Summary
Detta protokoll beskriver ett förfarande för temporär permeabilisering av vidhäftande celler med hjälp av en inert gasstråle. Denna teknik underlättar överföringen av genetiskt material och biomolekyler i adherenta däggdjursceller genom användning av mekaniska krafter för att störa plasmamembranet.
Abstract
Olika cell transfektionstekniker finns och dessa kan brytas ner till tre breda kategorier: virus, kemiska och mekaniska. Detta protokoll beskriver en mekanisk metod för att tidsmässigt permeabilisering vidhäftande cellerna med användning av en inert gasstråle som kan underlätta överföringen av normalt icke-permeabla makromolekyler in i celler. Vi tror att den här tekniken fungerar genom att åstadkomma skjuvkrafter på plasmamembranet av vidhäftande celler, vilket resulterar i tillfällig bildning av mikroporer. När dessa porer skapas är cellerna sedan permeabla för genetiskt material och andra biomolekyler. De mekaniska krafter som är involverade inte riskerar att permanent skada eller lossnar cellerna från deras substrat. Det finns därför ett snävt intervall av inerta gasdynamik där tekniken är effektiv. En inert gas jet har visat sig effektiva på permeabilisering olika fastsittande cellinjer inklusive HeLa, HEK293 och mänskliga buken aorta endotelceller. Detta protokoll är lämpligt för den permeabilization av vidhäftande celler både in vitro och, som vi har visat, in vivo, visande den får användas till forskning och eventuellt i framtida kliniska applikationer. Det har också fördelen av permeabilisering celler i ett rumsligt restriktivt, vilket kan visa sig vara ett värdefullt forskningsverktyg.
Introduction
Med utvecklingen av biomedicin och förståelsen av cellmekanik, har leveransen av biomolekyler till celler blir avgörande för många forskningsområden och medicinska behandlingar. Olika tekniker har utvecklats för att införa främmande molekyler genom plasmamembranet och in i cellens cytosol. Dessa kan i allmänhet klassificeras som antingen: virus, kemiska eller mekaniska tekniker. Viral tekniker kan transfektera genetiskt material såsom RNA och DNA med hjälp av virala vektorer 1. Viral tekniker tenderar att ha en hög effektivitet i vissa cellinjer, men de har potential för immunologiska och inflammatoriska reaktioner 2. Vanliga kemiska transfektion metoder är utfällning med kalciumfosfat 3, bakteriella exotoxiner 4 och lipofektion 5. Dessa tekniker har visat sig vara effektiva, men det uppstår vissa problem, såsom celltoxicitet och icke-specificitet. Vidare tekniker såsom kalcium phosphate nederbörd har visat sig ha transfektionseffektiviteter upp till 70%, men endast i vissa cellinjer, sällan i primära celler 6. Detta är anmärknings som ökade forskningsinsatser sätts in i primära celler, särskilt när det gäller att utforma olika behandlingar för klinisk användning och studier av DNA-funktion.
Tidsmässig sönderdelning av cellmembranet genom mekanisk stimuli är ett alternativ för att införa främmande molekyler i celler. Tekniker inkluderar: mikroinjektion av molekyler 7, elektroporering med användning av ett elektriskt fält för att störa membranet 8,9, sonoporation använder ultraljudsvågor för att störa cellmembranet 10 till 12, partikelbombardemang, vilket framgår av den "gene gun", som skjuter partiklar bundna med gener i cellen 13, och mer nyligen, tillämpningen av vätska skjuvspänningen som har visat sig tidsmässigt permeabilisera däggdjursceller 14,15. Även mekanikeral metoder undvika några av de ovannämnda frågorna, de är oftast åtföljs av lägre effektivitet och mycket komplicerade och specialiserade inställningar. Ett lufttryck glimurladdning brännare (APGD-t) utvecklades vid McGill med det ursprungliga målet för functionalizing ytor och lösgöra vidhäftande celler in vitro 16. Serendipitously, upptäcktes det att en levande / död fläck som används på något sätt tas in av celler utan en permeabilisering medel som läggs till. Dessutom verkade det ha skett endast i begränsade områden i brunnarna som hänt för att matcha upp med facklan vägen. Utredning permeabilization kapacitet APGD-t fortsatt och i kontrollstudier, visade det sig att bäraren inert gas stråle av plasma utan excitation kunde också permeabilize celler. Detta motsade den inledande hypotesen att de reaktiva ämnen som skapas av plasmastråle försämras tillfälligt membranfunktion och föreslog att bara de mekaniskatiska styrkor var tillräcklig för att orsaka cell permeabilization. Härifrån, studier fortsatte i vårt labb för att försöka kvantifiera och karakterisera permeabilization effektiviteten av en inert gas jet samt titta på dess transfektion kapacitet 16.
