Summary
Dit protocol beschrijft een werkwijze voor de tijdelijke permeabilisatie van hechtende cellen met een inert gas jet. Deze techniek bevordert de overdracht van genetisch materiaal en biomoleculen in hechtende zoogdiercellen door het gebruik van mechanische krachten op het plasmamembraan verstoren.
Abstract
Verschillende celtransfectie technieken bestaan en deze kunnen worden onderverdeeld in drie grote categorieën: virale, chemische en mechanische. Dit protocol beschrijft een mechanische methode om tijdelijk doorlaatbaar hechtende cellen met een inerte gasstroom die de overdracht van gewoonlijk ondoorlaatbare macromoleculen in cellen kan vergemakkelijken. Wij geloven dat deze techniek werkt door het meegeven van schuifkrachten op het plasmamembraan van hechtende cellen, waardoor de tijdelijke vorming van microporiën. Zodra deze poriën worden gecreëerd, de cellen worden vervolgens doorlaatbaar voor genetisch materiaal en andere biomoleculen. De mechanische krachten betrokken hebben, lopen het risico van blijvend beschadigen of losmaken cellen van hun substraat. Er is dus een beperkt aantal inert gas dynamiek waar deze techniek effectief is. Een inert gas jet is efficiënt gebleken bij permeabilizing verschillende hechtende cellijnen waaronder HeLa, HEK293 en menselijke abdominale aorta endotheelcellen. Dit protocol is geschikt voor de permeabilization van hechtende cellen zowel in vitro en, zoals aangetoond in vivo laten zien kan worden gebruikt voor onderzoek en mogelijk toekomstige klinische toepassingen. Het heeft ook het voordeel van permeabilisatie cellen in een ruimtelijk restrictief, waardoor zeer waardevol onderzoeksinstrument zijn.
Introduction
Met de evolutie van de medische biologie en het begrip van cel mechanica, is de levering van biomoleculen in cellen van vitaal belang voor vele onderzoeksgebieden en medische therapieën. Verschillende technieken zijn ontwikkeld om vreemde moleculen te introduceren door het plasmamembraan en de cel cytosol. Deze kunnen in het algemeen worden geclassificeerd als: virale, chemische of mechanische technieken. Virale technieken genetisch materiaal transfecteren zoals RNA en DNA onder toepassing van virale vectoren 1. Virale technieken hebben de neiging om een hoog rendement behalen in bepaalde cellijnen, maar ze hebben wel het potentieel voor immuun-en ontstekingsreacties 2. Gebruikelijke chemische transfectie werkwijzen omvatten precipitatie met calciumfosfaat 3, bacteriële exotoxinen 4 en 5 lipofectie. Deze technieken hebben bewezen effectief te zijn, maar ook problemen zoals toxiciteit cel en niet specifiek. Bovendien technieken zoals calcium Phosphate precipitatie gevonden transfectie efficiënties tot 70% maar alleen in bepaalde cellijnen, primaire cellen zelden 6. Dit is opmerkelijk het verhogen onderzoeksinspanningen worden in primaire cellen brengen, met name bij het ontwerpen van verschillende behandelingen voor klinisch gebruik en de studie van DNA functioneren.
Tijdelijke verstoring van het celmembraan door mechanische stimuli is een alternatief voor het inbrengen van vreemde moleculen in cellen. Technieken omvatten: micro-injectie van moleculen 7, elektroporatie met behulp van een elektrisch veld aan het membraan 8,9 verstoren, sonoporatie met ultrasone golven aan het celmembraan 10-12, met deeltjes verstoren zoals blijkt uit de "gene gun", welke deeltjes gebonden met scheuten genen in de cel 13, en meer recent, de toepassing van vloeistofschuifspanning die is getoond om tijdelijk doorlaatbaar zoogdiercellen 14,15. Hoewel monteural methoden voorkomen dat sommige van de bovengenoemde onderwerpen, zijn ze meestal gepaard met een lagere efficiëntie en zeer complexe en gespecialiseerde instellingen. Een atmosferische druk glimontlading fakkel (APGD-t) is ontwikkeld aan de McGill met het oorspronkelijke doel van functionaliserende oppervlakken en losmaken hechtende cellen in vitro 16. Vanzelf werd ontdekt dat een levende / dode vlek gebruikt werd ergens in genomen door cellen zonder permeabilisatie middel toegevoegd. Bovendien, dit leek te hebben plaatsgevonden alleen in gebieden van de putten, die toevallig overeenkomen met de fakkel pad beperkt. Onderzoek naar de permeabilisatie mogelijkheden van de APGD-t voortgezet en controle studies bleek dat de drager inert gas straal van het plasma zonder excitatie was ook in staat om cellen te permeabiliseren. Deze tegenspraak met de eerste hypothese dat de reactieve stoffen die door het plasma jet tijdelijk verminderde het membraan functie en suggereerde dat gewoon de mechanischecal krachten waren voldoende om cel permeabilisatie veroorzaken. Vanaf hier studies verder in ons lab om te proberen en te kwantificeren en karakteriseren van de permeabilisatie efficiëntie van een inert gas jet evenals blik op de transfectie mogelijkheden 16.
