Summary
هنا، ونحن نستخدم تنبيغ فيروسات وترنسفكأيشن concatemeric لإنشاء خط الخلية التي يمكن أن تعبر عن مكونات ناقلات lentiviral (LV) في غياب التتراسيكلين. هذا LV بترميز GFP وpseudotyped مع بروتين سكري، SVGmu، والتي هي محددة لمستقبلات على الخلايا الجذعية.
Abstract
ناقلات lentiviral (لفس) هي وسيلة قوية لإيصال المادة الوراثية لأنواع عديدة من الخلايا. بسبب مخاوف تتعلق بالسلامة المرتبطة بهذه ناقلات المستمدة HIV-1، وتنتج كميات كبيرة من لفس يمثل تحديا. في هذه الورقة، ونحن التقرير وسيلة لإنتاج التتر عالية من لفس-تعطيل الذاتي. نحن retrovirally تنبيغ تيت حالا الخلية المنتجة مستقرة خط GPR لتوليد خط الخلية، جي بي آر إس، والتي يمكن أن تعبر عن جميع مكونات الفيروسية، بما في ذلك بروتين سكري خلية محددة شجيري، SVGmu. ثم، ونحن نستخدم ترنسفكأيشن الحمض النووي concatemeric ل transfect نقل LV ترميز البلازميد GFP الجينات مراسل في تركيبة مع علامة اختيار. العديد من الحيوانات المستنسخة مما يمكن ان تنتج LV في عيار 10 أضعاف أكبر من ما نحقق مع ترنسفكأيشن عابرة. بالاضافة الى ذلك، هذه الفيروسات تنبيغ كفاءة الخلايا الجذعية في المختبر، وإنشاء خلية T استجابة مناعية قوية للمستضد مراسلنا. قد يكون هذا الأسلوب FO خيار جيدR إنتاج اللقاحات قوية قائمة على LV للدراسات السريرية للسرطان أو أمراض معدية.
Introduction
وقد تم تطوير العديد من أنظمة ناقلات لتوصيل الجينات. وكانت الناقلة على أساس lentiviruses بين نظام الفيروسية الأكثر شيوعا درس. هذه النواقل هي مفيدة لأنها يمكن أن تنبيغ بكفاءة سواء بتقسيم وغير تقسيم الخلايا 1، وتحقيق التعبير على المدى الطويل بسبب الاندماج في الجينوم المضيف، يحمل منخفض الطبيعية الحصانة مكافحة النواقل في معظم المجتمعات البشرية 2، ولها قدرة منخفضة على السمية الجينية من الطفرات غرزي 3،4.
كان دائما الملونة إنتاج lentiviruses بواسطة مخاوف تتعلق بالسلامة. وتستمد ناقلات lentiviral عموما من HIV-1، والعامل المسبب لمرض الإيدز. ترنسفكأيشن عابرة من المكونات الفردية للlentivector (نقل، مغلف، والبلازميدات التعبئة والتغليف) هو وسيلة مشتركة ومرنة لإيصال المادة الوراثية في بيئة معملية. ومع ذلك، ورفع مستوى transfections عابرة للتطبيقات السريرية هي مرهقة وأماهY يؤدي إلى تطوير الفيروسة البطيئة النسخ المتماثل المختصة 5،6. للتغلب على هذه العقبات، وقد وضعت العديد من التعبئة والتغليف وخطوط الخلية مستقرة المنتجة 6-11. واحد من هذه الخطوط، خط التعبئة والتغليف GPR 11، لديه ميزة جذابة من يجري تنظيمها من قبل التتراسيكلين. في هذه الورقة، ونحن لشرح كيفية التكيف مع هذا النظام لإنتاج تعطيل الذاتي ناقلات lentiviral التي تستهدف على وجه التحديد نحو الخلايا الجذعية (DC-لفس) 12.
الخلايا الجذعية (DCS) هي الأكثر قوة مستضد تقديم الخلايا في الجهاز المناعي. وقد كانت موضع اهتمام كبير في تطوير لقاح السرطان لأنها تشرع مباشرة، برنامج، وتنظيم الاستجابات المناعية ورم محددة 13. دمج بروتوكول التطعيم لتشمل البلدان النامية لديه القدرة على استثارة استجابة مناعية أقوى انتيتومور من اللقاحات الببتيد أو الحمض النووي. مؤخرا، قمنا بتطوير ناقلات lentiviral أن specificallY يستهدف الخلايا الجذعية من خلال بروتين سكري فيروس سندبيس تعديل، SVGmu 14. هذه النواقل هي فريدة من نوعها من حيث أنها تظهر خصوصية عالية للخلايا الجذعية وتوليد استجابات مناعية أقوى من غير محدد، ناقلات VSVG-pseudotyped.
