Summary
Questo protocollo descrive un metodo per la permeabilizzazione temporanea di cellule aderenti mediante un getto di gas inerte. Questa tecnica facilita il trasferimento di materiale genetico e biomolecole in cellule di mammifero aderenti mediante l'utilizzo delle forze meccaniche di distruggere la membrana plasmatica.
Abstract
Esistono varie tecniche di trasfezione cellulare e questi possono essere suddivisi a tre grandi categorie: virale, chimici e meccanici. Questo protocollo descrive un metodo meccanico per permeabilize temporalmente cellule aderenti mediante un getto di gas inerte che può facilitare il trasferimento di normalmente macromolecole non permeabili nelle cellule. Crediamo che questa tecnica funziona impartendo forze di taglio sulla membrana plasmatica di cellule aderenti, causando la formazione temporanea di micropori. Una volta che questi pori sono creati, le cellule sono poi permeabile al materiale genetico e altre biomolecole. Le forze meccaniche coinvolte non corrono il rischio di cellule permanentemente danneggiare o staccano dal loro substrato. Esiste, quindi, una ristretta gamma di dinamica dei gas inerti dove la tecnica è efficace. Un getto di gas inerte è dimostrata efficace in permeabilizzante varie linee cellulari aderenti, compresi HeLa, HEK293 e cellule endoteliali dell'aorta addominale umani. Questo protocollo è appropriato per la permeabilization di cellule aderenti sia in vitro che, come abbiamo dimostrato, in vivo, mostrando esso può essere usato per la ricerca e potenzialmente in future applicazioni cliniche. Essa ha anche il vantaggio di permeabilizzante cellule in modo spazialmente restrittiva, che potrebbe rivelarsi un valido strumento di ricerca.
Introduction
Con l'evoluzione della biomedicina e la comprensione della meccanica delle cellule, la consegna di biomolecole nelle cellule è diventato di vitale importanza per molti settori di ricerca e le terapie mediche. Diverse tecniche sono state sviluppate per introdurre molecole estranee attraverso la membrana plasmatica e nel citoplasma cellulare. Questi possono essere generalmente classificati come: tecniche virale, chimici o meccanici. Tecniche virali possono trasfettare materiale genetico come RNA e DNA utilizzando vettori virali 1. Tecniche virali tendono ad avere alte efficienze in certe linee cellulari, tuttavia hanno il potenziale di reazioni immunitarie e infiammatorie 2. I metodi più comuni di transfezione chimici includono precipitazione con fosfato di calcio a 3, esotossine batteriche 4 e lipofezione 5. Queste tecniche hanno dimostrato di essere efficace, tuttavia, alcuni problemi sorgono come tossicità cellulare e non specificità. Inoltre, tecniche come phosphat calcioe precipitazione sono stati trovati per avere efficienze di trasfezione fino al 70%, ma solo in certe linee cellulari, raramente in cellule primarie 6. Questo è da notare come crescenti sforzi di ricerca sono stati messi in cellule primarie, soprattutto nel caso di progettazione di vari trattamenti per uso clinico e lo studio del funzionamento del DNA.
Interruzione temporale della membrana cellulare attraverso stimoli meccanici è un'alternativa per introdurre molecole estranee nelle cellule. Tecniche includono: microiniezione di molecole 7, elettroporazione usando un campo elettrico di distruggere la membrana 8,9, sonoporazione utilizzando onde ad ultrasuoni per distruggere la membrana cellulare 10-12, bombardamento di particelle come dimostrato dal "gene gun", che spara particelle legate con geni nella cella 13, e, più recentemente, l'applicazione di un fluido sforzo di taglio che ha dimostrato di permeabilize temporalmente cellule di mammifero 14,15. Sebbene meccanicometodi AL evitare alcuni dei problemi di cui sopra, sono in genere accompagnati da efficienze inferiori e configurazioni molto complesse e specializzate. Una torcia scarica a bagliore a pressione atmosferica (APGD-t) è stato sviluppato presso la McGill con l'obiettivo iniziale di funzionalizzazione di superfici e staccando le cellule aderenti in vitro 16. Casualmente, si è scoperto che una macchia dal vivo / morto utilizzato era in qualche modo essere presa in dalle cellule senza essere aggiunto un agente permeabile. Inoltre, questo sembrava si sono verificati solo in aree ristrette dei pozzi che è accaduto a corrispondere con il percorso della torcia. Da studi sulle capacità di permeabilizzazione della APGD-t proseguito in studi di controllo, è stato trovato che il gas di trasporto inerte getto di plasma senza eccitazione era anche in grado di permeabilize cellule. Questo contraddice l'ipotesi iniziale che le specie reattive create dal getto di plasma alterati temporaneamente la funzione della membrana e ha suggerito che semplicemente le meccanicheforze CAL erano sufficienti a causare permeabilizzazione cellulare. Da qui, gli studi continuarono nel nostro laboratorio per cercare di quantificare e caratterizzare l'efficienza permeabilizzazione di un getto di gas inerte come pure un'occhiata alle sue capacità di trasfezione 16.