Genom dessa studier har det visat sig att mikroporerna i själva verket formen i plasmamembranet, och dessa porer tenderar att återförsluta inom ca 5 sek 15. Vi har visat att tekniken användbarhet in vitro och in vivo i korioallantoismembranet i ett kycklingembryo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Utveckling av LabView Program
- En massflödesregulator (MKS M100B Mass-Flo Controller) är fäst till heliumgasledningen för att säkerställa en exakt gasflödeshastigheten. Enheten styrs av en inspänning på mellan 0 och 5 V. En reglerkrets i LabView programmet bestämmer den spänning vid varje given tidpunkt. Gränssnitt mellan datorn och massflödesregulator utförs av en datainsamlingsenhet (NI USB-6009), och en 12 V strömförsörjning ger ström till massflödesregulator.
- Två positionerings linjära diabilder används för att kontrollera förflyttning av den 6-brunnar, en för varje riktning. Varje enhet består av en MA15-serier Velmex Unislide Assembly tillsammans med en stegmotor, och båda sammansättningar styrs av en enda Velmex VXM Stegmotor Controller. Regulatorn möjliggör manuell jogging för varje motor eller accepterar en sträng av externa seriella kommandon, en kombination som möjliggör viss rörelse patterns. Flera mönster kan programmeras in i LabView-program, kräver att användaren att endast den önskade facklan hastighet samt stigen dimensioner.
2. Beredning av utrustning
- Öppna både helium cylinder och regulator.
- Sätt på motorstyrningen.
- Öppna LabView-program och kontrollera alla förhållanden.
- Se till att plattformen är centrerad. För att kontrollera, titta på varje motor skede och kontrollera att varje vagn är inte nära någon scen slut. Antingen har det program centrum vagnarna eller manuellt justera genom att använda motions kontrollerna på framsidan av motorstyrenheten.
- Om detta är den första körningen för dagen, är det rekommenderat att köra programmet en gång utan celler, för att säkerställa att installationen fungerar korrekt.
3. Beredning av Gas Jet Capillary munstycke Höjd
- Ta bort kapillär från hållaren och noll höjden ratten.
- Placera 6-brunnar on plattformen.
- Ersätt och sänk gasstrålen kapillär till botten av brunnen, tills den träffar täckglas. Säkra kapillär i hållaren.
- Med hjälp av höjd urtavla, höja kapillär 3 mm. Markera denna höjd på kapillär basen.
- Höj kapillär till en säker höjd och sedan ta bort 6-brunnar.
4. Cell Permeabilization protokoll
- Kultur adherent cellinje till konfluens på glas täckglas i en 6-brunnars platta med användning av standardodlingstekniker. För HeLa-celler, utsäde 6-brunnars plattor med 2 x 10 5 celler per brunn och inkubera i 48 timmar före behandlingen.
- Förbered lämplig volym av lösning som innehåller den önskade vektorn. För hrGFPII-1, en koncentration av 50 ng / | il i 1 x PBS ger en stark fluorescerande signal i HeLa-celler 24 h efter transfektion. För dextran studier anses 80 | ig / ml av 10 kDa-grönfluorescerande dextran rekommenderas. Hädanefter kommer denna lösning att hänvisas till ens "vector-lösning".
- Avlägsna cellodlingsmedia från brunn och skölj tre gånger med 1 x PBS.
- Pipet 1,370 l av vektor lösning som beretts i steg 4.2 i väl. Detta bör leda till en vätskedjup på ca 1,3 mm.
- Placera brunn innehållande vektorlösningen i centrum av plattformen. Sänk gasen strålemunstycket till den tidigare markerade nivån indikerar ett munstycke höjd på 3 mm ovanför bilden.