هنا، ونحن التقرير وسيلة لإنتاج كميات كبيرة من هذه ناقلات lentiviral DC-المستهدفة. علينا أن نظهر أن هذه DC-لفس يمكن أن تصيب البلدان النامية وتولد قوية CD8 + T خلية الاستجابات المناعية. تم تنفيذ كافة الإجراءات التي تنطوي على الحيوانات بطريقة إنسانية، بموجب موافقة من USC Intitutional رعاية الحيوان واللجنة الاستخدام. من أجل أداء في التجارب المجراة والسريرية، فمن الأهمية بمكان لإنشاء خط الخلية التي يمكن أن تنتج فيروس في آن وعيار عالية. وتنفيذ الخطوات تنبيغ وترنسفكأيشن تماما كما هو موضح تعظيم فرص توليد هذا استنساخ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
هي التي شيدت DC-LV الخلايا المنتجة مستقرة استنادا إلى خلية التعبئة والتغليف GPR 11 السطر الذي يحتوي على المكونات اللازمة lentiviral gagpol، ومراجعة ونظام تيت حالا. أولا، يتم استخدام تنبيغ فيروسات لتوليد جي بي آر إس خط خلية التعبئة والتغليف الذي يشفر بروتين سكري SVGmu تيت التي تعتمد على. ثم، يتم استخدام متسلسل ترنسفكأيشن مجموعة ل transfect خط الخلية جي بي آر إس مع التحوير ناقلات lentiviral مثل GFP. هذا خط الخلية المنتجة مستقرة، تسمى LV-MGFP، يمكن اختبارها في المختبر والمجراة لقدرته على إنتاج لقاح DC-LV ضد GFP.
1. توليد تيت التي تعتمد على خط الخلية SVGmu
البلازميد PRX-SVGmu هو بناء التي يتم استنساخ SVGmu بروتين سكري DC-محددة المصب من المروج نقل واكتساب التكنولوجيا المتقدمة من فيروسات البلازميد pRetroX-تيت حالا 1 (الشكل 1C). ثقافة 293T الخلايا في D10 (متوسطة Dulbecco لتعديل النسر مع10٪ مصل بقري جنيني، 2 مم L-الجلوتامين). ثقافة GPR خط خلية التعبئة والتغليف في D10 مع الدوكسيسيكلين (1 نانوغرام / مل) وبوروميسين (2 ميكروغرام / مل). يتم استزراع جميع الخلايا في ترطيب الحاضنة 37 درجة مئوية مع نسبة 5٪ CO 2.
- 16-18 ساعة قبل ترنسفكأيشن عابرة، لوحة 2 × 10 6 خلايا 293T في 4 مل من D10 في 6 سم، والأنسجة صحن الثقافة مثل أن الخلايا تقترب من 90٪ confluency في وقت ترنسفكأيشن.
- ترنسفكأيشن من البلازميدات فيروسات: مزيج 100 ميكرولتر 1.25 M و CaCl 2 الحل، الماء المعقم ملي-Q والبلازميدات التالية: 5 ميكروغرام PRX-SVGmu، 2.5 ميكروغرام pGag بول، و 2.5 ميكروغرام pVSV-G. الحجم النهائي هو 500 ميكرولتر. لمل أنبوب البوليسترين جولة القاع 5، إضافة 500 ميكرولتر 2X HBS (50 HEPES ملي و 10 ملي بوكل، 12 ملم سكر العنب، 280 ملي مول كلوريد الصوديوم، 1.5 ملي نا 2 هبو 4 * 7H 2 O، ودرجة الحموضة 7.05). إضافة قطرة قطرة خليط البلازميد في المخزن المؤقت HBS 2X بينما محتدما المخزن المؤقت بقوة مع كوب باستور ماصة. بعد إضافة ميلxture، يستمر محتدما لآخر 30 ثانية. ثم، يضاف خليط كله على الخلايا 293T في طبق ثقافة 6 سم، واحتضان عند 37 درجة مئوية.
