 개체에 속하는)을 따라 존재 여부를 확인하기 위해 노란색 영역을 클릭합니다. Z-축 돌기는 그림의 오른쪽 아래 부분에 볼 수 있습니다.
- 스냅 샷을 가져 가라.
- 보기를 능가로 이동.
- 셀 또는 셀 클러스터를 분리하는 3D를 자릅니다.
- 화면 조정 패널에 하나의 채널을 선택합니다.
- 능가 / 표면 알고리즘 빌더를 선택합니다. 알고리즘 단계 :
- 채널을 선택합니다.
- 임계 값을 정의 (t에서 동일한 최소 값을 사용그는) 조정 패널을 표시합니다.
- 크기 조정 정의합니다.
- (최고의 = 0.200) 스무딩 정의합니다.
- 색상의 외관을 정의합니다.
- 알고리즘을 종료합니다.
- 각 채널에 대해 단계 3.12를 반복합니다.
- 화면 조정 패널에 형광 채널을 모두 취소하고 모든 세 개의면을 선택합니다.
- 최고의 전망을 찾기 위해 볼륨을 이동합니다.
- 스냅 샷을 가져 가라.
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Representative Results
라벨 프로토콜 및 공 촛점 인수는 허혈 영역으로 수행 될 때 얻어진 결과의 일례는도 1a 및도 1b에 도시되어있다. 획득 된 영상의 2 차원보기는 허혈 후 이십사시간에서 (A), 리소좀 마커 CD68 (녹색) 허혈성 핵심에 존재 비대 ameboid CD11b를 세포 (적색)로 표시되어 있음을 보여줍니다. 국경 지역에서 (B)는 CD11b 양성 세포는 둥근 세포 기관 및 CD68에 대한 긍정적 인 분지의 프로세스를 표시합니다. Z 축 돌기 (오른쪽 아래 부분과 B)는 하나의 평면도에 설명 된 마커 분포는 또한 Z-축을 따라 존재하는지 여부를 시각화 할 수 있습니다. colocalization을가 발생할 경우, 노란색 픽셀이 생성됩니다. CD11b를는 C3 단편에 대한 수용체이며, 막 분포를 나타낸다. CD68는 리소좀 레이블 주로 세포질에 따라서 존재한다. CD11b/CD68 이중 양성 세포는 일반적 colocalized 복셀의 작은 비율을 가지고, 대부분의 경우는 CD11b를 CD68 (도 1a)를 둘러싼 다. 된 phagosomes이 식세포 과정에서 세포막에 바인딩 된 경우에만, CD11b를하고 CD68 사이 colocalization을 (그림 1B)를 실현.
도 2에서, 마커 동시 발현의 정의 리드 화상 처리가보고되어있다. 에서, 취득한 공 초점 화상의 입체 뷰 CD68 양성 세포 (녹색), YM1 (레드) 양성 세포의 존재를 나타내고 있지만 colocalization을 정의하는 데 사용되지 않을 수도있다. 실제로, 관찰자의 관점에 평행하게 누워 형광 복셀은 마커 사이의 실제 거리 (그들은 고체 물질없고 투명 효과가있을 수 있습니다)에 관련되지 않을 수 있습니다 colocalized 신호 (노랑), 얻을 수있다. colocalization을 정의하려면, Z-축 돌기 하나의 평면도해야바람직한 (B). colocalization을 (노란색 픽셀)을 찾고 Z-축을 따라 이동, Z 축 돌기 (권리와 B의 하단 부분에 표시)를 얻을 수있다. 형광 복셀은 세 가지 차원 렌더링 (그림 2C)에 의해 고체 물질로 전환 할 수 있습니다. 볼륨의 회전은 물체를보고 적절하게 특정 세포 몸에 마커 식을 할당에 대한 ( 'C '' ''에'C에서) 가장 잘 볼 수 있습니다. 높은 배율과 3 차원 렌더링의 고체보기 세포 (DD '')의 클러스터에서 마커의 표현을 정의 할 수 있습니다. 높은 배율과 3D 렌더링 한 후, 두 개의 마커 (CD68 및 YM1는) 다른 세포 가까이에 있지만에 속하는 것으로 나타납니다.
