A multi-electrodo Sistema Patch-clamp asistida por ordenador

Summary

De múltiples electrodos patch-clamp grabaciones constituyen una tarea compleja. Aquí se muestra cómo, mediante la automatización de muchas de las medidas experimentales, es posible acelerar el proceso que conduce a una mejora cualitativa en el rendimiento y el número de grabaciones.

Abstract

La técnica de patch-clamp es hoy en día el método más bien establecido para el registro de la actividad eléctrica de las neuronas individuales o sus compartimentos subcelulares. Sin embargo, el logro de grabaciones estables, incluso a partir de células individuales, sigue siendo un procedimiento que consume tiempo de considerable complejidad. Automatización de los muchos pasos en conjunto con la pantalla de información eficiente puede ayudar enormemente experimentadores en la realización de un mayor número de grabaciones con una mayor fiabilidad y en menos tiempo. Con el fin de lograr grabaciones a gran escala concluimos el enfoque más eficiente no es para automatizar completamente el proceso, pero para simplificar los pasos experimentales y reducir las posibilidades de error humano al tiempo que incorpora de manera eficiente la experiencia del experimentador y la retroalimentación visual. Con estos objetivos en mente, hemos desarrollado un sistema de ayuda de computadora que centraliza todos los controles necesarios para una multi-electrodo experimento de patch-clamp en una sola interfaz, un comercgamepad inalámbrico ially disponibles, al tiempo que muestra de experimentos relacionados con las señales de información y orientación en la pantalla de ordenador. Aquí se describen los diferentes componentes del sistema que nos permitió reducir el tiempo requerido para alcanzar la configuración de grabación y aumentar considerablemente las posibilidades de grabar con éxito un gran número de neuronas al mismo tiempo.

Introduction

La capacidad para grabar y estimular múltiples sitios con precisión micrómetro es extremadamente útil para lograr experimentalmente una mejor comprensión de los sistemas neuronales. Muchas técnicas se han desarrollado para este fin pero ninguno permitir la resolución submillivolt logra mediante la técnica de patch-clamp, esencial para el estudio de la actividad subumbral y potenciales postsinápticos individuales. Aquí se describe el desarrollo de un sistema de patch-clamp asistida por ordenador de doce electrodo destinado a registrar y la estimulación de un gran número de células individuales con la suficiente precisión para el estudio de la conectividad neuronal simultáneamente. Mientras que muchas otras aplicaciones pueden ser concebidos para un sistema de este tipo, se presta particularmente bien para el estudio de la conectividad sináptica dado que el número de conexiones posibles dentro de un grupo de neuronas crece proporcionalmente al cuadrado del número de neuronas en cuestión. Por lo tanto, mientras que un sistema con tres electrodos permite probar laocurrencia de hasta seis conexiones y más a menudo grabación de una sola, la grabación de doce neuronas permite probar la ocurrencia de hasta 132 conexiones y observando con frecuencia más de una docena (Figura 1). La observación de decenas de conexiones simultáneamente hace posible el análisis de la organización de las redes de pequeñas y deducir propiedades estadísticas de la estructura de red que no se puede probar lo contrario ^1. Por otra parte, la estimulación precisa de numerosas células también permite la cuantificación del reclutamiento de las células postsinápticas ^2.

Protocol

1. Equipo de preparación

1. Manipuladores de control desde un ordenador
   1. Conecte cada caja del controlador micromanipulador a una computadora a través de puertos serie (RS-232).
   2. Implementar los comandos para el posicionamiento, consultar y ajustar la configuración para ser enviados a través del puerto serie. Problemas de velocidad y compatibilidad de hardware Dadas C / C + + se recomienda como el lenguaje de programación.
   3. Estandarizar el sistema de referencia de los manipuladores de modo que el cero es la posición más próxima posible con respecto a los motores y movimiento positivo se dirige lejos de los motores.
   4. Coloque el microscopio a su posición central 2 mm por encima de la muestra de plano focal (coordenadas [0, 0, 2000]).
   5. Almacenar, para cada manipulador, las coordenadas locales que permiten que la punta de una pipeta que se observó en el centro del campo de visión del microscopio. Este es el punto de referencia inicial para cada electrodo.
2. Visuaposiciones de los electrodos Lize. Es muy útil ser capaz de seguir la posición de cada electrodo durante un experimento. Una representación gráfica es la forma más intuitiva de lograr esto. Para ello los sistemas de referencia de cada electrodo y la del microscopio deben coincidir. Una manera sencilla de lograr esto es:
   1. Llevar la punta de un electrodo al centro del campo de vista.
   2. Almacenar la posición en cada eje del manipulador y cada eje del microscopio.
   3. Ejecutar con el eje x del manipulador de un movimiento relativamente grande (1 mm).
   4. Ubique la punta una vez más se mueve sólo el microscopio.
   5. Calcular la diferencia en la posición de microscopio, ya que se midió última. Estas son las proyecciones del movimiento del eje del electrodo en los ejes de microscopio.
   6. Repita los pasos 2.3 a 2.5 para el Y y Z ejes del manipulador electrodo. Esto permite una matriz de proyecciones en el microscopio ejes por determinar (<strong> Figura 2) también llamado matriz coseno:
      
