Summary
Qui, usiamo trasduzione retrovirale e trasfezione concatemeric per creare una linea cellulare che può esprimere le componenti di un vettore lentivirale (LV) in assenza di tetraciclina. Questo LV codifica GFP ed è pseudotyped con una glicoproteina, SVGmu, che è specifico per un recettore sulle cellule dendritiche.
Abstract
Vettori lentivirali (LV) sono un mezzo efficace per la fornitura di materiale genetico di molti tipi di cellule. A causa di problemi di sicurezza associati a questi HIV-1 vettori derivati, la produzione di grandi quantità di volumi logici è impegnativo. In questo lavoro, riportiamo un metodo per produrre alti titoli di LV auto-inattivanti. Abbiamo retrovirally trasdurre il tet-off stabile produttore cella linea GPR per generare una linea cellulare, GPRS, che può esprimere tutti i componenti virali, compresa una cellula dendritica glicoproteina-specifico, SVGmu. Poi usiamo trasfezione del DNA concatemeric trasfezione trasferimento plasmide codificante GFP LV un gene reporter in combinazione con un marcatore selezionabile. Molti dei cloni risultanti possono produrre LV ad un titolo 10 volte più grande di quello che otteniamo con trasfezione transiente. In più, questi virus efficientemente trasdurre cellule dendritiche in vitro e generano una cellula T forte risposta immunitaria all'antigene nostra giornalista. Questo metodo può essere una buona opzione for la produzione di vaccini forti LV-based per gli studi clinici di cancro o di malattie infettive.
Introduction
Molti sistemi vettore sono stati sviluppati per il trasferimento genico. Vettori basati su lentivirus sono stati tra il sistema virale più comunemente studiate. Questi vettori sono vantaggiose perché possono trasdurre efficientemente sia divisione e non divisione delle cellule 1, ottenere l'espressione a lungo termine a causa di integrazione nel genoma dell'ospite, mostrare bassa immunità anti-vettore naturale nella maggior parte delle popolazioni umane 2, e hanno un basso potenziale di genotossicità di mutagenesi inserzionale 3,4.
Produzione di lentivirus è sempre stata colorata da preoccupazioni di sicurezza. Vettori lentivirali derivano generalmente da HIV-1, l'agente eziologico dell'AIDS. Trasfezione transiente dei singoli componenti del lentivector (trasferimento, busta e plasmidi di imballaggio) è un mezzo comune e flessibile di fornire materiale genetico in laboratorio. Tuttavia, scaling-up transfezioni transitori per le applicazioni cliniche è ingombrante e may portare allo sviluppo di replicazione-competenti lentivirus 5,6. Per superare questi ostacoli, vari imballaggio stabile e linee cellulari di produttori sono state sviluppate 6-11. Una di queste linee, la linea di confezionamento GPR 11, ha il vantaggio di essere attraente regolato dalla tetraciclina. In questo lavoro, dimostriamo come adattare questo sistema per la produzione di auto-inattivanti vettori lentivirali che sono specificamente indirizzate verso le cellule dendritiche (DC-VL) 12.
Le cellule dendritiche (DC) sono le più robuste cellule presentanti l'antigene del sistema immunitario. Essi sono stati oggetto di grande interesse per lo sviluppo di vaccini cancro perché essi avviano direttamente, programmi, e regolano le risposte immunitarie tumore-specifici 13. Inserimento di un protocollo di vaccinazione per includere PVS ha il potenziale di provocare una risposta immunitaria antitumorale forte di peptide o DNA vaccini. Recentemente, abbiamo sviluppato un vettori lentivirali che specifically obiettivi di cellule dendritiche attraverso un Sindbis modificato virus glicoproteina, SVGmu 14. Questi vettori sono unici nel senso che mostrano elevata specificità per le cellule dendritiche e di generare risposte immunitarie più forti che non specifici, vettori VSVG-pseudotyped.