허혈 영역에서의 M / M 표현형 마커의 동시 발현의 평가의 일례가도 3에 도시된다. CD11b를 (적색), 엄마의 동시 발현M / M의 활성화 / 모집 rker은 CD68 (녹색) 대안 활성화 M / M으로 표시 리소좀뿐만 아니라 YM1과 관련된 마커, 허혈성 영역에 조사된다. M / M의 기능 상태에 대한 세부 정보를 제공하기 위해, 우리는 뉴런 (노이 앤, 파란색)과의 관계를 평가 하였다. 샘플링 된 영역 (그림 3A-3D)의 이미지는 3 차원 물체 (그림 3A'-3D ')으로 평가됩니다. CD11b/CD68 이중 양성 세포는 세 가지 차원 렌더링 (그림 3A '와 3B')에 의해 검사된다. 분석 뉴런 (파란색)이 종종 허혈 후 24 시간에서 모두 허혈성 코어와 국경 지역에는 CD11b 양성 세포에 휩싸이는 것을 알 수있다. 대부분의 경우 신경 세포를 둘러싸는 CD11b 세포는 이러한 세포가 활성 식균 작용에 종사하는 것을 제안, 두 영역 모두에서 CD68에 대한 긍정적이다. CD11b/Ym1 이중 양성 세포 중에 (그림 3C와 3C ')는 phagocy 종사하는 나타나지 않습니다신경과 안면 경련의 상호 작용 인 CD11b/Ym1 이중 양성 세포 결코 노이 앤 양성 세포와 접촉.
| 항-CD11b를 | TSA 증폭 (Cy5에) λ = 646 nm의 | 알렉사 546 안티 쥐 λ = 532 nm의 |
| 1:800 | + | + |
| 1:1.500 | + | + |
| 1:3,000 | + | + |
| 1:5,000 | + | + |
| 1:10,000 | + | + |
| 1:30,000 | + | - |
| 1:40,000 | - | - |
표 1. 쥐 안티 CD11b를 항체에 대한 작업을 희석의 미세 조정.
그림 1. CD11b를 (빨강) 및 CD68 (녹색)의 동시 발현이는 CD11b와 CD68에 대한 pMCAO. 공 초점 현미경 후 24 시간은 허혈성 코어는 CD11b 세포가 만연한 구상하고 그들 중 일부는 CD68 (A)에 대한 긍정적 인 것을 보여줍니다. 국경 지역에서 (B) 둥근와 분지 모두는 CD11b 세포는 CD68에 긍정적이다. 핵은 파란색으로되어 있습니다. 바 : 20 μm의.
그림 2. 허혈 영역, CD68 (녹색), YM1 (빨간색)과 핵 (파란색) (A)에 인수 한 공 초점 이미지의 pMCAO. 입체보기 후 24 시간에서 CD68 (녹색) 및 YM1 (적색)의 동시 발현. z 축 돌기 하나의 평면도 colocalized 복셀의 존재 (에 노란색시를 제외gnal, B). 입체 렌더링은 고체 물질 (C)에 형광 복셀을집니다. 볼륨은 최고의 전망 (C'-C ''을 '')를 찾기 위해 회전한다. 가까운 세포의 클러스터 (D)로 본다. 입체 렌더링 마커 세포 (D ')의 클러스터의 경우는 동일한 셀에 의해 표현되는지 여부를 정의하는 것을 돕는다. CD68 및 YM1은, 밀착, 동일한 세포에 의해 동시 발현되지 않더라도, 분명히 다른 핵 (D ')와 관련된다. 바 :. 5 μm의는 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 3. 시 이후 24 시간에서 CD68 (녹색) 또는 YM1와 CD11b를 (빨강) 및 노이 앤 (파란색)의 동시 발현. CAO 공 초점 허혈성 코어 현미경 (A; 차원에서 렌더링 ')과 경계 영역에서 (BB')는 CD11b/CD68 이중 양성 세포는 아마도 신경 세포의 식균 작용을 나타내는 노이 앤 양성 세포를 감싸는 것을 보여준다. YM1 양성 세포가 독점적으로 허혈성 코어 (CD)에 위치하고 있습니다. CD11b/Ym1 이중 양성 세포의 공 촛점 분석은 뉴런과 식세포 작용에 관여 나타나지 않는 것을 보여줍니다 (노이 앤 양성 세포, C, 3D는 'C에서 렌더링). 모두 허혈성 코어 (CC ')과 경계 지역 (DD')에서 CD11b를 하나의 양성 세포는 신경 세포를 둘러싸고 있습니다. 바 :. 20 μm의 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
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Discussion
우리는 여기에서 허혈 영역 (더 자세한 분석을 위해 심판 6 참조)에 M / M 표현형 마커의 현지화 및 공동 발현을 조사 할 수있는 강력한 방법으로 세 가지 차원 공 초점 분석 한 다음 면역 형광 기반의 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 세 가지 차원 공 촛점 이미징 M / M 활성화의 관련 마커의 특정 염색을 결합한다. 항체, 혈청 희석 작업을 fluorconjugated의 미세 조정은 조사 마커 잡음 비율로 최적의 신호를 할 수 있습니다. 입체 렌더링을 얻기 위해 이미지 처리는 M / M의 기능 상태의 획득 된 영상을 나타내는하고, 세포의 클러스터에 마커 표현의 정의를 허용 연구의 증가는 이제 M / M은 다양한 표현형을 획득하고 주변 신호에 따라 서로 다른 기능을 프로그램에 참여할 수있는 고도의 플라스틱 세포 것을 동의합니다. 염증 환경은 시간이 지남에 따라 진화하고 조율 할 수 있습니다M / M의 편광, 생체 내 연구에 훨씬 더 유익 체외 모델보다, 모집 / 활성화 된 세포의 완전한 네트워크가 재현 할 수있는 제조.
