Summary
Этот протокол описан способ временного проницаемости из адгезивных клеток с использованием инертного газовой струи. Этот метод облегчает перенос генетического материала и биомолекул в прикрепленных клетках млекопитающих путем использования механических сил, чтобы разрушить плазматическую мембрану.
Abstract
Различные методы клеточной трансфекции существуют и они могут быть разбиты на три основные категории: вирусные, химических и механических. Этот протокол описывает механический способ временно прилипшие клетки проницаемыми с использованием инертного газа струи, что может облегчить передачу нормально не проницаемых макромолекул в клетки. Мы считаем, что этот метод работает путем придания силы сдвига на плазматической мембране адгезивных клеток, что приводит к временному формированию микропор. После того как эти поры создаются, клетки затем проницаемой для генетического материала и других биомолекул. Механические силы, участвующие действительно рискуете навсегда повреждения или отсоединение клеток от субстрата. Существует, следовательно, узкий диапазон инертных газовой динамики, где метод является эффективным. Инертный струя газа оказалась эффективной при permeabilizing различные прилипшие клеточных линий, включая HeLa, HEK293 и брюшной аорты эндотелиальных клеток человека. Этот протокол подходит для рermeabilization из прикрепленных клеток в пробирке и, как мы показали, в естественных условиях, показывает, что это может быть использовано для исследования и потенциально в будущих клинических применений. Он также имеет то преимущество, permeabilizing клетки в пространственно ограничительно, которые могли бы оказаться ценным инструментом исследования.
Introduction
С развитием биомедицины и понимания механики клеток, поставка биомолекул в клетки стал жизненно важным для многих областях исследований и медицинских методов лечения. Различные методы были разработаны, чтобы ввести чужеродных молекул через плазматическую мембрану и в цитозоле клетки. Они могут быть в общем классифицировать как: вирусные, химических или механических методов. Вирусные методы могут трансфекции генетического материала, такие как РНК и ДНК с использованием вирусных векторов 1. Вирусные методы, как правило, имеют высокую эффективность в определенных клеточных линиях, однако у них есть потенциал для иммунных и воспалительных реакций 2. Общие методы химической трансфекции включают осаждение фосфатом кальция 3, бактериальных экзотоксинов 4 и липофекцией 5. Эти методы доказали свою эффективность, однако, некоторые проблемы возникают, таких как клеточной токсичности и отсутствие специфичности. Кроме того, такие методы, как Phosphat кальцияе осадки были обнаружены эффективности трансфекции до 70%, но только в определенных клеточных линий, редко в первичных клеток 6. Это следует отметить, что при более научно-исследовательских работ в настоящее время введены в первичных клеток, особенно в случае проектирования различные процедуры для клинического применения и изучения функционирования ДНК.
Временное нарушение клеточной мембраны с помощью механических раздражителей является альтернативой для введения чужеродных молекул в клетки. Методы включают: микроинъекции молекул 7, электропорацию с помощью электрического поля, чтобы разрушить мембрану 8,9, sonoporation с помощью ультразвуковых волн нарушить клеточную мембрану 10-12, бомбардировки частицами, как показано на "генной пушки", который снимает частицы, связанные с гены в клетку 13, а в последнее время, применение напряжения сдвига жидкости, что, как было показано временно проницаемыми клеток млекопитающих 14,15. Хотя механикаль методы избежать некоторых из вышеупомянутых вопросов, они, как правило, сопровождается низкой эффективностью и очень сложных и специализированных установок. Свечение давление на выходе горелки атмосферного (APGD-т) была разработана в McGill с начальным целью функционализации поверхности и снятие прилипшие клетки в пробирке 16. По счастливой случайности, было обнаружено, что живой / мертвый пятно используется как-то принимаются в клетками без permeabilizing агент добавляются. Кроме того, это, казалось, произошли только в ограниченных областях скважин, которые произошли в соответствии с пути факела. Исследование в проницаемости возможностей APGD-т продолжали и в контрольных исследований было установлено, что носитель инертный газ струя плазмы без возбуждения также был в состоянии проницаемыми клеток. Это противоречило первоначальную гипотезу о том, что активные формы, созданные с помощью плазменной струи временно нарушенной функции мембран и предложил просто механическические силы было достаточно, чтобы вызвать проницаемости клеточной мембраны. Отсюда, исследования продолжались в нашей лаборатории, чтобы попытаться количественно определяет и характеризует эффективность пермеабилизации инертного газовой струи, а также взглянуть на своих возможностей трансфекции 16.
