Summary
这个协议描述了用于贴壁细胞用惰性气体喷射的暂时通透性的方法。这种技术有利于遗传物质和生物分子转移到贴壁哺乳动物细胞中通过机械力的利用来破坏细胞膜。
Abstract
各种细胞的转染技术存在并且这些可以细分到三个大类：病毒，化学和机械。这个协议描述了一种机械方法，用惰性气体喷射，可以方便的通常不可渗透大分子转移到细胞中，以时间上通透贴壁细胞。我们相信这种技术的工作原理是赋予对贴壁细胞的质膜的剪切力，从而在临时形成微孔。一旦创建了这些孔，然后将细胞可渗透的遗传物质和其它生物分子。所涉及的机械力，还是从他们的衬底运行永久损坏或脱落细胞的风险。有，因此，一个狭窄的范围内的惰性气体动力学，其中该技术是有效的。惰性气体喷流在不同的透贴壁细胞系包括HeLa细胞，HEK293和人的腹主动脉内皮细胞被证明有效。这个协议是适当的在p在体外和，贴壁细胞ermeabilization因为我们已经证明， 在体内 ，显示出它可以在今后的临床应用中用于研究和潜在的。它也有一个空间限制的方式透化细胞的优势，这可能被证明是一个有价值的研究工具。
Introduction
随着生物医学的发展和细胞力学的理解，传递生物分子进入细胞已成为许多研究领域和药物治疗是至关重要的。不同的技术已被开发，通过细胞膜，进入细胞胞质溶胶中引入外来分子。这些通常可分类为：病毒，化学的或机械的技术。病毒的技术能够转染遗传物质，例如使用病毒载体1的RNA和DNA。病毒的技术往往具有高的效率在某些细胞系中，但是它们有用于免疫和炎症反应2的潜力。常见的化学转染方法包括沉淀磷酸钙3，细菌外毒素4和脂质体转染5。这些技术已被证明是有效的，然而，某些问题时，如细胞毒性和非特异性。此外，如钙phosphat技术ë沉淀已发现具有转染效率可达70％，但仅在某些细胞系中，很少在原代细胞6。这是值得注意的是越来越多的研究工作正在投入的原代细胞，特别是在临床使用和DNA功能的研究设计各种处理的情况下。
通过机械刺激细胞膜瞬时中断是用于将外来分子进入细胞的一种替代方法。技术包括：使用超声波来破坏细胞膜10-12，粒子轰击就证明了“基因枪”，其拍摄粒子结合有显微注射分子7，利用电场来破坏膜8,9电穿孔，声孔效应基因进入细胞13，以及最近的，已被证明在时间上通透哺乳动物细胞14,15的流体剪切应力的应用。虽然技工人的方法避免上述的一些问题，它们通常伴随着较低的效率和非常复杂的和专门的设置。大气压辉光放电火炬（APGD-T）于麦吉尔开发的功能化表面和体外 16分离贴壁细胞的初始目标。偶然，人们发现，一活/死染色被用来在某种程度上被取入细胞而不被加入渗透剂。此外，这似乎只发生在其中发生在火炬路径匹配井的禁区。调查的APGD-叔的通透能力，以及继续在对照研究中，我们发现，如果没有激发等离子体的载体惰性气体射流也能够透化细胞。这违背了最初的假设，即由等离子体射流产生的活性物种暂时受损的细胞膜功能，并建议只是式机械密封卡尔力量足以引起细胞通透性。从这里，研究持续在我们的实验室，试图量化和表征惰性气体射流的通透性效率以及看看它的转染能力16。
通过这些研究，已经发现，微孔做实际上形式在质膜，并且这些孔隙倾向于在大约5秒15重新密封。我们已经证明了该技术的效用在体外和体内在鸡胚绒毛尿囊膜上。
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Protocol
1。 LabVIEW程序的开发
- 质量流量控制器（MKS M100B海量弗洛控制器）连接到氦气线，以确保精确的气体流量。这个单元由一个输入电压控制的，介于0和5 V.在LabView的程序的控制回路确定所需的电压在任何给定的时间范围内。计算机之间的接口连接是通过一个数据采集设备（NI USB-6009）进行的质量流量控制器，和一个12伏电源提供电源的质量流量控制器。
- 两个定位线性滑动是用来控制在6孔板中，每一个方向的移动。每个组件包括一个MA15系列Velmex Unislide装配加上一个步进电机，而这两个组件是由一个单一Velmex VXM步进电机控制器来控制。该控制器允许为每个电机的手动慢跑或接受外部串行命令的字符串，它的组合允许针对特定的移动patterns。几个模式可以被编程到LabVIEW程序，要求用户提供唯一所需的焊炬速度以及该路径的尺寸。
2。设备的研制
- 打开氦气瓶和调节器两个。
- 转动电机控制器上。
- 打开LabVIEW程序，并确认所有条件。
- 请确保该平台为中心。要检查，看看每个电机阶段和验证每个车厢不靠近任何阶段结束。要么有程序中心的车厢或者通过使用对电机控制器的前慢跑控制手动调整。
- 如果这是当天的第一次运行时，建议以无细胞的运行程序一次，以确保安装工作正常。
3。气体射流毛细管喷嘴高度的制备
- 从支架上取下毛细管和零高度拨号。
- 将6孔板Øn个平台。
- 替换和降低气体喷射毛细管到井的底部，直至它碰到盖玻片。固定在支架中的毛细管。
- 使用高度表盘，提高毛细血管3毫米。标记在毛细管基地这个高度。
- 提高毛细管到安全高度，然后取出6孔板。
4。细胞渗透协议
