Summary
Biocompatibele pH responsieve sol-gel nanosensors kan in poly (melkzuur-co-glycolzuur) (PLGA) electrospun steigers worden opgenomen. De geproduceerde zelfrapportage steigers kunnen worden gebruikt voor in situ bewaking van micromilieu omstandigheden tijdens het kweken van cellen op de scaffold. Dit is gunstig als de 3D cellulaire construct kan in real-time zonder de proef.
Abstract
Kweken van cellen in 3D geschikte steigers wordt gedacht dat de in vivo micro beter nabootsen en meer cel-cel interacties. De resulterende 3D cellulaire construct kan vaak relevanter voor onderzoek naar de moleculaire gebeurtenissen en cel-cel interacties dan vergelijkbare experimenten onderzocht 2D. Om een effectieve 3D culturen levensvatbaarheid hoge cel gedurende het skelet creëren kweekomstandigheden zoals zuurstof en pH moeten zorgvuldig worden gecontroleerd als hellingen analyt concentratie bestaan binnen het 3D construct. Hier beschrijven we de methoden van de voorbereiding biocompatibel pH responsieve sol-gel nanosensoren en worden geïntegreerd in poly (melkzuur-co-glycolzuur) (PLGA) electrospun steigers samen met hun verdere voorbereiding op de cultuur van zoogdiercellen. De pH responsieve steigers kunnen worden gebruikt als instrumenten om microenvironmental pH bepalen binnen een 3D cellulaire construct. Verder hebben we uitvoerig de levering van pH responsieve nanosensors de intracellulaire omgeving van zoogdiercellen waarvan de groei werd ondersteund door electrospun PLGA steigers. De cytoplasmatische locatie van de pH responsieve nanosensors kan worden gebruikt om de intracellulaire pH (pHi) volgen tijdens lopende experimenten.
Introduction
Een belangrijke strategie weefselengineering is het gebruik van biocompatibele materialen steigers morfologie die lijkt op het weefsel dat het zal vervangen en kan ook ondersteuning van de groei en functie 1,2 cel fabriceren. De steiger verschaft mechanische ondersteuning doordat celhechting en-proliferatie toch laat celmigratie gedurende de tussenruimten van een 3D cellulaire construct. De steiger moet ook zorgen voor het massatransport van cel voedingsstoffen en verwijdering van metabolische afvalproducten 3 niet remmen.
Electrospinning is ontstaan als een veelbelovende methode voor de vervaardiging van polymere scaffolds kan ondersteunen celgroei 4-6. De niet-geweven electrospun vezels geproduceerd zijn geschikt voor celgroei omdat ze vaak poreus en laat cel-cel interacties en celmigratie gedurende de tussenruimten van een 3D cellulaire construct 7. Het is belangrijk om cellevensvatbaarheid te controleren tijdens tHij periode van cultuur en die cellevensvatbaarheid behouden blijft gedurende de gehele 3D-construct. Bijvoorbeeld kweekomstandigheden zoals zuurstof en pH vereisen zorgvuldige controle, gradiënten analyt concentratie bestaan binnen het 3D-construct. Bioreactoren of perfusie systemen kunnen worden gebruikt om de in vivo omstandigheden na te bootsen van interstitiële stroom en als gevolg toename nutriëntentransfers en metabole afvalverwijdering 8. De vraag of dergelijke systemen zorgen voor een constante micro-omgeving van omstandigheden kan worden aangepakt door het beoordelen van de cellulaire micro-omgeving in real-time.
Belangrijke micromilieu statistieken die kunnen worden in real time omvatten: temperatuur, chemische samenstelling van celmedium, concentratie van opgeloste zuurstof en kooldioxide, pH en vocht. Van deze statistieken, kan de temperatuur de meeste gemakkelijk worden gecontroleerd met behulp van in situ sondes. Voor de controle van de overige vermelde metrics vaak involve verwijdering van een monster voor de bemonstering en daarom verstoren de celcultuur en verhogen het risico op besmetting. Continue, real-time methoden worden gezocht. Huidige controlemethoden, meestal rekenen op instrumenten die fysiek sonde de cellulaire constructie zoals een pH-monitor of zuurstof sonde. Toch kunnen deze indringende methoden de cellulaire constructie beschadigen en verstoren de lopende experiment. Niet-invasieve bewaking van analytconcentraties binnen de 3D-constructie kan real-time monitoring van de verschillende milieuaspecten, zoals een tekort aan nutriënten 9 staat. Dit zou de beoordeling van voedingsstoffen laten diepere regionen binnen de structuur en bepalen of metabolisch afval werd effectief 10,11 verwijderd. Systemen die trachten het probleem van invasiviteit pakken algemeen de toepassing van een perfusie kamer die kweekmedium passeert zowel kweekvat en externe sensoren te controleren pH, zuurstof en glucose 12. Dere een toenemende belangstelling voor het ontwikkelen sensoren die direct kan worden geïntegreerd in het kweekvat dat geen verwijdering van een hoeveelheid voor bemonstering vereisen en als zodanig in situ bewaking zou bieden.
