Summary
Este protocolo descreve um método para a permeabilização temporária de células aderentes utilizando um jacto de gás inerte. Esta técnica facilita a transferência de material genético e biomoléculas em células de mamíferos aderentes por meio da utilização das forças mecânicas para romper a membrana de plasma.
Abstract
Existem várias técnicas de transfecção celular e estes podem ser divididos em três categorias principais: virais, químicas e mecânicas. Este protocolo descreve um método mecânico para temporalmente permeabilizar as células aderentes utilizando um jacto de gás inerte, que pode facilitar a transferência de normalmente macromoléculas não permeáveis nas células. Acreditamos que esta técnica funciona por transmissão de forças de cisalhamento sobre a membrana plasmática de células aderentes, resultando na formação temporária de microporos. Uma vez que esses poros são criadas, as células são, então, permeável ao material genético e outras biomoléculas. As forças mecânicas envolvidas não correr o risco de danificar as células permanentemente ou desencaixar do seu substrato. Existe, portanto, uma estreita faixa de dinâmica de gás inerte, onde a técnica é eficaz. Um jato de gás inerte mostrou-se eficaz na permeabilização várias linhas celulares aderentes incluindo HeLa, HEK293 e células endoteliais da aorta abdominal humanos. Este protocolo é apropriado para a permeabilization de células aderentes, quer in vitro e, como aqui demonstrado, in vivo, mostrando que pode ser utilizado para a pesquisa e, potencialmente, em aplicações clínicas futuras. Tem também a vantagem de permeabilização de células de uma forma espacialmente restritiva, que poderia revelar-se uma ferramenta de pesquisa valiosa.
Introduction
Com a evolução da biomedicina e da compreensão da mecânica de células, a entrega de biomoléculas em células tornou-se vital para muitos campos de pesquisa e terapias médicas. Diferentes técnicas têm sido desenvolvidas para introduzir moléculas estranhas através da membrana do plasma e para dentro do citoplasma celular. Estes podem ser geralmente classificadas como: técnicas virais, químicos ou mecânicos. Técnicas virais podem transfectar material genético tais como ARN e ADN utilizando vectores virais 1. Técnicas virais tendem a ter alta eficiência em certas linhagens de células, no entanto, eles têm o potencial para reações imunes e inflamatórias 2. Métodos de transfecção químicos comuns incluem precipitação com fosfato de cálcio de 3, 4 e exotoxinas bacterianas lipofecção 5. Estas técnicas têm provado ser eficaz, no entanto, certos problemas surgem, tais como toxicidade da célula e não especificidade. Além disso, as técnicas tais como o cálcio phosphate precipitação foram encontrados a ter eficiências de transfecção superior a 70%, mas apenas em certas linhas celulares, raramente em células primárias 6. Isto é digno de nota que cada vez mais esforços de pesquisa são colocados em pilhas, em especial no caso da concepção de vários tratamentos para uso clínico e o estudo do ADN funcionamento.
Temporal rompimento da membrana celular através de estímulos mecânico é uma alternativa para a introdução de moléculas estranhas nas células. As técnicas incluem: microinjecção de moléculas 7, electroporação usando um campo eléctrico para romper a membrana de 8,9, sonoporação usando ondas de ultra-sons para romper a membrana de células 10-12, bombardeamento de partículas, como revelado no "pistola de genes", que dispara partículas ligadas com genes na célula 13, e, mais recentemente, a aplicação de tensão de corte do fluido que tem sido demonstrado que temporalmente permeabilizar as células de mamíferos 14,15. Embora mecânicométodos al evitar alguns dos problemas acima mencionados, eles são normalmente acompanhadas por eficiências menores e configurações muito complexas e especializadas. Uma tocha de descarga luminescente pressão atmosférica (APGD-t) foi desenvolvido na McGill, com o objetivo inicial de funcionalização de superfícies e retirar células aderentes in vitro 16. Por acaso, descobriu-se que uma mancha vivo / morto sendo usado foi de algum modo a ser levado por células sem um agente de permeabilização ser adicionado. Além disso, esta parecia ter ocorrido apenas em áreas restritas dos poços, que aconteceram a corresponder-se com o caminho da tocha. A investigação sobre as capacidades de permeabilização da APGD-t contínua e em estudos de controlo, verificou-se que o jacto de gás veicular inerte do plasma sem excitação, também foi capaz de permeabilizar as células. Isto contradiz a hipótese inicial de que as espécies reativas criadas pelo jato de plasma prejudicada temporariamente a função da membrana e sugeriu que simplesmente os mecânicosforças cal foram suficientes para causar a permeabilização celular. A partir daqui, os estudos continuaram em nosso laboratório para tentar quantificar e caracterizar a eficiência de permeabilização de um jato de gás inerte, bem como olhar para as suas capacidades de transfecção 16.
Através destes estudos, verificou-se que os microporos façam efectivamente na membrana do plasma, e estas tendem a selar os poros dentro de aproximadamente 5 seg 15. Demonstrámos a utilidade do cultivo in vitro e in vivo na membrana corioalantóica de um embrião de pinto.
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Protocol
1. Desenvolvimento do Programa LabView
- Um controlador de fluxo de massa (MKS M100B Massa-Flo Controller) está ligado à linha de gás de hélio para assegurar uma taxa de fluxo de gás precisa. Este aparelho é controlado por uma tensão de entrada, que varia entre 0 e 5 V. Um circuito de controle no programa LabView determina a tensão necessária num dado momento. A interface entre o computador eo controlador de fluxo de massa é realizada por um dispositivo de aquisição de dados (NI USB-6009), e uma fonte de alimentação de 12 V fornece energia para o controlador de fluxo de massa.
- Duas corrediças posicionamento lineares são utilizados para controlar o movimento da placa de 6 cavidades, uma para cada sentido. Cada conjunto é constituído por uma série MA15-Velmex montagem UniSlide acoplado com um motor passo a passo, e os dois conjuntos são controlados por um único Velmex VXM Intensificação do controlador do motor. O controlador permite movimentar-se o manual de cada motor ou aceita uma seqüência de comandos seriais externos, a combinação de que permitir o movimento específico patterns. Vários padrões podem ser programados para o programa LabView, exigindo que o usuário forneça apenas a velocidade da tocha desejada, bem como as dimensões de caminho.
2. Preparação do Equipamento
- Abra tanto o cilindro de hélio e regulador.
- Ligue o controlador do motor.
- Abra o programa LabView e verificar todas as condições.
- Certifique-se de que a plataforma está centrado. Para verificar, olhar para cada fase do motor e verificar que cada carro não está perto de uma das extremidades palco. Ou que o centro do programa de carruagens ou ajustar manualmente usando os controles de corrida na parte da frente do controlador de motor.
- Se esta é a primeira corrida do dia, recomenda-se executar o programa de uma vez, sem células, para garantir a configuração está funcionando corretamente.
3. Preparação do Gás Jet Capilar Bico Altura
- Retire o capilar do suporte e zerar o mostrador altura.
- Coloque o 6 bem-placa on da plataforma.
- Substituir e reduzir o capilar jato de gás para o fundo do poço até atingir o lamínula. Prenda o capilar no suporte.
- Utilização do selector de altura, elevar o capilar 3 mm. Marque esta altura na base capilar.
- Elevar o capilar a uma altura segura e, em seguida, retire a placa de 6 poços.
4. Celular Permeabilização Protocolo
- Cultura linha de células aderentes até à confluência na tampa de vidro desliza numa placa de 6 poços, utilizando técnicas de cultura Standard. Para as células HeLa, de sementes de placas de 6 poços, com 2 x 10 5 células por poço e incubar durante 48 horas antes do tratamento.
- Prepare o volume apropriado de solução contendo o vector desejado. Para hrGFPII-1, uma concentração de 50 ng / mL em 1x PBS fornece um forte sinal de fluorescência em células HeLa de 24 horas após a transfecção. Para os estudos de dextrano, é recomendado de 80 ug / ml de 10 kDa dextrano fluorescente verde. A partir de agora, esta solução vai ser encaminhado para um"solução vetor" s.
- Remova a mídia de cultura de células de bem e lavar três vezes com PBS 1x.
- Pipetar 1,370 ml de solução vetor preparados no passo 4.2 em bem. Isto deve resultar em uma profundidade de líquido de aproximadamente 1,3 mm.
- Coloque o recipiente contendo a solução de vector no centro da plataforma. Abaixe o bico de jato de gás para o nível previamente marcado indicando uma altura do bocal de 3 mm acima do slide.
- Ajustar a taxa de fluxo de hélio no programa Labview e seleccionar o padrão de movimento desejado para ser utilizado. Selecione "Executar" quando estiver pronto para iniciar o protocolo de permeabilização. Haverá um período de atraso inicial durante o qual o controlador de fluxo de massa se prepara para proporcionar a taxa de fluxo necessária. Uma vez que a taxa de fluxo apropriada tiver sido atingido, o programa LabView irá activar os motores passo a passo para mover a bem no padrão desejado permeabilização. Uma vez que a plataforma parar, esperar cerca de 30 segundos e retire a solução vetor.Nota: a permeabilização óptima ocorre perto de uma pressão dinâmica de 100 a 200 Pa, a saída do bocal, de acordo com o diâmetro do capilar.
- Lavar bem três vezes com PBS 1x.
- Encha bem com meio de cultura fresco.
- Repita os passos de 4,3-4,6 para o número desejado de experimentos. Nota: Certifique-se de incluir amostras de controle que consistem em poços que estão sendo preenchidos com a solução de vetor sem o jato de gás que está sendo executado sobre eles. Deixar a solução em poços de controlo durante cerca de 1 min, em seguida, continuar com os passos 4.5 e 4.6.
- Se realizando uma experiência de transfecção hrGFP, retornar de 6 cavidades da placa para incubadora durante 24 horas para permitir que o material transfectadas ser transcrita pelas células. Se a execução de um experimento permeabilização dextrano, volte 6 bem-placa para incubadora por 15 min.
5. Imagens de células
- Se desejar, imediatamente antes de imagem, contrastante com mancha vivo / morto apropriado para avaliar a morte celular.
- Células de imagem com appropmicroscópio riate para investigar a eficácia de transfecção / permeabilização.
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Representative Results
Permeabilização de células HeLa com 10 kDa dextrano fluorescente verde usando um jacto de gás hélio com um capilar de diâmetro interno 0,86 milímetros é mostrado na Figura 1. As células foram contrastadas imediatamente após a permeabilização com 2 ul / ml EthD-1 solução (Live / Dead viabilidade / citotoxicidade Kit) para visualizar a morte celular. Imediatamente após contracoloração, lamínulas foram montadas e fotografadas. Esta figura mostra resultados da execução do jato de gás hélio em três diferentes pressões de saída em comparação com uma amostra de controlo. Note-se que a largura da faixa de permeabilização e eficiência aumentada com uma pressão mais elevada dinâmica e a morte celular apenas mostraram um ligeiro aumento (A e B). No entanto, uma vez que uma pressão dinâmica alta foi alcançada, as células HeLa que foram retirados dos lamelas e muito pouco permeabilização periférico ocorreu. Uma análise mais detalhada da remoção de células e eficiência de transfecção foi previamente realizada pela Chouinard15-Pelletier et al.
Através de estudos de microscopia eletrônica de varredura, microporos foram observadas na membrana celular (Figura 2). Permeabilização de células HeLa foi realizada utilizando um jacto de gás de hélio com uma 0,86 milímetros de diâmetro interno capilar a uma pressão de saída de 300 Pa. Após o protocolo permeabilização, as células foram imediatamente fixadas com uma solução de paraformaldeído a 1% em PBS 1x.
Figura 1. Permeabilização de células HeLa com 10 kDa dextran verde fluorescente usando um jato de gás hélio com um diâmetro interno do bico capilar de 0,86 mm. Dextrano fluorescente verde e células mortas da fluorescência vermelha. A) Pressão dinâmica de 100 Pa, B) de 135 Pa, e C ) de 175 Pa. D) de controle com dextrano b adicionadout nenhuma exposição ao jato de gás hélio.
Figura 2. MEV com uma ampliação de 50.000 X da superfície das células HeLa seguinte gás jet permeabilização a 300 Pa. A) amostra de controle exibindo uma superfície celular suave. B) Superfície celular permeabilizadas exibindo um poro com um diâmetro de 84 nm. Clique aqui para ampliar figura .
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Discussion
Inerte permeabilização jato de gás é uma técnica útil para a transfecção de células aderentes. Ele oferece a capacidade de transferir biomoléculas para as células com a utilização de forças mecânicas, o que elimina a necessidade de produtos químicos potencialmente nocivos ou vectores virais. A técnica poderia dar aos pesquisadores e clínicos de forma eficiente e relativamente simples de transfecção com precisão células. A seletividade da permeabilização também é único permitindo que os pesquisadores apenas para tratar certas células em uma única colônia, que poderia ser útil em várias aplicações.
Vários parâmetros podem ser ajustados para experimentação individual, tais como o diâmetro do bico capilar e ângulo, a taxa de fluxo de gás, líquido e altura capilar, linha celular, biomolécula alvo a ser utilizado, e tipo de gás inerte. Um nível conjunto líquido e altura capilar foram descritas no processo e estes valores foram escolhidas para minimizar o número de variáveis envolvidas no nosso experiments. Atualmente, estamos modelando o sistema usando a visualização do fluxo experimental e dinâmica de fluidos computacional. Isso nos dará uma melhor compreensão das forças transmitidas nas células, o que nos permite determinar a dependência da permeabilização de variáveis como as propriedades líquidas.
É importante tomar nota da pressão dinâmica máxima segundo a qual as células podem sobreviver. Verificou-se que uma vez que as pressões dinâmicas se aproximava de 200 Pa para a altura do bocal de jacto de gás de 3 mm, HeLa decapagem celular tornou-se provável. Isto está de acordo com outros estudos, como Lu et al. Que observou WT NR6 desprendimento de células de fibroblastos em 200-265 Pa 17. Se ocorrerem grandes quantidades de remoção, uma taxa de fluxo de gás inferior deve aliviar este problema. Da mesma forma, as taxas de fluxo elevadas resultam em morte celular e resultados falso-positivos permeabilização. Uma vez que as células morreram eles vão se tornar permeável às moléculas e, portanto, as células mortas pode ser confundido com células vivas permeabilizadas. ElePor conseguinte, recomenda-se realizar a / ensaio morto vivo para assegurar que as células permeabilizadas são, de facto, ainda vivos. Morte aumenta com o aumento da pressão e descobriu que o nosso laboratório a 390 Pa a maioria das células HeLa foram permeabilizadas morto 15. A viabilidade das células durante um período longo de tempo também foi investigada, com hrGFPII-1 expressão sendo observados até 72 horas após a permeabilização (dados não mostrados). Outros estudos estão em andamento para investigar a viabilidade em momentos ainda mais longos.
Nossa hipótese é que as tensões de cisalhamento de fluidos nas células, criadas pelo jato de gás e do deslocamento dos meios de comunicação, causar interrupção temporária da membrana plasmática celular. Este é o mesmo mecanismo proposto para os outros métodos físicos mais complexos, tais como o colapso de microbolhas e sonoporação 18. As condições de funcionamento para este método são dependentes do tipo de células, a ligação ao substrato, as propriedades mecânicas da célulae da parede celular, molécula de interesse, as propriedades do líquido e do gás, bem como as dimensões físicas da instalação. Através de estudos de exclusão de tamanho, verificou-se que as moléculas de dextrano maiores do que 40 kDa apresentam baixa eficiência de permeabilização e que um tamanho de dextrano óptimo é 10 kDa para a experimentação 15. Isto é importante, uma vez que limita o tamanho das moléculas que podem ser permeabilizadas em células usando este protocolo. Até agora, só têm investigado as propriedades de transfecção de plasmídeos. Outros estudos irá determinar se os pedaços maiores de material genético são capazes de serem transfectadas utilizando esta técnica.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer às seguintes fontes de financiamento: Canadian Institutes of Health Research (CIHR), as ciências naturais e do Conselho de Pesquisa de Engenharia (NSERC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vitality hrGFPII-1 | Agilent Technologies Canada | 240143-57 | Green fluorescent protein for transfection experiments on HeLa cells |
| Dextran, AlexaFluor 488; 10,000 MW, Anionic, Fixable | Life Technologies Inc. | D22910 | dextran for permeabilization experiments |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit | Life Technologies Inc. | L3224 | for counterstaining of mammalian cells |
| Prolong Gold Antifade Reagent | Invitrogen | P36930 | for mounting slides when imaging |
| Ultra High Purity Helium | Praxair Canada Inc. | HE 5.0UH-T | |
| Hyclone DMEM/ High Glucose Media - 500 ml | Thermo Scientific | SH30022.01 | for HeLa cells |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 26140079 | For DMEM media |
| Penicillin-Streptomycin, liquid | Invitrogen | 15140-122 | For DMEM media |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) 1x | Produced in lab | ||
| Table 1. List of required reagents | |||
| 6-Well Clear TC-Treated Microplates | Corning | 3506 | |
| #1 22 x 22 Coverslips | Fisher | 12-542B | |
| Glass Capillaries | World Precision Instruments | WPI Sizing Information | |
| ID (mm): 1, 0.86, 0.68, 0.5 Order #: 1B200, 1B150, 1B120, 1B100 | |||
| Mass-Flo Controller | MKS | M100B01314CS1BV | Mass flow controller, Series M100B, requires an external 12 V power supply |
| USB-6009 DAQ Device | National Instruments | 779026-01 | |
| UniSlide Assembly with stepping motor and controller | Velmex | Two series MA15 UniSlide Assemblies, fitted with Vexta 1.8° stepping motors provided by Velmex, and controlled by a VXM Stepping Motor Controller | |
| Table 2. List of required equipment |
References
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