Qui riportiamo un metodo per produrre grandi quantità di questi vettori lentivirali DC-mirati. Dimostriamo che questi DC-LV può infettare cellule dendritiche e generare forti CD8 + risposta immunitaria delle cellule T. Tutte le procedure che coinvolgono animali sono stati eseguiti con umanità, con l'approvazione della USC istituzionale dell'Ateneo cura degli animali e del Comitato Istituzionale Usa. Per svolgere esperimenti in vivo e clinici, è fondamentale per creare una linea cellulare che può produrre virus ad un alto titolo. Di eseguire la procedura di trasduzione e trasfezione esattamente come descritto consentirà di massimizzare le probabilità di generare una tale clone.
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Protocol
DC-LV cellule produttori stabili sono costruite sulla base della confezione cella linea 11 GPR che contiene la necessaria componenti lentivirale gagpol, rev e il sistema tet-off. Prima, trasduzione retrovirale viene utilizzato per generare una linea cellulare di packaging GPRS che codifica un tet-dipendente SVGmu glicoproteina. Poi, concatemer matrice trasfezione è usato per trasfettare la linea cellulare GPRS con un vettore lentivirale come transgene GFP. Questa linea cellulare stabile produttore, designato come LV-MGFP, può essere testato in vitro e in vivo per la sua capacità di produrre un vaccino DC-LV contro GFP.
1. Generazione di un Tet-dipendente SVGmu Cell Line
Plasmide PRX-SVGmu è un costrutto in cui DC-specifico SVGmu glicoproteina è clonato a valle del promotore tTA-avanzata di plasmide retrovirale pRetroX-Tet-off 1 (Figura 1C). Cultura 293T cellule in D10 (medium di Eagle modificato da Dulbecco con10% di siero fetale bovino, 2 mM L-glutammina). Coltura GPR linea cellulare di packaging in D10 con doxiciclina (1 ng / ml) e puromicina (2 mg / ml). Tutte le cellule sono coltivate in un umidificata 37 ° C incubatore con il 5% di CO 2.
- 16-18 hr prima della transfezione transiente, piastra 2 x 10 6 cellule 293T in 4 ml di D10 in un piatto di coltura tissutale a 6 cm in modo che le cellule si avvicinano 90% di confluenza al momento della transfezione.
- Trasfezione di plasmidi retrovirali: mescolare 100 ml 1,25 M CaCl 2 soluzione, acqua Milli-Q sterile e seguenti plasmidi: 5 mcg PRX-SVGmu, 2,5 mcg pGag-Pol, 2,5 mcg pVSV-G. Il volume finale è di 500 microlitri. Per un ml polistirolo tubo a fondo rotondo 5, aggiungere 500 microlitri 2X HBS (HEPES 50 mm, 10 mm, 12 mm KCl Destrosio, 280 mM NaCl, 1,5 mM Na 2 HPO 4 * 7H 2 O, pH 7,05). Aggiungere goccia a goccia la miscela plasmide nel buffer HBS 2X mentre ribolle il buffer energicamente con una pipetta Pasteur di vetro. Dopo aver aggiunto il mixture, continuare spumeggiante per altri 30 sec. Quindi, aggiungere l'intera miscela sulle cellule 293T in colture di 6 cm, e incubare a 37 ° C.
- 4 ore dopo la transfezione, sostituire attenzione il mezzo nel piatto cultura con 4 ml D10 preriscaldato.
- Spin infezione: 48 ore dopo la trasfezione, raccolto SVGmu-codifica particelle retrovirali nel surnatante facendo passare il surnatante attraverso un filtro di 0,45 micron. Piastra le cellule di packaging GPR in un piatto da 24 pozzetti con 2 x 10 4 cellule / pozzetto. Aggiungere surnatante filtrato per cellule di packaging GPR nel piatto (2 ml / pozzetto) e cellule centrifugare per 90 min a 1050 xg e 25 ° C. Cambiare mezzo in D10 fresco con doxiciclina (1 ng / ml) dopo spin-infezione (2 ml / pozzetto).
- 72 ore post-trasfezione, espandere la cultura di cellule trasdotte confezionamento in D10 con doxiciclina (1 ng / ml) e puromicina (2 ng / ml).
- Per confermare l'espressione di SVGmu, coltivare le cellule senza doxiciclina per 48 ore. Misurare ex superficiepressione di SVGmu con citometria a flusso utilizzando siero anti-Sindbis. Queste cellule sono designati come GPRS linea cellulare di packaging.