С помощью этих исследований было обнаружено, что микропоры сделать на самом деле формы в плазматической мембране, и эти поры имеют тенденцию запечатать в течение примерно 5 секунд 15. Мы продемонстрировали полезность этой техники в пробирке и в естественных условиях в хорионаллантоисной оболочки куриного эмбриона.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Развитие LabView программы
- Контроллер массового расхода (MKS M100B Масс-Flo контроллер) прикреплен к газовой линии гелия, чтобы обеспечить точную скорость потока газа. Это устройство управляется входным напряжением в диапазоне от 0 до 5 В. контур управления в программе LabView определяет необходимое напряжение в любой момент времени. Взаимодействие между компьютером и регулятор массового расхода производится с помощью сбора данных устройства (NI USB-6009), и источник питания 12 В обеспечивает питание контроллера массового расхода.
- Два позиционирование линейных слайды используются для управления движением в 6-луночный планшет, по одному на каждую сторону. Каждый узел состоит из MA15-серии Velmex Unislide Ассамблеи в сочетании с шаговым двигателем, и оба сборки под контролем одного Velmex VXM шаговый двигатель контроллер. Контроллер позволяет для ручного бега каждого двигателя или принимает строку внешних последовательных команд, сочетание которых позволяют специфическое движение рatterns. Несколько моделей могут быть запрограммированы в программе LabView, требуя от пользователя предоставить только нужную скорость горелки, а также размеры путей.
2. Подготовка оборудования
- Откройте как цилиндр гелия и регулятор.
- Включите контроллер двигателя.
- Откройте программу LabView и проверить все условия.
- Убедитесь, что платформа находится в центре. Чтобы проверить, посмотрите на каждом этапе двигателя и убедиться, что каждый вагон не рядом или стадии конце. Либо есть программа центр вагоны или вручную настроить с помощью элементов управления бег на передней панели контроллера двигателя.
- Если это первый запуск дня, рекомендуется запускать программу один раз, без клеток, чтобы обеспечить установка работает правильно.
3. Подготовка газа Джет капиллярного сопла Высота
- Снимите капилляр из держателя и обнулить высоты диска.
- Поместите диск сцепления Ø 6-ан платформа.
- Заменить и нижней газовой струи капилляр в нижней части скважины, пока не достигнет покровное стекло. Закрепите капилляр в держатель.
- Использование высоты диска, поднять капиллярную 3 мм. Отметить эту высоту на капиллярной базы.
- Поднимите капилляр к безопасной высоте, а затем удалить пластину 6-а.
4. Проницаемости клеточной мембраны протокол
- Культура прилипший клеточной линии до слияния на стеклянной крышкой скользит в 6-луночный планшет с использованием стандартных способов культивирования. Для HeLa клеток, семян 6-луночные планшеты с 2 х 10 5 клеток на лунку и инкубировать в течение 48 часов до начала лечения.
- Подготовка соответствующий объем раствора, содержащего желаемый вектор. Для hrGFPII-1, концентрация 50 нг / мкл в 1 × PBS обеспечивает прочную флуоресцентного сигнала в клетках HeLa с 24 часами после трансфекции. Для декстрана исследований, 80 мкг / мл 10 кДа зеленого флуоресцентного декстрана рекомендуется. В дальнейшем это решение будет называтьсяс "вектор решения".
- Удалить питательных сред клеток из хорошо и промыть три раза 1x PBS.
- Внесите 1370 мкл вектора решения, полученного на стадии 4.2 в скважину. Это должно привести к жидкой глубине около 1,3 мм.
- Поместите хорошо, содержащий векторную решение в центре платформы. Опустите газовой струи сопла к ранее отмеченного уровня, указывающего высоту сопла 3 мм над горкой.
