Summary
Biocompatíveis pH responsivos nanosensors sol-gel pode ser incorporado em poli (ácido láctico-co-glicólico) (PLGA) andaimes electrospun. Os andaimes de auto-relato produzidos podem ser utilizados para a monitorização in situ de condições micro-ambientais, enquanto a cultura de células sobre o andaime. Isto é benéfico porque a construção celular 3D pode ser monitorado em tempo real, sem perturbar o experimento.
Abstract
Células de cultivo em 3D no andaimes apropriados é pensado para melhor imitar o vivo microambiente e aumentar as interações célula-célula. A construção celular 3D, resultando muitas vezes pode ser mais relevante para estudar os eventos moleculares e interações célula-célula que experimentos semelhantes estudados em 2D. Para criar culturas 3D eficazes com alta viabilidade celular ao longo do andaime as condições de cultura, tais como o oxigénio e necessidade de pH deve ser cuidadosamente controlada de gradientes de concentração do analito pode existir em todo o construto 3D. Descrevemos aqui os métodos de preparação de pH responsivos nanosensors sol-gel biocompatíveis e a sua incorporação em poli (ácido láctico-co-glicólico) (PLGA) andaimes electrospun juntamente com a sua preparação posterior para a cultura de células de mamíferos. Os andaimes de pH reagir podem ser utilizados como ferramentas para determinar microambiental pH dentro de uma construção celular 3D. Além disso, detalhamos a entrega de pH nanose responsivonsors para o ambiente intracelular de células de mamíferos, cujo crescimento foi suportado por suportes de PLGA electrospun. A localização citoplasmática do pH nanosensors responsivo pode ser utilizado para monitorar o pH intracelular (pHi) durante a experimentação contínua.
Introduction
Uma estratégia chave na engenharia de tecidos é o uso de materiais biocompatíveis para o fabrico de andaimes, cuja morfologia se assemelha ao tecido que vai substituir e também é capaz de suportar o crescimento e função das células de 1,2. O andaime proporciona suporte mecânico permitindo adesão e proliferação de células ainda permite a migração de células ao longo dos interstícios de uma construção celular 3D. O andaime também deve permitir o transporte de massa de nutrientes celulares e não inibir a remoção de resíduos metabólicos 3.
Eletrofiação emergiu como um método promissor para a fabricação de suportes poliméricos capazes de suportar o crescimento celular 4-6. As fibras não tecidas electrospun produzidos são adequados para o crescimento celular, como eles são muitas vezes poroso e permitir a interacção célula-célula, assim como a migração de células ao longo dos interstícios de uma construção celular 3D 7. É importante monitorar a viabilidade celular durante tele período de cultura e para assegurar que a viabilidade celular é mantido ao longo de todo o construto 3D. Por exemplo, as condições de cultura, tais como o oxigénio e requerem um controlo cuidadoso do pH, como os gradientes de concentração do analito pode existir dentro da construção 3D. Ou sistemas de biorreactores de perfusão podem ser empregues para mimetizar as condições in vivo de fluxo intersticial e, como um resultado de transferência de aumento de nutrientes e remoção de resíduos metabólicos 8. A questão de saber se tais sistemas estão garantindo condições do microambiente constantes podem ser abordadas por meio da avaliação do microambiente celular em tempo real.
Microambiente métricas-chave que poderiam ser monitorados em tempo real incluem: temperatura, composição química dos meios de comunicação de células, a concentração de oxigênio dissolvido e dióxido de carbono, pH e umidade. Dessas métricas, a temperatura pode ser mais facilmente controlada por meio de sondas in situ. Os métodos para monitorar os restantes métricas listadas comumente emvolve a remoção de uma aliquota para a amostragem e, por conseguinte, perturbar a cultura de células e aumentam o risco de contaminação. , Métodos contínua em tempo real estão sendo procurados. Métodos de monitoramento atuais geralmente dependem de instrumentos que verificam fisicamente a construção celular, como um monitor ou sonda pH oxigênio. No entanto, estes métodos invasivos podem danificar a construção celular e perturbar a experiência em curso. Monitoramento não invasivo de concentrações de analito dentro da construção 3D poderia permitir o monitoramento em tempo real de vários aspectos ambientais, tais como esgotamento de nutrientes 9. Isso permitiria que a avaliação de fornecimento de nutrientes para as regiões mais profundas na estrutura e determinar se os resíduos metabólicos estava sendo removido de forma eficaz 10,11. Os sistemas que tentam resolver o problema da capacidade de invasão envolvem geralmente a utilização de uma câmara de perfusão que passa através do meio de cultura, tanto o vaso de cultura e para sensores externos, para monitorar o pH, o oxigénio e glicose, 12. ORe é um interesse crescente no desenvolvimento de sensores que podem ser directamente integrados no vaso de cultura, que não exigem a remoção de uma aliquota para a amostragem e, como tal, poderia prever na monitorização in situ.