- Ställ helium flöde i LabView-program och välj önskat rörelsemönster som ska användas. Välj "Kör" när du är klar att börja permeabilization protokollet. Det kommer att finnas en inledande fördröjningsperiod under vilken massflödesstyrenheten förbereder sig för att ge den nödvändiga flödeshastigheten. När lämplig flödeshastighet har uppnåtts, kommer LabView programmet aktivera stegmotorer för att flytta väl i det önskade permeabilization mönstret. När plattformen har stoppats, vänta ca 30 sekunder och ta bort vektorlösningen.Anm: Optimal permeabilisering inträffar nära ett dynamiskt tryck på 100 till 200 Pa vid munstyckets utlopp, beroende på kapillär diameter.
- Tvätta väl tre gånger med 1x PBS.
- Fyll väl med färsk odlingsmedia.
- Upprepa steg 4,3-4,6 för önskat antal experiment. OBS: Se till att inkludera kontrollprov som består av brunnar fylls med vektorn lösning utan gasstrålen körs över dem. Låt lösningen i kontrollbrunnarna för ca 1 minut sedan vidare till steg 4.5 och 4.6.
- Om kör en hrGFP transfektionsexperiment, retur 6-brunnars platta till inkubatorn under 24 h för att tillåta Transfected material som skall transkriberas av cellerna. Om du kör en dextran permeabilization experiment tillbaka 6-brunnar till inkubatorn i 15 minuter.
5. Cell imaging
- Om så önskas, omedelbart före avbildning, kontrast med lämplig levande / död fläck att utvärdera celldöd.
- Image celler med åtgärdaderiate mikroskop för att undersöka transfektion / permeabilization effekten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Permeabilisering av HeLa-celler med 10 kDa grönfluorescerande dextran med användning av en helium gasstråle med en 0,86 mm kapillär inre diameter visas i figur 1. Cellerna counterstained omedelbart efter permeabilisering med 2 pl / ml EthD-1-lösning (LIVE / DEAD Viability / Cytotoxicity Kit) för att visualisera celldöd. Omedelbart efter motfärgning, var täckglas monterade och avbildas. Denna figur visar resultaten av att helium gasstråle vid tre olika utgångstryck jämfört med ett kontrollprov. Observera att permeabilization spårvidd och effektiviteten ökas med ett högre dynamiskt tryck och celldöd bara visade en liten ökning (A och B). Men när ett högt dynamiskt tryck uppnåddes ades HeLa-celler avlägsnas från täckglas och mycket lite perifer permeabilisering inträffat. En mer detaljerad analys av cellstripp och transfektion effektivitet har tidigare genomförts av Chouinard-Pelletier et al. 15
Genom svepelektronmikroskopi studier var mikroporer iakttas i cellmembranet (fig 2). Permeabilisering av HeLa-celler utfördes med användning av en helium gasstråle med en 0,86 mm kapillär inre diameter i ett utloppstryck av 300 Pa Efter permeabilisering protokollet fick cellerna omedelbart fixerades med 1% paraformaldehydlösning i 1 x PBS.
Figur 1. Permeabilisering av HeLa-celler med 10 kDa grönt fluorescerande dextran med hjälp av en heliumgasen stråle med en kapillär munstycke innerdiameter 0,86 mm. Dextran fluorescerar grönt och döda celler fluorescerar rött. A) Dynamiskt tryck på 100 Pa, B) på 135 Pa, och C ) på 175 Pa D) Styrning med dextran lagt bUT Ingen exponering för heliumgas jet.
Figur 2. SEM-bilder på en förstoring av 50.000 X på ytan av HeLa-celler efter gasstråle permeabilization vid 300 Pa A) Styr prov uppvisar en jämn cellytan. B) Ytan permeabiliserad cell uppvisar en por med en 84 nm i diameter. Klicka här för att visa en större bild .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Inert gas jet permeabilization är en användbar teknik för vidhäftande cell transfektion. Det ger möjlighet att överföra biomolekyler i celler med hjälp av mekaniska krafter, vilket eliminerar behovet av potentiellt skadliga kemikalier eller virala vektorer. Tekniken skulle kunna ge forskare och kliniker ett effektivt och relativt enkelt sätt att exakt transfektera celler. Selektivitet permeabilization är också unikt att låta forskare endast behandla vissa celler i en enda koloni som kan vara användbart i flera program.