- 培养贴壁细胞系生长至汇合的玻璃盖玻片在使用标准培养技术的6孔板中。对于HeLa细胞，种子的6孔板中，每孔2×10 5个细胞，并孵育在治疗前48小时。
- 准备包含所需向量解适当的音量。为hrGFPII-1，50纳克/微升在1x PBS中的浓度提供了在HeLa细胞中的转染后24小时的强荧光信号。对于葡聚糖的研究中，80微克/毫升的10 kDa的绿色荧光葡聚糖推荐。此后，该解决方案将被称为一个的“向量解决方案”。
- 从井除去细胞培养基和冲洗三次，用1×PBS。
- 吸取1,370微升的载体溶液制备步骤4.2为好。这将导致约1.3mm的液下深度。
- 将包含在所述平台的中心的矢量溶液阱。降低气体喷嘴向先前标记级别指示为3毫米的幻灯片上述喷嘴的高度。
- 在LabVIEW程序设定氦的流量，并选择要使用的所需的运动模式。选择“运行”准备开始通透通讯协定时。会有在此期间，在质量流量控制器正在准备提供必要的流量的初始滞后期。一旦适当的流量已经达到时，LabVIEW程序将启动步进马达来移动以及在期望的通透模式。一旦该平台已停止，等待大约30秒，取出向量的解决方案。注意：最优透附近发生的100到200帕的动态压力在喷嘴出口处，取决于毛细管直径。
- 用1×PBS洗好三倍。
- 用新鲜的培养基填充好。
- 对于实验所需数量4.6 - 重复步骤4.3。注意：一定要包括控制样本，包括油井被充满向量解决方案，而该气体射流被辗过他们。离开溶液，对照孔约1分钟，然后进行步骤4.5和4.6。
- 如果运行的hrGFP的转染实验中，返回6孔板到培养箱24小时，以允许转染材料由细胞中转录。如果运行葡聚糖通透性实验，返回6孔板到孵化器15分钟。
5。细胞成像
- 如果需要的话，马上前成像，染液适当的活/死染色评估细胞死亡。
- 与approp细胞图像riate显微镜研究转/通透效果。
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Representative Results
HeLa细胞以利用氦的气体喷射用0.86毫米内径毛细管10 kDa的绿色荧光葡聚糖透示于图1。细胞进行复通透与2μl/ ml的ETHD-1溶液（LIVE / DEAD活力/细胞毒性试剂盒）进行可视化细胞死亡之后。紧随复染，盖玻片封片和成像。该图中示出了在相对于对照样品三个不同的出口压力运行氦气喷射的效果。注意的是，透磁迹宽度和效率增加具有更高的动态压力和细胞死亡仅表现出轻微增加（A和B）。然而，一旦一个高动态压力达到，HeLa细胞的盖玻片上剥离并发生非常小的外围通透。以前由乔伊纳德进行细胞剥离和转染效率的更详细的分析-佩尔蒂埃等 15
通过扫描电子显微镜研究，微细孔中观察到细胞膜上（ 图2）。用氦气喷射与在300帕的出口压力随着透协议0.86毫米内径的毛细管进行的HeLa细胞的通透性，细胞立即固定在1x PBS中的1％多聚甲醛溶液中。
图1。 HeLa细胞以利用氦的气体喷射为0.86毫米的毛细管喷嘴内径10 kDa的绿色荧光葡聚糖通透性。葡聚糖荧光绿和死细胞的荧光135帕B）和 C红A）动态100帕的压力175帕D））控制与右旋糖酐B加入UT斯达康没有接触到氦气喷射。
图2。 SEM图像在50,000×HeLa细胞的表面在300帕A）控制样品呈现出平滑的细胞表面B）透化细胞表现出与84纳米直径的孔的表面下气体射流通透的放大倍率 。 点击这里查看大图 。
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Discussion
惰性气体喷射通透是贴壁细胞转染的有效技术。它提供了传送生物分子进入细胞的使用的机械力，从而省去了潜在的有害化学物质或病毒载体的能力。该技术可以潜在地给研究者和临床医生的效率和相对简单的方法来精确地转染的细胞。透化的选择性也是唯一允许研究人员只是将某些细胞中的单个菌落这可能是在多种应用中是有用的。
一些参数可以为个别的实验，如毛细管喷嘴直径和角度，气体流速，液体和毛细管高度，细胞系，靶生物分子也可以使用，并且惰性气体的类型进行调整。一组液位和毛细管高度的过程已被描述和被选择这些值以尽量减少参与本experime变量数NTS。目前，我们正在使用实验流程可视化和计算流体动力学建模系统。这将为我们提供一个更好的理解传授对细胞的力量，使我们能够确定的变量，如液体性质的通透的依赖。
取最大动态压力下，细胞可存活的注释是很重要的。人们发现，一旦动态压力接近200帕为3毫米的气体喷嘴的高度，HeLa细胞的剥离变得容易。这与其他研究如Lu 等人。谁观察野生NR6成纤维细胞脱落在200-265帕17。如果有大量剥离的发生，降低气体流速应减轻这个问题。同样，高流速导致细胞死亡和假阳性通透的效果。一旦细胞已经死亡，他们将成为渗透分子，因此死亡的细胞可被误认为是透活细胞。它因此，建议进行活/死测定法，以确保透细胞实际上仍然活着。随着压力的增加，我们的实验室死亡增加发现，在390帕广大透HeLa细胞都死了15。以上的较长时间的细胞存活率也进行了研究，以hrGFPII-1的表达被观察到72小时后的透化（数据未显示）。进一步的研究目前正在进行在更长的时间点进行调查的可行性。