Para lidar com essas deficiências para in situ e monitoramento não invasivo das condições do microambiente que incorporaram analitos nanosensors responsivos em andaimes electrospun para produzir auto-relato andaimes 13. Os andaimes que actuam como dispositivos de detecção por monitorização da actividade de fluorescência foram preparados anteriormente, em que o dispositivo de detecção era ou o andaime polimérico real criado por electrospinning, ou através do uso de um corante sensível analito que é incorporada no polímero antes da formação do andaime 14,15 . No entanto, estes dispositivos sensores têm o potencial para se obter saídas ópticas erróneos causados pela possível interferência de outros analitos. O uso de um dispositivo de detecção de medida proporcional such como os que são preparados no protocolo descrito tem o potencial de eliminar estes efeitos adversos possíveis e fornecer uma resposta específica para o analito em questão.
Os andaimes electrospun aqui apresentados foram preparados a partir da poli-co-polímero sintético (ácido láctico-co-glicólico) (PLGA), escolhido devido a ter a Food and Drug Administration aprovação (FDA), devido às suas propriedades biodegradáveis e biocompatíveis e uma faixa ficha de suporte do crescimento e função de vários tipos de células 16-18. Os analitos raciométrica nanosensors responsivos preparados são sensíveis ao pH. Os nanosensors incorporar dois corantes fluorescentes numa matriz de sol-gel biocompatível, onde um corante, FAM é sensível ao pH e o outro, TAMRA actua como um padrão interno, uma vez que não é sensível ao pH. Além disso, a fluorescência de ambos FAM e TAMRA podem ser analisados separadamente uma vez que não se sobrepõem. A determinação da relação da emi fluorescênciassion de ambos os corantes em comprimentos de onda específicos dá uma resposta independente do pH de outras condições ambientais. Os andaimes de auto-relato pode permitir a avaliação da repetição do pH in situ e em tempo real, sem perturbar o modelo 3D desenvolvido. Demonstrou-se que estes suportes são capazes de suportar fixação e proliferação celular e permanecer sensível ao analito em questão. A cinética de ácido subprodutos em construções projetadas permanece pouco estudado e, como tal, utilizando o pH andaimes responsivos poderia facilitar muito os estudos 19. Além disso, o uso dos andaimes de auto-relato para aplicações em engenharia de tecidos apresenta a oportunidade de compreender, monitorar e otimizar o crescimento do modelo 3D construções de tecidos in vitro, de forma não invasiva e em tempo real.
Os pH nanosensors responsivos também foram entregues para o meio intracelular de fibroblastos cultivados sobre electrospun scaffol PLGAds. A proporção da emissão de fluorescência a partir dos corantes foram utilizados para monitorizar o pHi e comparado com um auto-relato de andaime integrem nanosensors pH. A entrega de nanosensores para as células cultivadas em um ambiente 3D poderia permitir o monitoramento da concentração de analito de profundidade dentro da construção de uma forma não destrutiva. Portanto nanosensors pode ser uma ferramenta de imagem viável para avaliar o comportamento das células de modo não destrutivo ao longo 3D constrói permitindo a análise de longo prazo. Rastreio a concentração do analito de células individuais dentro de uma construção em 3D poderia garantir que eles estão recebendo as concentrações de nutrientes e oxigênio suficientes. Parâmetros do processo de acompanhamento pode ajudar no desenvolvimento de técnicas padronizadas para o transporte de massa eficiente de oxigênio e nutrientes. A entrega de nanosensores para o meio intracelular e incorporação de nano-sensores em scaffolds poliméricos podem ser combinadas para permitir a avaliação da viabilidade das células, bem como o desempenho de andaime dentro de const 3Dructs durante o processo de crescimento do tecido. Isso pode levar a um maior conhecimento dessas construções e progredir a fabricação de substitutos de tecido biologicamente relevantes.
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Protocol
Visão global
Secção 1 descreve a preparação de pH nanosensors reactivos e caracterização da resposta nanosensor para pH usando espectrometria de fluorescência e o seu tamanho usando SEM.
Seção 2 descreve a preparação de suportes poliméricos electrospun e caracterização da sua morfologia e tamanho utilizando SEM. Seção 2 também descreve a preparação de andaimes de auto-relato que são andaimes electrospun com a inclusão dos pH nanosensors responsivos. Os andaimes resultantes de auto-relato são caracterizados por MEV para avaliar se as alterações morfológicas nas fibras electrospun ocorreu. A fluorescência a partir dos suportes de auto-relato resultantes das nanosensors incorporadas é avaliada por microscopia confocal.