- 4 ساعة بعد ترنسفكأيشن، استبدال بعناية المتوسطة في الطبق الثقافة مع 4 مل D10 قبل ساخنة.
- تدور عدوى: 48 ساعة بعد ترنسفكأيشن، حصاد SVGmu ترميز جسيمات فيروس في طاف عن طريق تمرير طاف من خلال مرشح 0.45 ميكرون. لوحة الخلايا التعبئة والتغليف GPR في صحن 24 أيضا في 2 × 10 4 خلايا / جيد. إضافة تصفيتها طاف للخلايا التعبئة والتغليف GPR في طبق (2 مل / جيد) والخلايا الطرد المركزي لمدة 90 دقيقة في 1،050 XG و 25 درجة مئوية. تغيير المتوسطة في D10 جديدة مع الدوكسيسيكلين (1 نانوغرام / مل) بعد زيادة ونقصان العدوى (2 مل / جيد).
- 72 ساعة بعد ترنسفكأيشن، وتوسيع ثقافة ترانسدوسيد الخلايا التعبئة والتغليف في D10 مع الدوكسيسيكلين (1 نانوغرام / مل) وبوروميسين (2 نانوغرام / مل).
- لتأكيد التعبير عن SVGmu والثقافة الخلايا دون الدوكسيسيكلين لمدة 48 ساعة. قياس السابقين سطحاالكتئاب من SVGmu مع التدفق الخلوي باستخدام مصل مضاد للسندبيس. وتتم تسمية هذه الخلايا كما جي بي آر إس خط خلية التعبئة والتغليف.
2. بناء خلايا المنتج DC-LV بواسطة متسلسل ترنسفكأيشن صفيف
نقل Lentiviral البلازميد TL20-GFP هو تعطيل الذاتي lentiviral نقل ناقلات البلازميد على أساس pCL20c-MSCV-GFP مع الفيروسي RNA نظام التعبير الجينوم دوكس-regulatable واستبدال الفيروس المضخم للخلايا (CMV) محسن مع 7 تيت مشغلي (الشكل 1C) 11 ، 12،15. البلازميد PGK-بلي هو مقاومة (بلي) كاسيت بليوميسين يقودها ضعيفة المروج PGK 2.
- ملخص 20 ميكروغرام البلازميد TL20-GFP مع تقييد انزيم SfiI في 50 درجة مئوية. ملخص 20 ميكروغرام البلازميد PGK-بلي مع PflMI عند 37 درجة مئوية.
- تنقية شظايا الحمض النووي (الكاسيت PGK-بلي هو 1011 BP وناقلات TL20-GFP هو 6861 BP) بواسطة الاغاروز الكهربائي للهلام.
- Ligate متجه TL20-GFP وPGK-كاسيت بلي في نسبة المولي من 25:1 (نب يغاز DNA T4). احتضان بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.
- بعد ربط بين عشية وضحاها، وتنقية الحمض النووي من خليط ربط (QIAGEN DNeasy الدم والأنسجة كيت). ضمان كمية من الحمض النووي المنقى حوالي 5 ميكروغرام.
- 16-18 ساعة قبل ترنسفكأيشن، لوحة الخلايا التعبئة والتغليف جي بي آر إس في 6 سم، والأنسجة صحن الثقافة بحيث confluency ستكون حوالي 90٪ في وقت ترنسفكأيشن.
- استخدام الأسلوب ترنسفكأيشن فوسفات الكالسيوم هو موضح في الخطوة 1.2 ل transfect 5 ميكروغرام من الحمض النووي concatemeric المنقاة الخلايا التعبئة والتغليف جي بي آر إس في 6 سم صحن زراعة الأنسجة. 4 ساعة بعد ترنسفكأيشن، وإزالة بعناية المتوسطة واستبدالها مع 4 مل D10 قبل ساخنة مع الدوكسيسيكلين (1 نانوغرام / مل).
- 48 ساعة بعد ترنسفكأيشن، تغيير المتوسطة في D10 مع الدوكسيسيكلين (1 نانوغرام / مل) وبوروميسين (2 ميكروغرام / مل). اختر لاستنساخ transfected بإضافة zeocin (50 ميكروغرام / مل) في ثقافة المتوسط. ثقافة الخلايا لمدة حوالي 2 أسابيع حتى الخلية كولونيويمكن رؤية ES في الجزء السفلي من الأطباق.