Om dergelijke tekortkomingen voor in situ en niet-invasieve monitoring van microenvironmental voorwaarden die we hebben analyt responsieve nanosensors opgenomen in electrospun steigers om zelfrapportage steigers 13 te produceren. Steigers die als sensoren fungeren door toezicht fluorescentie activiteit zijn eerder bereid, waarbij de sensor is zowel het werkelijke polymère steiger door electrospinning of door het gebruik van een analyt reageren kleurstof die wordt opgenomen in het polymeer vóór steiger vorming 14,15 . Echter, deze aftastinrichtingen het potentieel foutieve optische uitgangen veroorzaakt door mogelijke interferentie van andere analyten te geven. Het gebruik van een ratiometrische sensor such als die bereid in het protocol beschreven heeft het potentieel om deze mogelijke bijwerkingen te elimineren en een respons specifiek voor de analyt in kwestie.
De electrospun steigers hier gepresenteerd zijn bereid uit de synthetische co-polymeer poly (melkzuur-co-glycolzuur) (PLGA), geselecteerd als gevolg van het hebben van Food and Drug Administration (FDA) goedkeuring, ten gevolge van zijn biologisch afbreekbaar en biocompatibel eigenschappen en een track verslag van ondersteunen van de groei en functie van diverse celtypen 16-18. De bereide ratiometrische analyt reageren nanosensors reageren op pH. De nanosensors bevatten twee fluorescerende kleurstoffen in een biocompatibele sol-gel-matrix waarbij een kleurstof, FAM reageert op pH en andere, TAMRA fungeert als interne standaard omdat het niet reageert op pH. Verder is de fluorescentie van zowel FAM en TAMRA kunnen afzonderlijk worden geanalyseerd niet wezenlijk overlappen. Bepalen van de verhouding van de fluorescentie emission beide kleurstoffen op specifieke golflengten geeft een pH reactie onafhankelijk van andere omgevingsfactoren. De zelf-rapporterende steigers kunnen herhaalde beoordeling van de pH in situ en in real-time mogelijk zonder verstoring van de ontwikkelde 3D-model. We hebben aangetoond dat deze steigers kunnen ondersteunen celhechting en proliferatie en reageert op de analyt in kwestie blijven. De kinetiek van zure bijproducten engineered constructen blijft weinig bestudeerd en als zodanig behulp van de pH responsieve steigers danig dergelijke studies vergemakkelijkt 19. Bovendien is het gebruik van het zelf-rapporterende draagstructuren voor weefselregeneratie toepassingen biedt de mogelijkheid om volledig te begrijpen, controleren en optimaliseren van de groei van 3D-model weefselconstructen in vitro noninvasively en in real-time.
De pH responsieve nanosensors zijn ook de intracellulaire omgeving van fibroblasten gekweekt op electrospun PLGA scaffol geleverdds. De verhouding van de fluorescentie emissie van de kleurstoffen werden gebruikt voor het bewaken pHi en vergeleken met een zelf-rapporterende steiger Integratie pH nanosensors. De levering van nanosensors aan cellen gekweekt in een 3D omgeving kan monitoring van analytconcentratie diep in het construct in een niet-destructieve manier mogelijk te maken. Daarom nanosensors kan een levensvatbare imaging tool om het gedrag van cellen niet-destructief evalueren hele 3D construeert waardoor op lange termijn analyse. Screening van de analytconcentratie van individuele cellen binnen een 3D-constructie kan ervoor zorgen dat ze krijgen voldoende voedingsstoffen en zuurstof concentraties. Monitoring procesparameters kunnen helpen bij de ontwikkeling van gestandaardiseerde technieken voor de effectieve massa transport van zuurstof en voedingsstoffen. De levering van nanosensors aan de intracellulaire milieu en integratie van nano-sensoren in polymere steigers kunnen worden gecombineerd om de beoordeling van de levensvatbaarheid cel evenals steiger prestaties toestaan binnen 3D constructs tijdens het weefsel groeiproces. Dit kan leiden tot meer kennis over deze constructen en de voortgang van de fabricage van biologisch relevante weefsel vervangers.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Overzicht
Deel 1 beschrijft de bereiding van pH-responsieve nanosensoren en karakterisering van nanosensor respons op pH via fluorescentie spectrometrie en de grootte met SEM.
Deel 2 beschrijft de bereiding van electrospun polymere ondergronden en karakterisering van de morfologie en de grootte met SEM. Hoofdstuk 2 beschrijft ook de bereiding van zelfrapportage steigers die electrospun steigers met de opname van de pH-responsieve nanosensors zijn. De resulterende zelfrapportage steigers worden gekenmerkt door SEM te bepalen of een morfologische veranderingen in de electrospun vezels heeft plaatsgevonden. De fluorescentie van de zelf-rapportage steigers gevolg van de opgenomen nanosensors wordt beoordeeld door confocale microscopie.
Paragraaf 3 beschrijft de cultuur van cellen na de electrospun schavot en de zelfrapportage schavot. De steigers worden eerst gesteriliseerd in Gereedstellingion voor celkweek waarna de steigers worden beoordeeld om te bepalen of sterilisatie en de cultuur van cellen beïnvloeden de fluorescentie vermogen van de zelfrapportage steigers. Het protocol beschrijft ook de levering van nanosensors aan cellen die zijn gekweekt op electrospun steigers. Lysotracker kleurstof wordt gebruikt zodat nanosensoren niet in cellulaire compartimenten zuur hebben.
1. Voorbereiding en analyse van pH Responsive Sol-gel Nanosensoren
1.1 Voorbereiding van de pH Responsive Sol-gel Nanosensoren
Opmerking: Deze voorbereiding moet worden uitgevoerd in een zuurkast.