A seção 3 descreve a cultura de células em cima do andaime eo andaime electrospun auto-relato. Os andaimes são esterilizados em primeiro preparatíon para cultura celular após o que os andaimes são avaliados para determinar se a esterilização ea cultura de células afetam a capacidade de fluorescência dos andaimes de auto-relato. O protocolo também descreve a entrega de nanosensors de células que são cultivadas sobre andaimes electrospun. Corante Lysotracker é usado para garantir que nanosensors não foram tidas em compartimentos celulares ácidas.
1. Elaboração e análise de pH Responsive Nanosensors sol-gel
1.1 Preparação de pH Responsive Nanosensors sol-gel
Nota: A preparação deve ser realizada numa hote.
- Preparar os fluoróforos para utilização nas nanosensors pH por dissolução de 5 - (e-6)-carboxifluoresceína, éster de succinimidilo (FAM-SE) (1.5 mg) em dimetilformamida (DMF) (1 ml) em um balão de fundo redondo e 6-carboxitetrametilrodamina fundo , éster de succinimidilo (TAMRA-SE) (1,5 mg) em DMF (1 ml) num outro balão de fundo redondo.Adicionar 3-aminopropiltrietoxisilano (APTES) (1,5 ml) a cada balão e agita-se sob uma atmosfera de azoto seco (21 ° C) durante 24 horas no escuro, ou seja, moldar as amostras em alumínio.
- Adicionar tanto dos corantes acima (250 uL) a uma mistura de etanol (6 ml) e hidróxido de amónio (30% em peso, 4 ml), contida num balão de fundo redondo e agitou-se durante 1 hora (21 ° C).
- Lentamente, adicionar tetraetilortossilicato (TEOS) (0,5 ml) à mistura, a continuar com agitação durante mais 2 horas. A mistura vai ficar turva. Os nano-sensores podem ser recolhidos por evaporação rotativa. Nano pode ser armazenado num frasco de vidro a 4 ° C para uso futuro.
CUIDADO: subsequente manuseamento da nanosensors na sua forma seca, devem ser realizados em um exaustor ou no caso de pesagem lhes o equilíbrio deve ser colocado, por exemplo, em um Weighsafe.
1.2 nanosensor Resposta ao pH
- Preparar soluções de tampão fosfato de Sorensen que variam de 5,5-8,0 pH por mixing proporções específicas de fosfato monobásico de sódio (0,2 M) e fosfato de sódio dibásico soluções stock (0,2 M). Verifique o pH final usando um medidor de pH. Faça os ajustes menores ao pH utilizando hidróxido de sódio (NaOH) (4 M) ou ácido clorídrico (HCl) (2 M).
- Suspender as nanosensors pH nas soluções tampão de pH (5 mg / ml), em primeiro lugar, segurando o recipiente contendo a solução nanosensor num vortex durante 3 minutos e depois da submersão do recipiente num ultrasonicator até a solução se tornar turva (aproximadamente 5 min). Repita essas etapas para suspender totalmente as nanosensors em solução.
- Colocar a primeira solução a uma cuvete óptico e utilizar comprimentos de onda de excitação de 488 nm para a 5 - (e-6)-carboxifluoresceína (FAM) e 568 nm para a 6-carboxitetrametilrodamina (TAMRA). Recolha os comprimentos de onda de emissão de 500-530 nm para FAM e 558-580 nm para TAMRA usando um espectrômetro de fluorescência.
- Mudar as soluções na cuvete óptico de modo a que o pH pode ser observada em diferentes pH e continuar collecting os espectros de emissão.
- Calcula-se a relação entre o máximo de emissão produzido em cada valor de pH para produzir uma curva de calibração.
1.3 SEM de Nanosensors
- Coloque uma amostra dos nano-sensores em um revestimento de carbono microscópio eletrônico de stub e arranhar o revestimento com ouro por 5 min em atmosfera de árgon.
- Observar por microscopia eletrônica de varredura (MEV). Durante o exame ajustar a distância de trabalho, tensão e ampliação para minimizar o carregamento de elétrons (Figura 1).
2. Elaboração e Análise de PLGA Andaimes
2.1 Electrospinning PLGA Andaimes
- Numa hotte dissolver o poli (ácido láctico-co-glicólico) (PLGA), em diclorometano (DCM) (20% (w / w)) com formato de piridínio (PF) (1% (w / w)). Coloque a solução numa seringa de 10 ml com uma agulha 18 G romba de enchimento e de forma segura para o ajuste de uma bomba de seringa.
- Distância da ponta da agulha 20 centímetros de distância de uma 20cm x 15 cm de alumínio placa de coleta.
- Conecte o eletrodo de uma fonte de alimentação de alta tensão para a ponta da seringa e da terra para a placa de coleta de alumínio.