- تسمية المستعمرات الخلية في الجزء السفلي من الأطباق. تأخذ 24 أيضا أطباق زراعة الأنسجة، وعدد الآبار وإضافة إلى كل بئر 2 مل D10 تحتوي على zeocin (50 ميكروغرام / مل)، الدوكسيسيكلين (1 نانوغرام / مل)، وبوروميسين (2 ميكروغرام / مل). نضح المتوسطة من الخلايا ترانسدوسيد، ثم إضافة قطرة واحدة من التربسين على كل من المستعمرات لأقل من دقيقة واحدة. ثم، إضافة واحد أو أكثر من قطرات D10 على نفس المستعمرات. التقاط المستعمرات واحدا تلو الآخر مع ماصة ونقلها إلى آبار منفصلة من 24 جيدا نسيج لوحة الثقافة.
- الثقافة وتوسيع جميع الحيوانات المستنسخة خلية في D10 تحتوي على zeocin (50 ميكروغرام / مل)، الدوكسيسيكلين (1 نانوغرام / مل) وبوروميسين (2 ميكروغرام / مل) لتقييم القدرة المنتجة الفيروسية.
3. تقييم الانتاج الفيروسية من كل استنساخ الخلية
- يعرض للتريبسين الخلايا المنتجة وحول لوحة 4x10 6 خلايا في 6 سم، والأنسجة صحن الثقافة في D10 دون الدوكسيسيكلين بحيث confluencyيتجاوز 90٪. استبدال المتوسطة مع D10 قبل ساخنة طازجة يوميا وجمع المتوسطة للمقايسة عيار 72 ساعة بعد إزالة دوكس.
- حصاد طاف الفيروسية من خلال تصفية المتوسطة مع مرشح 0.45 ميكرون.
- الخلايا المستهدفة لوحة تعبر عن مستقبلات DC-SIGN (على سبيل المثال 293T.hDC في التوقيع أو نخاع العظام المستمدة الماوس الخلايا الجذعية 16) و293T كعنصر تحكم السلبية في أطباق ثقافة 96 جيدا، 1 × 10 4 خلايا / جيد. إضافة التخفيفات التسلسلي 2 أضعاف من طاف الفيروسية إلى الآبار (100 ميكرولتر / جيد). عادة، 6-8 التخفيفات كافية للوصول إلى النطاق الذي ترانسدوسيد GFP إيجابية الخلايا هي في وجود علاقة خطية لكمية من الفيروس المضافة.
- أجهزة الطرد المركزي الخلايا واستبدال المتوسطة كما هو موضح في الخطوة 1.4. يجب أن يكون مثقف BMDCs في RPMI المتوسطة مع FBS 10٪ و GM-CSF (1:20 J558L المتوسطة مكيفة).
- قياس التعبير GFP في ترانسدوسيد الخلايا عن طريق التدفق الخلوي 4-6 أيام بعد تنبيغ. وvecto lentiviralيتم احتساب R عيار في نطاق تخفيف ناقلات عندما تكون النسبة المئوية للخلايا GFP إيجابية وكمية النواقل هما في وجود علاقة خطية. اختر استنساخ الخلية وفقا لأعلى الانتاج الفيروسية للتطبيقات اللاحقة.
4. إنتاج والتركيز ناقلات lentiviral
- ثقافة خط الخلية المنتج (LV-MGFP) في 15 سم أطباق زراعة الأنسجة.
- يعرض للتريبسين الخلايا والخلايا المنتجة لوحة في 15 سم أطباق زراعة الأنسجة في أكثر من 90٪ confluency في D10 طازج بدون الدوكسيسيكلين. تغيير المتوسطة مع الطازجة، D10 قبل ساخنة يوميا.
- في وقت الذروة الانتاج الفيروسية (كما هو محدد من قبل المستخدم)، والحصاد طاف الفيروسية وتحديد ذلك باستخدام فلتر 0.45 ميكرون. تحميل طاف تصفيتها في الجدار السميك 32.5 مل أنابيب نابذة فائقة السرعة، وختم مع parafilm والطرد المركزي في XG 50،000، 4 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة. resuspend بدقة بيليه في 50 ميكرولتر أو حجم مناسب من برنامج تلفزيوني أو HBSS اعتمادا على التطبيق. </ لى>
5. تحصين الفئران في الجسم الحي وتحليل الاستجابة المناعية مستضد محددة
- إنتاج فيروس عيار عالية كما هو موضح في القسم 4.
