Summary
Burada, retroviral transdüksiyon ve tetrasiklin yokluğunda bir lentiviral vektör (IV) bileşenleri ifade edebilen bir hücre çizgisi oluşturmak için concatemeric transfeksiyon kullanın. Bu AG GFP kodlar ve dendritik hücreler üzerinde reseptörü için spesifik olan bir glikoprotein, SVGmu ile pseudotyped edilir.
Abstract
Lentiviral vektörleri (karaciğer hacimleri) hücrelerin birçok çeşit genetik materyal teslim güçlü araçlardır. LVS büyük miktarlarda üretim, bu, HIV-1 ile ilişkili elde edilen vektörler, güvenlik kaygıları nedeniyle zordur. Bu yazıda, kendi kendini inaktive karaciğer hacimleri yüksek titreleri üretmek için bir yöntem rapor. Bu retroviral olarak bir dendritik hücre-özgü glikoproteini, SVGmu de dahil olmak üzere, tüm viral bileşenler ifade edebilen bir hücre hattı, GPRS oluşturmak için tet fiyatına stabil üretici hücre hattı GPR iletmektedir. Daha sonra, sol ventrikül aktarım plazmid kodlayan bir seçilebilir marker ile bir arada bir GFP raportör gen transfekte etmek için concatemeric DNA transfeksiyon kullanın. Sonuçta elde edilen klonlar çeşitli biz geçici transfeksiyon ile elde olandan 10 kat daha fazla bir titre de LV üretebilir. Ayrıca, bu virüsler, in vitro olarak verimli bir şekilde dendritik hücrelerin transdüksiyonu ve muhabir antijene karşı güçlü bir T hücresi bağışıklık tepkisi oluşturur. Bu yöntem iyi bir seçenek olabilir for kanser veya bulaşıcı hastalıkların klinik çalışmalar için güçlü LV-tabanlı aşısı üreten.
Introduction
Birçok vektör sistemleri gen aktarımı için geliştirilmiştir. Lentivirüsler dayalı vektörler en sık çalışılan viral sistemi arasında yer almıştır. Verimli bir şekilde, hücreleri 1 bölme ve olmayan bölünmesi hem transduce nedeniyle ev sahibi genomuna entegrasyonu için uzun vadeli ifade elde, en insan nüfusu 2 düşük doğal anti-vektör bağışıklık sergi ve için düşük potansiyeline sahip, çünkü bu vektörler avantajlıdır girmeyle mutagenez 3,4 ikinci genotoksisite.
Lentivirüsler üretimi her zaman güvenlik kaygıları ile renklendi. Lentiviral vektörleri, genellikle, HİV-1, AIDS etken ajan elde edilmektedir. Lentivector tek tek bileşenleri (transfer, zarf ve ambalaj plazmid) geçici transfeksiyon laboratuvar ortamlarında genetik materyal sunma ortak ve esnek bir araçtır. Ancak, klinik uygulamalar için ölçekleme-up geçici transfections hantal ve may çoğaltma yetkili lentivirüs 5,6 gelişmesine yol açar. Bu engellerin üstesinden gelmek için, çeşitli kararlı ambalaj ve üretici hücre çizgileri 6-11 geliştirilmiştir. Bu hatlarından biri, GPR paketleme hattı 11, tetrasiklin tarafından düzenlenen olma cazip bir avantaja sahiptir. Bu yazıda, özellikle dendritik hücreler (DC-LVs) 12 doğru hedeflenmektedir kendini inaktive lentiviral vektörler üretmek için bu sistem uyum nasıl gösterilmektedir.