2. Costruire DC-LV Produttore Cells da Concatemer Array Transfezione
Lentiviral trasferimento plasmide TL20-GFP è una auto-inattivanti lentivirali trasferimento plasmide vettore sulla base di pCL20c-MSCV-GFP con un sistema di Dox-regulatable virale RNA del genoma espressione e la sostituzione del citomegalovirus (CMV) enhancer con 7 tet operatori (Figura 1C) 11 , 12,15. Plasmide PGK-bile è un resistente (BLE) cassette bleomicina guidato da un debole promotore PGK 2.
- Digest 20 mcg TL20-GFP plasmide con l'enzima di restrizione SfiI a 50 ° C. Digest 20 mcg plasmide PGK-bile con PflMI a 37 ° C.
- Purificare i frammenti di DNA (la cassetta PGK-bile è 1011 bp e il vettore TL20-GFP è 6861 bp) mediante elettroforesi su gel di agarosio.
- Legare il vettore TL20-GFP e PGK-cassetta bile ad un rapporto molare di 25:1 (NEB DNA ligasi T4). Incubare per una notte a temperatura ambiente.
- Dopo una notte legatura, purificare il DNA dalla miscela di ligazione (Qiagen DNeasy Blood and Tissue Kit). Garantire la quantità di DNA purificato è di circa 5 mg.
- 16-18 hr prima della transfezione, le cellule piastra GPRS confezionamento in un piatto di coltura tissutale a 6 cm in modo che la confluenza saranno circa il 90% al momento della transfezione.
- Utilizzare il metodo di trasfezione fosfato di calcio descritto nel passo 1.2 trasfezione 5 pg di DNA purificato concatemeric nelle cellule confezionamento GPRS nel piatto di coltura tissutale di 6 cm. 4 ore dopo la trasfezione, rimuovere con attenzione il mezzo e sostituirlo con 4 ml D10 pre-riscaldata con doxiciclina (1 ng / ml).
- 48 ore dopo la trasfezione, cambiare il mezzo in D10 con doxiciclina (1 ng / ml) e puromicina (2 mg / ml). Seleziona per cloni trasfettati aggiungendo Zeocin (50 mcg / ml) nel mezzo di coltura. Cultura le cellule per circa 2 settimane fino cella Colonies può essere visto sul fondo dei piatti.
- Etichettare le colonie di cellule sul fondo dei piatti. Prendere 24 pozzetti piatti di coltura di tessuto, il numero dei pozzetti e aggiungere a ciascun pozzetto contenente 2 ml D10 Zeocin (50 mcg / ml), doxiciclina (1 ng / ml), e puromicina (2 mg / ml). Aspirare il terreno delle cellule trasdotte, quindi aggiungere una goccia di tripsina su ciascuna delle colonie per meno di un minuto. Poi, aggiungere una o più gocce di D10 sulle stesse colonie. Prelevare colonie uno ad uno con una pipetta e trasferirli in pozzetti separati della piastra di coltura tissutale a 24 pozzetti.
- Cultura e espandere tutti cloni cellulari in D10 contenente Zeocin (50 mcg / ml), doxiciclina (1 ng / ml) e puromicina (2 mg / ml) per la valutazione della capacità di produzione virale.
3. Valutare virale produzione di ogni clone cellulare
- Trypsinize le cellule di produttori e piastra in tutto 4x10 6 celle a 6 cm di tessuto cultura piatto in D10 senza doxiciclina tale che la confluenzasupera il 90%. Sostituire il supporto con fresca D10 preriscaldato quotidianamente e raccogliere il supporto per il titolo test 72 ore dopo la rimozione dox.
- Raccogliere il surnatante virale filtrando il mezzo con un filtro di 0,45 micron.