- حقن الفئران BALB / ج (6-8 أسبوع من العمر، أنثى) عن طريق المسار قاطع الطريق مع تعليق النواقل (25 ميكرولتر لكل قاطع الطريق).
- بعد 2 أسابيع التحصين، وعزل الطحال وsplenocytes الحصاد. splenocytes الثقافة مع GFP الببتيدات حاتمة وتحليل وجود GFP محددة CD8 + الخلايا التائية باستخدام الخلايا تلطيخ خلوى، كما هو موضح سابقا 17 (الشكل 3B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
خط الخلية مستقرة وصفها في هذا الأسلوب يمكن أن تنتج كميات كبيرة من ناقلات lentiviral التي تستهدف على وجه التحديد إلى الخلايا الجذعية. كما هو مبين في الشكل 1B، أسفرت عن عزل الحيوانات المستنسخة الفردية خطوط الخلايا مستقرة متفاوتة الجودة 12. بين 26 استنساخ اختبارها، وتنتج 8 الجسيمات lentiviral في عيار أكبر من 10 6 وحدات تنبيغ لكل مل (TU / مل)، والذي هو المعيار النموذجي لناقلات lentiviral SVG-pseudotyped التي تنتجها ترنسفكأيشن عابرة. في نفس الوقت، أنتجت العديد من الحيوانات المستنسخة أقل من 10 4 TU / مل، ومن المهم لعزل الحيوانات المستنسخة متعددة من أجل الحصول على منتج قوي.
واحد استنساخ إنتاج موثوق ناقلات lentiviral في عيار أكبر من 10 7 TU / مل. أظهرت إجراء مزيد من التجارب على هذا استنساخ أن هذا المستوى من الانتاج الفيروسية مستقر منذ عدة أيام، لم تتأثر من جراء وجود / غياب المصل في ثقافة المتوسط، وعلىchievable في الخلايا المستزرعة لأكثر من 3 أشهر (الشكل 2) 12.
للتأكد من أن هذه الفيروسات لم تكن فعالة في المختبر فقط، وأنها كانت تستخدم أيضا لتحصين الفئران. تحليل الاستجابة المناعية GFP محددة من قبل الخلايا تلطيخ خلوى وجدت أن ثابت المنتجة DC-LV يمكن أن يحفز توسيع GFP محددة CD8 + الخلايا التائية إلى ما يقرب من 4٪ من جميع Splenocytes + CD8 (الشكل 3) 12.
الشكل 1. جيل من التتراسيكلين التنظيم lentiviral الخلايا المنتجة النواقل. (A) مخطط تخطيطي لإجراء لصنع DC-المستهدفة lentiviral الخلايا المنتجة الناقل بما في ذلك تنبيغ من خطوط GRP مع تابع ناقلات فيروساتaining الجين المغلف SVGmu وترنسفكأيشن من الجينات في المصالح (ناقلات فيروسية) بواسطة ترنسفكأيشن concatemeric. (B) تم توسيع استنساخ فرد يتم اختياره عن طريق العلاج zeocin أكثر من 1-2 أسابيع، وكان يقاس عيار من طاف الفيروسية بعد 3 أيام إزالة من الدوكسيسيكلين. كما هو مبين، تباينت التتر الفيروسية على نطاق واسع من قبل استنساخ. (C) خرائط البلازميد. الناقل الفيروسي البلازميد، TL20-GFP، يشفر بروتين الفلورية الخضراء تحت سيطرة خلية الجذعية الفئران المروج الفيروس والجينوم ناقلات تحت سيطرة أحد المروجين التتراسيكلين-كظوم. PGK-بلي بترميز zeocin الجينات المقاومة (الشيخ بلي) تحت التأسيسي فسفوغليسرات كيناز 1 المروج (PGK). الرجعية SVGmu يحتوي على بروتين سكري SVGmu تحت ضيق تيت استجابة عنصر P. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .
الشكل 2. خصائص الإنتاج ناقلات فيروسية. (A) بعد إزالة دوكس، تم قياس عيار ناقلات فيروسية من supernatants ثقافة كل يوم لمدة 7 أيام. بلغ ذروته إنتاج فيروس بين 48-72 ساعة بعد الاستقراء. الخلايا المستزرعة في وسائل الإعلام خالية من المصل تنتج ما يقرب من قدر فيروس مثل تلك تربيتها مع FBS 10٪. (B) ومثقف خلايا المنتج أكثر من 3 أشهر، وجرى اختبار مأخوذة بشكل دوري لإنتاج الفيروس. لم يلاحظ أي خسارة كبيرة في إنتاج الفيروس.
الشكل (3). يمكن أن ناقلات lentiviral التي تنتجها خطوط الخلايا DC-المستهدفة مستقرة تنبيغ انتقائي البلدان النامية في المختبر، وتوليد استجابة مناعية في الجسم الحي. <STRONG> (A) أصيبوا نخاع العظام المستمدة من الخلايا الجذعية الفأر مع تم قياس LV-GFP وGFP التعبير مع التدفق الخلوي. وكان GFP التعبير محددة لCD11c و+ الخلايا، والتي تشمل الخلايا الجذعية. (B) تم تحصين الفئران مع 2 × 10 7 طوس من المنقى ومركزة LV-GFP. بعد أسبوعين، تم تنشيط ما يقرب من 4٪ من جميع CD8 + الخلايا التائية وأعرب IFNγ ردا على عرض الببتيد المهيمنة GFP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا، لدينا الخطوط العريضة لطريقة لإنتاج كميات كبيرة من ناقلات lentiviral باستخدام 293T الخلايا ترانسدوسيد ثابت مع جميع المكونات lentiviral تحت تيت قبالة نظام التنظيمية. حتى الآن، معظم بروتوكولات لإنتاج ناقلات lentiviral الاعتماد على معيار فوسفات الكالسيوم ترنسفكأيشن عابرة (انظر 18، على سبيل المثال). وكان هذا النهج الناجحة على نطاق والسريرية، لكنها قد تعاني من بعض القيود غير المحتمل أن تكون موجودة في رفع مستوى الإنتاج من خطوط الخلايا مستقرة. على سبيل المثال، يمكن أن شارك في ترنسفكأيشن مع كميات كبيرة من البلازميدات LV زيادة نظريا فرصة لتطوير النسخ المتماثل الفيروسة البطيئة المختصة 19. وعلاوة على ذلك، من المرجح أن تسفر عن نتائج متغير على نطاق واسع من استخدام خط منتج مستقر نظرا لكميات كبيرة من المدخلات الحمض النووي المطلوب 12 transfections عابرة. في ظل الظروف المناسبة، وقد استخدمت خطوط منتج مثل لتوليد الأخرى γ الرجعيةناقلات فيروسية في المقاييس الكبيرة 20،21. ومع ذلك، والدراسات باستخدام خطوط منتج lentiviral محدودة، وبالتالي إدراج فحوصات قوي 22 للكشف عن الفيروسة البطيئة المختصة النسخ المتماثل ستكون حاسمة في وضع أي خط الخلية للاستخدام السريري.
وقد نشرت مجموعات أخرى أوصاف المنتجة للالفيروسة البطيئة خطوط الخلايا مستقرة 6-11،23. ومع ذلك، وجود قيود شيوعا من هذه التقارير هو أن العديد منهم يعتمدون على transducing الخلايا المنتجة مع ناقلات lentiviral ترميز الجينات في المصالح، الأمر الذي قد يقلل سلامتهم للاستخدام السريري. هنا، ونحن الاستفادة من مجموعة concatemeric طريقة ترنسفكأيشن 11 إلى تنبيغ الخلايا التي يمكن أن تنتج الفيروسة البطيئة تعطيل الذاتي. وعلاوة على ذلك، استخدامنا للنظام قبالة تيت يحسن ملاءمة الأسلوب في الاستخدام السريري. هذا النظام يمنع التنظيمية سمية من SVGmu أثناء الصيانة خلية ثقافة ويسمح لجمع من ناقلات lentiviral تحت المضادات الحيويةظروف خالية من IC.