Dendritik hücreler (DC) bağışıklık sisteminin en güçlü antijen sunan hücrelerdir. Doğrudan, programı başlatmak ve tümör spesifik immün yanıtları 13 düzenleyen çünkü kanser aşısı geliştirilmesi büyük ilgi konusu olmuştur. DC peptid veya DNA aşıları daha güçlü bir anti-tümör immün yanıt ortaya çıkarmak potansiyeline sahip dahil etmek için bir aşı protokolü içeren. Son zamanlarda, bir lentiviral vektör geliştirdiğimiz specifically, bir modifiye sindbis virüsü glikoprotein, SVGmu 14 boyunca dendritik hücreler hedeflemektedir. Onlar dendritik hücreler için yüksek özgüllük göstermek ve spesifik olmayan, VSVg-pseudotyped vektörler daha güçlü bağışıklık yanıtları üreten bu vektörler benzersizdir.
Burada, bu DC-hedefli lentiviral vektörleri büyük miktarlarda üretilmesi için bir yöntem sunulmuştur. Biz bu DC-DC LVs bulaştırmak ve güçlü CD8 + T hücre bağışıklık yanıtı oluşturabilir göstermektedir. Hayvanlar ile ilgili tüm işlemler USC Intitutional Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu onayı altında, insanca yapıldı. In vivo ve klinik deneylerde gerçekleştirmek için, bu yüksek bir titresi virüs üretebilen bir hücre çizgisi oluşturmak için çok önemlidir. Aynen anlatıldığı gibi iletimi ve transfeksiyon adımları uygulayarak böyle bir klon üretme şansını maksimize edecek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
DC-LV istikrarlı üretici hücreleri gerekli lentiviral bileşenleri gagpol, devir ve tet-off sistemi içeren GPR ambalaj hücre hattı 11 temel inşa edilir. İlk olarak, bir retroviral transdüksiyon tet-bağımlı SVGmu glikoprotein kodlayan bir GPRS paketleme hücre hattı üretmek için kullanılır. Daha sonra, bir dizi concatemer transfeksiyon gibi GFP gibi bir lentiviral vektör transgen ile GPRS hücre hattı transfekte etmek için kullanılır. AG-MGFP olarak tanımlanan bu stabil üretici hücre hattı, GFP karşı, bir DC-AG aşı üretme kabiliyetini için in vitro ve in vivo olarak test edilebilir.
1. Bir Tet bağımlı SVGmu Hücre Hattı oluşturma
Plazmid PrX-SVGmu DC-özgü glikoproteini SVGmu alt retroviral plazmid pRetroX-Tet fiyatına 1 (Şekil 1C) tTA-gelişmiş promotör klonlanmış olduğu bir yapıdır. D10 Kültür 293T hücreleri (Dulbecco değiştirilmiş Eagle ortamı ile% 10 fetal bovin serumu, 2 mM L-glutamin). Doksisiklin (1 ng / ml) ve puromisin (2 ug / ml) ile D10 Kültür GPR paketleme hücre hattı. Tüm hücreler% 5 CO2 ile nemlendirilmiş 37 ° C inkübatör içinde kültürlendi.
- 16-18 saat önce, geçici transfeksiyon, levha 2 x 10 hücre transfeksiyon zaman az% 90 konfluent yaklaşım, böyle bir 6-cm doku kültürü çanağı içinde D10 4 ml 6 293T hücreleri.
- Retroviral plasmidlerin transfeksiyonu: karışım 100 ul 1.25 M CaCI2 çözeltisi steril Milli-Q su ve aşağıdaki plazmid: 5 ug PrX-SVGmu, 2.5 ug pGag-Pol, 2.5 ug pVSV-G. Son hacim 500 ul. 5 ml polistiren yuvarlak tabanlı tüp, 500 ul 2X HBS (50 mM HEPES, 10 mM KCI, 12 mM Dekstroz, 280 mM NaCI, 2 HPO 4 * 7H 2, O, pH 7.05, 1.5 mM Na) ekleyin. Bir cam Pasteur pipeti ile şiddetli bir şekilde tampon köpüren ise 2X HBS tampon plazmid karışımı damla damla ilave edin. Mi ekledikten sonraxture, bir 30 saniye boyunca köpüren devam. Daha sonra, 6 cm kültür tabağına 293T hücreleri üzerine bütün karışımı eklenir, ve 37 ° C de inkübe
- 4 saat transfeksiyon sonra, dikkatli bir şekilde 4 ml önceden ısıtılmış D10 ile kültür çanak orta yerine.