Attraverso questi studi, si è scoperto che micropori costituiscano effettivamente nella membrana plasmatica, e questi pori tendono a richiudere entro circa 5 sec 15. Abbiamo dimostrato l'utilità della tecnica in vitro e in vivo nella membrana corioallantoidea di embrione di pollo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Sviluppo di LabView Programma
- Un controllore di flusso di massa (MKS M100B Mass-Flo Controller) è collegato alla linea di gas elio per garantire una portata gas precisa. Questa unità è controllata da una tensione di ingresso, compreso tra 0 e 5 V. Un circuito di controllo nel programma LabView determina la tensione richiesta in un dato momento. Interfacciamento tra il computer ed il controllore di flusso di massa è eseguita con un dispositivo di acquisizione dati (NI USB-6009), e un alimentatore 12 V fornisce alimentazione al controllore di flusso di massa.
- Due slitte di posizionamento lineari sono usati per controllare il movimento della piastra da 6 pozzetti, uno per ciascuna direzione. Ogni gruppo è costituito da una serie MA15 Velmex Assemblea Unislide accoppiato con un motore passo-passo, ed entrambi i gruppi sono controllati da un unico Velmex VXM Stepping Motor Controller. Il controllore consente pareggiare manuale di ogni motore o accetta una stringa di comandi seriali esterni, la cui combinazione consente di movimento specifico patterns. Diversi modelli possono essere programmati nel programma LabView, richiedere all'utente di fornire solo la velocità torcia desiderato così come le dimensioni di percorso.
2. Preparazione delle attrezzature
- Aprire sia la bombola di elio e il regolatore.
- Accendere il controller del motore.
- Aprire il programma LabView e verificare tutte le condizioni.
- Assicurarsi che la piattaforma sia centrato. Per controllare, guardare in ogni fase del motore e verificare che ogni carrello non è vicino a entrambe le estremità palco. O hanno al centro del programma le carrozze o regolare manualmente utilizzando i comandi da jogging sul frontale del controller del motore.
- Se questa è la prima corsa della giornata, si consiglia di eseguire il programma una volta senza le cellule, al fine di garantire il setup è corretto.
3. Preparazione del Height Gas Jet capillare Nozzle
- Rimuovere il capillare dal supporto e azzerare il quadrante altezza.
- Posizionare la piastra da 6 pozzetti on la piattaforma.
- Sostituire e abbassare il capillare getto di gas al fondo del pozzo fino a raggiungere il vetrino. Fissare la capillare nel supporto.
- Utilizzando la manopola di altezza, sollevare il capillare 3 mm. Segnare questa altezza sulla base capillare.
- Sollevare il capillare a un'altezza di sicurezza e quindi rimuovere la piastra da 6 pozzetti.
4. Cella Permeabilization protocollo
- Culture linea cellulare aderente a confluenza sul coperchio vetro scivola in una piastra da 6 pozzetti utilizzando tecniche di coltura standard. Per le cellule HeLa, sementi 6 pozzetti con 2 x 10 5 cellule per pozzetto e incubare per 48 ore prima del trattamento.
- Preparare appropriato volume di soluzione contenente il vettore desiderato. Per hrGFPII-1, una concentrazione di 50 ng / ml in PBS 1x fornisce un forte segnale fluorescente in cellule HeLa 24 ore dopo la trasfezione. Per gli studi di destrano, si raccomanda di 80 mg / ml di 10 kDa destrano fluorescente verde. D'ora in poi, questa soluzione si farà riferimento ad uns "vettore soluzione".
- Rimuovere cellule di coltura da bene e sciacquare tre volte con PBS 1x.
- Pipettare 1.370 ml di soluzione di vettore preparati in fase 4.2 nel bene. Ciò dovrebbe tradursi in una profondità liquida di circa 1,3 mm.
- Posizionare il pozzetto contenente il vettore soluzione nel centro della piattaforma. Abbassare l'ugello getto di gas al livello precedentemente contrassegnato indica un'altezza di ugello 3 mm sopra la diapositiva.