Flera parametrar kan justeras för enskilda experiment såsom kapillär munstycksdiameter och vinkel, gasflödeshastighet, flytande och kapillär höjd, cellinje, målbiomolekyl som skall användas, och typen av inert gas. En uppsättning vätskenivå och kapillär höjd har beskrivits i förfarandet och dessa värden har valts för att minimera antalet variabler som är involverade i vår experiments. För närvarande är vi modellering av systemet med hjälp av experimentella flödesvisualisering och Computational Fluid Dynamics. Detta kommer att ge oss en bättre förståelse för de krafter som överförs på cellerna, vilket tillåter oss att bestämma permeabilization beroende av variabler såsom flytande egenskaper.
Det är viktigt att ta del av den största dynamiska trycket under vilket cellerna kan överleva. Man fann att en gång dynamiska trycket närmade 200 Pa för en gas-strålemunstycke höjd av 3 mm, blev sannolikt HeLa-cell-strippning. Detta överensstämmer med andra studier, t.ex. Lu et al. Som observerade WT NR6 fibroblastcellinje lossnar vid 200-265 Pa 17. Om stora mängder stripp uppträder bör en lägre gasflöde lindra problemet. Likaså höga flöden leda till celldöd och falskt positiva permeabilization resultat. När cellerna har dött de kommer att bli genomsläpplig för molekyler och därmed döda celler kan misstas för permeabilized levande celler. Denrekommenderas därför att göra en levande / död analys för att säkerställa att de permeabiliserade cellerna är i själva verket fortfarande är vid liv. Death ökar med ökande tryck och vårt labb fann att vid 390 Pa de flesta permeabiliserade HeLa-celler var döda 15. Cellernas livsduglighet under en utsträckt tidsperiod har också undersökts, med hrGFPII-1 expression observeras upp till 72 h efter permeabilisering (data visas ej). Ytterligare studier pågår för att undersöka lönsamheten på ännu längre tidspunkter.
Vår hypotes är att fluid skjuvspänningar på cellerna, som skapats av den stråle av gas och förskjutningen av media, orsaka temporär sönderdelning av cellplasmamembranet. Detta är samma mekanism som föreslagits för de andra mer komplexa fysikaliska metoder såsom mikrobubbelkollaps och sonoporation 18. Driftsbetingelserna för denna metod är beroende av den typ av celler, fastsättning vid substratet, mekaniska egenskaper hos cellenoch cell-wall, molekyl av intresse, egenskaperna hos vätskan och gasen, och de fysiska dimensionerna hos installationen. Genom storleksexklusion studier har vi funnit att dextran molekyler större än 40 kDa visar mycket låg permeabilization effektivitet och att en optimal dextran storlek är 10 kDa för experiment 15. Detta är viktigt eftersom det begränsar storleken på molekyler som kan permeabilized i celler med hjälp av detta protokoll. Hittills har vi bara undersökt transfektion egenskaper plasmider. Ytterligare studier kommer att undersöka om större bitar av genetiskt material är i stånd att transfekterade med den här tekniken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Författarna vill tacka följande finansieringskällor: Canadian Institutes of Health Research (CIHR), naturvetenskaplig och teknisk forskning Council (NSERC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vitality hrGFPII-1 | Agilent Technologies Canada | 240143-57 | Green fluorescent protein for transfection experiments on HeLa cells |
| Dextran, AlexaFluor 488; 10,000 MW, Anionic, Fixable | Life Technologies Inc. | D22910 | dextran for permeabilization experiments |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit | Life Technologies Inc. | L3224 | for counterstaining of mammalian cells |
| Prolong Gold Antifade Reagent | Invitrogen | P36930 | for mounting slides when imaging |
| Ultra High Purity Helium | Praxair Canada Inc. | HE 5.0UH-T | |
| Hyclone DMEM/ High Glucose Media - 500 ml | Thermo Scientific | SH30022.01 | for HeLa cells |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 26140079 | For DMEM media |
| Penicillin-Streptomycin, liquid | Invitrogen | 15140-122 | For DMEM media |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) 1x | Produced in lab | ||
| Table 1. List of required reagents | |||
| 6-Well Clear TC-Treated Microplates | Corning | 3506 | |
| #1 22 x 22 Coverslips | Fisher | 12-542B | |
| Glass Capillaries | World Precision Instruments | WPI Sizing Information | |
| ID (mm): 1, 0.86, 0.68, 0.5 Order #: 1B200, 1B150, 1B120, 1B100 | |||
| Mass-Flo Controller | MKS | M100B01314CS1BV | Mass flow controller, Series M100B, requires an external 12 V power supply |
| USB-6009 DAQ Device | National Instruments | 779026-01 | |
| UniSlide Assembly with stepping motor and controller | Velmex | Two series MA15 UniSlide Assemblies, fitted with Vexta 1.8° stepping motors provided by Velmex, and controlled by a VXM Stepping Motor Controller | |
| Table 2. List of required equipment |
References
- Rosenberg, S. A., et al. Gene transfer into humans--immunotherapy of patients with advanced melanoma, using tumor-infiltrating lymphocytes modified by retroviral gene transduction. The New England Journal of Medicine. 323, 570-578 (1990).