- Cellule bersaglio targa che esprime il recettore DC-SIGN (es. 293T.hDC-SIGN o il mouse derivate dal midollo osseo cellule dendritiche 16) e 293T come controllo negativo in piatti di coltura da 96 pozzetti, 1 x 10 4 cellule / pozzetto. Aggiungere diluizioni seriali di 2 volte del surnatante virale ai pozzetti (100 pl / pozzetto). Solitamente, 6-8 diluizioni sono sufficienti per raggiungere l'intervallo in cui trasdotte cellule GFP-positive sono in un rapporto lineare alla quantità di aggiunta di virus.
- Centrifugare le cellule e sostituire il mezzo come descritto al punto 1.4. BMDCs dovrebbero essere coltivate in terreno RPMI con 10% di FBS e GM-CSF (01:20 J558L terreno condizionato).
- Misurare l'espressione di GFP in cellule trasdotte mediante citometria di flusso 4-6 giorni post-trasduzione. Il vecto lentiviralir titolo è calcolata nell'intervallo di diluizione vettore quando la percentuale di cellule GFP-positive e quantità vettoriali sono in una relazione lineare. Scegliere il clone cellulare con la produzione virale più alta per le applicazioni successive.
4. Produrre e Concentrato vettori lentivirali
- Cultura della linea cellulare produttore (LV-MGFP) in 15 cm di tessuto piatti della cultura.
- Trypsinize le cellule produttrici e le cellule in piastre da 15 cm piatti coltura di tessuti a più di 90% di confluenza in D10 fresca senza doxiciclina. Cambiare media con fresco D10, preriscaldato quotidiana.
- Al momento della produzione virale picco (come determinato dall'utente), raccogliere il surnatante virale e filtrare utilizzando un filtro di 0,45 micron. Caricare il surnatante filtrato in spessore parete 32,5 tubi ultracentrifuga ml, sigillare con parafilm e centrifugare a 50.000 xg, a 4 ° C per 90 min. Accuratamente risospendere il pellet in 50 microlitri o un volume appropriato di PBS o HBSS seconda dell'applicazione. </ Li>
5. Immunizzare topi in vivo e analisi antigene-specifica risposta immunitaria
- Produrre virus ad alto titolo come descritto nel capitolo 4.
- Iniettare topi BALB / c (6-8 settimane di età, femmina) attraverso un percorso footpad con il vettore di sospensione (25 microlitri per footpad).
- 2 settimane dopo l'immunizzazione, isolare milza e splenociti raccolto. Splenociti coltura con GFP peptidi epitopi e analizzare la presenza di GFP-specifiche cellule T CD8 + mediante colorazione intracellulare delle citochine, come precedentemente descritto 17 (Figura 3B).
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Representative Results
La linea cellulare stabile descritto nel presente metodo può produrre grandi quantità di vettori lentivirali mirati specificatamente alle cellule dendritiche. Come mostrato nella Figura 1B, isolamento di cloni individuali ha prodotto linee cellulari stabili di qualità variabile 12. Tra 26 cloni saggiati, 8 prodotte particelle lentivirali ad un titolo maggiore di 10 6 unità di trasduzione per ml (TU / ml), che è un punto di riferimento tipico per vettori lentivirali SVG-pseudotyped prodotti dalla trasfezione transiente. Allo stesso tempo, diversi cloni prodotte meno di 10 4 TU / ml, è importante isolare cloni multipli al fine di ottenere un forte produttore.
Un clone prodotto in maniera affidabile vettori lentivirali ad un titolo maggiore di 10 7 TU / ml. Ulteriori test su questo clone dimostrato che tale livello di produzione virale era stabile per più giorni, influenzati dalla presenza / assenza di siero nel mezzo di coltura, e unchievable in cellule coltivate per più di 3 mesi (Figura 2) 12.
Per confermare che questi virus non erano soltanto efficace in vitro, sono stati utilizzati anche per immunizzare topi. Analisi della risposta immunitaria GFP-specifico mediante colorazione intracellulare citochina trovato che stabilmente prodotta DC-LV potrebbe stimolare l'espansione della GFP-specifiche cellule T CD8 + a quasi il 4% di tutti CD8 + splenociti (Figura 3) 12.