수정 및 문제 해결
여기에 제시된 프로토콜은 특히 마우스 뇌 저온부 (20 μm의)에서 개발되었다. 사용한 작업 희석액과 항체는 동물의 종에 따라 또는 간주 조직의 특성에 따라 변경 될 수있다. 또한, 면역 형광 프로토콜 뉴런 colabeling를 포함하도록 수정 될 수있다. 이 경우 1.17 단계를 다음과 같이 프로토콜의 1.19는 수정 될 수있다 :
- PBS는 기본 AB 쥐 항 CD68 [1:200], 기본 AB 마우스 방지 노이 앤 [1:100], 3 % NGS 0.3 % 트리톤을 포함에 4 ° C에서 하룻밤 배양한다.
- fluorconjugated 차 AB 알렉사 546 안티 쥐 [1:500], AB 알렉사 488 항 - 마우스가 포함 된 PBS에서 60 분 동안 품어 [1:500]및 1 % NGS.
당신은 다른 항원을 검출하기위한 안티 - 노이 앤 이외의 항체를 추가 할 수 있습니다. 이 경우 차 항체와 교차 반응을 피하기 위해 쥐에서 다른 종에서 얻어진 항체를 고려합니다. 사용되는 다른 염료와 중복되지 여기 발광 스펙트럼과도 보조 알렉사 항체를 고려하십시오.
두꺼운 이미지 볼륨 (단계 2.7)을 얻도록 입체 촛점 수집을위한 프로토콜 (즉 z 축 길이를 증가) 변형 될 수있다. z 축에 1:1 픽셀 비율 (단계 2.9)를 유지한다.
프로토콜 내에서 중요한 단계
면역 프로토콜은 적절한 음성 대조군을 수행함으로써 확인 될 필요가있다. 음성 대조군은 일차 항체를 생략하거나 동일한 내용이 분석 된 샘플의 종과 반응하지 않는 차 항체를 사용하여 수행되어야otype 관심의 항체 (즉, 같은 예방 접종 종에서 얻은) 일정 지역.
같은 예방 접종을 종 두 가지 항체를 사용하는 이중 형광 염색에서 적절한 대조군이 사용에만 두 번째 일차 항체를 생략하여 수행해야합니다. 서로 다른 시점에서 얻은 조직에서 작업하는 경우 M / M 마커의 발현이 시간에 따라 변화 될 수 있으므로, 각 시점에서 부정적인 관리를 실시하고 있습니다.
기술의 한계
입체 공 촛점 이미징은 전체 부상 영역의 대표 그림을 제공하지 않을 수 있습니다. 입체 분석은 특정 셀 내에서 M / M 마커 표현의 안정적인 표현을 산출하더라도,이 관심의 영역에서 전체 M / M 인구의 선물을 확장 할 수 없습니다. 이 한계를 극복하기 위해, 당신은 관심, 말일의 뇌 영역의 충분한 샘플링을 제공한다블리 공정한 티슈 샘플링을 수행하는 동력 현미경 스테이지를 사용. 분명히, 면적당 취득한 프레임의 수를 증가시키는 것은 더 많은 시간이 걸리는 과정을 초래할 것이다.