- Bereid de fluoroforen voor gebruik binnen het pH nanosensors door 5 - (en-6)-carboxyfluoresceïne, succinimidylester (FAM-SE) (1,5 mg) in dimethylformamide (DMF) (1 ml) in een rondbodemkolf en 6-carboxytetramethylrhodamine , succinimidyl ester (TAMRA-SE) (1,5 mg) in DMF (1 ml) in een rondbodemkolf.Voeg 3-aminopropyltriethoxysilaan (APTES) (1,5 ml) aan elke kolf en roeren onder een droge stikstofatmosfeer (21 ° C) gedurende 24 uur in het donker namelijk wikkel de monsters in folie.
- Voeg beide bovenstaande kleurstoffen (250 pl) van een mengsel van ethanol (6 ml) en ammoniumhydroxide (30 gew%, 4 ml) in een rondbodemkolf en roer gedurende 1 uur (21 ° C).
- Voeg langzaam tetraethylorthosilicaat (TEOS) (0,5 ml) aan het mengsel, blijf roeren nog 2 uur. Het mengsel wordt troebel. De nanosensors kan worden verzameld door rotatieverdamping. Nanosensoren kunnen worden opgeslagen in een glazen fles bij 4 ° C voor toekomstig gebruik.
LET OP: verdere afhandeling van nanosensors in hun droge vorm moet in een zuurkast of in het geval van wegen hen het saldo moet worden afgesloten, bijvoorbeeld in een Weighsafe worden uitgevoerd.
1.2 Nanosensor Reactie op pH
- Bereid Sørensen fosfaatbufferoplossingen variërend van pH 5,5-8,0 door mixing specifieke verhoudingen van monobasisch (0,2 M) en dibasisch (0,2 M) voorraad oplossingen. Controleer de uiteindelijke pH met een pH-meter. Voer eventueel kleine aanpassingen van de pH met natriumhydroxide (NaOH) (4 M) of zoutzuur (HCl) (2 M).
- Hang de pH nanosensors in het pH buffers (5 mg / ml) door eerst met het vat dat de nanosensor oplossing op een vortex gedurende 3 min vervolgens onderdompelen van het vaartuig in een ultrasonicator totdat de oplossing troebel (ca. 5 min). Herhaal deze stappen om de nanosensoren in oplossing volledig te schorsen.
- Plaats de eerste oplossing in een optische cuvet en gebruik golflengten van 488 nm voor 5 - (en-6)-carboxyfluoresceïne (FAM) en 568 nm voor 6-carboxytetramethylrhodamine (TAMRA). Verzamel de emissie golflengten 500-530 nm voor FAM en 558-580 nm voor TAMRA met fluorescentie spectrometer.
- Wijzig de oplossingen in de optische cuvet zodat de pH kan worden waargenomen bij verschillende pH en verder collecting de emissie spectra.
- Bereken de verhouding van de emissiemaxima geproduceerd bij elke pH tot een ijkkromme.
1.3 SEM van Nanosensoren
- Plaats een steekproef van de nanosensors op een koolstof beklede elektronenmicroscoop stub en sputteren jas met goud voor 5 min onder een argon atmosfeer.
- Let door scanning elektronenmicroscopie (SEM). Tijdens beeldvorming pas de werkafstand, spanning en vergroting elektron opladen (figuur 1) te minimaliseren.
2. Voorbereiding en analyse van PLGA steigers
2.1 Electrospinning PLGA Stellingen
- In een zuurkast ontbinden poly (melkzuur-co-glycolzuur) (PLGA) in dichloormethaan (DCM) (20% (w / w)) met pyridinium formiaat (PF) (1% (w / w)). Plaats de oplossing in een 10 ml spuit met een 18 G botte vulling naald en veilig geschikt om een injectiepomp.
- Afstand van de naald 20 cm verwijderd van een 20cm x 15 cm aluminium verzamelen plaat.
- Bevestig de elektrode van een hoogspanningsvoeding de punt van de spuit en de aarde om de aluminium opvangschaal.
LET OP: Zorg moet worden genomen als hoogspanning wordt gebruikt dwz u altijd de elektrische voeding af voordat u een van de elektrospinnen apparatuur. - Lever de oplossing met een constante stroomsnelheid van 3,5 m / h bij 12 kV 2 uur. Electrospinning gebruik van deze voorwaarden zal een steiger diepte van ongeveer 60 micrometer te geven.
- Laat de steiger in een zuurkast voor 24 uur om resten oplosmiddelen verdampen.
2.2 Electrospinning pH Responsive PLGA Stellingen
- Bereid steigers waarin pH reageren nanosensors zoals beschreven in paragraaf 2.1, maar met de wijziging van het toevoegen nanosensors aan het polymeer-oplossing (5 mg / ml). Hang de nanosensors in de PLGA oplossing met behulp van ultrasone trillingen (ongeveer 5 min) vóór te plaatsen in een 10 ml spuit.
2.3 SEM van PLGA Steiger en pH Responsive Steiger
- Plaats een steekproef van de PLGA steiger of pH responsieve steiger op een koolstof beklede elektronenmicroscoop stub en ga verder zoals beschreven voor SEM van nanosensors (figuur 1).
2.4 Kalibratie van pH Responsive Steiger
- Plaats een steekproef van pH responsieve steiger in een 35 mm cultuur plaat en onder te dompelen in geschikte bufferoplossingen.