   7. Invertir esta matriz para que sea posible calcular los movimientos en tres dimensiones, requeridos por el manipulador de electrodos para llegar a una posición determinada en el microscopio sistema de coordenadas:
      
   8. Usando el punto de referencia inicial y la matriz de coseno determinar la posición de cada electrodo en el microscopio de coordenadas.
   9. Mostrar gráficamente, basado en el microscopio de coordenadas, la posición de cada electrodo a intervalos regulares. Hemos elegido utilizar / C + + bibliotecas dibujo C (GDI +) para dibujar posiciones de los electrodos cada 40 ms.
   10. Repetir los pasos 1.2.1 - 1.2.7 cada vez que se cambian los ángulos de manipulador o si se necesitan cambios de posición de varios milímetros, por ejemplo, cuando el tipo de electrodo se cambia.
3. Habilitar el almacenamiento de la positions de características relevantes en el tejido, tales como células o puntos de referencia anatómicos, en microscopio coordenadas.
4. Adquirir vídeo y superponer información pertinente.
   1. Mecánicamente alinear el eje x de movimiento del microscopio con el eje horizontal de la cámara del microscopio.
   2. Instalar en el equipo un framegrabber con vídeo en directo y la capacidad de recubrimiento y un kit de desarrollo de software (SDK).
   3. Implementar la operación de visualización de vídeo en directo con el SDK.
   4. Convertir el microscopio sistema de coordenadas en el sistema de referencia de la cámara por la traducción de escala apropiado.
   5. Dibuje las características relevantes en coordenadas de cámara y superposición sobre el vídeo en directo la imagen resultante a intervalos regulares de unos 40 ms (Figura 3).
5. Amplificadores de control.
   1. Utilice el software de amplificador de controlar los ajustes del amplificador de la interfaz.
6. Control osciloscopios.
   1. Conecte los osciloscopios para PC mediante puertos serie.
   2. Determinar la escala osciloscopio, acoplamiento y resolución temporal para los diferentes pasos del procedimiento de patch-clamp en de fijación de voltaje (por ejemplo, electrodo en el baño, la formación del sello, configuración de célula completa) y la corriente-abrazadera.
   3. Envíe los comandos de ajuste de osciloscopio apropiadas cuando los comandos de amplificación se emiten desde la interfaz.
7. Presión pipeta de control.
   1. Montar un sistema de control de presión de acuerdo con la Figura 4.
      1. Utilice una fuente de alimentación de 12 V / 5 V para suministrar cada componente electrónico adecuada.
      2. Conectar la salida de una bomba de membrana en el búfer de presión positiva (un recipiente de 100 ml).
      3. Conectar la entrada de una bomba de membrana en el búfer de presión negativa (un recipiente de 100 ml).
      4. Conecte el tubo de soporte de pipeta a un sensor de presión en el pressure sistema de control y una válvula neumática que se conecta al compartimento principal de presión.
      5. Conectar cada uno de los tampones de presión a una válvula conectada al compartimento principal de presión.
      6. Conecte una válvula entre el compartimiento de presión principal y la atmósfera.
      7. Conecte un sensor de presión en el compartimento principal de presión.
      8. Conecte un sensor de presión para cada búfer.
      9. Conecte el sistema de control de presión para una tarjeta de adquisición de datos.
      10. Conecte cada sensor de presión a una entrada analógica.
      11. Conectar cada válvula a una salida digital.
   2. Retire desplazamiento de todos los sensores mediante la apertura de todas las válvulas excepto las que conectan a las bombas de membrana y restando la presión medida de la presión atmosférica.
   3. Implementar el control de presión
      1. Definir en la interfaz de un control para activar o desactivar el control de presión positiva para cada pipeta.
      2. Definir una presión positiva mínima para la pipetas de aproximadamente 70 mbar.
      3. Periódicamente (cada 0,5 segundos) detectar cuando la presión en pipetas bajo control de presión activa desciende por debajo del umbral establecido.
      4. Al cruce del umbral de abrir el amortiguador de presión positiva al compartimento de presión principal y este compartimiento hacia la pipeta en cuestión durante breves períodos de tiempo (20 ms) hasta que la presión en las pipetas es superior al umbral. Cierre todas las válvulas.
      5. De-activar aún más el control de presión como se inicia la aproximación final hacia una célula de interés.
   4. Aplique presión negativa para la formación del sello
      1. Cierre todas las válvulas y abra la válvula de amortiguador de presión negativa hacia el compartimiento de presión principal y este compartimiento hacia la pipeta en cuestión durante el tiempo que el experimentador requiere manteniendo un botón pulsado.
8. Centralizar los comandos en un dispositivo de interfaz humana.
   1. Conecte un wirele comercialmente disponibless gamepad para PC.
   2. Implementar la lectura del estado de joystick. Por ejemplo, usar las bibliotecas de DirectX para C / C + + para realizar lecturas cada 5 ms.
   3. Comparar la situación actual con el estado anterior de detectar que se han pulsado, soltado o se mantiene pulsado los botones ya que paso la última vez.
   4. Asignar funciones a cada botón en el mando de juegos. Un ejemplo de este mapeo se muestra en la Figura 5.