- Yang, Y., et al. Cellular immunity to viral antigens limits E1-deleted adenoviruses for gene therapy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 4407-4411 (1994).
- Chen, C., Okayama, H. High-efficiency transformation of mammalian cells by plasmid DNA. Molecular and cellular biology. 7, 2745-2752 (1987).
- Walev, I., et al. Delivery of proteins into living cells by reversible membrane permeabilization with streptolysin-O. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 3185-3190 (2001).
- Felgner, P. L., et al. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84, 7413-7417 (1987).
- Hamm, A., Krott, N., Breibach, I., Blindt, R., Bosserhoff, A. K. Efficient transfection method for primary cells. Tissue engineering. 8, 235-245 (2002).
- Rauth, S., Kucherlapati, R. S. Expression of DNA Transferred into Mammalian-Cells. J. Bioscience. 6, 543-567 (1984).
- Spandidos, D. A. Electric field-mediated gene transfer (electroporation) into mouse Friend and human K562 erythroleukemic cells. Gene analysis techniques. 4, 50-56 (1987).
- Chu, G., Hayakawa, H., Berg, P. Electroporation for the efficient transfection of mammalian cells with DNA. Nucleic Acids Research. 15, 1311-1326 (1987).
- Fechheimer, M., et al. Transfection of mammalian cells with plasmid DNA by scrape loading and sonication loading. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84, 8463-8467 (1987).
- Koch, S., Pohl, P., Cobet, U., Rainov, N. G. Ultrasound enhancement of liposome-mediated cell transfection is caused by cavitation effects. Ultrasound in Medicine & Biology. 26, 897-903 (2000).
- Greenleaf, W. J., Bolander, M. E., Sarkar, G., Goldring, M. B., Greenleaf, J. F. Artificial cavitation nuclei significantly enhance acoustically induced cell transfection. Ultrasound in Medicine & Biology. 24, 587-595 (1998).
- Yang, N. S., Burkholder, J., Roberts, B., Martinell, B., McCabe, D. In vivo and in vitro gene transfer to mammalian somatic cells by particle bombardment. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87, 9568-9572 (1990).
- Hallow, D. M., et al. Shear-induced intracellular loading of cells with molecules by controlled microfluidics. Biotechnology and Bioengineering. 99, 846-854 (2008).
- Chouinard-Pelletier, G. L., Guay, M., Coulombe, D., Leask, S., L, R., Jones, E. Use of inert gas jets to measure the forces required for mechanical gene transfection. Biomedical Engineering Online. 11, (2012).
- Leduc, M., Coulombe, S., Leask, R. L. Atmospheric Pressure Plasma Jet Deposition of Patterned Polymer Films for Cell Culture Applications. Ieee T. Plasma Sci. 37, 927-933 (2009).
- Lu, H., et al. Microfluidic shear devices for quantitative analysis of cell adhesion. Analytical Chemistry. 76, 5257-5264 (2004).
- Sankin, G. N., Yuan, F., Zhong, P. Pulsating tandem microbubble for localized and directional single-cell membrane poration. Physical Review Letters. 105, 078101 (2010).