- Impostare portata elio nel programma LabView e selezionare il modello di movimento desiderata da utilizzare. Seleziona "Esegui" quando è pronto per iniziare il protocollo di permeabilizzazione. Ci sarà un periodo di ritardo iniziale in cui il controllore di flusso di massa si appresta a fornire la portata necessaria. Una volta portata appropriata è stato raggiunto, il programma LabView attiverà i motori passo-passo per spostare il bene nel modello permeabilizzazione desideri. Una volta che la piattaforma è fermato, attendere circa 30 sec e rimuovere la soluzione vettoriale.Nota: permeabilizzazione ottimale si verifica vicino ad una pressione dinamica di 100 a 200 Pa all'uscita dell'ugello, a seconda del diametro del capillare.
- Lavare ben tre volte con PBS 1x.
- Riempire bene con terreni di coltura fresco.
- Ripetere i passaggi 4,3-4,6 per il numero desiderato di esperimenti. Nota: Assicurati di includere campioni di controllo che consistono di pozzi essere riempiti con la soluzione di vettore senza il getto di gas che viene eseguito su di loro. Lasciare la soluzione nei pozzetti di controllo per circa 1 minuto poi procedere alle fasi 4.5 e 4.6.
- Se si esegue un esperimento di transfezione hrGFP, ritorno 6 pozzetti di incubatore per 24 ore per permettere il materiale transfettati da trascrivere dalle cellule. Se si esegue un esperimento di permeabilizzazione destrano, ritorno 6 pozzetti di incubatore per 15 min.
5. Imaging cellulare
- Se lo si desidera, subito prima di imaging, di contrasto con adeguate macchia dal vivo / morto per valutare la morte cellulare.
- Celle di immagine con appropriate microscopio per studiare l'efficacia di trasfezione / permeabilizzazione.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Permeabilizzazione delle cellule HeLa con 10 kDa destrano fluorescente verde utilizzando un getto di gas elio con un diametro interno di 0,86 millimetri capillare è mostrato in Figura 1. Le cellule sono state contrastate immediatamente dopo permeabilizzazione con 2 microlitri / ml EthD-soluzione 1 (LIVE / DEAD Viabilità / citotossicità Kit) per visualizzarne la morte cellulare. Subito dopo di contrasto, vetrini sono stati montati e ripreso. Questa figura mostra risultati dell'esecuzione del getto di gas elio a tre differenti pressioni di uscita rispetto ad un campione di controllo. Si noti che la carreggiata permeabilizzazione ed efficienza aumentata con una pressione più elevata dinamica e la morte cellulare solo mostrato un lieve incremento (A e B). Tuttavia, una volta che è stato raggiunto un alta pressione dinamica, cellule HeLa sono stati spogliati dai scivola coperchio e si è verificato poco permeabilizzazione periferico. Un'analisi più dettagliata della spoliazione delle cellule e l'efficienza di trasfezione è stato precedentemente condotto da Chouinard-Pelletier et al 15.
Attraverso studi di microscopia elettronica a scansione, micropori sono stati osservati nella membrana cellulare (Figura 2). Permeabilizzazione delle cellule HeLa è stata effettuata utilizzando un getto di gas elio con un capillare diametro interno 0,86 millimetri ad una pressione di uscita di 300 Pa. In seguito il protocollo permeabilizzazione, le cellule sono state immediatamente fissate con una soluzione di paraformaldeide all'1% in PBS 1x.
Figura 1. Permeabilizzazione delle cellule HeLa con 10 kDa destrano fluorescente verde utilizzando un getto di gas elio con un diametro interno ugello capillare di 0,86 mm. Destrano fluorescente verde cellule morte e fluorescenza rossa. A) Pressione dinamica di 100 Pa, B) di 135 Pa, e C ) di 175 Pa. D) controllo con destrano aggiunto bUT Nessuna esposizione al getto di gas elio.
Figura 2. Immagini SEM a un ingrandimento di 50.000 X della superficie delle cellule HeLa seguenti gas jet permeabilizzazione a 300 Pa. A) del campione di controllo che presenta una superficie cellulare liscia. B) Superficie delle cellule permeabilizzate esibendo un poro con diametro 84 nm. Clicca qui per ingrandire la figura .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Getto di gas inerte permeabilizzazione è una tecnica utile per la trasfezione di cellule aderenti. Offre la possibilità di trasferire biomolecole nelle cellule con l'uso di forze meccaniche, che elimina la necessità di prodotti chimici potenzialmente dannosi o vettori virali. La tecnica potrebbe potenzialmente offrire ai ricercatori e medici un modo efficiente e relativamente semplice per transfettare con precisione le cellule. La selettività del permeabilizzazione è unico anche consentendo ai ricercatori di trattare solo alcune celle in una singola colonia che potrebbe essere utile in molteplici applicazioni.
Diversi parametri possono essere regolati per sperimentazione individuale come diametro dell'ugello capillare e l'angolo, portata del gas, liquido e l'altezza capillare, linea cellulare, biomolecola bersaglio da utilizzare ed il tipo di gas inerte. Un livello impostato liquido ed altezza capillare sono stati descritti nella procedura e questi valori sono stati scelti per minimizzare il numero di variabili coinvolte nel nostro experimenti. Attualmente, stiamo modellando il sistema con visualizzazione del flusso sperimentale e la fluidodinamica computazionale. Questo ci darà una migliore comprensione delle forze impartite sulle cellule, che ci permette di determinare dipendenza del permeabilizzazione a variabili quali le proprietà del liquido.
E 'importante prendere atto della pressione dinamica massima in base al quale le cellule possono sopravvivere. Si è constatato che le pressioni volta dinamici avvicinavano 200 Pa per un'altezza ugello getto di gas di 3 mm, strippaggio cellule HeLa diventato probabile. Questo concorda con altri studi come Lu et al. Hanno osservato WT NR6 distacco delle cellule dei fibroblasti a 200-265 Pa 17. In caso di grandi quantità di stripping, un flusso di gas inferiore dovrebbe alleviare questo problema. Analogamente, portate elevate provocano morte cellulare e permeabilizzazione risultati falsi positivi. Una volta che le cellule sono morte diventeranno permeabili a molecole e quindi le cellule morte possono essere scambiati per cellule vive permeabilizzate. EssoSi raccomanda pertanto di effettuare un test dal vivo / morto per garantire che le cellule permeabilizzate sono in realtà ancora viva. Morte aumenta con l'aumento della pressione e il nostro laboratorio ha scoperto che a 390 Pa la maggior parte delle cellule HeLa permeabilizzate erano morti 15. La vitalità cellulare per un periodo prolungato di tempo è stato anche valutato, con hrGFPII-1 viene osservato fino a 72 ore post-permeabilizzazione (dati non mostrati). Ulteriori studi sono attualmente in corso per indagare la vitalità in momenti ancora più lunghi.
La nostra ipotesi è che le sollecitazioni di taglio fluido sulle cellule, create dal getto di gas e lo spostamento dei mezzi di comunicazione, causano temporanea interruzione della membrana plasmatica delle cellule. Questo è lo stesso meccanismo proposto per gli altri metodi fisici più complessi come collasso delle microbolle e sonoporazione 18. Le condizioni operative per questo metodo sono dipendenti dal tipo di cellule, attaccamento al substrato, le proprietà meccaniche della cellae parete cellulare, molecola di interesse, proprietà del liquido e gas, e le dimensioni fisiche della configurazione. Attraverso studi esclusione dimensionale, abbiamo trovato che le molecole di destrano maggiori di 40 kDa mostrano molto bassa efficienza permeabilizzazione e che la dimensione ottimale è destrano 10 kDa per la sperimentazione 15. Questo è importante in quanto limita la dimensione delle molecole che possono essere permeabilizzate nelle cellule usando questo protocollo. Finora, abbiamo investigato solo le proprietà di trasfezione di plasmidi. Ulteriori studi dovranno verificare se le più grandi parti di materiale genetico sono in grado di essere trasfettate utilizzando questa tecnica.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare le seguenti fonti di finanziamento: Canadian Institutes of Health Research (CIHR), le scienze naturali e ingegneria Research Council (NSERC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vitality hrGFPII-1 | Agilent Technologies Canada | 240143-57 | Green fluorescent protein for transfection experiments on HeLa cells |
| Dextran, AlexaFluor 488; 10,000 MW, Anionic, Fixable | Life Technologies Inc. | D22910 | dextran for permeabilization experiments |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit | Life Technologies Inc. | L3224 | for counterstaining of mammalian cells |
| Prolong Gold Antifade Reagent | Invitrogen | P36930 | for mounting slides when imaging |
| Ultra High Purity Helium | Praxair Canada Inc. | HE 5.0UH-T | |
| Hyclone DMEM/ High Glucose Media - 500 ml | Thermo Scientific | SH30022.01 | for HeLa cells |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 26140079 | For DMEM media |
| Penicillin-Streptomycin, liquid | Invitrogen | 15140-122 | For DMEM media |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) 1x | Produced in lab | ||
| Table 1. List of required reagents | |||
| 6-Well Clear TC-Treated Microplates | Corning | 3506 | |
| #1 22 x 22 Coverslips | Fisher | 12-542B | |
| Glass Capillaries | World Precision Instruments | WPI Sizing Information | |
| ID (mm): 1, 0.86, 0.68, 0.5 Order #: 1B200, 1B150, 1B120, 1B100 | |||
| Mass-Flo Controller | MKS | M100B01314CS1BV | Mass flow controller, Series M100B, requires an external 12 V power supply |
| USB-6009 DAQ Device | National Instruments | 779026-01 | |
| UniSlide Assembly with stepping motor and controller | Velmex | Two series MA15 UniSlide Assemblies, fitted with Vexta 1.8° stepping motors provided by Velmex, and controlled by a VXM Stepping Motor Controller | |
| Table 2. List of required equipment |
References
- Rosenberg, S. A., et al. Gene transfer into humans--immunotherapy of patients with advanced melanoma, using tumor-infiltrating lymphocytes modified by retroviral gene transduction. The New England Journal of Medicine. 323, 570-578 (1990).
- Yang, Y., et al. Cellular immunity to viral antigens limits E1-deleted adenoviruses for gene therapy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 4407-4411 (1994).
- Chen, C., Okayama, H. High-efficiency transformation of mammalian cells by plasmid DNA. Molecular and cellular biology. 7, 2745-2752 (1987).
- Walev, I., et al. Delivery of proteins into living cells by reversible membrane permeabilization with streptolysin-O. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 3185-3190 (2001).
- Felgner, P. L., et al. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84, 7413-7417 (1987).
- Hamm, A., Krott, N., Breibach, I., Blindt, R., Bosserhoff, A. K. Efficient transfection method for primary cells. Tissue engineering. 8, 235-245 (2002).
- Rauth, S., Kucherlapati, R. S. Expression of DNA Transferred into Mammalian-Cells. J. Bioscience. 6, 543-567 (1984).
- Spandidos, D. A. Electric field-mediated gene transfer (electroporation) into mouse Friend and human K562 erythroleukemic cells. Gene analysis techniques. 4, 50-56 (1987).
- Chu, G., Hayakawa, H., Berg, P. Electroporation for the efficient transfection of mammalian cells with DNA. Nucleic Acids Research. 15, 1311-1326 (1987).
- Fechheimer, M., et al. Transfection of mammalian cells with plasmid DNA by scrape loading and sonication loading. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84, 8463-8467 (1987).
- Koch, S., Pohl, P., Cobet, U., Rainov, N. G. Ultrasound enhancement of liposome-mediated cell transfection is caused by cavitation effects. Ultrasound in Medicine & Biology. 26, 897-903 (2000).
- Greenleaf, W. J., Bolander, M. E., Sarkar, G., Goldring, M. B., Greenleaf, J. F. Artificial cavitation nuclei significantly enhance acoustically induced cell transfection. Ultrasound in Medicine & Biology. 24, 587-595 (1998).
- Yang, N. S., Burkholder, J., Roberts, B., Martinell, B., McCabe, D. In vivo and in vitro gene transfer to mammalian somatic cells by particle bombardment. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87, 9568-9572 (1990).
- Hallow, D. M., et al. Shear-induced intracellular loading of cells with molecules by controlled microfluidics. Biotechnology and Bioengineering. 99, 846-854 (2008).
- Chouinard-Pelletier, G. L., Guay, M., Coulombe, D., Leask, S., L, R., Jones, E. Use of inert gas jets to measure the forces required for mechanical gene transfection. Biomedical Engineering Online. 11, (2012).
- Leduc, M., Coulombe, S., Leask, R. L. Atmospheric Pressure Plasma Jet Deposition of Patterned Polymer Films for Cell Culture Applications. Ieee T. Plasma Sci. 37, 927-933 (2009).
- Lu, H., et al. Microfluidic shear devices for quantitative analysis of cell adhesion. Analytical Chemistry. 76, 5257-5264 (2004).
- Sankin, G. N., Yuan, F., Zhong, P. Pulsating tandem microbubble for localized and directional single-cell membrane poration. Physical Review Letters. 105, 078101 (2010).