2. Procedimiento Patch-clamp

1. Preparar las rodajas de cerebro de la región de interés.
2. Coloque un trozo de cerebro de interés, con la región de interés en el centro del rango de desplazamiento del microscopio.
3. La selección de la célula
   1. Identificar las células de interés por la navegación con el microscopio. Guarde la posición de las células sobre la base del microscopio sistema de coordenadas con un derecho del ratón haga clic en la pantalla de vídeo en directo en la parte superior de la célula de interés. La interfaz gráfica mostrará las celdas seleccionadas, así como las micropipetas para una visión general y global de software añadirá un marcador en la posición de la celda que se superponen sobre las imágenes. Además de una imagen de la célula es capturada para futuras referencias en el archivo 'Celda #. Jpg'.
4. Atribución de las células para pipetas
   1. Después de seleccionar las células de interés, asignar qué pipeta registrará cada celda. La interfaz gráfica proporciona controles de asignación que se debe establecer. Visualice una vista previa de la configuración final seleccionando la casilla 'Mostrar Posiciones Finales'.
   2. Seleccione cada pipeta para el que se desea la vista previa de la posición final o marque la casilla 'Seleccionar todo'. Desactivar la visualización de la posición actual para una mejor visualización, si es necesario.
5. Preparar las pipetas
   1. Llene las pipetas (6-8 MΩ suelen ser mejores si se usan muchas pipetas) with solución intracelular y cargarlos en sus titulares. Coloca los Headstages en sus fijaciones, pero no se deslicen hacia adelante para evitar tocar el baño con la punta de la pipeta.
   2. Habilitar el control de la presión positiva y seleccionar todas las pipetas para asegurar que las puntas se mantendrán limpios. Deslice suavemente cada headstage en su lugar.
6. Localización de las puntas de pipeta
   1. Coloque el microscopio a una posición central con el foco 3 mm por encima de la rebanada pulsando el botón R2 mientras sostiene el botón 'A'. Use la posición correspondiente para cada manipulador como se almacena en el experimento anterior pulsando el botón L2 mientras mantiene pulsado el botón A.
      Nota: En este punto no debe haber ya sea una sombra distintiva de una pipeta a la vista o un pequeño movimiento a lo largo del eje de la pipeta debe ser suficiente para observar que en la mayoría de los casos. La compensación por las ligeras diferencias en la forma de la pipeta tiene que ser realizada manualmente.
   2. Llevar la punta de la pipeta en el foco. Coloque la punta en el punto central de color rojo de la pantalla de vídeo sin mover el microscopio (debe estar aún en la posición [0, 0, 2000]).
   3. Informar al software que la pipeta está en el centro de la pantalla pulsando el botón Z mientras mantiene el botón C. Después de cada punta de la pipeta se encuentra, enviar ese pipeta hacia atrás de modo que la siguiente se puede localizar pulsando el botón L1 mientras mantiene pulsado el botón A.
7. Acercarse a las células
   1. Una vez que todas las puntas de las pipetas se han localizado con precisión y cada pipeta se atribuye a una celda, coloque automáticamente las pipetas cercanas a sus respectivas celdas. Simplemente haga clic derecho en el centro del grupo de celdas y seleccionar la opción 'Cluster' en el menú emergente. En la ventana de opciones de clúster que aparecerá, seleccione todas las pipetas que desea posicionarse en este momento y haga clic en 'Ir con todas las pipetas controladas ». Repita esta operación para cada grupo de células de interés.