Figura 1. Generazione di cellule produttrici vettori lentivirali tetraciclina-regolamentati. (A) Schema schema della procedura per le cellule produttrici DC-mirati vettori lentivirali, tra cui la trasduzione di GRP linee con un vettore retrovirale containing il gene busta SVGmu e trasfezione del gene di interesse (vettore virale) per trasfezione concatemeric. (B) singoli cloni selezionati mediante trattamento Zeocin stati espansi in 1-2 settimane, e il titolo del surnatante virale è stata misurata 3 giorni dopo la rimozione di doxiciclina. Come si vede, titoli virali varia ampiamente dal clone. (C) mappe plasmidi. Il plasmide vettore virale, TL20-GFP, codifica la proteina fluorescente verde sotto il controllo di una cellula staminale murina virus promotore e il genoma del vettore sotto il controllo di un promotore tetraciclina-reprimibile. PGK-bile codifica il gene di resistenza Zeocin (Sh BLE) sotto la costitutiva fosfoglicerato chinasi 1 promoter (PGK). Retro-SVGmu contenente la glicoproteina SVGmu sotto la stretta tet elemento reattivo P. Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 2. Caratteristiche della produzione vettore virale. (A) Dopo la rimozione della DOX, il vettore virale titolo di surnatanti di coltura è stata misurata ogni giorno per 7 giorni. Produzione di virus ha raggiunto il picco tra 48-72 ore dopo l'induzione. Cellule coltivate in mezzi privi di siero prodotte quasi quanto virus come quelli coltura con 10% FBS. (B) sono state coltivate cellule produttrici oltre 3 mesi e aliquote sono state testate periodicamente per la produzione di virus. È osservata riduzione significativa della produzione di virus.
Figura 3. Vettori lentivirali prodotte da linee cellulari DC-targeting stabili possono trasdurre selettivamente cellule dendritiche in vitro e generare una risposta immunitaria in vivo. <strong> (A) derivate dal midollo osseo cellule dendritiche del mouse sono state infettate con LV-GFP e di espressione GFP è stata misurata con la citometria a flusso. Espressione GFP era specifico per CD11c + cellule, tra cui le cellule dendritiche. (B) I topi sono stati immunizzati con 2 x 10 7 TU di purificato e concentrato LV-GFP. Due settimane dopo, quasi il 4% di tutte le cellule T CD8 + sono stati attivati ed espresso IFNy in risposta alla presentazione del peptide dominante GFP.
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Discussion
Qui, abbiamo delineato un metodo per la produzione di grandi quantità di vettori lentivirali utilizzando 293T cellule trasdotte stabilmente con tutti i componenti lentivirali sotto il tet off sistema di regolamentazione. Ad oggi, la maggior parte dei protocolli per produrre vettori lentivirali basano su standard di trasfezione transiente di calcio fosfato (cfr. 18, per esempio). Questo approccio ha avuto successo su scala clinico, ma può soffrire di alcune limitazioni che possono non essere presenti in scaling up di produzione da linee cellulari stabili. Per esempio, co-trasfezione con grandi quantità di plasmidi LV potrebbe teoricamente aumentare la probabilità per lo sviluppo di replicazione lentivirus competente 19. Inoltre, trasfezioni transienti hanno maggiori probabilità di risultati variabili su larga scala che utilizzando una linea stabile produttore a causa delle grandi quantità di DNA richiesto ingressi 12. Nelle giuste condizioni, tali linee di produzione sono stati utilizzati per generare altre γ-retrovettori virali su grandi scale 20,21. Tuttavia, studi che utilizzano linee di produttori lentivirali sono limitati, e quindi l'inclusione di saggi robusti 22 per rilevare la replicazione lentivirus competente sarà fondamentale nello sviluppo di qualsiasi linea cellulare per l'uso clinico.
Altri gruppi hanno pubblicato descrizioni per lentivirus produttrici di linee cellulari stabili 6-11,23. Tuttavia, un limite comune di questi rapporti è che molti di loro si basano sulla trasduzione delle cellule produttrici con vettori lentivirali codificanti per il gene di interesse, che possono ridurre la loro sicurezza per l'uso clinico. Qui, utilizziamo il metodo di trasfezione concatemeric schiera 11 di trasdurre cellule che possono produrre lentivirus auto-inattivanti. Inoltre, il nostro uso del sistema tet off migliora l'idoneità del metodo per l'uso clinico. Questo sistema normativo impedisce tossicità da SVGmu durante la manutenzione di coltura cellulare e consente la raccolta di vettori lentivirali sotto antibioticocondizioni ic-liberi.