- Установить расход гелия в программе LabView и выберите нужный шаблон движения, которые будут использоваться. Выберите "Выполнить", когда будете готовы, чтобы начать протокол пермеабилизации. Там будет начальный период задержки, в течение которого регулятор массового расхода готовится для обеспечения необходимой скорости потока. Как только соответствующая скорость потока была достигнута, программа LabView активирует шаговые двигатели для перемещения скважины в желаемой структуре пермеабилизации. Как только платформа остановилась, подождите примерно 30 секунд и снимите вектор решения.Примечание: Оптимальное пермеабилизации происходит вблизи динамическом давлении от 100 до 200 Па при выходе из сопла, в зависимости от диаметра капилляра.
- Хорошо промыть три раза 1x PBS.
- Хорошо Залейте свежее питательных сред.
- Повторите шаги 4,3 - 4,6 для нужного количества экспериментов. Примечание: Не забудьте включить контрольные образцы, которые состоят из скважин загружаемого с вектором решения без газовой струи наезда них. Оставьте раствор в контрольных скважин в течение приблизительно 1 мин, затем перейдите к шагам 4.5 и 4.6.
- Если работает под трансфекции эксперимент hrGFP, возвращение 6-луночный планшет в инкубаторе в течение 24 часов, чтобы позволить трансфицированных материал для транскрипции в клетках. Если работает декстрана эксперимент пермеабилизации, вернуться 6-луночный планшет в инкубатор в течение 15 мин.
5. Изображений сотовый
- При желании, непосредственно перед томография, контрастирующая с соответствующей живой / мертвый пятно для оценки гибели клеток.
- Клетки Изображение с appropriate микроскоп для исследования трансфекции / пермеабилизации эффективность.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Пермеабилизации из HeLa клеток с 10 кДа зеленого флуоресцентного декстрана с помощью газовой струи гелия с внутренней капилляра диаметром 0,86 мм показан на рисунке 1. Клетки контрастно сразу после пермеабилизации с 2 мкл / мл EthD-1 раствора (LIVE / DEAD Жизнеспособность / цитотоксичности Kit) для визуализации гибель клеток. Сразу же после контрастного, покровные стекла были установлены и образ. Эта фигура показывает результаты выполнения струю газообразного гелия при трех различных давлениях на выходе по сравнению с контрольным образцом. Обратите внимание, что пермеабилизации ширина колеи и эффективность увеличивается с высоким динамическим давлением и гибели клеток показал незначительный рост (A и B). Однако, как только была достигнута высокая динамическое давление, HeLa клетки отделяют от покровных стеклах и произошло очень мало периферической пермеабилизации. Более детальный анализ клеток зачистки и эффективности трансфекции ранее проведенное Chouinard-Пеллетье и др.. 15
Через сканирование электронно-микроскопических исследований, микропоры наблюдались в клеточной мембране (рис. 2). Пермеабилизации из HeLa клеток проводили с использованием газовой струи гелия с 0,86 мм внутреннего диаметра капилляра при давлении на выходе 300 Па в соответствии с протоколом пермеабилизации клетки немедленно фиксировали 1%-ного раствора параформальдегида в 1х PBS.
Рисунок 1. Пермеабилизации из HeLa клеток с 10 кДа зеленого флуоресцентного декстрана с помощью газовой струи гелия с капиллярной сопла внутренним диаметром 0,86 мм. Декстран флуоресцирует зеленым и мертвые клетки светиться красным цветом. A) динамического давления 100 Па, б) 135 Па, а С ) из 175 Па D) управления с декстран добавил бне ут нет воздействия струи газообразного гелия.
Рисунок 2. СЭМ изображения при увеличении 50000 X от поверхности клеток HeLa следующей газовой струи пермеабилизации при 300 Па А) Контрольный образец экспонирование гладкую поверхность клеток. B) Поверхность проницаемыми клетки, обладающего поры с диаметром 84 нм. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Инертный струя газа пермеабилизации является полезным методом для единомышленником трансфекции клеток. Она обеспечивает возможность передачи биомолекул в клетки с использованием механических сил, что исключает необходимость в потенциально вредных химических веществ или вирусных векторов. Эта технология может потенциально дать исследователей и клиницистов эффективный и относительно простой способ точно трансфекции клеток. Селективность проницаемости также уникален позволяя исследователей только лечения некоторых клеток в одной колонии, которые могут быть полезны в различных приложениях.