- Op een confocale microscoop een 488 nm argon laser om de FAM en 568 nm kryptonlaser de TAMRA wekken binnen de nanosensors wekken. Let op de fluorescentie-emissie voor pH responsieve steigers bij 500-530 nm voor FAM en 558-580 nm voor TAMRA. (Figuur 2). Gebruik sequentiële scanning om de verzameling van excitatiegolflengten voorkomen.
3. Cel Cultuur op PLGA Stellingen en pH Responsive PLGA Stellingen
ntent "> Opmerking: De volgende moet in een celkweek kabinet worden uitgevoerd.3.1 Voorbereiding van PLGA Stellingen voor Cultuur van de Cel
- Snijd de PLGA of pH responsieve PLGA steigers in 2 cm 2 stuks.
- Steriliseer steigers door bestraling met ultraviolet (UV) licht op een afstand van 8 cm gedurende 15 min. elke zijde.
- Breng de steigers om een 12-well cultuur plaat en plaats een stalen ring op de top. Voeg een oplossing van penicilline / streptomycine (5% v / v) in met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) aan de binnen-en buitenzijde van de stalen ring, overnacht incuberen (37 ° C, 5% CO2). Let op de stalen ring is vervaardigd aan de Universiteit van Nottingham en heeft de volgende afmetingen: 2 cm buitendiameter, 1 cm binnendiameter, 1 cm diepte.
- Verwijder de steriliserende oplossing en was met PBS.
- Voeg celkweek media naar binnen (500 ui) en buiten (500 ui) van de stalen ring, plaats in een incubator (37 ° C, 5% CO2
- Bereid een celsuspensie en uitvoeren van een aantal cellen met een trypan blauw exclusietest.
- Maak een celsuspensie om een cel aantal van 1 x 10 6 cellen / ml te bereiken.
- Verwijder het afdrukmateriaal uit de binnen-en buitenkant van de stalen ring.
- Vervang voorverwarmde kweekmedium aan de buitenzijde van de stalen ring (1 m).
- Voeg 300 ul van de celsuspensie aan de binnenkant van de stalen ring - steen plaat heen en weer voorzichtig cellen verdelen.
- Plaats de celkweek plaat in een incubator (37 ° C, 5% CO2) - moet celhechting hebben plaatsgevonden binnen 24 uur, maar blijven cultuur zolang het experiment vereist - verfrissend de media om de 2-3 dagen.
3.2 Nanosensor Levering aan cellen gekweekt op PLGA Steiger
- Zaad cellen op PLGA steiger zoals beschreven in paragraaf 3.1. Voor deze studie een lege PLGA steiger (geen containersNing nanosensors) werd gebruikt vanwege overlap van fluorescentie-emissie bij beeldvorming.
- Plaats de cellen geënte steiger in een incubator (37 ° C, 5% CO2) gedurende 72 uur om de cellen om te groeien en migreren tijdens het schavot voor levering Nanosensor.
- Vóór levering Nanosensor was de cellen met PBS en veranderen de media van standaard kweekmedium met antibiotica en serumvrije media incuberen (37 ° C, 5% CO2) gedurende 1 uur. Opmerking: standaard kweekmedia voor 3T3 cellen omvat Modified Dulbecco's Eagle's aangevuld met foetaal kalfsserum (10% (v / v)), L-glutamine-oplossing (2 mM), penicilline / streptomycine (1% (v / v)) .
- Gedurende de incubatieperiode bereiden nanosensor-liposoomcomplex door kort sonicatie nanosensors (5 mg) met Optimem (50 pi) aan oplossing A. creëren
- Maak oplossing B door toevoeging van Lipofectamine 2000 (5 pi) tot Optimem (45 pl), incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
- Oplossing toevoegenA oplossing B, incuberen bij kamertemperatuur gedurende 20 min bij oplossing C die de nanosensor-liposoom complex te vormen.
- Toevoegen oplossing C (100 ul) aan cellen en incubeer (37 ° C, 5% CO2) gedurende 3 uur.
- De cel gezaaid steigers uit de incubator, zuig media en tweemaal wassen met PBS voor het toevoegen van PBS (1 ml) live celvisualisatie door confocale microscopie mogelijk. Opmerking: PBS werd in dit protocol zodat het fenolrood bevat aanwezig in cel kweekmedium geen autofluorescentie heeft veroorzaakt en ook omdat een ijking bij verschillende pH werd uitgevoerd. Echter fenolrood vrije media kunnen worden gebruikt voor lange termijn analyse celculturen.
- Dompel de cel geënte steiger in buffers met verschillende pH en toezicht op de respons van de nanosensors geassocieerd met de cellen.
- Controleer de pHi door bepaling van de verhouding van de fluorescentie-intensiteiten van FAM en TAMRA door observatie met fluorescentie confocale microscopie (Figure 3).
3.3 Nanosensor Locatie binnen zoogdiercellen
- Incubeer cellen met nanosensors die alleen de FAM kleurstof zoals beschreven in punt 3.2 (dit is omdat de fluorescentie-emissie van TAMRA in dezelfde spectrale gebied als Lysotracker Red). Bereid deze nanosensors zoals beschreven in paragraaf 1.1, maar met weglating van de voorbereiding en het toevoegen TAMRA.
- Na de nanosensor leveringstermijn verdunnen Lysotracker Red stockoplossing tot 50 nM.
- Voeg een hoeveelheid van de verdunde oplossing (2 pi) cellen gekweekt op PLGA steigers.
- Incubeer de cellen met Lysotracker Red gedurende 1 uur (37 ° C, 5% CO2).