Door deze studies is gebleken dat microporiën daadwerkelijk deel in het plasmamembraan en deze poriën vaak sluit op ongeveer 5 sec 15. We hebben bruikbaarheid van de techniek in vitro en in vivo in het chorioallantoïsmembraan van een kippenembryo aangetoond.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Ontwikkeling van LabView Program
- Een massadebietregelaar (MKS M100B Mass-Flo Controller) is de heliumgas lijn bevestigd aan een nauwkeurige gasstroom te waarborgen. Deze wordt bediend door een ingangsspanning tussen 0 en 5 V. Een regelkring in het LabView programma bepaalt de gewenste spanning op een bepaald moment. Interfacing tussen de computer en de massadebietregelaar wordt uitgevoerd door een data-acquisitie apparaat (NI USB-6009), en een 12 V voeding levert stroom aan de massastroom controller.
- Twee positionering lineaire geleidingen worden gebruikt om de beweging van de 6-well plaat, een voor elke richting besturen. Elke module bestaat uit een MA15-serie Velmex Unislide Montage in combinatie met een stappenmotor, en beide vergaderingen worden gecontroleerd door een enkele Velmex VXM stappenmotor controller. De regelaar kan met de hand joggen van elke motor of accepteert een reeks externe seriële commando, de combinatie waarmee specifieke beweging patterns. Verscheidene patronen kunnen worden geprogrammeerd in het LabView programma, dat de gebruiker alleen de gewenste toorts snelheid en het pad afmetingen leveren.
2. Voorbereiding van de apparatuur
- Open zowel de helium cilinder en regelaar.
- Zet de motor controller.
- Open het LabView programma en controleer alle omstandigheden.
- Zorg ervoor dat het platform in het midden. Om te controleren, kijk naar elke motor stadium en controleer dat elke wagen is niet in de buurt van beide eind stadium. Ofwel het programma midden de rijtuigen of handmatig aanpassen met de jogging bedieningselementen aan de voorzijde van de motor controller.
- Als dit de eerste run van de dag, is het raadzaam om het programma een keer draaien zonder cellen, om ervoor te zorgen de installatie goed werkt.
3. Voorbereiding van het Gas Jet capillaire Nozzle Hoogte
- Verwijder het capillair uit de houder en de hoogte draaiknop nul.
- Plaats de 6-well plaat on het platform.
- Vervangen en laat de gasstraal capillair naar de bodem van de put tot in de dekglas raakt. Zet het capillair in de houder.
- Met behulp van de hoogte wijzerplaat, verhogen de capillaire 3 mm. Markeer deze hoogte de capillaire basis.
- Breng de capillaire naar een veilige hoogte en verwijder vervolgens de 6-wells plaat.
4. Cel Permeabilisatie Protocol
- Cultuur hechtende cellijn tot confluentie op glas dekglaasjes in een 6-wells plaat met behulp van standaard kweektechnieken. Voor HeLa-cellen, zaden 6-well platen met 2 x 10 5 cellen per putje en incubeer 48 uur voor de behandeling.
- Bereid geschikt volume van de oplossing die het gewenste vector. Voor hrGFPII-1, een concentratie van 50 ng / ul in 1x PBS verschaft een sterk fluorescerend signaal in HeLa-cellen 24 uur na transfectie. Voor dextran studies, is 80 ug / ml 10 kDa groen fluorescent dextran aanbevolen. Voortaan zal deze oplossing worden doorverwezen naar eens "vector solution".
- Verwijder celcultuurmedia uit goed en spoel drie keer met 1x PBS.
- Pipet 1370 ul van vector bereid in stap 4.2 in goed. Dit moet resulteren in een vloeibare laag van ongeveer 1.3 mm.
- Plaats het putje met de vector oplossing in het midden van het platform. Laat de gasstraalspuitmond het eerder gemarkeerde niveau aangeeft een mondstuk hoogte van 3 mm boven de dia.