- Enfeksiyon Spin: Transfeksiyondan 48 saat sonra hasat SVGmu-kodlayan bir 0.45 mikron filtre içinden geçen süpernatant ile süpernatantı retroviral parçacıklar. / Iyi 2 x 10 4 hücre bir 24-iyi çanak plaka GPR ambalaj hücreleri. 1,050 x g'de 90 dakika ve 25 ° C için çanak GPR paket hücreleri (2 ml / oyuk) ve santrifüj hücrelere Süpernatan süzülmüş ekleme (2 ml / oyuk) Spin-enfeksiyon sonrası doksisiklin (1 ng / ml) ile taze D10 içine orta değiştirin.
- Paket hücreleri doksisiklin (1 ng / ml) ve puromisin (2 ng / ml) ile D10 transduse 72 saat post-transfeksiyon, kültür genişletmek.
- 48 saat doksisiklin olmadan SVGmu, kültür hücrelerin ifade onaylamak için. Yüzey eski ölçünAnti-Sindbis serum kullanılarak akım sitometri ile SVGmu bir depresyon. Bu hücreler, GPRS, paketleme hücre olarak adlandırılır.
2. Concatemer Dizi Transfeksiyon tarafından DC-LV Üretici Hücreler Construct
Lentiviral transferi TL20 plazmid GFP bir kendi kendine inaktif lentiviral transfer vektörü bir plazmiddir Dox-regüle viral bir RNA genomu ekspresyon sistemi ve 7 tet operatör (Şekil 1C) 11, sitomegalovirüs (CMV) güçlendirici yer değiştirmesi ile pCL20c-MSCV-GFP dayalı , 12,15. Plazmid PGK-ble zayıf bir PGK organizatörü 2 tarafından yönlendirilen bir bleomisin dayanıklı (dür) kaset olduğunu.
- 50 kısıtlama enzimi sindirimi Sfil ile 20 ug plazmid TL20-GFP ° C 37 PflMI ile Digest 20 mg plazmid PGK-ble ° C
- Agaroz jel elektroforezi ile DNA fragmanları (PGK-labilir kaseti 1011 bp ve vektör TL20-GFP 6861 bp) arıtınız.
- TL20-GFP vektör ve PGK-Arter25:1 'lik bir molar oranda (NEB, T4 DNA ligaz) de ble kaseti. Gece boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
- Gece boyunca ligasyon sonra ligasyon karışımı (Qiagen DNeasy Kan ve doku Kiti) DNA arındırmak. Arıtılmış DNA miktarını sağlamak 5 mg civarındadır.
- Transfeksiyondan 16-18 saat önce, konfluent transfeksiyon zaman yaklaşık olarak% 90 olacak şekilde, 6 cm doku kültürü çanağı içinde plaka GPRS paket hücreleri.
- 6 cm doku kültürü çanağı içinde GPRS paket hücreleri içine concatemeric saflaştırılmış DNA 5 ug transfekte etmek için aşama 1.2 'de tarif edilen kalsiyum fosfat transfeksiyon yöntemi. Transfeksiyon, 4 saat sonra, dikkatli bir şekilde orta kaldırmak ve doksisiklin (1 ng / ml) ile 4 ml önceden ısıtılmış D10 ile değiştirin.
- Transfeksiyondan 48 saat sonra, doksisiklin (1 ng / ml) ve puromisin (2 ug / ml) ile D10 içine orta değiştirmek. Kültür ortamı içinde zeosin (50 mg / ml) eklenerek transfekte klonlar için seçin. Hücre koloni kadar yaklaşık 2 hafta boyunca kültür hücreleries yemekleri altındaki görülebilir.
- Yemeklerin altındaki hücre kolonileri etiketleyin. , 24 oyuklu doku kültürü tabaklarında al sayıda kuyu ve her biri de 2 ml zeosin D10 içeren (50 ug / ml), doksisiklin (1 ng / ml) ve puromisin (2 ug / ml) ekleyin. Transduse edilmiş hücrelerin medyumu aspire, o zaman en az bir dakika süre ile kolonilerin her birisi üzerine tripsin bir damla ilave edin. Daha sonra, aynı koloniler D10, bir ya da daha fazla damla ilave edin. Bir pipet yardımıyla tek koloniler bir pick up ve 24-iyi doku kültürü plakası ayrı kuyu içine aktarın.
- Kültür ve viral üreten yeteneğinin değerlendirilmesi için zeosin D10 içeren (50 ug / ml), doksisiklin (1 ng / ml) ve puromisin (2 ug / ml) içindeki tüm hücre klonları genişletebilir.
3. Her Hücre Clone Viral Üretim değerlendirin
- Doksisiklin olmadan birbirine karışmış gibi D10, 6 cm doku kültürü çanağı içinde 4x10 6 hücre etrafındaki üretici hücreler ve levha Trypsinize% 90 aşıyor. Günlük taze önceden ısıtılmış D10 ile orta değiştirin ve dox çıkardıktan sonra titre testi 72 saat için orta toplamak.
- Bir 0.45 mikron filtre ile filtreleme ortamı ile viral süpernatan hasat.
- Plaka hedef hücreler 4 x 10 hücre / 1, 96-çukurlu kültür tabaklarında bir negatif kontrol olarak, DC-SIGN reseptörü (örneğin, elde edilen 293T.hDC-SIGN veya fare kemik iliği dendritik hücreler 16) ve 293T ifade. Kuyu (göz başına 100 ul /) için viral üstte yüzen 2-kat seri dilüsyonları ekleyin. Genellikle, 6-8 seyreltileri GFP pozitif hücreleri ilave virüs miktarı için doğrusal bir ilişki içinde olan transduse hangi aralığı ulaşmak için yeterlidir.
- Hücreler santrifüj ve benzeri gibi Adım 1.4 'de tarif edilen orta yerine. BMDCs% 10 FBS ve GM-CSF (1:20 J558L koşullandırılmış ortam) ile RPMI ortamında edilmelidir.
- Akım sitometri 4-6 gün sonrası transdüksiyon hücreleri transduced en GFP ifade ölçün. Lentiviral vectoGFP-pozitif hücreler ve vektör miktarının yüzde doğrusal bir ilişki içinde olduğunda R titresi vektör seyreltme aralığında hesaplanır. Sonraki uygulamalar için en yüksek virüs üretimi ile hücre klonu seç.
4. Lentiviral Vektörler üretmek ve Konsantre
- Kültür 15 cm doku kültür tabaklarında üretici hücre hattı (AG-MGFP).
- Doksisiklin olmadan taze D10 konfluense% 90 daha az 15 cm doku kültürü yemekleri üretici hücreleri ve plaka hücreleri Trypsinize. Günlük taze, önceden ısıtılmış D10 orta değiştirin.
- Pik viral üretimi (kullanıcı tarafından tanımlanır) bir zamanda, viral süpernatan hasat ve bir 0.45 mikron filtre kullanılarak filtre. 90 dakika boyunca 50,000 x g'de santrifüj parafin ve, 4 ° C mühür, kalın duvar 32.5 ml'lik bir ultra santrifüj tüpleri içine süzüldü süpernatant yerleştirin. İyice 50 ul veya uygulamaya bağlı olarak, PBS veya HBSS uygun bir hacmi pelletini. </ Li>
5. In vivo farelerine bağışıklık ve antijen-spesifik bir bağışıklık tepkisi Analiz
- Bölüm 4'te açıklandığı gibi yüksek titre virüs üretin.
- Vektör süspansiyon (ayak yastığı başına 25 ul) ile bir haydut yolla BALB / c farelerde (eski, kadın 6-8 hafta) enjekte edilir.
- 2 hafta aşılama sonra, dalak ve hasat dalak izole. GFP epitop peptitleri ile ve GFP-özgül CD8 + varlığında, hücre içi sitokin boyaması kullanılarak bir T-hücrelerinde analiz Kültür splenositler, daha önce 17 (Şekil 3B) tanımlamışlardır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu yöntem, anlatılan stabil hücre hattı, özellikle dendritik hücreler için hedeflenen lentiviral vektörleri büyük miktarda üretebilir. Şekil 1B 'de gösterildiği üzere, bireysel klonların izolasyonu kaliteli 12 arasında değişen stabil hücre hatları elde edilmiştir. Test edilmiş 26 klon içinde, 8 geçici transfeksiyon tarafından üretilen SVG pseudotyped lentiviral vektörleri için tipik bir ölçüttür ml (TU / ml) başına 10'dan daha fazla 6 birimleri transdüksiyon bir titrede lentiviral parçacıkları ürer. Aynı zamanda, çok sayıda klon 10'dan az 4 TU / ml olarak üretilen, bir güçlü üretici elde etmek amacıyla çoklu klonların izole edilmesi için önemlidir.
Bir klon güvenilir bir şekilde daha büyük 10 7 TU / ml 'lik bir titrede lentiviral vektörleri üretti. Bu klon daha fazla test viral Bu üretim düzeyi kültür ortamı, serum varlığı / yokluğu etkilenmeyen, birden fazla gün boyunca stabildir ve olduğunu gösterdi3 aydan daha fazla (Şekil 2) 12 kültürlü hücrelerde chievable.
Bu virüsler sadece in vitro etkili olmadığını doğrulamak için, aynı zamanda farenin bağışıklık kazandırmak için kullanılmıştır. Hücre içi sitokin boyama ile GFP spesifik bağışıklık tepkisinin analizi stabil olarak üretilen DC-AG tüm CD8 + dalak yaklaşık% 4 (Şekil 3) 12 ile GFP spesifik CD8 + T hücre büyüme teşvik bulmuşlardır.
Şekil 1. Tetrasiklin ile regüle lentiviral vektör üretici hücrelerin üretilmesi. Retroviral vektör ile devam CTP hatları transdüksiyon dahil DC-hedefli lentiviral vektör üretici hücreler, işlem yapmak için (A) şematik ana hatlarınıSVGmu kaplama geni ve concatemeric transfeksiyonu ile ilgi (viral vektör) geninin transfeksiyonu Aining. (B), zeosin işlenerek seçilen tek klon 1-2 hafta içinde genişletildi ve viral süpernatan titresi 3 gün çıkarıldıktan sonra ölçülmüştür doksisiklinin. Gösterildiği gibi, viral titreleri klonu tarafından yaygın olarak değişmiştir. (C) Plazmid haritalar. Plazmid viral vektör, TL20-GFP, bir fare kök hücre virüsü promoteri ve bir tetrasiklin baskılanmaları promotörün kontrolü altında vektör genomu kontrolü altında yeşil floresan protein kodlar. PGK-ble kurucu fosfogliserat 1 promotörü (PGK) altında zeosin direnç geni (Sh ble) kodlar. Retro-SVGmu P sıkı tet duyarlı elemanı altında SVGmu glikoprotein içerir. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .
Şekil 2. Viral vektör üretimi özellikleri. (A) DOX çıkarılmasından sonra, kültür yüzer viral vektör titresi 7 gün boyunca her gün ölçüldü. 72 saat sonrası indüksiyon - Virüs üretim 48 arasında zirve yaptı. Serum barındırmayan ortam içinde kültüre edilmiş hücreler,% 10 FBS ile kültürlendi gibi yaklaşık olarak çok virüs üretilir. (B), Üretici hücreler 3 ay içinde kültüre edildi ve alikotları virüs üretimi için periyodik olarak test edilmiştir. Virüs üretimini belirgin bir kayıp gözlendi.
Şekil 3,. Stabil DC hedeflenen hücre çizgileri tarafından üretilen lentiviral vektörleri seçici in vitro DC'ler transdüksiyonu ve in vivo olarak bir bağışıklık yanıtı oluşturabilir. <strong> (A) Fare kemik iliği kökenli dendritik hücreler LV-GFP ve GFP ifade akım sitometri ile ölçülmüştür ile enfekte edildi. GFP tanımı, dendritik hücreler dahil CD11c + hücreleri için spesifikti. (B) Fareler saflaştırılmış ve konsantre AG-GFP 2 x 10 7 DS ile aşılandı. İki hafta sonra, tüm CD8 + T hücreleri, yaklaşık% 4 GFP baskın peptit sunumu yanıt olarak aktive edilir ve IFNy ifade edildi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada, stabil olarak düzenleyici sistem kapalı Tet altında lentiviral bileşenleri ile transduse 293T hücreleri kullanılarak lentiviral vektörleri büyük miktarlarda üretilmesi için bir yöntem, ana hatlarıyla. Bugüne kadar, lentiviral vektörleri üretmek için en çok kullanılan protokol (örneğin, 18), standart kalsiyum fosfat geçici transfeksiyon dayanmaktadır. Bu yaklaşım bir klinik ölçekte başarılı olmuştur, ama istikrarlı hücre hatları üretimi ölçeklendirme mevcut olması muhtemel değildir bazı sınırlamalar muzdarip olabilir. Örneğin, AG plazmid büyük miktarlarda ile ko-transfeksiyon teorik kopyelemeye yetkin lentivirüs 19 geliştirilmesi için fırsat artırabilir. Ayrıca, geçici transfeksiyonlar için gerekli DNA 12 girişlerinin büyük miktarlarda nedeniyle istikrarlı bir üretici hattı kullanılarak daha büyük bir ölçekte, değişken sonuçlar üretmek için daha muhtemeldir. Uygun koşullar altında, bu tür Üretici hatları oluşturmak için kullanılmış olan diğer γ-retrobüyük ölçeklerde 20,21 viral vektörler. Ancak, lentiviral yapımcı hatları kullanan çalışmalar sınırlıdır ve bu nedenle çoğaltma yetkili lentivirüs tespit etmek için sağlam deneyleri 22 dahil klinik kullanım için herhangi bir hücre hattı geliştirilmesinde önemli olacaktır.
Diğer gruplar lentivirüs üreten istikrarlı hücre hatları 6-11,23 için açıklamalar yayınladı. Bununla birlikte, bu raporlar, ortak bir sınırlama bunların çoğu klinik kullanım için kendi güvenlik azaltabilir, ilgi konusu gen, kodlama lentiviral vektörleri ile üretici hücrelerin iletici güvenmek olmasıdır. Burada, kendini inaktive lentivirüs üretebilir hücreleri uyum sağlamak concatemeric dizi transfeksiyon yöntemi 11 kullanmaktadır. Ayrıca, tet kapalı sistem bizim kullanımı klinik kullanım için yöntem uygunluğunu geliştirir. Bu düzenleyici sistem hücre kültürü bakım sırasında SVGmu gelen toksisite önler ve antibiyotiklerin altında lentiviral vektörlerin toplanması için izin veriric içermeyen koşullar.
İşlem sırasında, bu lentiviral vektörler tutarken laboratuar çalışanları uygun önlemler kullanmanız önemlidir. Lentiviral vektörler HIV-1, bir insan patojen türetilmiştir ve tüm işlemler bir kurum biyogüvenlik komitesi gözetiminde yapılmalıdır. Deneyler klinik uygulama 24 için büyütülüyor eğer gelişmiş BL2 çevreleme belirtilmiş olabilir, ancak NIH göre, BL2 çevreleme, genellikle burada açıklanan bir gibi gelişmiş lentiviral sistemleri ile çalışmak için uygundur.
Özel bakım gerektiren işlem birkaç önemli adım vardır. İlk olarak, hücre kültürü büyük özen ile yapılmalıdır. Bu üretici hücreler, her 24 saat geçişli takdirde virüs titreleri belirgin düşüş olduğunu bulduk. Benzer şekilde, FBS bazı çok virüs üretiminde önemli düşüşler yol açabilir, bu yüzden FBS BEF birden fazla sayıda test etmek önemlidircevheri bir deney kadar ölçeklendirme. Yüksek virüs titreleri üretebilen bir klonun seçilmesi alt uygulamalar için çok önemlidir. Önceki çalışmaları 25 ile uyumlu olarak, daha hızlı bölünen görünen klonlar daha fazla virüs üretme eğilimindedir bulduk. Bir kez bir yüksek titre klonu bulunmuştur, bu hücrelerin bölünüp FBS dondurulmuş +% 10 DMSO gibi kısa zamanda mümkün olmalıdır. Daha sonra, taze çözülmüş alikotları kullanarak mümkün olan en yüksek titre oluşturmak için yardımcı olur. Başparmak bu kural izleyerek, biz geçici transfections aracılığıyla virüs üreten en başarılı oldu, ve benzer hücre hattı bakım istikrarlı virüs üreten hücrelerin yararlanacaktır bekliyoruz.
Bu yöntemin önemli bir kısıtlaması, istikrarlı bir üretici çizgi oluşturmak kadar ön çaba önemli miktarda gerektirir. Bu nedenle, bu lentiviral vektörleri birden fazla türde test edilecek durumlarda uygun olması muhtemel değildir. Geçici transfeksiyonlar thes için daha uygun olabiliruygulamalar e türleri. Genellikle vektörü küçük bir biçimde test edilmiştir sonra viral vektör büyük miktarlarda üretmek için bu yöntemi kullanarak öngörmektedir. Bizim belirli bir hücre hattı bir diğer olumsuzluğu da kaplama proteini, SVGmu, bu reseptöre bağlanan için GPRS hücreleri tarafından üretilen vektörler yalnızca DC-SIGN eksprese eden hücreler için spesifik olacaktır olmasıdır. Diğer hücresel reseptörler hedeflemek için, prosedür orijinal GPR hücre hattı içine diğer glikoprotein plazmid getirerek değiştirilebilir. Lentiviral vektörleri GFP daha fazla sayıda ilgili proteinlerin dağıtılması ve böylece benzer bir şekilde, diğer ilgi genlerinin üretici hücre çizgileri içine transfekte edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Yazarlar bu yazının verileri katkıda Michael Chou, Bingbing Dai ve Liang Xiao kabul etmek istiyorum. Biz de bu çalışmada kullanılan reaktiflerin cömert hediyeler için Dr John Gray kabul. PB Ulusal Kanser Merkezi'nden bir doktora sonrası burs tarafından desteklenmektedir. Bu araştırma Ulusal Sağlık Enstitüsü (R01AI68978, P01CA132681 ve RCA170820A), Bill ve Melinda Gates Vakfı, Translational Medicine için Ortak Merkezi'nden bir öteleme ivme hibe ve Kaliforniya HIV / AIDS bir hibe bir hibe hibe tarafından desteklenmiştir Araştırma Programı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Mediatech Inc. | 10-013-CV | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Glutamine | Mediatech Inc. | 25-005-Cl | |
| Doxycycline | Clontech Laboratories, Inc. | 631311 | |
| Zeocin | Invitrogen | R250-01 | Toxic |
| Puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 | |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69506 |
References
- Naldini, L., et al. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272, 263-267 (1996).
- Kootstra, N. A., Verma, I. M. Gene therapy with viral vectors. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 43, 413-439 (2003).
- Montini, E., et al. Hematopoietic stem cell gene transfer in a tumor-prone mouse model uncovers low genotoxicity of lentiviral vector integration. Nat. Biotechnol. 24, 687-696 (2006).
- Montini, E., et al. The genotoxic potential of retroviral vectors is strongly modulated by vector design and integration site selection in a mouse model of HSC gene therapy. J. Clin. Invest. 119, 964-975 (1172).
- Hu, B., Tai, A., Wang, P. Immunization delivered by lentiviral vectors for cancer and infectious diseases. Immunological Reviews. 239, 45-61 (2011).
- Broussau, S., et al. Inducible packaging cells for large-scale production of lentiviral vectors in serum-free suspension culture. Molecular Therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy. 16, 500-507 (2008).
- Cockrell, A. S., Ma, H., Fu, K., McCown, T. J., Kafri, T. A trans-lentiviral packaging cell line for high-titer conditional self-inactivating HIV-1 vectors. Molecular Therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy. 14, 276-284 (2006).
- Ikeda, Y., et al. Continuous high-titer HIV-1 vector production. Nature Biotechnology. 21, 569-572 (2003).
- Kafri, T., van Praag, H., Ouyang, L., Gage, F. H., Verma, I. M. A packaging cell line for lentivirus vectors. Journal of Virology. 73, 576-584 (1999).
- Strang, B. L., et al. Human immunodeficiency virus type 1 vectors with alphavirus envelope glycoproteins produced from stable packaging cells. Journal of Virology. 79, 1765-1771 (2005).
- Throm, R. E., et al. Efficient construction of producer cell lines for a SIN lentiviral vector for SCID-X1 gene therapy by concatemeric array transfection. Blood. 113, 5104-5110 (2009).
- Lee, C. L., Chou, M., Dai, B., Xiao, L., Wang, P. Construction of stable producer cells to make high-titer lentiviral vectors for dendritic cell-based vaccination. Biotechnol. Bioeng. 109, 1551-1560 (2012).
- Steinman, R. M., Banchereau, J. Taking dendritic cells into medicine. Nature. 449, 419-426 (2007).
- Yang, L., et al. Engineered lentivector targeting of dendritic cells for in vivo immunization. Nature Biotechnology. 26, 326-334 (2008).
- Hanawa, H., et al. Efficient gene transfer into rhesus repopulating hematopoietic stem cells using a simian immunodeficiency virus-based lentiviral vector system. Blood. 103, 4062-4069 (2004).
- Yang, L., Baltimore, D. Long-term in vivo provision of antigen-specific T cell immunity by programming hematopoietic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 4518-4523 (2005).
- Dai, B., et al. HIV-1 Gag-specific immunity induced by a lentivector-based vaccine directed to dendritic cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 20382-20387 (2009).
- Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system. J. Vis. Exp. (63), e4031 (2012).
- Kochan, G., Escors, D., Stephenson, H., Breckpot, K.
- Loew, R., et al. A new PG13-based packaging cell line for stable production of clinical-grade self-inactivating gamma-retroviral vectors using targeted integration. Gene Ther. 17, 272-280 (2010).
- Gaspar, H. B., et al. Gene therapy of X-linked severe combined immunodeficiency by use of a pseudotyped gammaretroviral vector. Lancet. 364, 2181-2187 (2004).
- Cornetta, K., et al. Replication-competent lentivirus analysis of clinical grade vector products. Molecular Therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy. 19, 557-566 (2011).
- Stewart, H. J., et al. A stable producer cell line for the manufacture of a lentiviral vector for gene therapy of Parkinson's disease. Human Gene Therapy. 22, 357-369 (2011).
- Biosafety Considerations for Research with Lentiviral Vectors [Internet]. , National Institute of Health Recombinant DNA Advisory Committee. Available from: http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidance/LentiVirus_Containment/pdf/Lenti_Containment_Guidance.pdf (2006).
- Coroadinha, A. S., et al. Retrovirus producer cell line metabolism: implications on viral productivity. Appl. Microbiol. Biotechnol. 72, 1125-1135 (2006).