Nel corso del procedimento, è importante che i lavoratori di laboratorio usare le opportune precauzioni quando si maneggiano i vettori lentivirali. Vettori lentivirali sono derivati da HIV-1, un agente patogeno umano, e di tutte le procedure devono essere eseguite sotto la guida di un comitato di istituto biosicurezza. Secondo il NIH, BL2 contenimento è in genere appropriato per lavorare con sistemi lentivirali avanzati come quello descritto qui, anche se migliorata BL2 contenimento può essere indicato se gli esperimenti vengono scalati per la pratica clinica 24.
Ci sono diversi passaggi critici della procedura che necessitano di cure particolari. In primo luogo, la coltura cellulare deve essere eseguita con grande attenzione ai dettagli. Abbiamo scoperto che titoli di virus diminuiscono notevolmente se le cellule di produttori che non sono diversi passaggi ogni 24 ore. Allo stesso modo, alcuni lotti di FBS può portare a significativi cali della produzione di virus, quindi è importante per testare più un sacco di FBS befminerale di scaling up di un esperimento. La selezione di un clone che può produrre viremia elevata è essenziale per applicazioni a valle. In accordo con il precedente lavoro 25, abbiamo trovato che i cloni che sembrano dividere più velocemente tendono a produrre più virus. Una volta che un clone alto titolo è stato trovato, queste cellule devono essere aliquotati e congelati in FBS + 10% DMSO appena possibile. Quindi, utilizzando aliquote appena scongelati aiuta generare il massimo titolo possibile. Seguendo questa regola, abbiamo avuto la maggior produzione di virus attraverso transfezioni transitori successo, e ci aspettiamo che simili manutenzione linea cellulare trarrà beneficio le cellule che producono virus stabili.
Limitazione principale di questo metodo è che richiede una notevole quantità di sforzo fino anteriore per generare una linea di produzione stabile. Così, non è probabile che sia adatta nel caso saranno provati diversi tipi di vettori lentivirali. Transfezioni transitorie possono essere più conveniente per thestipi di applicazioni elettroniche. In genere prevediamo di utilizzare questo metodo per generare grandi quantità di vettore virale dopo il vettore è già stato testato in un piccolo formato. Un'altra limitazione della nostra linea cellulare specifica prevede che vettori prodotti dalle cellule GPRS saranno solo specifico per le cellule esprimenti DC-SIGN perché la proteina dell'involucro, SVGmu, si lega a questo recettore. A bersaglio altri recettori cellulari, la procedura può essere modificata introducendo altri plasmidi glicoproteici nella linea cellulare GPR originale. Allo stesso modo, altri geni di interesse possono essere trasfettati in linee cellulari di produttori in modo che vettori lentivirali in grado di fornire le proteine più importanti di GFP.
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Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare Michael Chou, Bingbing Dai, e Liang Xiao per contribuire dati per questo manoscritto. Riconosciamo anche il Dr. John Gray per i doni generosi di reagenti utilizzati in questo studio. PB è sostenuto da una borsa di studio post-dottorato dal National Cancer Center. Questa ricerca è stata sostenuta da sovvenzioni dal National Institute of Health (R01AI68978, P01CA132681 e RCA170820A), una borsa di studio dalla Fondazione Bill e Melinda Gates Foundation, una borsa di accelerazione traslazionale dal Centro comune di Medicina Traslazionale e di una sovvenzione da parte del California HIV / AIDS programma di ricerca.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Mediatech Inc. | 10-013-CV | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Glutamine | Mediatech Inc. | 25-005-Cl | |
| Doxycycline | Clontech Laboratories, Inc. | 631311 | |
| Zeocin | Invitrogen | R250-01 | Toxic |
| Puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 | |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69506 |
References
- Naldini, L., et al. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272, 263-267 (1996).
- Kootstra, N. A., Verma, I. M. Gene therapy with viral vectors. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 43, 413-439 (2003).
- Montini, E., et al. Hematopoietic stem cell gene transfer in a tumor-prone mouse model uncovers low genotoxicity of lentiviral vector integration. Nat. Biotechnol. 24, 687-696 (2006).
- Montini, E., et al. The genotoxic potential of retroviral vectors is strongly modulated by vector design and integration site selection in a mouse model of HSC gene therapy. J. Clin. Invest. 119, 964-975 (1172).
- Hu, B., Tai, A., Wang, P. Immunization delivered by lentiviral vectors for cancer and infectious diseases. Immunological Reviews. 239, 45-61 (2011).
- Broussau, S., et al. Inducible packaging cells for large-scale production of lentiviral vectors in serum-free suspension culture. Molecular Therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy. 16, 500-507 (2008).
- Cockrell, A. S., Ma, H., Fu, K., McCown, T. J., Kafri, T. A trans-lentiviral packaging cell line for high-titer conditional self-inactivating HIV-1 vectors. Molecular Therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy. 14, 276-284 (2006).
- Ikeda, Y., et al. Continuous high-titer HIV-1 vector production. Nature Biotechnology. 21, 569-572 (2003).
- Kafri, T., van Praag, H., Ouyang, L., Gage, F. H., Verma, I. M. A packaging cell line for lentivirus vectors. Journal of Virology. 73, 576-584 (1999).
- Strang, B. L., et al. Human immunodeficiency virus type 1 vectors with alphavirus envelope glycoproteins produced from stable packaging cells. Journal of Virology. 79, 1765-1771 (2005).
- Throm, R. E., et al. Efficient construction of producer cell lines for a SIN lentiviral vector for SCID-X1 gene therapy by concatemeric array transfection. Blood. 113, 5104-5110 (2009).
- Lee, C. L., Chou, M., Dai, B., Xiao, L., Wang, P. Construction of stable producer cells to make high-titer lentiviral vectors for dendritic cell-based vaccination. Biotechnol. Bioeng. 109, 1551-1560 (2012).
- Steinman, R. M., Banchereau, J. Taking dendritic cells into medicine. Nature. 449, 419-426 (2007).
- Yang, L., et al. Engineered lentivector targeting of dendritic cells for in vivo immunization. Nature Biotechnology. 26, 326-334 (2008).
- Hanawa, H., et al. Efficient gene transfer into rhesus repopulating hematopoietic stem cells using a simian immunodeficiency virus-based lentiviral vector system. Blood. 103, 4062-4069 (2004).
- Yang, L., Baltimore, D. Long-term in vivo provision of antigen-specific T cell immunity by programming hematopoietic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 4518-4523 (2005).
- Dai, B., et al. HIV-1 Gag-specific immunity induced by a lentivector-based vaccine directed to dendritic cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 20382-20387 (2009).
- Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system. J. Vis. Exp. (63), e4031 (2012).
- Kochan, G., Escors, D., Stephenson, H., Breckpot, K.
- Loew, R., et al. A new PG13-based packaging cell line for stable production of clinical-grade self-inactivating gamma-retroviral vectors using targeted integration. Gene Ther. 17, 272-280 (2010).
- Gaspar, H. B., et al. Gene therapy of X-linked severe combined immunodeficiency by use of a pseudotyped gammaretroviral vector. Lancet. 364, 2181-2187 (2004).
- Cornetta, K., et al. Replication-competent lentivirus analysis of clinical grade vector products. Molecular Therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy. 19, 557-566 (2011).
- Stewart, H. J., et al. A stable producer cell line for the manufacture of a lentiviral vector for gene therapy of Parkinson's disease. Human Gene Therapy. 22, 357-369 (2011).
- Biosafety Considerations for Research with Lentiviral Vectors [Internet]. , National Institute of Health Recombinant DNA Advisory Committee. Available from: http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidance/LentiVirus_Containment/pdf/Lenti_Containment_Guidance.pdf (2006).
- Coroadinha, A. S., et al. Retrovirus producer cell line metabolism: implications on viral productivity. Appl. Microbiol. Biotechnol. 72, 1125-1135 (2006).