أثناء الإجراء، فمن المهم أن العاملين في المختبرات واستخدام الاحتياطات المناسبة عند التعامل مع ناقلات lentiviral. وتستمد ناقلات lentiviral من HIV-1، وهو العامل الممرض الإنسان، ويجب أن يتم تنفيذ كافة الإجراءات تحت إشراف لجنة السلامة الأحيائية المؤسسة. ووفقا لمعاهد الصحة القومية، BL2 الاحتواء هو عادة مناسبة للعمل مع أنظمة lentiviral المتقدمة مثل واحد هو موضح هنا، على الرغم من تعزيز الاحتواء BL2 يجوز أن يبين إذا يتم تحجيم التجارب تصل للممارسة السريرية 24.
وهناك العديد من الخطوات الحاسمة في الإجراء التي تتطلب رعاية خاصة. أولا، يجب إجراء زراعة الخلايا مع الاهتمام الكبير بالتفاصيل. لقد وجدنا أن التتر فيروس ينخفض بشكل ملحوظ إن لم يكن و passaged الخلايا المنتجة كل ساعة 24. وبالمثل، يمكن لبعض الكثير من FBS يؤدي إلى انخفاض كبير في إنتاج الفيروس، لذلك من المهم لاختبار الكثير متعددة من FBS فرنكاخام توسيع نطاق التجربة. اختيار استنساخ التي يمكن أن تنتج التتر الفيروس عالية أمر أساسي لتطبيقات المصب. في اتفاق مع العمل السابق 25، وجدنا أن الحيوانات المستنسخة التي تظهر لتقسيم بسرعة أكبر تميل إلى إنتاج المزيد من الفيروس. مرة واحدة تم العثور على استنساخ عيار عالية، وينبغي aliquoted هذه الخلايا والمجمدة في FBS + 10٪ DMSO في أقرب وقت ممكن. ثم، وذلك باستخدام مأخوذة إذابة طازجة يساعد على توليد أعلى عيار ممكن. باتباع هذه القاعدة من الإبهام، وكان لدينا أكثر نجاحا إنتاج الفيروس عن طريق transfections عابرة، ونحن نتوقع أن مماثلة صيانة خط الخلية سوف تستفيد الخلايا مستقرة المنتجة للفيروس.
أوجه القصور الرئيسية في هذا الأسلوب هو أنه يتطلب قدرا كبيرا من الجهد في خط الهجوم لتوليد خط منتج مستقر. وبالتالي، فإنه ليس من المحتمل أن يكون مناسبا في الحالات التي يكون فيها وسيتم اختبار أنواع متعددة من ناقلات lentiviral. قد تكون عابرة transfections أكثر ملاءمة للتساأنواع البريد من التطبيقات. ونحن نتوقع عموما باستخدام هذه الطريقة لتوليد كميات كبيرة من ناقلات فيروسية بعد أن تم بالفعل اختبار النواقل في شكل صغير. قيود أخرى لدينا خط خلية معينة هو أن ناقلات التي تنتجها الخلايا جي بي آر إس وسوف تكون محددة لالخلايا معربا عن DC-SIGN فقط لأن البروتين المغلف، SVGmu، بربط هذه المستقبلات. لاستهداف المستقبلات الخلوية الأخرى، فإن الإجراء يمكن تعديلها عن طريق إدخال البلازميدات بروتين سكري الأخرى في خط الخلية GPR الأصلي. وبالمثل، يمكن transfected الجينات الأخرى ذات الاهتمام في خطوط الخلايا المنتجة بحيث ناقلات lentiviral البروتينات يمكن أن يحقق أكثر أهمية من GFP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
فإن الكتاب أود أن أنوه مايكل تشو، بينغ بينغ داي، ويانغ شياو للمساهمة بتقديم البيانات لهذه المخطوطة. ونحن نعترف أيضا الدكتور جون غراي لهدايا سخية من الكواشف المستخدمة في هذه الدراسة. معتمد من قبل PB زمالة ما بعد الدكتوراه من المركز الوطني للسرطان. وأيد هذا البحث من المنح المقدمة من المعهد الوطني للصحة (R01AI68978، P01CA132681 وRCA170820A)، منحة من مؤسسة بيل وميليندا غيتس، منحة تسريع متعدية من المركز المشترك للطب بالحركة ومنحة من كاليفورنيا فيروس نقص المناعة البشرية / الإيدز برنامج البحوث.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Mediatech Inc. | 10-013-CV | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Glutamine | Mediatech Inc. | 25-005-Cl | |
| Doxycycline | Clontech Laboratories, Inc. | 631311 | |
| Zeocin | Invitrogen | R250-01 | Toxic |
| Puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 | |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69506 |
References
- Naldini, L., et al. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272, 263-267 (1996).