- Na de incubatieperiode verwijder de media en was de cellen tweemaal met PBS (pH 7,4) alvorens de media PBS (pH 7,4) (2 ml) als voorbereiding voor het bekijken via confocale microscopie. Opmerking: fenolrood vrije media kunnen worden gebruikt in plaats van PBS.
- Voeg de nucleaire vlek Draq5 de PBS zodat de eindconcentratie 5 uM en incuberen met de cellen gedurende 3 min (37 ° C 5% CO2). Het is niet noodzakelijk de media na incubatie met Draq5 veranderen.
- Gebruik een 488 nm argon laser om de FAM prikkelen alleen nanosensors, een 568 nm kryptonlaser de Lysotracker Rode en 633 nm helium / neon laser prikkelen om de Draq5 chromofoor prikkelen en te observeren fluorescentie bij 500-530 nm, 580-600 nm, 650 -750 nm respectievelijk (figuur 3). Gebruik sequentiële scanning om de verzameling van excitatiegolflengten voorkomen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De grootteverdeling van de bereide pH responsieve nanosensors werd gekarakteriseerd met SEM, waarbij de populatie van nanosensors afgebeeld werden gemeten en nanometer afmetingen in het bereik van 240-470 nm (Figuur 1A). Het bereiken van een smalle en redelijk kleine diameter is met behulp van de Stöber methode om nanodeeltjes te bereiden. Gebleken is dat met een basische pH omgeving tijdens de synthese van nanodeeltjes dwz nanodeeltjes bereid met de Stöber methode maakt een goede beheersing van de grootte, terwijl bereiding middels zure omstandigheden levert een brede spreiding in deeltjesgrootte. Representatieve SEM microfoto van de PLGA electrospun vezels vervaardigd volgens de beschreven werkwijzen worden in Figuur 1B tonen dat de geproduceerde PLGA steiger bestaat uit geweven vezels weergeven minimale frezen of breken wanneer de vezels nanometer afmetingen. Figuur 1C figuur 1B, SEM microfoto kunnen aantonen nanosensor verband op het oppervlak van de vezels maar ze kunnen binnen de steiger vezels worden opgenomen, omzettingsstudies deze steiger / nanosensor steigers kunnen worden in combinatie met SEM en / of confocale microscopie uitgevoerd om te bepalen of dit van invloed nanosensor prestaties.
Het vermogen van de nanosensors om hun optische activiteit behouden na opname in het PLGA vezels werd gecontroleerd door onderzoek van de zelfrapportage steigers met behulp van confocale microscopie. Behoud van de mogelijkheid om optisch en chemisch actief blijven wanneer zij in het skelet vezels kunnen analyt concentraties te kunnen volgen. De fluorescentie geëmitteerd vanuit de nanosensors aangetoond dat de nanosensors retained hun optische activiteit en zijn geassocieerd met de steiger vezels. Fluorescentie geëmitteerd door de kleurstoffen FAM (groen) en TAMRA (rood) opgenomen in het pH-responsieve nanosensors wordt respectievelijk getoond in figuren 2A en 2B. Dit is een positief resultaat, dat maakt het mogelijk voor analytconcentraties te kunnen houden in situ. Het is ook de eerste keer dat optisch actieve ratiometrisch nanosensors zijn opgenomen in PLGA steiger vezels met behulp van de elektrospinproces. Nadat bevestigd dat de nanosensors kan worden gevisualiseerd met fluorescentiemicroscopie na incorporatie in PLGA-vezels, werd de nanosensor reactie op veranderingen in analytconcentratie geverifieerd. Onderdompelen van de steiger in buffers met verschillende pH resulteerde in een verandering van de fluorescentie-intensiteit van de FAM kleurstof terwijl de fluorescentie geëmitteerd door de TAMRA referentie kleurstof niet merkbaar verandert. De verhouding van fluorescentie-intensiteit van beide kleurstoffen kunnen worden gebruikt prodUce een kalibratiecurve zoals getoond in figuur 2C. De kalibratiecurve voor nanosensoren alleen beoordeeld en, indien ze in electrospun PLGA steiger is vergelijkbaar en toont aan dat de nanosensors behouden hun optische activiteit na opname in het zelfrapportage steigers. Het vermogen van het zelf-rapporterende steiger omkeerbaar reageren op verschillende pH-waarden werd bepaald door afwisselend onderdompelen van de steiger buffers met een pH van 5,5 en 7,5. De reversibiliteit bleek zeer goed zoals weergegeven in figuur 2D waarbij de zelf-rapporterende steiger kan reageren talrijke cyclische veranderingen in de pH. Lange-termijn studies zijn niet uitgevoerd om het effect van PLGA degradatie op de nanosensor oprichting beoordelen; men denkt dat, omdat de nanosensors bieden een ratiometrisch reactie de hoeveelheid nanosensors aanwezig zal geen invloed op het resultaat.