我们的假设是，在细胞上的流体剪切应力，通过气体的喷射和媒体的位移产生，导致细胞质膜的暂时中断。这是提出了其他更复杂的物理方法如微气泡崩溃和声孔效应18相同的机制。的操作条件下，此方法都依赖于细胞，附着到衬底上，该细胞的机械性能，飞行和细胞壁中，感兴趣的分子，所述液体和气体的性质，和设置的物理尺寸。通过尺寸排阻研究中，我们已经发现，葡聚糖分子大于40 kDa的放大显示非常低的透化效率和最佳的右旋糖酐大小为10 kDa的用于实验15。这是很重要的，因为它限制了可以使用该协议来透入细胞的分子的大小。到目前为止，我们只研究了质粒转染特性。进一步的研究将确定较大块的遗传物质是否能够使用该技术被转染。
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Disclosures
作者宣称他们没有竞争的经济利益。
Acknowledgments
笔者想感谢以下资金来源：健康研究加拿大学院（CIHR），自然科学和工程研究理事会（NSERC）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vitality hrGFPII-1 | Agilent Technologies Canada | 240143-57 | Green fluorescent protein for transfection experiments on HeLa cells |
| Dextran, AlexaFluor 488; 10,000 MW, Anionic, Fixable | Life Technologies Inc. | D22910 | dextran for permeabilization experiments |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit | Life Technologies Inc. | L3224 | for counterstaining of mammalian cells |
| Prolong Gold Antifade Reagent | Invitrogen | P36930 | for mounting slides when imaging |
| Ultra High Purity Helium | Praxair Canada Inc. | HE 5.0UH-T | |
| Hyclone DMEM/ High Glucose Media - 500 ml | Thermo Scientific | SH30022.01 | for HeLa cells |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 26140079 | For DMEM media |
| Penicillin-Streptomycin, liquid | Invitrogen | 15140-122 | For DMEM media |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) 1x | Produced in lab | ||
| Table 1. List of required reagents | |||
| 6-Well Clear TC-Treated Microplates | Corning | 3506 | |
| #1 22 x 22 Coverslips | Fisher | 12-542B | |
| Glass Capillaries | World Precision Instruments | WPI Sizing Information | |
| ID (mm): 1, 0.86, 0.68, 0.5 Order #: 1B200, 1B150, 1B120, 1B100 | |||
| Mass-Flo Controller | MKS | M100B01314CS1BV | Mass flow controller, Series M100B, requires an external 12 V power supply |
| USB-6009 DAQ Device | National Instruments | 779026-01 | |
| UniSlide Assembly with stepping motor and controller | Velmex | Two series MA15 UniSlide Assemblies, fitted with Vexta 1.8° stepping motors provided by Velmex, and controlled by a VXM Stepping Motor Controller | |
| Table 2. List of required equipment |
References
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