기존의 방법에 대한 중요성
M / M 편광의 마커의 발현 이전에 체외 모델 (세포 배양 편광 에이전트에 노출), FACS 분석, MRI 및 분광, 특정 제한과 관련된 모든 등 다양한 기술적 접근 방법에 의해 분석되었다. M / M의 편광을 유도 할 수 요인에 대한 정보를 제공하면서, 체외 모델은 완전히 생체 반응의 복잡한 M / M을 반영 할 수 없습니다. 그것은 실제로 잘 손상 뇌에서 활성화 M / M은 면역 세포 상호 작용 (12)의 복잡한 네트워크의 결과로서, 혼합 표현형 및 기능을 표현하는 것이 확립되었다. FACS 분석은 S 편광의 정량적 측정 값을 제공한다전체 M / M 인구의 탓. 그러나,이 기술과 관련된 주요 제한은 병변에 대하여에있는 M / M 마커의 현지화의 부족에있다. 더욱이 조직 표본에서 세포 현탁액을 얻는 프로토콜은 세포 스트레스 및 가능 표현형을 변경할 수있다. MRI와 분광법은 생체 내에서 뇌 영역 내에서 M / M 세포를 집중하는 것을 허용하지만, 저해상도 전력이 있고 M / M 마커의 다양한 연구에 적용 할 수 없다.
입체 촛점 분석 허혈 영역으로 M / M 표현형 마커의 지역화 및 공동 발현에 대한 정보를 제공하고, 따라서 철저 M / M의 편광 상태를 조사하기 위하여 상기보고 된 기술과 연관되어야한다.
결론 및 향후 응용 프로그램
설명 된 방법은 다양한 스트로크 연구 분야의 응용 범위뿐 아니라 적합한 다른 소재 acut전자 또는 부상 회복에 M / M의 이중 역할이 제안되었다 만성 신경 질환. 또한 설명한 후 처리 분석 fruitfully 세포 수준에서 또는 신호를 선택적으로 다른 공간면 지역화해야하는 경우에 어떤 동시 발현 colocalization을 분석하기 위해 악용 될 수 있습니다.
보다 효율적으로 장비를 사용할 수있게되면 다음 미래에이 기술이 크게 향상 될 수있다. 공 초점 현미경은 자동 및 빠른 조직 샘플에 대한 높은 감도, 여러 개의 레이저 라인 및 소프트웨어 시스템의 셋업을 활용할 수 있습니다. 이는 고화질화, 두꺼운 획득 볼륨 및 디지털 화상으로 모든 생체 정보를 변환하는 목적으로 다수의 신호들의 동시 수집을 초래할 것이다. 마지막으로, 형광 리포터로 태그 된 특정 마커 새로운 형질 전환 동물 모델의 개발은 공동 EXPR의 분석을 허용 할 것이 광자 현미경에 입체 화상 분석을 적용하여 생체 내에서 ession.
이 접근법은 보호 표현형을 구동하는 경향이 미래 치료 전략을 개발의 관점에서 뇌 기능의 복잡도를 이해하는 강력한 도구를 나타낼 수있다.
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Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Acknowledgments
스테파노 Fumagalli는 Monzino 재단의 동료입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Rat Anti-mouse CD11b | Kindly provided by Dr. A. Doni, Istituto Clinico Humanitas, Milan, Italy | ||
| Rat Anti-mouse CD68 | AbD Serotec | MCA 1957 | |
| Rabbit Anti-mouse Ym1 | Stem Cell Technologies | 1404 | |
| H–chst 33342 | Life technologies | H21492 | |
| Mouse Anti-Neural Nuclei (NeuN) | CHEMICON | MAB377 | |
| Biotinilated Goat Anti-Rat antibody | Jackson Immuno Research | 112-065-143 | |
| TSA Cyanine 5 System | Perkin Elmer | NEL705A001KT | |
| Prolong Gold | Invitrogen | P36930 | |
| Anti-rat alexa 546 | Invitrogen | A-11081 | |
| Anti mouse Alexa 488 | Invitrogen | A-21121 | |
| Anti-rabbit Alexa 594 | Invitrogen | A-11037 | |
| Normal Goat Serum | Vectors Laboratories | S-1000 | |
| Tritin X-100 | Sigma | T8787 | |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma | P4417-100 | |
| Equipment | |||
| Cryostat CM1850 | Leica | ||
| Olympus IX81 confocal microscope | Olympus | ||
| AnalySIS software | Olympus | ||
| Imaris software 5.0 | Bitplane | ||
| Photoshop cs2 | Adobe Systems | ||
| Software packages GraphPad Prism version 4.0 | GraphPad Software Inc. | ||
References
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