Analyte responsieve nanosensors werden geleverd met behulp van een liposomal transfectiemiddel de intracellulaire omgeving van 3T3 fibroblasten waarvan de groei werd ondersteund door lege PLGA steigers. Confocale microscopie beelden 3T3 fibroblasten op lege PLGA steigers tonen dat nanosensors worden geassocieerd met de fibroblast cellen met fluorescentie waargenomen van respectievelijk FAM en TAMRA getoond in figuren 3A en B. Overlappen de fluorescentie van deze kanalen laat zien dat de fluorescentie van de twee kleurstoffen is mede-gelokaliseerd, waaruit blijkt dat de kleurstoffen zijn gebleven ingesloten in biocompatibele matrix de nanosensors '(zoals weergegeven door gele fluorescentie in figuur 3C). De nanosensors wordt gedacht dat in het cytoplasma van de 3T3 fibroblasten en zich niet in zure compartimenten zoals blijkt uit het ontbreken van co-gelokaliseerde fluorescentie van FAM alleen nanosensoren en Lysotracker Rode kleurstof in figuur 3D. De fluorescentie-intensiteit van pH responsieve nanosensors leverened aan 3T3 fibroblasten werd gevolgd terwijl de cellen werden blootgesteld aan veranderingen in pH de resultaten worden getoond in figuur 3E. De geproduceerde grafiek toont aan dat de cellen gekweekt op de electrospun PLGA schavot een pHi hebben behouden in de range 6,8-7,0.
Figuur 1. SEM microfoto van nanosensoren, PLGA vezels en zelfrapportage steigers. (A) pH responsieve sol-gel nanosensors toont sferische nanometer deeltjes (B) PLGA electrospun geweven vezels waar vezelmorfologie is regelmatig met minimale kralen en breuken (C) pH responsieve zelfrapportage steigers waar de nanosensors kunnen worden waargenomen worden uitsteken van de PLGA nog vezelmorfologie vergelijkbaar blijft met controle PLGA vezels die niet nano's bevattenEnsors. Klik hier voor grotere afbeelding .
Figuur 2. Confocale microscopie beelden pH responsieve zelfrapportage scaffolds waar fluorescentie kan worden waargenomen vanaf de nanosensors verband met de PLGA steiger vezels. (A) FAM (groen) pH responsieve kleurstof en (B) TAMRA (rood) de referentie kleurstof. (C) Kalibratie grafieken van pH responsieve sol-gel nanosensoren en pH responsieve steigers demonsttarief dat de optische en chemische reactie van de nanosensors werd niet beïnvloed wanneer opgenomen in de PLGA schavot vezels. (D) omkeerbaarheid van de zelfrapportage steiger uitgevoerd door onderdompeling van de steiger in afwisselende bufferoplossingen van pH 5,5 en pH 7,5. Klik hier voor grotere afbeelding .
Figuur 3. Confocale microscopie beelden van cel geïnternaliseerd nanosensoren en grafieken van de pH en pHi reactie. Fluorescentie van de geïnternaliseerde nanosensors (A) FAM (groen) (B) TAMRA (rood) (C) co-lokalisatie van fluorescentie van FAM en TAMRA (geel) ( D) FAM alleen nanosensors (groen) geleverd aan 3T3 fibroblasten cultuurd na PLGA steiger met Draq5 (magenta) etikettering van de kern en Lysotracker Red (rood) etikettering van lysosomen. De fluorescentie van FAM en Lysotracker rode niet co-gelokaliseerd derhalve aangetoond dat het onwaarschijnlijk is dat nanosensors zijn geïnternaliseerd in cellulaire compartimenten zuur (E) pHi metingen van nanosensors afgeleverd 3T3 fibroblasten op een lege PLGA steiger tegenover de pH kalibratie van een pH-sensing steiger zonder de cultuur van cellen. Dit toont ook aan dat de pH-metingen uitgevoerd met de geïnternaliseerde nanosensors zijn niet zuur als de cellen gekweekt op de electrospun PLGA schavot een pHi hebben behouden in de range 6,8-7,0. Klik hier voor grotere afbeelding .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tissue engineering streeft biologische substituten te maken die gebruikt kan worden zowel in vivo als in vitro modellen weefsel en weefsel vervangingstherapie tot reparatie, vervanging, handhaven of verbeteren van de functie van een bepaald weefsel of orgaan. Synthetische substituten zijn gebruikt voor vele jaren vervangen of steun herstel van weefsels, maar deze vaak niet vanwege slechte integratie met gastheerweefsel en / of infectie, wat uiteindelijk leidt tot afstoting of verder revisiechirurgie. Het genereren van levend weefsel in het laboratorium vóór implantatie kan de kwestie van de volledige integratie aan te pakken en het verminderen van de noodzaak van een herziening chirurgie. Voor dit doel te realiseren geschikte in vitro vermeerdering en manipulatie van cellen in de 3D constructen worden gecombineerd met geschikte fysieke conditie van het weefsel in vitro. Dit kan op een aantal manieren waarvan een verder onderzoek naar fundamenteel biologisch bereikenbetrokken maar ook de technische en productieproblemen voor de productie van synthetische substituten onderzoeken. Het is dit laatste punt dat de beschreven protocol beoogt bij te dragen.
De bestemming van de beschreven PLGA steigers is een tijdelijke steun aan zoogdiercellen om hun groei te helpen in een biologisch relevante structuur. Incorporatie van analyt responsieve nanosensors in de PLGA steigers waardoor lokale analytconcentraties gedurende een 3D-constructie te worden gecontroleerd tijdens het weefsel groeiproces. Het gebruik van pH-responsieve scaffolds kan bepalen of zure bijproducten gevormd als de steiger degradeert en cellen groeien effectief worden vanuit een 3D construct verwijderd staan. Dit is een stap in de oplossing van de huidige gebrek aan proces monitoring en controle van in vitro weefselregeneratie processen. Het gebruik van steigers die zich sensing apparaten in staat kan stellen insitu, real-time microenvironmental assessment. Monitoring van het construct micro zonder beschadiging van het weefsel is essentieel en zal procesbewaking mogelijk in alle stadia van weefsel productie.