- Stel helium debiet in het LabView programma en selecteer de gewenste bewegingspatroon te gebruiken. Selecteer "Run" wanneer je klaar bent om de permeabilisatie protocol beginnen. Er zal een initiële vertraging periode waarin de massastroomregeleenheid bereidt zich voor om de nodige debiet te verschaffen. Zodra de juiste stroomsnelheid is bereikt, zal het LabView programma de stappenmotoren activeren om de put in de gewenste permeabilisatie patroon. Zodra het platform is gestopt, wacht ongeveer 30 seconden en verwijder de vector oplossing.Opmerking: Optimale permeabilisatie optreedt bij een dynamische druk van 100 tot 200 Pa bij de mondstukuitlaat, afhankelijk van de capillaire diameter.
- Goed wassen driemaal met 1x PBS.
- Vul goed met vers kweekmedium.
- Herhaal de stappen 4,3-4,6 voor de gewenste aantal experimenten. Opmerking: Zorg ervoor dat u de controle monsters die bestaan uit putten wordt gevuld met de vector-oplossing zonder de gas jet over hen wordt uitgevoerd omvatten. Laat de oplossing in de controleputjes ongeveer 1 min daarna verder met de stappen 4.5 en 4.6.
- Als een actief hrGFP transfectie experiment terug 6-wells plaat incubator gedurende 24 uur om getransfecteerde materiaal wordt getranscribeerd door de cellen. Als het runnen van een dextran permeabilization experiment, terug 6-wells plaat incubator gedurende 15 minuten.
5. Cell imaging
- Indien gewenst, direct voor de beeldvorming, tegenkleuring met gepaste live / dead vlek om celdood te evalueren.
- Afbeelding cellen met appropringen niet optreden microscoop om transfectie / permeabilisatie werkzaamheid onderzoeken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Permeabilisatie van HeLa cellen met 10 kDa groene fluorescent dextran met een helium gasstraal met een 0,86 mm inwendige capillair diameter getoond in figuur 1. Cellen werden onmiddellijk na permeabilisatie met 2 pl / ml EthD-1-oplossing (live / DEAD Leefbaarheid / Cytotoxicity Kit) om celdood te visualiseren tegengekleurd. Onmiddellijk na tegenkleuring, werden dekglaasjes gemonteerd en afgebeeld. Deze figuur toont de resultaten van het uitvoeren van de helium gasstraal op drie verschillende uitlaatdruk vergeleken met een controlemonster. Merk op dat de permeabilisatie spoorbreedte en efficiëntie toe met een hogere dynamische druk en celdood slechts licht gestegen (A en B). Echter, zodra een hoge dynamische druk werd bereikt, HeLa cellen werden ontdaan van de dekglaasjes en zeer weinig perifere permeabilisatie opgetreden. Een meer gedetailleerde analyse van cel strippen en transfectie-efficiëntie werd voorheen uitgevoerd door Chouinard-Pelletier et al.. 15
Door scanning elektronen microscopie studies werden microporiën waargenomen in de celmembraan (figuur 2). Permeabilisatie van HeLa-cellen werd uitgevoerd met een helium gasstraal met een 0,86 mm capillaire binnendiameter aan een uitlaatdruk 300 Pa Na permeabilisatie protocol werden de cellen onmiddellijk opgelost met 1% paraformaldehyde oplossing in 1x PBS.
Figuur 1. Permeabilisatie van HeLa-cellen met 10 kDa groen fluorescerend dextran met een helium gas jet met een capillair mondstuk inwendige diameter van 0,86 mm. Dextraan fluoresceert groen en dode cellen fluoresceren rood. A) Dynamische druk van 100 Pa, B) van 135 Pa, en C ) van 175 Pa D) Control met dextran toegevoegd but geen blootstelling aan heliumgas jet.
Figuur 2. SEM beelden bij een vergroting van 50.000 X van het oppervlak van HeLa-cellen na gas jet permeabilization bij 300 Pa A) Controle monster vertoont een glad celoppervlak. B) Oppervlakte van gepermeabiliseerde cel vertoont een porie met een 84 nm diameter. Klik hier om bekijk groter figuur .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Inert gas jet permeabilization is een nuttige techniek voor het aanhangend celtransfectie. Het biedt de mogelijkheid om biomoleculen overdracht in cellen met behulp van mechanische krachten, waardoor de behoefte aan potentieel schadelijke chemicaliën of virale vectoren elimineert. De techniek zou kunnen geven onderzoekers en werkers een efficiënte en relatief eenvoudige wijze nauwkeurig te transfecteren. De selectiviteit van de permeabilisatie is ook uniek voor onderzoekers die slechts bepaalde cellen behandeld met een enkele kolonie die bruikbaar zijn in verschillende toepassingen kunnen worden.
Verscheidene parameters kunnen worden aangepast voor afzonderlijke experimenten zoals capillair mondstuk diameter en hoek gasdebiet, vloeistof en capillaire hoogte cellijn doelbiomolecuul te gebruiken, en het type inert gas. Een reeks vloeistofniveau en capillaire hoogte zijn beschreven in de procedure en deze waarden werden gekozen om het aantal variabelen betrokken bij onze experime minimaliserengen. Momenteel zijn we de modellering van het systeem met behulp van experimentele stroom visualisatie en computational fluid dynamics. Dit zal ons een beter inzicht in de krachten bijgebracht op de cellen te geven, zodat we de afhankelijkheid van de permeabilisatie bepalen van variabelen zoals de vloeistof eigenschappen.
Het is belangrijk om kennis te nemen van de maximale dynamische druk waaronder de cellen kunnen overleven. Gebleken is dat zodra dynamische drukken naderde 200 Pa voor een gasstraalspuitmond hoogte van 3 mm, HeLa strippen werd waarschijnlijk. Dit komt overeen met andere studies, zoals Lu et al.. Die WT NR6 fibroblastcellijn detachement waargenomen bij 200-265 Pa 17. Als er grote hoeveelheden strippen optreden, moet een lagere gasstroom dit probleem te verlichten. Evenzo, hoge stroomsnelheden resulteren in celdood en vals-positieve permeabilisatie resultaten. Zodra cellen zijn gestorven zullen ze doorlaatbaar voor moleculen en dus dode cellen kan worden verward met gepermeabiliseerde levende cellen zijn. Hetwordt daarom aanbevolen om een live / dead-test uit te voeren om ervoor te zorgen dat de gepermeabiliseerde cellen zijn in feite nog in leven. Dood neemt toe met toenemende druk en ons lab bleek dat bij 390 Pa de meerderheid van gepermeabiliseerde HeLa-cellen dood 15 waren. Levensvatbaarheid van de cellen gedurende langere tijd is ook onderzocht met hrGFPII-1 expressie wordt waargenomen tot 72 uur na permeabilisatie (gegevens niet getoond). Verdere studies zijn momenteel aan de gang is om de levensvatbaarheid te onderzoeken op nog langere tijd punten.
Onze hypothese is dat vloeistof schuifspanning op de cellen, die door de gasstraal en de verplaatsing van de media veroorzaken tijdelijke verstoring van de cel plasmamembraan. Dit is hetzelfde voorgesteld voor de andere meer complexe fysische methoden zoals microbellen collaps en sonoporatie 18 mechanisme. De bedrijfsomstandigheden voor deze werkwijze zijn afhankelijk van het type cellen, hechting aan het substraat, mechanische eigenschappen van de celen celwand, molecuul van belang, eigenschappen van de vloeistof en gas, en de fysieke afmetingen van de setup. Door size exclusion studies hebben we gevonden dat dextran moleculen groter dan 40 kDa blijkt zeer laag rendement permeabilisatie en die optimale dextran is 10 kDa voor experimenten 15. Dit is belangrijk omdat het de grootte van moleculen die kunnen worden permeabel in cellen met dit protocol beperkt. Tot nu toe hebben we alleen onderzocht de eigenschappen transfectie van plasmiden. Verdere studies zullen bepalen of grotere stukken genetisch materiaal kunnen worden getransfecteerd met deze techniek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
De auteurs willen graag de volgende financieringsbronnen bedanken: Canadian Institutes of Health Research (CIHR), de Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vitality hrGFPII-1 | Agilent Technologies Canada | 240143-57 | Green fluorescent protein for transfection experiments on HeLa cells |
| Dextran, AlexaFluor 488; 10,000 MW, Anionic, Fixable | Life Technologies Inc. | D22910 | dextran for permeabilization experiments |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit | Life Technologies Inc. | L3224 | for counterstaining of mammalian cells |
| Prolong Gold Antifade Reagent | Invitrogen | P36930 | for mounting slides when imaging |
| Ultra High Purity Helium | Praxair Canada Inc. | HE 5.0UH-T | |
| Hyclone DMEM/ High Glucose Media - 500 ml | Thermo Scientific | SH30022.01 | for HeLa cells |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 26140079 | For DMEM media |
| Penicillin-Streptomycin, liquid | Invitrogen | 15140-122 | For DMEM media |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) 1x | Produced in lab | ||
| Table 1. List of required reagents | |||
| 6-Well Clear TC-Treated Microplates | Corning | 3506 | |
| #1 22 x 22 Coverslips | Fisher | 12-542B | |
| Glass Capillaries | World Precision Instruments | WPI Sizing Information | |
| ID (mm): 1, 0.86, 0.68, 0.5 Order #: 1B200, 1B150, 1B120, 1B100 | |||
| Mass-Flo Controller | MKS | M100B01314CS1BV | Mass flow controller, Series M100B, requires an external 12 V power supply |
| USB-6009 DAQ Device | National Instruments | 779026-01 | |
| UniSlide Assembly with stepping motor and controller | Velmex | Two series MA15 UniSlide Assemblies, fitted with Vexta 1.8° stepping motors provided by Velmex, and controlled by a VXM Stepping Motor Controller | |
| Table 2. List of required equipment |
References
- Rosenberg, S. A., et al. Gene transfer into humans--immunotherapy of patients with advanced melanoma, using tumor-infiltrating lymphocytes modified by retroviral gene transduction. The New England Journal of Medicine. 323, 570-578 (1990).
- Yang, Y., et al. Cellular immunity to viral antigens limits E1-deleted adenoviruses for gene therapy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 4407-4411 (1994).
- Chen, C., Okayama, H. High-efficiency transformation of mammalian cells by plasmid DNA. Molecular and cellular biology. 7, 2745-2752 (1987).
- Walev, I., et al. Delivery of proteins into living cells by reversible membrane permeabilization with streptolysin-O. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 3185-3190 (2001).
- Felgner, P. L., et al. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84, 7413-7417 (1987).
- Hamm, A., Krott, N., Breibach, I., Blindt, R., Bosserhoff, A. K. Efficient transfection method for primary cells. Tissue engineering. 8, 235-245 (2002).
- Rauth, S., Kucherlapati, R. S. Expression of DNA Transferred into Mammalian-Cells. J. Bioscience. 6, 543-567 (1984).
- Spandidos, D. A. Electric field-mediated gene transfer (electroporation) into mouse Friend and human K562 erythroleukemic cells. Gene analysis techniques. 4, 50-56 (1987).
- Chu, G., Hayakawa, H., Berg, P. Electroporation for the efficient transfection of mammalian cells with DNA. Nucleic Acids Research. 15, 1311-1326 (1987).
- Fechheimer, M., et al. Transfection of mammalian cells with plasmid DNA by scrape loading and sonication loading. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84, 8463-8467 (1987).
- Koch, S., Pohl, P., Cobet, U., Rainov, N. G. Ultrasound enhancement of liposome-mediated cell transfection is caused by cavitation effects. Ultrasound in Medicine & Biology. 26, 897-903 (2000).
- Greenleaf, W. J., Bolander, M. E., Sarkar, G., Goldring, M. B., Greenleaf, J. F. Artificial cavitation nuclei significantly enhance acoustically induced cell transfection. Ultrasound in Medicine & Biology. 24, 587-595 (1998).
- Yang, N. S., Burkholder, J., Roberts, B., Martinell, B., McCabe, D. In vivo and in vitro gene transfer to mammalian somatic cells by particle bombardment. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87, 9568-9572 (1990).
- Hallow, D. M., et al. Shear-induced intracellular loading of cells with molecules by controlled microfluidics. Biotechnology and Bioengineering. 99, 846-854 (2008).
- Chouinard-Pelletier, G. L., Guay, M., Coulombe, D., Leask, S., L, R., Jones, E. Use of inert gas jets to measure the forces required for mechanical gene transfection. Biomedical Engineering Online. 11, (2012).
- Leduc, M., Coulombe, S., Leask, R. L. Atmospheric Pressure Plasma Jet Deposition of Patterned Polymer Films for Cell Culture Applications. Ieee T. Plasma Sci. 37, 927-933 (2009).
- Lu, H., et al. Microfluidic shear devices for quantitative analysis of cell adhesion. Analytical Chemistry. 76, 5257-5264 (2004).
- Sankin, G. N., Yuan, F., Zhong, P. Pulsating tandem microbubble for localized and directional single-cell membrane poration. Physical Review Letters. 105, 078101 (2010).