Некоторые параметры могут быть скорректированы для индивидуального экспериментирования, таких как диаметр капилляра сопла и угла, скорости потока газа, жидкости и капиллярной высоте, клеточной линии, целевой биомолекулы, которые будут использоваться, и типа инертного газа. Уровень набор жидкости и капиллярной высота были описаны в порядке и эти значения были выбраны для минимизации количества переменных, участвующих в нашей experimeНТС. В настоящее время мы моделируем систему, используя визуализацию экспериментальную потока и вычислительной гидродинамики. Это даст нам лучшее понимание сил, сообщаемых на клетках, что позволяет нам определить зависимость в пермеабилизации по переменных, таких как жидких свойств.
Важно принять к сведению максимального динамического давления, при которых клетки могут выжить. Было установлено, что, как только динамические давления приблизились 200 Па, требования к росту газовой струи сопла 3 мм, HeLa клетки зачистки стало вероятным. Это согласуется с результатами других исследований, таких как Лу и др.. Который наблюдал WT nR6 фибробластов клеток отряд в 200-265 Па 17. Если большое количество зачистки происходят, ниже расход газа должен решить эту проблему. Точно так же, высокие скорости потока приводит к гибели клеток и ложноположительных результатов пермеабилизации. Как только клетки умерли они станут проницаемыми для молекул и, следовательно, мертвые клетки могут быть ошибочно приняты за пермеабилизированных живых клеток. ЭтоПоэтому рекомендуется проводить живой / мертвый анализа для того, чтобы их проницаемость клетки, на самом деле еще жив. Смерти возрастает с увеличением давления и нашей лаборатории обнаружили, что в 390 Па большинство пермеабилизированных клеток HeLa были мертвы 15. Жизнеспособность клеток в течение длительного периода времени также были исследованы с hrGFPII-1 экспрессии, наблюдаемой быть до 72 ч после проницаемости (данные не показаны). Дальнейшие исследования в настоящее время проводятся по расследованию жизнеспособность при даже более длительных.
Наша гипотеза заключается в том, что жидкость напряжения сдвига на клетках, созданных струи газа и смещения СМИ, вызвать временное нарушение функций плазматической мембраны клетки. Это то же самое механизм, предложенный для других более сложных физических методов, таких как распада микропузырьков и sonoporation 18. Рабочие условия для этого метода зависит от типа клеток, привязанность к подложке, механических свойств клеткии клеточной стенки, интерес молекула, свойства жидкости и газа, а также физические размеры установки. Через эксклюзионной исследований мы обнаружили, что декстран молекулы размером более 40 кДа показывают очень низкую эффективность проницаемости и что оптимальный размер декстрана 10 кДа для экспериментов 15. Это важно, поскольку оно ограничивает размер молекул, которые могут быть проницаемыми в клетки с использованием этого протокола. До сих пор мы только исследовали трансфекции свойства плазмид. Дальнейшие исследования будут установить, является ли более крупные частицы генетического материала способны к трансфецировали помощью этой техники.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить следующих источников финансирования: Канадского института исследований в области здравоохранения (CIHR), естественных наук и инженерным исследованиям Совета (NSERC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vitality hrGFPII-1 | Agilent Technologies Canada | 240143-57 | Green fluorescent protein for transfection experiments on HeLa cells |
| Dextran, AlexaFluor 488; 10,000 MW, Anionic, Fixable | Life Technologies Inc. | D22910 | dextran for permeabilization experiments |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit | Life Technologies Inc. | L3224 | for counterstaining of mammalian cells |
| Prolong Gold Antifade Reagent | Invitrogen | P36930 | for mounting slides when imaging |
| Ultra High Purity Helium | Praxair Canada Inc. | HE 5.0UH-T | |
| Hyclone DMEM/ High Glucose Media - 500 ml | Thermo Scientific | SH30022.01 | for HeLa cells |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 26140079 | For DMEM media |
| Penicillin-Streptomycin, liquid | Invitrogen | 15140-122 | For DMEM media |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) 1x | Produced in lab | ||
| Table 1. List of required reagents | |||
| 6-Well Clear TC-Treated Microplates | Corning | 3506 | |
| #1 22 x 22 Coverslips | Fisher | 12-542B | |
| Glass Capillaries | World Precision Instruments | WPI Sizing Information | |
| ID (mm): 1, 0.86, 0.68, 0.5 Order #: 1B200, 1B150, 1B120, 1B100 | |||
| Mass-Flo Controller | MKS | M100B01314CS1BV | Mass flow controller, Series M100B, requires an external 12 V power supply |
| USB-6009 DAQ Device | National Instruments | 779026-01 | |
| UniSlide Assembly with stepping motor and controller | Velmex | Two series MA15 UniSlide Assemblies, fitted with Vexta 1.8° stepping motors provided by Velmex, and controlled by a VXM Stepping Motor Controller | |
| Table 2. List of required equipment |
References
- Rosenberg, S. A., et al. Gene transfer into humans--immunotherapy of patients with advanced melanoma, using tumor-infiltrating lymphocytes modified by retroviral gene transduction. The New England Journal of Medicine. 323, 570-578 (1990).
- Yang, Y., et al. Cellular immunity to viral antigens limits E1-deleted adenoviruses for gene therapy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 4407-4411 (1994).
- Chen, C., Okayama, H. High-efficiency transformation of mammalian cells by plasmid DNA. Molecular and cellular biology. 7, 2745-2752 (1987).
- Walev, I., et al. Delivery of proteins into living cells by reversible membrane permeabilization with streptolysin-O. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 3185-3190 (2001).
- Felgner, P. L., et al. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84, 7413-7417 (1987).
- Hamm, A., Krott, N., Breibach, I., Blindt, R., Bosserhoff, A. K. Efficient transfection method for primary cells. Tissue engineering. 8, 235-245 (2002).
- Rauth, S., Kucherlapati, R. S. Expression of DNA Transferred into Mammalian-Cells. J. Bioscience. 6, 543-567 (1984).
- Spandidos, D. A. Electric field-mediated gene transfer (electroporation) into mouse Friend and human K562 erythroleukemic cells. Gene analysis techniques. 4, 50-56 (1987).
- Chu, G., Hayakawa, H., Berg, P. Electroporation for the efficient transfection of mammalian cells with DNA. Nucleic Acids Research. 15, 1311-1326 (1987).
- Fechheimer, M., et al. Transfection of mammalian cells with plasmid DNA by scrape loading and sonication loading. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84, 8463-8467 (1987).
- Koch, S., Pohl, P., Cobet, U., Rainov, N. G. Ultrasound enhancement of liposome-mediated cell transfection is caused by cavitation effects. Ultrasound in Medicine & Biology. 26, 897-903 (2000).
- Greenleaf, W. J., Bolander, M. E., Sarkar, G., Goldring, M. B., Greenleaf, J. F. Artificial cavitation nuclei significantly enhance acoustically induced cell transfection. Ultrasound in Medicine & Biology. 24, 587-595 (1998).
- Yang, N. S., Burkholder, J., Roberts, B., Martinell, B., McCabe, D. In vivo and in vitro gene transfer to mammalian somatic cells by particle bombardment. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87, 9568-9572 (1990).
- Hallow, D. M., et al. Shear-induced intracellular loading of cells with molecules by controlled microfluidics. Biotechnology and Bioengineering. 99, 846-854 (2008).
- Chouinard-Pelletier, G. L., Guay, M., Coulombe, D., Leask, S., L, R., Jones, E. Use of inert gas jets to measure the forces required for mechanical gene transfection. Biomedical Engineering Online. 11, (2012).
- Leduc, M., Coulombe, S., Leask, R. L. Atmospheric Pressure Plasma Jet Deposition of Patterned Polymer Films for Cell Culture Applications. Ieee T. Plasma Sci. 37, 927-933 (2009).
- Lu, H., et al. Microfluidic shear devices for quantitative analysis of cell adhesion. Analytical Chemistry. 76, 5257-5264 (2004).
- Sankin, G. N., Yuan, F., Zhong, P. Pulsating tandem microbubble for localized and directional single-cell membrane poration. Physical Review Letters. 105, 078101 (2010).