Het vermogen van de geproduceerde pH reageren steiger aan de lokale analytconcentratie verslag werd beoordeeld door het bewaken van de fluorescentie-uitgang van de nanosensors behulp van confocale microscopie. Een kalibratie experiment werd uitgevoerd voor pH sensing steiger en bleek vergelijkbaar met die van de pH responsieve nanosensors niet in PLGA vezels opgenomen. De mogelijkheid om een ijkkromme te zien dat de nanosensors reageren op veranderingen in de pH na toevoeging van het polymeer scaffold en dat het sterilisatieproces van de steigers geen verslechtering veroorzaakte de sensing capaciteit pH nanosensors blijven. Bovendien werden nanosensors de intracellulaire omgeving van cellen gekweekt op PLGA steigers geleverd where cellulaire reactie op veranderingen in pHi worden bewaakt. De verhouding van de fluorescentie-intensiteiten van FAM en TAMRA werden gebruikt voor het bewaken van de pHi en vergeleken met een pH responsieve steiger, wat suggereert dat de 3T3 fibroblastcellen een pHi hebben behouden in het traject pH 6,8-7. Incubatie 3T3 fibroblasten getransfecteerd met nanosensors met nucleaire vlek Draq5 aangegeven dat de meeste cel-geassocieerde nanosensors niet in de kernregio. Nanosensor locatie lijkt niet binnen zure compartimenten zoals endosomen of lysosomen zoals bepaald door het incuberen van de nanosensor 3T3 fibroblasten getransfecteerd met Lysotracker Red, waarbij co-lokalisatie van FAM en Lysotracker rood worden afgebeeld door gele pixels in confocale beelden. Verdere studies zoals analyse van transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) en de identificatie van biologische merkers voor internalisatie wegen kan dit controleren verder. Bovendien langdurige studies zoals tijdsopgeloste confocale microscopiekan het lot op lange termijn van de nanosensors in cellen gekweekt op zelfrapportage steigers bepalen. Als nanosensors zouden andere celtypes te leveren dan hun locatie worden geïdentificeerd als het resultaat niet hetzelfde als hier deze afbeeldingen.
Het gebruik van zelf-rapportage scaffolds het potentieel invasief bewaken microenvironmental omstandigheden binnen tissue engineered constructen. Met de mogelijkheid om uit te voeren in situ metingen kan stellen optimale groei van 3D weefsel constructen in vitro invasief en in real-time. De cytoplasmatische locatie van de pH responsieve nanosensors kan worden gebruikt om te controleren pHi bij actieve experimenten. De aan de interne omgeving van cellen of zelfrapportage scaffolds nanosensors kunnen beide worden gebruikt in statische of dynamische weefselkweek systemen en kan leiden tot vaststelling van de kweekomstandigheden vereist voor optimale groei van weefsel gemanipuleerde constructenvitro. Verdere ontwikkeling kan leiden tot een on-line systeem dat handelen tekort aan nutriënten een consistente aanvoer van voedingsstoffen en zuurstof door het construct, waardoor uiteindelijk een zeer reproduceerbare werkwijze voor het kweken van weefsel constructen.
De beschreven protocollen zijn opgesteld scaffolds met afmetingen die geschikt zodat beeldvorming middels confocale microscopie echter grotere 3D staat constructen worden afgebeeld meerdere fotonexcitatie nodig zijn om beeldvorming zodat binnen dieper constructen. De optische apparatuur zoals de microscoop lens moet worden gekozen om te bepalen de optimale afstand voor de lens en het construct afmetingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
De financiering van de BBSRC wordt vriendelijk erkend (licentienummer BB H011293 / 1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol | Fisher | 32221 | |
| Anhydrous dimethylformamide (DMF) | Sigma | 270547 | |
| Ammonium hydroxide 50% (v/v) aqueous solution | Alfa Aesar | 35574 | diluted to 30% (v/v) with pure water |
| TEOS | Sigma | 13190-3 | |
| 3-Aminopropyltriethoxysilane (APTES) | Sigma | A3648 | |
| 5-(and-6)-carboxyfluorescein, succinimidyl ester (FAM-SE) | Invitrogen | C1311 | |
| 6-carboxytetramethylrhodamine, succinimidyl ester (TAMRA-SE) | Invitrogen | C1171 | |
| Sodium phosphate monobasic (0.2 M) | Sigma Aldrich | S-9638 | |
| Sodium phosphate dibasic (0.2 M) | Sigma Aldrich | S-0876 | |
| NaOH | Sigma Aldrich | S8045 | |
| Trypsin/EDTA | Sigma Aldrich | T4174 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma Aldrich | P0781 | |
| PBS | Sigma Aldrich | D8537 | |
| DMEM | Sigma Aldrich | D6046 | |
| FBS | Source Bioscience | Batch-213-101992 | |
| L-Glutamine | Sigma Aldrich | G7513 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| Optimem | Invitrogen | 11058-021 | |
| LysoTracker Red | Invitrogen | L-7528 | |
| Draq5 | Biostatus Ltd | DR50050 | |
| Nitrogen gas | BOC | ||
| DCM | Sigma Aldrich | 320269 | |
| TFA | Sigma Aldrich | T6508 | |
| Confocal microscope | Leica TCS-SP | equipped with argon and krypton lasers and a 63X 0.9NA water immersion lens | |
| UV light | UVLS28 UVP, USA | ||
| Stirrer plate | SB161-3 Jencons-PLS | ||
| pH meter | Jenway model 3510 | ||
| Rotary Evaporator | Buchi Rotary Evaporator R200 | ||
| Centrifuge (nanosensors) | Hermle Z300 | ||
| Centrifuge (cell culture) | Thermo Scientific Heraeus Biofuge Primo | ||
| Vortex | Whirlimixer Fisherbrand | ||
| Ultrasonicator | FB11021 Fisherbrand | ||
| Aluminum sheet | Nottingham University | ||
| 35mm cell culture plate | Iwaki | 3000035 | |
| 10 ml syringe | Becton Dickenson | ||
| 3T3 Fibroblast cells | European Collection of Cell Cultures | ||
| PLGA | Lakeshore Biomaterials | 7525 DLG 7E | |
| Pyridinium formate | Sigma Aldrich | P8535 | |
| Trypan blue | Sigma Aldrich | T8154 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | S9638 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | S5136 | |
| HCl | Sigma Aldrich | 320331 |
References
- Takimoto, Y., Dixit, V., Arthur, M., Gitnick, G. De novo liver tissue formation in rats using a novel collagen-polypropylene scaffold. Cell Transplantation. 12 (4), 413-421 (2003).