   2. Performa la aproximación final manualmente. La posición de las pipetas en relación con las células se puede especificar de manera diferente, pero por lo general es simplemente 200 m de distancia de la celda en el eje de la pipeta y 200 micras por encima de ella en la dirección vertical, que es suficiente para mantener la punta de la pipeta fuera del tejido . Espere a que termine la colocación de las pipetas y mover el microscopio hacia una pipeta presionando el botón R1 mientras mantiene el botón C.
   3. Vuelva a calibrar cada posición de la pipeta, centrándose el microscopio en la punta en cualquier lugar de la pantalla de vídeo y pulsando el botón B mientras mantiene el botón C. Una cuadrícula debería aparecer brevemente indicando la posición identificada de la pipeta. Si la posición no es correcta, coloque la punta en el punto central de la pantalla de vídeo y pulse el botón Z mientras mantiene el botón C.
8. Establecer la configuración de la celda-adjunto
   1. Confirme que la célula de interés para la pipeta actual es correctamarcada. De lo contrario, mover el microscopio para que coincida con la célula de interés con el punto rojo central. Marque la celda presionando el botón Y mientras mantiene el botón pulsador C. Pulse L2 mientras mantiene el botón C para colocar la pipeta de 200 m de distancia de su celda asignada, el microscopio se moverá automáticamente a la posición correspondiente.
   2. Ajuste la posición de la pipeta para que coincida con el punto rojo. Ajustar el offset pulsando el botón R1 mientras mantiene el botón X. pipeta
   3. Active el impulso de prueba pulsando el botón L1 mientras mantiene el botón X. Poco a poco acercarse a la pipeta para su célula atribuido.
   4. Al observar la formación de un hoyuelo en la superficie de la membrana de la célula de aplicar un breve pulso de la presión negativa pulsando el botón Y mientras mantiene el botón Z para permitir que la presión aplicada para llegar a la célula. Un potencial de mantenimiento de alrededor de-65mV debería establecido en este punto, pulse el botón L2 mientras mantiene el botón X.
9. Configuración de célula completa
   1. Una vez que un sello Giga-se forma para cada celda, iniciar la ruptura de las membranas mediante la aplicación de presión negativa.
10. Realizar grabaciones
    1. Utilice el sistema de estimulación / adquisición para realizar sus grabaciones. Aplicar impulsos o trenes de impulsos en una célula individual a la vez y observar las respuestas en las células restantes a mapa de conectividad entre las células registradas.
11. Retroceder pipetas
    1. Una vez que las grabaciones se terminaron, retroceder pipetas lentamente del tejido con un clic derecho sobre el botón de radio tabla. Seleccione 'retroceden-> Pipetas 500 m' de tener las pipetas se alejan a una corta distancia a lo largo de sus ejes. Observar la deriva en el potencial de las células (la limpieza de las puntas aplicando un poco de presión positiva puede ayudar).
    2. Para retroceder pipetas totalmente hacia atrás, ajuste la velocidad de posicionamiento en 'Fast' y repetir la misma operación pero seleccione la opción "Todos". Retire el utilizadopipetas deslizando suavemente los Headstages y desenroscar las pipetas de los poseedores. Es útil para evitar las torsiones de los titulares en sus cuencas ya que esto podría interferir en gran medida con la posición de la punta de la pipeta.

Representative Results

Siguiendo los métodos descritos anteriormente hemos tenido éxito en la realización de la grabación de células enteras de hasta doce neuronas simultáneamente, casi duplicando el mayor número de neuronas simultáneamente parche-sujetada hasta ahora. Ejemplos de redes de conexiones sinápticas directas entre neuronas piramidales registrada en la capa V de la corteza somatosensorial de las ratas se muestran en la Figura 6.