- Kootstra, N. A., Verma, I. M. Gene therapy with viral vectors. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 43, 413-439 (2003).
- Montini, E., et al. Hematopoietic stem cell gene transfer in a tumor-prone mouse model uncovers low genotoxicity of lentiviral vector integration. Nat. Biotechnol. 24, 687-696 (2006).
- Montini, E., et al. The genotoxic potential of retroviral vectors is strongly modulated by vector design and integration site selection in a mouse model of HSC gene therapy. J. Clin. Invest. 119, 964-975 (1172).
- Hu, B., Tai, A., Wang, P. Immunization delivered by lentiviral vectors for cancer and infectious diseases. Immunological Reviews. 239, 45-61 (2011).
- Broussau, S., et al. Inducible packaging cells for large-scale production of lentiviral vectors in serum-free suspension culture. Molecular Therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy. 16, 500-507 (2008).
- Cockrell, A. S., Ma, H., Fu, K., McCown, T. J., Kafri, T. A trans-lentiviral packaging cell line for high-titer conditional self-inactivating HIV-1 vectors. Molecular Therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy. 14, 276-284 (2006).
- Ikeda, Y., et al. Continuous high-titer HIV-1 vector production. Nature Biotechnology. 21, 569-572 (2003).
- Kafri, T., van Praag, H., Ouyang, L., Gage, F. H., Verma, I. M. A packaging cell line for lentivirus vectors. Journal of Virology. 73, 576-584 (1999).
- Strang, B. L., et al. Human immunodeficiency virus type 1 vectors with alphavirus envelope glycoproteins produced from stable packaging cells. Journal of Virology. 79, 1765-1771 (2005).
- Throm, R. E., et al. Efficient construction of producer cell lines for a SIN lentiviral vector for SCID-X1 gene therapy by concatemeric array transfection. Blood. 113, 5104-5110 (2009).
- Lee, C. L., Chou, M., Dai, B., Xiao, L., Wang, P. Construction of stable producer cells to make high-titer lentiviral vectors for dendritic cell-based vaccination. Biotechnol. Bioeng. 109, 1551-1560 (2012).
- Steinman, R. M., Banchereau, J. Taking dendritic cells into medicine. Nature. 449, 419-426 (2007).
- Yang, L., et al. Engineered lentivector targeting of dendritic cells for in vivo immunization. Nature Biotechnology. 26, 326-334 (2008).
- Hanawa, H., et al. Efficient gene transfer into rhesus repopulating hematopoietic stem cells using a simian immunodeficiency virus-based lentiviral vector system. Blood. 103, 4062-4069 (2004).
- Yang, L., Baltimore, D. Long-term in vivo provision of antigen-specific T cell immunity by programming hematopoietic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 4518-4523 (2005).
- Dai, B., et al. HIV-1 Gag-specific immunity induced by a lentivector-based vaccine directed to dendritic cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 20382-20387 (2009).
- Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system. J. Vis. Exp. (63), e4031 (2012).
- Kochan, G., Escors, D., Stephenson, H., Breckpot, K.
- Loew, R., et al. A new PG13-based packaging cell line for stable production of clinical-grade self-inactivating gamma-retroviral vectors using targeted integration. Gene Ther. 17, 272-280 (2010).
- Gaspar, H. B., et al. Gene therapy of X-linked severe combined immunodeficiency by use of a pseudotyped gammaretroviral vector. Lancet. 364, 2181-2187 (2004).
- Cornetta, K., et al. Replication-competent lentivirus analysis of clinical grade vector products. Molecular Therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy. 19, 557-566 (2011).
- Stewart, H. J., et al. A stable producer cell line for the manufacture of a lentiviral vector for gene therapy of Parkinson's disease. Human Gene Therapy. 22, 357-369 (2011).
- Biosafety Considerations for Research with Lentiviral Vectors [Internet]. , National Institute of Health Recombinant DNA Advisory Committee. Available from: http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidance/LentiVirus_Containment/pdf/Lenti_Containment_Guidance.pdf (2006).
- Coroadinha, A. S., et al. Retrovirus producer cell line metabolism: implications on viral productivity. Appl. Microbiol. Biotechnol. 72, 1125-1135 (2006).