- Sales, V. L., Engelmayr, G. C., et al. Protein precoating of elastomeric tissue-engineering scaffolds increased cellularity, enhanced extracellular matrix protein production, and differentially regulated the phenotypes of circulating endothelial progenitor cells. Circulation. 116 (11), I55-I63 (2007).
- Hollister, S. J. Porous scaffold design for tissue engineering. Nature Materials. 4 (7), 518-524 (2005).
- Li, D., Xia, Y. N.
- Sill, T. J., von Recum, H. A. Electro spinning: Applications in drug delivery and tissue engineering. Biomaterials. 29 (13), 1989-2006 (2008).
- Pham, Q. P., Sharma, U., Mikos, A. G. Electrospinning of polymeric nanofibers for tissue engineering applications: A review. Tissue Engineering. 12 (5), 1197-1211 (2006).
- Sawyer, N. B. E., Worrall, L. K., et al. In situ monitoring of 3D in vitro cell aggregation using an optical imaging system. Biotechnology and Bioengineering. 100 (1), 159-167 (2008).
- Dan, L., Chua, C. K., Leong, K. F. Fibroblast Response to Interstitial Flow: A State-of-the-Art Review. Biotechnology and Bioengineering. 107 (1), 1-10 (2010).
- Pancrazio, J. J., Wang, F., Kelley, C. A. Enabling tools for tissue engineering. Biosensors & Bioelectronics. 22 (12), 2803-2811 (2007).
- You, Y., Lee, S. W., Youk, J. H., Min, B. M., Lee, S. J., Park, W. H. In vitro degradation behaviour of non-porous ultra-fine poly(glycolic acid)/poly(L-lactic acid) fibres and porous ultra-fine poly(glycolic acid) fibres. Polymer Degradation and Stability. 90 (3), 441-448 (2005).
- Dong, Y. X., Liao, S., Ramakrishna, S., Chan, C. K. Distinctive degradation behaviors of electrospun PGA, PLGA and P(LLA-CL) nanofibers cultured with/without cell culture. Multi-Functional Materials and Structures. 47 - 50, 1327-1330 (2008).
- Xu, Y. H., Sun, J. J., Mathew, G., Jeevarajan, A. S., Anderson, M. M. Continuous glucose monitoring and control in a rotating wall perfused bioreactor. Biotechnology and Bioengineering. 87 (4), 473-477 (2004).
- Harrington, H. C., Rose, F. R. A. J., Reinwald, Y., Buttery, L. D. K., Ghaemmaghami, A. M., Aylott, J. W. Electrospun PLGA fibre sheets incorporating fluorescent nanosensors: self-reporting scaffolds for application in tissue engineering. Analytical Methods. 5 (1), (2013).
- Wang, X. Y., Drew, C., Lee, S. H., Senecal, K. J., Kumar, J., Sarnuelson, L. A. Electrospun nanofibrous membranes for highly sensitive optical sensors. Nano Letters. 2 (11), 1273-1275 (2002).
- Yang, Y., Yiu, H. H. P., El Haj, A. J. On-line fluorescent monitoring of the degradation of polymeric scaffolds for tissue engineering. Analyst. 130 (11), 1502-1506 (2005).
- Blackwood, K. A., McKean, R., et al. Development of biodegradable electrospun scaffolds for dermal replacement. Biomaterials. 29 (21), 3091-3104 (2008).
- Bashur, C. A., Dahlgren, L. A., Goldstein, A. S. Effect of fiber diameter and orientation on fibroblast morphology and proliferation on electrospun poly(D,L-lactic-co-glycolic acid) meshes. Biomaterials. 27 (33), 5681-5688 (2006).
- Li, W. J., Laurencin, C. T., Caterson, E. J., Tuan, R. S., Ko, F. K. Electrospun nanofibrous structure: A novel scaffold for tissue engineering. Journal of Biomedical Materials Research. 60 (4), 613-621 (2002).
- Sung, H. J., Meredith, C., Johnson, C., Galis, Z. S. The effect of scaffold degradation rate on three-dimensional cell growth and angiogenesis. Biomaterials. 25 (26), 5735-5742 (2004).