La determinación de los perfiles de probabilidad de conexión como una función de la distancia inter-somática para un tipo de célula dada es una medida típica de interés que se puede realizar de manera eficiente con un sistema de patch-clamp de múltiples electrodos ^1. Recientemente foto-estimulación comenzó a aparecer como un medio aún más eficientes de obtención de dicha ^3,4 datos. Es importante destacar, sin embargo, los datos adquiridos con los sistemas de patch-clamp de electrodos múltiples permite a los experimentadores para obtener un mapeo más completa de la red en estudio, así como tinción de alta resolución con intracelular difunde colorantes. En electrodos múltiples experimentos de patch-clamp cada célula se puede grabar y estimulada, que a menudo no es el caso con otras técnicas tales como foto-estimulación o de imágenes de calcio. Esta característica permite a los experimentadores a realizar un seguimiento de los sesgos en la conectividad, tales como la alta incidencia de las conexiones recíprocas, que no se puede medir lo contrario. Mediante la estimulación y el registro de todas las neuronas estudiadas se demostró que las neuronas no sólo son sesgados hacia estar conectado recíprocamente sino que también forman racimos. La escala de nuestras grabaciones también nos ha permitido observar que existía una probabilidad más alta de conexión entre pares de neuronas que compartían los vecinos comunes, es decir, fueron ambos conectados al mismo tiempo a otras neuronas individuales en la red de muestreo (Figura 7). Esta observación fue significativa en cada bin distancia intersomática de 50 mm (de 50 a 250 mm). También observamos pares de neuronas que comparten muchos vecinos comunes ocurrieron significativamente másdiez de lo esperado por azar (Figura 7b). Por otra parte, se detectó un efecto sobre la probabilidad de conexión de acuerdo con el número de vecinos comunes compartidos por un par determinado de neuronas. Los vecinos más comunes que comparte la mayor probabilidad de un par de neuronas es estar interconectados (Figura 7c).

Esta tendencia lleva a la formación de grupos de neuronas que están más densamente interconectadas que el promedio. Curiosamente, los grupos altamente interconectadas de neuronas no sólo exhibieron más numerosas conexiones, sino también, en promedio, los más fuertes ^1. Estos resultados nos llevaron a la conclusión de que los circuitos neocortical no sólo organiza en capas y columnas, sino también en conjuntos de células, es decir, grupos de neuronas que comparten densa y fuerte interconexión sináptica como postulado por Donald Hebb hace varias décadas.

Otros resultados de interés que se pueden lograr con múltiples simultáneamente parche-Conector Neurons incluyen la cuantificación de la captación de la inhibición por la actividad supra-umbral en diferentes números de células excitadoras ^2. Una forma ubicua de la inhibición en el neocórtex ⁵ está mediada por las células Martinotti (Figuras 8a y b, adaptado de Berger et al.) Que reciben de entrada a partir de células piramidales y lo integran a su vez afecta a, con un tiempo de latencia, otras células piramidales. Hemos demostrado que, después de breves ráfagas de clavar la actividad en tan sólo cuatro células piramidales, cada célula piramidal en un microcircuito local recibe esta forma de inhibición (Figuras 8c, c, f). También puso de manifiesto que estos potenciales postsinápticos inhibitorios tienden a saturar cuando ocho o más células piramidales son estimulados simultáneamente (Figura 8E).

Una visión general de los componentes del sistema se puede ver en la Figura 9. La interfaz de hardware y software de ARe muestra en la Figura 9a y b, así como la interfaz de controlador en la figura 9c guiar los electrodos hacia las células para grabar bajo objetivo de microscopio (Figura 9d).

Figura 1. Cálculo del número de conexiones observados en un experimento como una función del número de neuronas registradas simultáneamente muestra un crecimiento cuadrática. Cálculos numéricos (TOP). Diagrama ilustrativo donde se añaden sucesivamente otras neuronas de la misma red (parte inferior).

Figura 2. Sistemas de coordenadas de cada manipulador electrodo (amarillo) y el microscopio (rojo).

Figura 3. Captura de pantalla de una pipeta en el enfoque hacia la celda asignada con enfoque superpuesto vector, posiciones de celda y la barra de escala.

Figura 4. Diagrama que ilustra el sistema neumático para el control de la presión de la pipeta.

Figura 5. Comandos en el dispositivo de interfaz humana que centraliza los controles utilizados en los experimentos de patch-clamp.

Figura 6. Ejemplo de tres redes deconexiones sinápticas directas asignadas en los experimentos individuales

Figura 7. Efecto vecino común. (A) Pares de neuronas que se conectan simultáneamente a al menos otra neurona en la red de la muestra (azul) presentan una probabilidad significativamente mayor de ser interconectados. (B) pares de neuronas que comparten múltiples vecinos comunes ocurren más a menudo de lo esperado por casualidad en las redes de la muestra. (c) la probabilidad de conexión dentro de pares de neuronas aumenta en función del número de vecinos comunes compartidos por el par.

Figura 8. La cuantificación de la captación de las células de Martinotti. (A) Representación gráfica de una célula piramidal (rojo) que forma sinapsis en una célula Martinotti (azul), que a su vez forma sinapsis en una segunda de células piramidales (negro). (b) la estimulación Supra-umbral de la célula piramidal ( rojo) conduce a la contratación de la Célula Martinotti (azul) a través de la integración de facilitar los potenciales excitatorios postsinápticos. La Célula Martinotti Reclutado entonces inhibe la segunda célula piramidal (negro). (C) Diagrama que representa la estimulación de un mayor número de células piramidales de parche-sujetado y los efectos sobre otra célula piramidal. (D) Promedio de los potenciales postsinápticos inhibitorios grabados desde una célula piramidal como una función del número de otras células piramidales cercanos que son estimulados. Adaptado de Berger et al. ² (e) La amplitud de la inhibición disynaptic en un circuito local de tiende a saturar cuando 9 o más células piramidales son Stimulated que indica el reclutamiento máxima de células Martinotti en probablemente alcanzado en este punto. (f) La fracción de células que reciben la inhibición disynaptic rápidamente se eleva a 1 como un número creciente de células piramidales son estimulados.

La Figura 9. Ilustración del conjunto del sistema. (A) Interfaz gráfica de usuario con la ventana principal, la visualización de vídeo en directo, la ventana y la representación gráfica de log. (B) Microscopio y manipuladores. (C) Dispositivo de interfaz humana con controles para el procedimiento experimental. (D) Vidrio micropipetas en posición para grabar múltiples neuronas.

Figura 10. Probabilit binomialfunciones de distribución y que describen la fracción de experimentos que registran con éxito un número dado de células dado el uso de doce electrodos. Comparación entre el rendimiento de los experimentos realizados utilizando la retroalimentación visual por usuarios experimentados se muestran en azul y por los usuarios menos experimentados en condiciones no ideales en rojo.

Discussion

Una pregunta inmediata suele surgir en relación con la tasa de éxito del procedimiento que hemos descrito. Para altas tasas de éxito la preparación es esencial. Las pipetas deben tener aberturas de punta que sean adecuados a los seres células grabadas. Filtrado de la solución intracelular para evitar pipetas obstruidos también es importante. Pipetas extremadamente limpias, de barril son otro requisito. Una distribución binomial es el modelo más simple que se puede utilizar para entender cómo estos problemas afectan el rendimiento final. Es razonable esperar que un experimentador con experiencia y equipo adecuado para lograr una tasa de éxito del 80% o más en el registro de neuronas individuales con información visual. Los principiantes se puede esperar para lograr tasas de éxito mucho más bajos, sobre todo si se pasan por alto los pasos de preparación importantes. ¿Cómo estas tasas se traducen en número de células grabadas por experimento se puede ver en la Figura 10. Nuevos aumentos en el número de forma simultánea patch-almejaneuronas de los agregados es probable que requiera la miniaturización de los manipuladores y el aumento de la fiabilidad del procedimiento, que a su vez requiere una atención considerable a los detalles, pero son totalmente factible.

La versatilidad del sistema que aquí se presenta todavía está siendo explorado y novedosas aplicaciones frecuentemente se ha encontrado, en particular, en la exploración de la relación entre las señales extracelulares y actividad de las neuronas individuales ^7. Consideraciones anatómicas se vuelven más importantes como la distancia entre células aumenta grabados. Sin embargo, este sistema permite definitivamente la investigación de largo alcance y la conectividad entre capas donde las conexiones se mantienen intactos después del procedimiento de corte.

Control Micromanipulador

Habilitación de posicionamiento automático con los micromanipuladores acelera en gran medida el proceso de múltiples electrodos de patch-clamp y aumenta su fiabilidad reducir la aparición deerrores humanos. Diferentes fabricantes ofrecen diferentes soluciones con el fin de establecer una conexión desde el PC a los manipuladores. