Summary
Здесь мы используем ретровирусной трансдукции и concatemeric трансфекции создать клеточную линию, которая может выразить компоненты лентивирусов вектор (LV) в отсутствие тетрациклина. Этот LV кодирующий GFP и pseudotyped с гликопротеином, SVGmu, которая является специфической для рецептором на дендритных клеток.
Abstract
Лентивирусов векторов (LV) являются мощным средством доставки генетического материала для многих типов клеток. В целях безопасности, связанные с этими ВИЧ-1, полученных векторов, производя большое количество ракет-носителей является сложной задачей. В данной работе мы сообщаем о первом способе получения высоких титров самостоятельно инактивирующий ЛВС. Мы трансдукции ретровирусом тет-офф стабильной клеточной линии производитель GPR для получения линии клеток, GPRS, который может экспрессировать все вирусные компоненты, в том числе дендритных клеток специфический гликопротеин, SVGmu. Затем мы используем concatemeric трансфекции ДНК для трансфекции передачи LV плазмиды, кодирующей репортерный ген GFP в комбинации с селективным маркером. Некоторые из полученных клонов может производить LV с титром 10 раз больше, чем то, что мы достигаем с временной трансфекции. Кроме того, эти вирусы эффективно трансдукции дендритных клеток в пробирке и генерировать сильный Т-клеточный иммунный ответ на наш репортер антигена. Этот метод может быть хорошим недопустимая кодировкат производстве сильный LV вакцины на основе клинических исследований рака или инфекционных заболеваний.
Introduction
Многие системы вектор были разработаны для доставки генов. Векторов на основе лентивирусы были одними из наиболее часто изучаются вирусная системы. Эти векторы выгодно, потому что они могут эффективно преобразовывать как деления и не делящиеся клетки 1, достижения долгосрочного выражение благодаря интеграции в геном хозяина, проявляют низкую природные анти-вектора иммунитета в большинстве человеческих популяций 2, и имеют низкий потенциал генотоксичностью от 3,4 инсерционного мутагенеза.
Производство лентивирусы всегда было окрашено безопасности. Лентивирусов векторов обычно получают из ВИЧ-1, этиологический агент СПИДа. Переходные трансфекции отдельных компонентов lentivector (передача, конверт и упаковку плазмид) является общим и гибким средством доставки генетического материала в лабораторных условиях. Тем не менее, расширение деятельности временных трансфекций для клинического применения является громоздкой и мау приводить к развитию к репликации лентивирусов 5,6. Чтобы преодолеть эти препятствия, несколько устойчивых линий упаковки и производителя клетки были разработаны 6-11. Одна из этих линий, линия упаковки GPR 11, имеет привлекательное преимущество, что они регулируются тетрациклина. В этой работе показано, как приспособить эту систему для получения самостоятельного инактивации лентивирусных векторов, которые специально ориентирована на дендритные клетки (DC-ПЗ) 12.
Дендритные клетки (ДК) являются наиболее надежными антигенпрезентирующих клетках иммунной системы. Они были предметом большой интерес в развитии рака вакцины, поскольку они непосредственно инициировать, программа, и регулируют опухоль-специфического иммунного ответа 13. Включение вакцинации протокола включить ДК имеет потенциал, чтобы вызвать более сильный противоопухолевый иммунный ответ, чем пептид или ДНК-вакцин. Недавно мы разработали лентивирусный вектор, который specificallу цели дендритные клетки через изменение гликопротеина вируса Синдбис, SVGmu 14. Эти векторы уникальны тем, что они показывают высокую специфичность в дендритные клетки и генерировать сильный иммунный ответ, чем неспецифические, VSVG-pseudotyped векторов.
Мы сообщаем способ получения больших количеств этих DC-целевых лентивирусов векторов. Мы показываем, что эти DC-Lys может заразить ДК и генерируют сильные CD8 + Т-клеточный иммунный ответ. Все процедуры, связанные с животных были проведены гуманно, с одобрения USC Intitutional уходу и использованию животных комитета. Для того, чтобы выполнить в естественных условиях и клинические эксперименты, очень важно, чтобы создать линию клеток, которая может производить вирус на высоком титре. Выполнение трансдукции и трансфекции шаги в точности так, как описано максимизирует вероятность получения такого клона.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
DC-LV стабильные клетки производителей построены на основе ячейки GPR упаковочной линии 11, которая содержит необходимые компоненты лентивирусный gagpol, оборот и Тет-офф системы. Во-первых, ретровирусной трансдукции используется для генерации клетки GPRS упаковочной линии, которая кодирует тет-зависимой SVGmu гликопротеина. Затем конкатемера массива трансфекции используется для трансфекции линии GPRS клетка с лентивирусный трансгенов вектор, такой как GFP. Это стабильной клеточной линии производитель, обозначенный как LV-MGFP, могут быть проверены в пробирке и в естественных для его способность производить DC-LV вакцины против GFP.
1. Создание Тет-зависимой клеточной линии SVGmu
Плазмиду PRX-SVGmu представляет собой конструкцию, в которой DC-специфический гликопротеин SVGmu клонировали ниже по потоку от TTA-расширенным промотор ретровирусной плазмиды pRetroX-Tet-офф 1 (фиг. 1С). Культуры клеток 293Т в D10 (среде Игла, модифицированной Дульбекко с10% фетальной бычьей сыворотки, 2 мМ L-глутамин). Культуры GPR упаковочных клеток линии D10 доксициклином (1 нг / мл) и пуромицина (2 мкг / мл). Все клетки культивируют в увлажненной 37 ° C инкубаторе с 5% CO 2.
- 16-18 ч перед временной трансфекции, пластина 2 × 10 6 клеток 293Т в 4 мл D10 в 6-см чашки для культивирования тканей таким образом, что клетки приблизится к 90% слияния во время трансфекции.
- Трансфекцию ретровирусную плазмид: смешать 100 мкл 1,25 М раствор CaCl2, стерильные Milli-Q воды и следующие плазмиды: 5 мкг PRX-SVGmu, 2,5 мкг pGag-Pol, 2,5 мкг pVSV-G. Конечный объем составляет 500 мкл. К 5 мл полистирола с круглым дном трубки, добавить 500 мкл 2X HBS (50 мМ HEPES, 10 мМ KCl, 12 мМ декстроза, 280 мм NaCl, 1,5 мМ Na 2 НРО 4 * 7H 2 O, рН 7,05). Добавить плазмиды смеси по каплям в буфере HBS 2X, барботируя буфера энергично стеклянной пипетки Пастера. После добавления мильxture, продолжает пузыриться еще в течение 30 сек. Затем добавляют всю смесь на клетках 293Т в 6-см чашки для культивирования, и инкубируют при 37 ° С.
- 4 ч после трансфекции тщательно замену среды в культуральной чашке с 4 мл предварительно нагретой D10.
- Спин инфекции: 48 ч после трансфекции урожай SVGmu кодирования ретровирусных частиц в супернатанте пропусканием супернатанта через 0,45 мкм фильтр. Пластина упаковки GPR клеток в 24-луночный планшет при 2 × 10 4 клеток / лунку. Добавить фильтруют супернатант в GPR упаковка клетки в тарелке (2 мл / лунку) и центрифуги клеток в течение 90 минут при 1050 х г до 25 ° C. Изменение среды в свежей D10 доксициклин (1 нг / мл) после спин-инфекции (2 мл / лунку).
- 72 часа после трансфекции, расширение культуры трансдуцированных клеток в упаковке D10 доксициклином (1 нг / мл) и пуромицина (2 нг / мл).
- Для подтверждения экспрессии SVGmu, культуры клеток без доксициклина в течение 48 часов. Поверхностная мера бывшихВыражение из SVGmu с проточной цитометрии с использованием анти-Синдбис сыворотки. Эти клетки обозначаются как GPRS клеточной линии упаковки.
2. Построить DC-LV Клетки Производитель путем трансфекции Массив конкатемера
Лентивирусов трансферной плазмиды TL20-GFP является самостоятельным инактивации лентивирусов вектор переноса плазмиды на основе pCL20c-MSCV-GFP с DOX-регулируемой вирусного генома РНК системы экспрессии и замена цитомегаловирус (ЦМВ) усилитель с 7-тет операторов (рис. 1в) 11 , 12,15. Плазмиды ПГК-BLE является блеомицин устойчивостью (BLE) кассеты обусловлен слабый промотор PGK 2.
- Дайджест 20 мкг плазмиды TL20-GFP с помощью рестрикционного фермента SfiI при 50 ° С. Дайджест 20 мкг плазмиды ПГК-BLE PflMI с при 37 ° С.
- Очищают фрагментов ДНК (ПГК-BLE кассета 1011 б.п., а вектор TL20-GFP является 6861 пар оснований) с помощью электрофореза в агарозном геле.
- Лигировать TL20-GFP вектора и ПГК-BLE кассеты в молярном соотношении 25:1 (NEB Т4 ДНК-лигазы). Инкубируют в течение ночи при комнатной температуре.
- После ночной перевязки, очищать ДНК из смеси для лигирования (Qiagen DNeasy крови и тканей Kit). Убедитесь, что количество ДНК, очищенная составляет около 5 мкг.
- 16-18 часа до трансфекции, плиты GPRS упаковки клеток в 6-см чашки для культивирования тканей таким образом, что слияния составит около 90% во время трансфекции.
- С помощью трансфекции с фосфатом кальция описано в пункте 1.2 для трансфекции 5 мкг очищенной ДНК concatemeric в упаковку GPRS клеток в 6-см чашку для культуры ткани. 4 ч после трансфекции, осторожно удалите среды и заменить 4 мл предварительно нагретой D10 доксициклин (1 нг / мл).
- 48 ч после трансфекции изменить среду в D10 доксициклин (1 нг / мл) и пуромицин (2 мкг / мл). Выбрать для трансфицированных клонов путем добавления зеоцина (50 мкг / мл) в культуральной среде. Культуры клеток в течение 2 недель до ячейки колоныES можно увидеть в нижней части блюда.
- Этикетка клеточных колоний в нижней части блюда. Возьмем 24-луночных планшетах для культуры ткани, число скважин и добавляют в каждую лунку по 2 мл D10 содержащий зеоцина (50 мкг / мл), доксициклин (1 нг / мл), и пуромицина (2 мкг / мл). Аспирируйте среде приемными клетками, затем добавьте одну каплю трипсина на каждую из колоний менее чем за одну минуту. Затем добавить один или несколько капель D10 на той же колоний. Возьмите колоний один за другим с помощью пипетки и передавать их в отдельные лунки 24-луночного планшета для культуры ткани.
- Культура и расширение всех клеточных клонов D10 содержащий зеоцина (50 мкг / мл), доксициклин (1 нг / мл) и пуромицина (2 мкг / мл) для оценки способности продуцировать вирусные.
3. Оцените Вирусные производство каждого клона клеток
- Trypsinize клеток-продуцентов и пластины вокруг 4x10 6 клеток в 6 см культуре ткани блюдо в D10 без доксициклин, что слиянияпревышает 90%. Замените среды свежей предварительно нагретой D10 ежедневно и собирать средства для анализа титра 72 ч после удаления DOX.
- Урожай вирусный супернатант путем фильтрации среды с размером пор 0,45 мкм.
- Клетки плиты целевой выражающие DC-SIGN рецепторов (например, 293T.hDC-SIGN или костного мозга мыши дендритных клетках 16) и 293Т в качестве отрицательного контроля в 96-луночные планшеты для культивирования, 1 × 10 4 клеток / лунку. Добавляют 2-кратные серийные разведения вирусного супернатанта в лунки (100 мкл / лунку). Как правило, 6-8 разведений являются достаточными для достижения диапазона, в котором трансдуцированных GFP-положительных клеток в линейной зависимости от количества вируса добавлены.
- Центрифуга клетки и заменить среде, как описано в пункте 1.4. BMDCs следует культивировали в среде RPMI с добавлением 10% FBS и GM-CSF (1:20 J558L кондиционированной среды).
- Измерить GFP выражение в трансдуцированных клеток методом проточной цитометрии 4-6 дней после трансдукции. Лентивирусный Vectoт титр вычисляется в диапазоне разбавления вектор когда процент GFP-положительных клеток и вектор количества находятся в линейной зависимости. Выбор клеточный клон с высокой вирусной производство для последующей приложений.
4. Производим и сосредоточиться лентивирусных векторов
- Культура линейный продюсер ячейки (LV-MGFP) в 15-см чашки для культуры ткани.
- Trypsinize клеток-продуцентов и пластины клеток в 15-см чашки для культуры ткани на более чем 90% слияния в свежем D10 без доксициклин. Изменение среды свежей, предварительно нагретой D10 ежедневно.
- Во время пика вирусной производства (как определено пользователем), урожай вирусный супернатант и фильтровать с использованием 0,45-мкм фильтр. Загрузка отфильтрованного супернатанта в толстые стены 32,5 мл пробирок ультрацентрифуге, печать парафином и центрифуге при 50 000 мкг, 4 ° С в течение 90 мин. Тщательно ресуспендируют осадок в 50 мкл или соответствующий объем PBS или HBSS, в зависимости от применения. </ Li>
5. Иммунизации мышей в естественных условиях и анализа антиген-специфического иммунного ответа
- Продукты с высоким титром вируса, как описано в разделе 4.
- Введите BALB / с мышей (в возрасте 6-8 недель, самки) через подушечку маршрут с вектором подвески (25 мкл на подушечку) композиций.
- 2 недели после иммунизации, изолировать селезенки и спленоцитам урожая. Культуры спленоцитов с GFP пептиды эпитопов и анализа присутствия GFP-специфических CD8 + Т-клеток с использованием внутриклеточного окрашивания цитокинов, как было описано ранее 17 (фиг. 3В).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Стабильной клеточной линии описаны в этот метод может производить большое количество лентивирусных векторов, которые специально предназначены для дендритных клеток. Как показано на фиг.1В, выделение индивидуальных клонов дали стабильных клеточных линий различного качества 12. Среди 26 клонов тестирования, 8 производится лентивирусов частиц с титром выше 10 6 трансдукции единиц на мл (TU / мл), который является типичным эталоном для SVG-pseudotyped лентивирусных векторов производится временной трансфекции. В то же время, некоторые клоны продуцировали менее 10 4 TU / мл, важно, чтобы изолировать несколько клонов с целью получения сильной производителя.
Один клон надежно производится лентивирусов векторов с титром выше 10 7 TU / мл. Дальнейшее испытание на этот клон показали, что этот уровень вирусной производство было стабильным в течение нескольких дней, не зависит от наличия / отсутствия сыворотки в культуральной среде, а такжеchievable в клетки культивировали в течение более 3 месяцев (рис. 2) 12.
Чтобы подтвердить, что эти вирусы не были эффективны только в пробирке, они также были использованы для иммунизации мышей. Анализ GFP-специфический иммунный ответ на внутриклеточного окрашивания цитокинов обнаружили, что стабильно производства DC-LV может стимулировать расширение GFP-специфических CD8 + Т-клеток почти до 4% всех CD8 + спленоцитов (фигура 3) 12.
Рисунок 1. Генерация тетрациклин-регулируемой лентивирусный клетки производителем вектор. (А) Схематическое изображение порядок внесения DC-целевых лентивирусный вектор клеток-продуцентов, в том числе трансдукции линий ВРП с ретровирусную продолжение вектораAining гена SVGmu конверт и трансфекция гена (вирусный вектор) по concatemeric трансфекции. (B) Один клоны отбирали путем обработки зеоцина были расширены в течение 1-2 недель, а титр вирусного супернатанте измеряли через 3 дня после удаления доксициклина. Как показано, вирусные титры варьировались в зависимости от клона. (C) Плазмиду карт. Вирусный вектор плазмиды, TL20-GFP, кодирующий зеленый флуоресцентный белок под контролем промотора мышиного стволовых клеток вирусом, а вектор геном под контролем тетрациклину репрессируемый промотора. ПГК-BLE зеоцином кодирует ген устойчивости (Sh BLE) под учредительными фосфоглицераткиназу 1 промотор (ПГК). Ретро-SVGmu содержит SVGmu гликопротеина P под жесткий Tet реагировать элемент. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .
Рисунок 2. Характеристики вирусный вектор производства. (А) После удаления парадокс, титр вируса вектор культуральных супернатантах измеряли каждый день в течение 7 дней. Вирус достигла пика между 48 - 72 ч после индукции. Клетки культивировали в бессывороточной среде производится почти столько же, как и вирус культивировали с 10% FBS. (B) Производитель клетки культивировали в течение 3 месяцев и аликвоты периодически проверять для продуцирования вирусов. Никаких значительных потерь продукции вируса не наблюдалось.
Рисунок 3. Лентивирусов векторов производства стабильных DC-целевые клеточные линии можно выборочно преобразовывать домена в пробирке и генерировать иммунный ответ в живом организме. <сильная> (А) Мышь костного мозга дендритные клетки были инфицированы LV-GFP и GFP выражение измеряли проточной цитометрией. GFP экспрессии, специфичные для CD11c + клеток, которые включают в дендритных клеток. (B) Мышей иммунизировали 2 х 10 7 БПД, очищенного и концентрированного LV-GFP. Две недели спустя, почти 4% всех CD8 + Т-клетки активируются и выразил IFN, в ответ на презентацию GFP доминирующего пептида.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы выделили способ получения больших количеств лентивирусных векторов использованием клеток 293Т стабильно трансдуцированных все лентивирусов компонентов в соответствии с тет от системы регулирования. На сегодняшний день большинство протоколов для производства лентивирусных векторов полагаются на стандартные фосфата кальция временной трансфекции (см. 18, например). Этот подход был успешным в клиническом масштабе, но он может страдать от некоторых ограничений не могут присутствовать в расширении масштабов производства из стабильных клеточных линий. Например, ко-трансфекции с большими количествами плазмид LV теоретически может увеличить вероятность развития компетентного по репликации лентивирусов 19. Кроме того, переходный процесс трансфекции, более вероятно, чтобы произвести различные результаты в крупном масштабе, чем использование стабильной линии производитель из-за больших количеств ДНК ресурсов, необходимых 12. При определенных условиях, таких линий производитель были использованы для получения других γ-ретровирусные векторы на больших масштабах 20,21. Однако исследований с использованием лентивирусов линии производитель ограничены, и, следовательно, включение надежных анализов 22 для обнаружения компетентного по репликации лентивирусов будет иметь решающее значение при разработке любой линии клеток для клинического использования.
Другие группы опубликовали описания лентивирусом получения стабильных клеточных линий 6-11,23. Однако общим недостатком этих сообщений в том, что многие из них полагаются на трансдукции клеток-продуцентов лентивирусными векторами, кодирующими ген, что может уменьшить их безопасности для клинического использования. Здесь мы используем метод трансфекции concatemeric массива 11 преобразовывать клетки могут произвести самостоятельно инактивирующий лентивирус. Кроме того, наши использовании системы тет от улучшают пригодность метода для клинического использования. Этот нормативный система предотвращает токсичность SVGmu во время клеточного обслуживания культуре и позволяет осуществлять сбор лентивирусного векторов при AntibiotIC-бесплатных условиях.
Во время процедуры, важно, чтобы работники лаборатории использовать соответствующие меры предосторожности при обращении лентивирусных векторов. Лентивирусов векторов, взятых у ВИЧ-1, патоген человека, а все процедуры должны выполняться под руководством учреждения комитета по биобезопасности. Согласно NIH, BL2 сдерживания, как правило, подходит для работы с расширенным лентивирусов системы, такие как описанный здесь, хотя расширенные сдерживания BL2 могут быть указаны, если эксперименты расширены для клинической практики 24.
Есть несколько критических этапов процедуры, которые требуют особого ухода. Во-первых, культура клеток должны быть выполнены с большим вниманием к деталям. Мы обнаружили, что титры вируса заметно снижаться, если производитель клетки не пересевали каждые 24 часа. Аналогичным образом, некоторые много FBS может привести к значительному снижению производства вируса, поэтому важно, чтобы протестировать несколько много FBS БЭФруды расширении эксперимента. Отбор клонов, которые могут производить высокие титры вируса имеет важное значение для последующих применений. В соответствии с предыдущей работе 25, мы обнаружили, что клоны, которые появляются разделить быстрее, имеют тенденцию производить больше вируса. После того, как с высоким титром клонов было установлено, эти клетки должны быть аликвоты и замораживали в FBS + 10% ДМСО как можно скорее. Затем, используя недавно талой аликвоты помогает генерировать высокий титр возможно. Следуя этому правилу, мы имели наибольший успех производству вируса через переходные трансфекциями, и мы ожидаем, что подобного содержания клеточной линии получат стабильную вирус-продуцирующие клетки.
Основным ограничением этого метода является то, что он требует значительного количества вперед усилие для получения стабильной линии производителя. Таким образом, вряд ли будет уместно в ситуациях, когда несколько типов лентивирусных векторов будут проверены. Переходные трансфекциями может быть более удобным для Фесэлектронной типов приложений. Мы обычно предусматривают использование этого метода для получения больших количеств вирусного вектора, после вектор уже был испытан в небольшом формате. Другим ограничением нашей конкретной клеточной линии, что векторы, продуцируемых клетками GPRS будет только специфичные для клеток, экспрессирующих DC-SIGN, потому что белок оболочки, SVGmu, связывается с этим рецептором. В отношении других клеточных рецепторов, процедура может быть изменена путем введения других плазмид гликопротеин в исходную линию клеток GPR. Аналогичным образом, другие интересующие гены могут быть трансфицированы в клетки линии производителя, так что лентивирусов векторов может обеспечить более соответствующих белков, чем GFP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить Майкла Чоу, Бингбинг Дай, и Лян Сяо за вклад данных для данной рукописи. Мы также признаем, доктор Джон Грей за щедрые дары реагенты, используемые в этом исследовании. PB поддерживается докторской стипендии от Национального онкологического центра. Это исследование было поддержано грантами от Национального института здоровья (R01AI68978, P01CA132681 и RCA170820A), грант от Фонда Билла и Мелинды Гейтс, грант поступательное ускорение от Объединенного центра Поступательное медицины и грант от Калифорнии ВИЧ / СПИД исследовательской программы.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Mediatech Inc. | 10-013-CV | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Glutamine | Mediatech Inc. | 25-005-Cl | |
| Doxycycline | Clontech Laboratories, Inc. | 631311 | |
| Zeocin | Invitrogen | R250-01 | Toxic |
| Puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 | |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69506 |
References
- Naldini, L., et al. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272, 263-267 (1996).
- Kootstra, N. A., Verma, I. M. Gene therapy with viral vectors. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 43, 413-439 (2003).
- Montini, E., et al. Hematopoietic stem cell gene transfer in a tumor-prone mouse model uncovers low genotoxicity of lentiviral vector integration. Nat. Biotechnol. 24, 687-696 (2006).
- Montini, E., et al. The genotoxic potential of retroviral vectors is strongly modulated by vector design and integration site selection in a mouse model of HSC gene therapy. J. Clin. Invest. 119, 964-975 (1172).
- Hu, B., Tai, A., Wang, P. Immunization delivered by lentiviral vectors for cancer and infectious diseases. Immunological Reviews. 239, 45-61 (2011).
- Broussau, S., et al. Inducible packaging cells for large-scale production of lentiviral vectors in serum-free suspension culture. Molecular Therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy. 16, 500-507 (2008).
- Cockrell, A. S., Ma, H., Fu, K., McCown, T. J., Kafri, T. A trans-lentiviral packaging cell line for high-titer conditional self-inactivating HIV-1 vectors. Molecular Therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy. 14, 276-284 (2006).
- Ikeda, Y., et al. Continuous high-titer HIV-1 vector production. Nature Biotechnology. 21, 569-572 (2003).
- Kafri, T., van Praag, H., Ouyang, L., Gage, F. H., Verma, I. M. A packaging cell line for lentivirus vectors. Journal of Virology. 73, 576-584 (1999).
- Strang, B. L., et al. Human immunodeficiency virus type 1 vectors with alphavirus envelope glycoproteins produced from stable packaging cells. Journal of Virology. 79, 1765-1771 (2005).
- Throm, R. E., et al. Efficient construction of producer cell lines for a SIN lentiviral vector for SCID-X1 gene therapy by concatemeric array transfection. Blood. 113, 5104-5110 (2009).
- Lee, C. L., Chou, M., Dai, B., Xiao, L., Wang, P. Construction of stable producer cells to make high-titer lentiviral vectors for dendritic cell-based vaccination. Biotechnol. Bioeng. 109, 1551-1560 (2012).
- Steinman, R. M., Banchereau, J. Taking dendritic cells into medicine. Nature. 449, 419-426 (2007).
- Yang, L., et al. Engineered lentivector targeting of dendritic cells for in vivo immunization. Nature Biotechnology. 26, 326-334 (2008).
- Hanawa, H., et al. Efficient gene transfer into rhesus repopulating hematopoietic stem cells using a simian immunodeficiency virus-based lentiviral vector system. Blood. 103, 4062-4069 (2004).
- Yang, L., Baltimore, D. Long-term in vivo provision of antigen-specific T cell immunity by programming hematopoietic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 4518-4523 (2005).
- Dai, B., et al. HIV-1 Gag-specific immunity induced by a lentivector-based vaccine directed to dendritic cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 20382-20387 (2009).
- Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system. J. Vis. Exp. (63), e4031 (2012).
- Kochan, G., Escors, D., Stephenson, H., Breckpot, K.
- Loew, R., et al. A new PG13-based packaging cell line for stable production of clinical-grade self-inactivating gamma-retroviral vectors using targeted integration. Gene Ther. 17, 272-280 (2010).
- Gaspar, H. B., et al. Gene therapy of X-linked severe combined immunodeficiency by use of a pseudotyped gammaretroviral vector. Lancet. 364, 2181-2187 (2004).
- Cornetta, K., et al. Replication-competent lentivirus analysis of clinical grade vector products. Molecular Therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy. 19, 557-566 (2011).
- Stewart, H. J., et al. A stable producer cell line for the manufacture of a lentiviral vector for gene therapy of Parkinson's disease. Human Gene Therapy. 22, 357-369 (2011).
- Biosafety Considerations for Research with Lentiviral Vectors [Internet]. , National Institute of Health Recombinant DNA Advisory Committee. Available from: http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidance/LentiVirus_Containment/pdf/Lenti_Containment_Guidance.pdf (2006).
- Coroadinha, A. S., et al. Retrovirus producer cell line metabolism: implications on viral productivity. Appl. Microbiol. Biotechnol. 72, 1125-1135 (2006).