CUIDADO: Cuidados devem ser tomados como de alta tensão é usado ou seja sempre recorrer a alimentação elétrica antes de manusear qualquer equipamento electrospinning. - Entregar a solução com um caudal constante de 3,5 m / h a 12 kV durante 2 horas. Electrospinning usando estas condições darão uma profundidade de andaime de cerca de 60 um.
- Deixar o andaime numa hote durante 24 horas para permitir resíduo solvente a evaporar.
2.2 Electrospinning pH Responsive PLGA Andaimes
- Prepare andaimes incorporando pH nanosensors sensíveis como descrito na seção 2.1, mas com a modificação de adicionar nanosensors para a solução de polímero (5 mg / ml). Suspender as nanosensors na solução de PLGA com o auxílio de ultra-sons (cerca de 5 min) antes para colocação numa seringa de 10 mL.
2.3 SEM de PLGA Andaime e pH Scaffold Responsive
- Coloque uma amostra do andaime PLGA ou pH andaime responsivo em um elétron revestido microscópio esboço de carbono e proceder conforme descrito para MEV de nano-sensores (Figura 1).
2.4 Calibração de pH Scaffold Responsive
- Coloque uma amostra de pH andaime sensível em uma placa de cultura de 35 mm, e mergulhar em soluções tampão adequadas.
- Em um microscópio confocal de utilizar um laser de árgon de 488 nm para excitar o FAM e um laser de crípton 568 nm para excitar o TAMRA dentro dos nano-sensores. Observe a emissão de fluorescência para pH andaimes responsivos a 500-530 nm para FAM e 558-580 nm para TAMRA. (Figura 2). Use varredura sequencial para evitar cobrança de comprimentos de onda de excitação.
3. Cultura celular em cima de PLGA Andaimes e pH Responsive PLGA Andaimes
ntent "> Nota: O seguinte deve ser realizada em um gabinete de cultura de células.3.1 Preparação de PLGA Andaimes para Cultura de Células
- Corte as PLGA ou pH sensíveis andaimes PLGA em dois centímetros 2 peças.
- Esterilizar andaimes por irradiação com luz ultravioleta (UV), a uma distância de 8 cm durante 15 minutos de cada lado.
- Transferir os andaimes para uma placa de cultura de 12 poços e colocar um anel de aço na parte superior. Adicionar uma solução de penicilina / estreptomicina (5% v / v) em tampão fosfato salino (PBS) para o interior e exterior do anel de aço, incubar durante a noite (37 ° C, 5% CO 2). Observe o anel de aço foi fabricado na Universidade de Nottingham e tem as seguintes dimensões: diâmetro externo 2 cm, diâmetro interno 1 centímetro, 1 cm de profundidade.
- Remover a solução de esterilização e lavou-se com PBS.
- Adicionar meio de cultura de células para o interior (500 ul) e exterior (500 ul) do anel de aço, em lugar de uma incubadora (37 ° C, 5% de CO 2
- Prepara-se uma suspensão de células e efectuar uma contagem de células utilizando um ensaio de exclusão com Trypan Blue.
- Criar uma suspensão de células para obter um número de células de 1 x 10 6 células / ml.
- Remova a mídia de dentro e de fora do anel de aço.
- Substituir com meio de cultura de células pré-aquecido na parte externa do anel de aço (1 m).
- Adicionar 300 ul da suspensão de células para o interior do anel de aço - placa de rocha para trás e para a frente suavemente para distribuir células.
- Coloque a placa de cultura de células em uma incubadora (37 ° C, 5% CO 2) - a fixação das células deveria ter ocorrido no prazo de 24 horas, no entanto continuar a cultura durante o tempo que o experimento exige - refrescante a mídia a cada 2-3 dias.
3.2 nanosensor entrega para as células cultivadas sobre PLGA Scaffold
- Células semente em PLGA andaime, conforme descrito na seção 3.1. Para este estudo um PLGA andaime em branco (não containanosensors ning) foi usado devido à sobreposição de emissão de fluorescência quando Imaging.
- Colocar o andaime semeado célula em uma incubadora (37 ° C, 5% CO 2) durante 72 horas para permitir que as células crescem e migram ao longo do andaime antes nanosensor entrega.
- Antes nanosensor entrega (37 ° C, 5% CO 2) lavar as células com PBS e alterar o suporte a partir de meios de cultura padrão para meios livres de soro e antibióticos, incubar durante 1 hora. Nota: os meios de cultura padrão para células 3T3 compreende de meio de Eagle modificado por Dulbecco suplementado com soro fetal de vitelo, a solução de ((v / v) a 10%), L-glutamina (2 mM), penicilina / estreptomicina (1% (v / v)) .
- Durante o período de incubação de preparar o complexo de lipossoma-nanosensor por sonicação breve nanosensors (5 mg) com Optimem (50 uL) para criar a solução A.
- Criar solução B por adição de Lipofectamine 2000 (5 ul) para Optimem (45 ul), incubar à temperatura ambiente durante 5 min.
- Adicionar soluçãoA à solução B, incubar à temperatura ambiente durante 20 minutos para formar a solução C, que é o complexo nanosensor-lipossoma.
- Adicionar a solução C (100 ul) a células e incuba-se (37 ° C, 5% CO 2) durante 3 horas.
- Remover os andaimes semeados células da incubadora, os meios aspirados e lavar duas vezes com PBS antes da adição de PBS (1 ml) para permitir a visualização de células vivas por microscopia confocal. Nota: O PBS foi utilizado neste protocolo de modo a que o indicador de vermelho de fenol presente em meios de cultura de células não causar autofluorescência e também porque a calibração em diferentes pH estava a ser executada. No entanto meio isento de vermelho de fenol pode ser utilizado para a análise de mais longo prazo de culturas de células.
- Mergulha-se o andaime semeado célula em tampões de pH diferente e monitorizar a resposta das nanosensors associados com as células.
- Monitorizar o pHi por determinação da relação entre as intensidades de fluorescência de FAM e TAMRA pela observação de fluorescência usando microscopia confocal (Figure 3).
3.3 nanosensor Localização dentro de células de mamíferos
- Incubar as células com nanosensors contendo apenas o corante FAM como descrito na secção 3.2 (isto é, porque a emissão de fluorescência de TAMRA é na mesma região espectral como a Lyso Tracker vermelho). Preparar estas nanosensors como descrito na seção 1.1, mas com a omissão de preparar e adicionando TAMRA.
- Após o período de entrega nanosensor diluir solução estoque Lyso Tracker Vermelho para 50 nm.
- Adicionar uma parte alíquota da solução diluída (2 mL) para células cultivadas sobre suportes de PLGA.
- Incubar as células com Lyso Tracker vermelha durante 1 hora (37 ° C, 5% CO 2).
- Após o período de incubação de remoção dos suportes e lavar as células duas vezes com PBS (pH 7,4) antes de mudar os meios de PBS (pH 7,4) (2 ml), em preparação para a visualização por microscopia confocal. Nota: Fenol meio isento de vermelho pode ser usado em vez de PBS.
- Adicione o corante nuclear DraQ5 para o PBS até a concentração final ser 5 mM e incuba-se com as células durante 3 minutos (37 ° C, 5% CO 2). Não é necessário mudar os meios de comunicação a seguir ao período de incubação com DRAQ5.
- Use um laser de 488 nm argônio para excitar o FAM só nanosensors, um laser de criptônio 568 nm para excitar o Lyso Tracker Red e 633 nm do laser de hélio / néon para excitar o cromóforo DRAQ5 e observar fluorescência em 500-530 nm, 580-600 nm, 650 -750 nm, respectivamente (Figura 3). Use varredura sequencial para evitar cobrança de comprimentos de onda de excitação.
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Representative Results
A distribuição do tamanho das pH nanosensors responsivos preparadas foi caracterizado utilizando SEM, onde a população de nanosensors fotografados foram medidos e verificou-se ter dimensões nanométricas na gama de 240-470 nm (Figura 1A). A realização de um diâmetro estreito e razoavelmente pequeno é consistente com o uso do método de Stöber para preparar nanopartículas. Verificou-se que utilizando um ambiente de pH básico durante a síntese de nanopartículas ou seja nanopartículas preparadas utilizando o método Stöber, permite um bom controlo do tamanho, ao passo que a preparação, utilizando condições ácidas produz uma grande dispersão de tamanho de partícula. Micrografias SEM representativos das fibras electrospun PLGA fabricadas usando os métodos descritos são mostrados na Figura 1B, demonstrando que o PLGA andaime produzido consiste de fibras não urdidas que exibem perolização mínima ou ruptura onde as fibras têm dimensões nanométricas. Figura 1C Figura 1B, As micrografias fornecem evidência de associação nanosensor na superfície das fibras no entanto elas poderão também ser incorporada no interior das fibras de andaime, estudos de degradação destes andaimes andaime / nanosensor poderia ser levada a cabo em conjunto com o SEM e / ou microscopia confocal para determinar se esta afecta o desempenho nanosensor.
A capacidade dos nanosensors para manter sua atividade óptica após a incorporação das fibras de PLGA foi verificada através da análise dos andaimes auto-relato por microscopia confocal. Retenção da capacidade de permanecerem opticamente e quimicamente activa quando incorporado nas fibras de andaime pode permitir que as concentrações de analito a ser monitorizado. A fluorescência emitida a partir dos nano-sensores demonstrado que os nanosensors retained sua actividade óptica e estão associadas com as fibras de andaime. A fluorescência emitida por corantes FAM (verde) e TAMRA (vermelho) incorporado nas nano-sensores que respondem de pH é mostrado nas Figuras 2A e 2B, respectivamente. Isto é um resultado positivo que faz com que seja possível para as concentrações de analito a ser monitorizada in situ. Também é a primeira vez que nanosensors raciométrica opticamente activos têm sido incorporados em fibras de andaime PLGA utilizando o processo de electrospinning. Depois de confirmar que os nanosensors pode ser visualizado utilizando microscopia de fluorescência, seguindo a incorporação de fibras de PLGA, foi verificada a resposta nanosensor a alterações na concentração do analito. Imergindo o andaime em tampões de pH diferentes resultou numa alteração da intensidade de fluorescência do corante FAM enquanto a fluorescência emitida pelo corante TAMRA referência não alterar visivelmente. A proporção da intensidade de fluorescência dos dois corantes podem ser usados para produce uma curva de calibração tal como mostrado na Figura 2C. A curva de calibração para nanosensors avaliado sozinho e quando incorporado electrospun PLGA andaime é comparável e demonstra que os nano-sensores mantêm a sua atividade óptica seguinte incorporação nos andaimes de auto-relato. A capacidade de o andaime de auto-relato de responder de forma reversível a diferentes valores de pH foi avaliada por imersão alternadamente o andaime em tampões com valores de pH 5,5 e 7,5. A reversibilidade foi considerada muito boa, como mostrado na Figura 2D, onde a escora de auto-relato pode responder a várias alterações cíclicas no pH. Estudos de longo prazo não foram realizados para avaliar o efeito da degradação do PLGA mediante a incorporação nanosensor; pensa-se que, como os nanosensors dar uma resposta raciométrica a quantidade de nano-sensores presentes não afetará o resultado.
Analitos nanosensors responsivos foram entregues usando uma Liposomai agente de transfecção para o ambiente intracelular de células 3T3 cujo crescimento foi suportado por suportes de PLGA em branco. As imagens de microscopia confocal de células 3T3 cultivadas em cima branco andaimes PLGA demonstrar que nanosensors estão associados com as células de fibroblastos com a fluorescência observada a partir de FAM e TAMRA mostrado nas Figuras 3A e B, respectivamente. A sobreposição da fluorescência a partir destes canais mostra que a fluorescência dos dois corantes é co-localizado, o que sugere que os corantes tenham permanecido aprisionado dentro da matriz biocompatível dos nanosensors (como representado por fluorescência amarela na Figura 3C). Os nano-sensores são considerados como estando dentro do citoplasma dos fibroblastos 3T3 e não contidas no interior dos compartimentos acídicos como evidenciado pela falta de fluorescência de co-localizado da FAM apenas nanosensors e Lyso Tracker corante vermelho ilustrado na figura 3D. A intensidade de fluorescência de pH nanosensors responsivos entregared para fibroblastos 3T3 foi monitorado enquanto as células foram sujeitas a mudanças no pH, cujos resultados são mostrados na Figura 3E. O gráfico produzido demonstra que as células cultivadas sobre o electrospun PLGA andaime têm mantido um pHi na faixa de 6,8-7,0.
Figura 1. Micrografias de nano-sensores, fibras de PLGA e andaimes de auto-relato. (A) nanosensors sol-gel de resposta de pH mostrando partículas de tamanho nanométrico esférica (B) PLGA electrospun fibras não tecidos onde morfologia da fibra é regular com beading mínima e quebras (C) pH andaimes auto-relato de resposta onde as nano-sensores podem ser observados a ser salientes a morfologia ainda fibra PLGA permanece comparável com controle de fibras de PLGA que não contêm nanosensors. Clique aqui para ver a imagem ampliada .
Figura 2. Imagens de microscopia confocal de pH andaimes auto-relato de resposta onde fluorescência podem ser observados a partir dos nanosensors associados com as fibras andaime PLGA. (A) FAM (verde) do corante sensível pH e (B) TAMRA (vermelho) o corante de referência. (C) os gráficos de calibração de pH sensíveis nanosensors sol-gel e pH andaimes responsivos demonsttaxa que a resposta óptica e química dos nanosensors não foi afetado quando incorporado dentro das fibras andaime PLGA. (D) Reversibilidade do andaime auto-relato realizado por imersão do andaime em soluções tampão alternativas de pH 5,5 e pH 7,5. Clique aqui para ver a imagem ampliada .
Figura 3. Imagens de microscopia confocal de células nanosensors internalizadas e gráficos de pH e resposta pHi. Fluorescência da nanosensors internalizadas (A) FAM (verde) (B) TAMRA (vermelho) (C) co-localização de fluorescência FAM e TAMRA (amarelo) ( D) FAM só nanosensors (verde) entregue à células 3T3 culturad em cima de PLGA andaime com DRAQ5 (magenta) marcação do núcleo e Lyso Tracker Red (vermelho) rotulagem dos lisossomos. A fluorescência de FAM e Lyso Tracker vermelho não são co-localizado, portanto, demonstrar que é improvável que nanosensors foram internalizados em compartimentos celulares medições ácidos (E) feita de pHi nanosensors entregues a células 3T3 cultivadas sobre um andaime de PLGA em branco, em comparação com a calibração de pH de um andaime de detecção do pH, sem a cultura de células. Isso também demonstra que as medições de pH realizadas utilizando os nanosensors internalizadas não são ácidas como as células cultivadas sobre o electrospun PLGA andaime têm mantido um pHi na faixa de 6,8-7,0. Clique aqui para ver a imagem ampliada .
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Discussion
A engenharia de tecidos aspira para criar substitutos biológicos que podem ser utilizados tanto in vivo como in vitro como em modelos de tecido e em terapia de substituição de tecido para substituição, reparação, manter ou melhorar a função de um tecido ou órgão específico. Substitutos sintéticos têm sido usados por muitos anos para substituir ou reparar ajuda de tecidos, mas estes muitas vezes não conseguem devido à falta de integração com o tecido e / ou infecção do hospedeiro, o que acaba por conduzir a rejeição ou a uma nova cirurgia de revisão. Gerando tecidos vivos em laboratório antes da implantação pode resolver o problema de alcançar a plena integração e reduzir a necessidade de cirurgia de revisão. No entanto, para que este objetivo seja realizado propagação apropriado in vitro e manipulação de células dentro das construções em 3D deve ser conjugada com o condicionamento físico adequado do tecido in vitro. Isto pode ser conseguido de várias maneiras, sendo um para continuar a investigação sobre a biologia fundamentalenvolvidos, mas também para a investigação das questões de engenharia e de manufatura relacionados à produção de substitutos sintéticos. É esta última questão que o protocolo descrito visa contribuir.
A utilização prevista para os suportes de PLGA descritos consiste em proporcionar um suporte temporário para células de mamíferos para ajudar o seu crescimento numa estrutura biologicamente relevante. Incorporação de analitos nanosensors responsivos para os andaimes de PLGA pode permitir que as concentrações de analito locais para ser monitorizada ao longo de um construto 3D durante o processo de crescimento do tecido. O uso de pH andaimes responsivos poderia permitir a determinação de se o ácido subprodutos produzidos como a degradação do andaime e células crescem estão a ser eficazmente removidos de dentro de uma construção de 3D. Este é um passo no sentido de resolver a actual falta de monitoramento e controle de processos de regeneração in vitro de tecidos processo. A utilização de andaimes que são eles mesmos dispositivos de detecção pode permitir emin situ, análise microambiental em tempo real. Acompanhamento do microambiente construção sem danificar o tecido é essencial e vai permitir o monitoramento do processo em todas as fases de produção de tecidos.
A capacidade de o pH andaime responsivo produzido para reportar a concentração do analito locais foi avaliada através da monitorização da produção de fluorescência a partir dos nano-sensores utilizando microscopia confocal. Uma experiência de calibração foi realizada para detecção de pH andaime e provou comparável à dos nano-sensores que respondem de pH não incorporados em fibras de PLGA. A capacidade para produzir uma curva de calibração demonstra que os nanosensors permanecem sensíveis às alterações no pH, quando incorporados no esqueleto do polímero e também que o processo de esterilização dos andaimes não causam quaisquer efeitos prejudiciais para a capacidade de detecção de nanosensors pH. Além disso, nano-sensores foram entregues para o meio intracelular das células cultivadas sobre andaimes PLGA where resposta celular a alterações no pHi pode ser monitorizada. A relação entre as intensidades de fluorescência de FAM e TAMRA foram utilizados para monitorizar o pHi e em comparação com um pH de andaime sensível, o que sugere que as células de fibroblastos 3T3 mantiveram um pHi na gama de pH 6,8-7. Incubar fibroblastos 3T3 transfectadas com nanosensors com o corante nuclear DRAQ5 indicou que a maioria dos nanosensors associados celulares não foram localizados na região nuclear. Localização nanosensor não parece estar dentro de compartimentos acídicos, tais como os endossomas ou lisossomas como determinado por incubação do nanosensor transfectadas 3T3 de fibroblastos com Lyso Tracker vermelho, em que a co-localização de FAM e Lyso Tracker vermelho seria representado por pixels em imagens confocais amarelo. Outros estudos, como a análise por microscopia eletrônica de transmissão (TEM) e identificação de marcadores biológicos para as vias de internalização poderia verificar isso melhor. Além disso, estudos de longo prazo, como a microscopia confocal resolvida no tempopoderia determinar o destino a longo prazo dos nano-sensores dentro das células cultivadas sobre andaimes de auto-relato. Se nanosensors eram para ser entregue a outros tipos de células, em seguida, a sua localização devem ser identificada como o resultado pode não ser o mesmo que é mostrado aqui.
A utilização de andaimes de auto-relato têm o potencial para monitorar de forma não invasiva condições do microambiente dentro da engenharia de tecidos construções. Ter a capacidade para realizar as medições in situ poderia permitir optimizar o crescimento das construções de tecido 3D in vitro de forma não invasiva e em tempo real. A localização citoplasmática do pH nanosensors responsivo pode ser utilizado para monitorar o pHi durante experimentação contínua. Os nanosensors entregues ao ambiente interno de células ou andaimes de auto-relato podem ambos ser utilizados em sistemas de cultura de tecidos estáticas ou dinâmicas e podem levar a determinação das condições de cultura necessárias para um crescimento óptimo da engenharia de tecidos em construçõesvitro. O desenvolvimento pode levar a um sistema on-line que agir de acordo com o esgotamento de nutrientes garantindo um fornecimento constante de nutrientes e oxigênio ao longo da construção, em última análise, dando um método altamente reprodutível para a cultura de construções de tecido.
Os protocolos descritos prepararam andaimes com as dimensões adequadas para permitir a imagiologia por microscopia confocal no entanto, para permitir maior 3D constrói a ser convertido em imagem multi-fotão de excitação pode ser exigido para permitir a imagiologia dentro construções mais profundas. O equipamento óptico utilizado, tais como a lente do microscópio deve ser seleccionada para determinar a distância de trabalho óptima para a lente e as dimensões do construto.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
O financiamento do BBSRC é gentilmente reconhecida (número de concessão BB H011293 / 1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol | Fisher | 32221 | |
| Anhydrous dimethylformamide (DMF) | Sigma | 270547 | |
| Ammonium hydroxide 50% (v/v) aqueous solution | Alfa Aesar | 35574 | diluted to 30% (v/v) with pure water |
| TEOS | Sigma | 13190-3 | |
| 3-Aminopropyltriethoxysilane (APTES) | Sigma | A3648 | |
| 5-(and-6)-carboxyfluorescein, succinimidyl ester (FAM-SE) | Invitrogen | C1311 | |
| 6-carboxytetramethylrhodamine, succinimidyl ester (TAMRA-SE) | Invitrogen | C1171 | |
| Sodium phosphate monobasic (0.2 M) | Sigma Aldrich | S-9638 | |
| Sodium phosphate dibasic (0.2 M) | Sigma Aldrich | S-0876 | |
| NaOH | Sigma Aldrich | S8045 | |
| Trypsin/EDTA | Sigma Aldrich | T4174 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma Aldrich | P0781 | |
| PBS | Sigma Aldrich | D8537 | |
| DMEM | Sigma Aldrich | D6046 | |
| FBS | Source Bioscience | Batch-213-101992 | |
| L-Glutamine | Sigma Aldrich | G7513 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| Optimem | Invitrogen | 11058-021 | |
| LysoTracker Red | Invitrogen | L-7528 | |
| Draq5 | Biostatus Ltd | DR50050 | |
| Nitrogen gas | BOC | ||
| DCM | Sigma Aldrich | 320269 | |
| TFA | Sigma Aldrich | T6508 | |
| Confocal microscope | Leica TCS-SP | equipped with argon and krypton lasers and a 63X 0.9NA water immersion lens | |
| UV light | UVLS28 UVP, USA | ||
| Stirrer plate | SB161-3 Jencons-PLS | ||
| pH meter | Jenway model 3510 | ||
| Rotary Evaporator | Buchi Rotary Evaporator R200 | ||
| Centrifuge (nanosensors) | Hermle Z300 | ||
| Centrifuge (cell culture) | Thermo Scientific Heraeus Biofuge Primo | ||
| Vortex | Whirlimixer Fisherbrand | ||
| Ultrasonicator | FB11021 Fisherbrand | ||
| Aluminum sheet | Nottingham University | ||
| 35mm cell culture plate | Iwaki | 3000035 | |
| 10 ml syringe | Becton Dickenson | ||
| 3T3 Fibroblast cells | European Collection of Cell Cultures | ||
| PLGA | Lakeshore Biomaterials | 7525 DLG 7E | |
| Pyridinium formate | Sigma Aldrich | P8535 | |
| Trypan blue | Sigma Aldrich | T8154 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | S9638 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | S5136 | |
| HCl | Sigma Aldrich | 320331 |
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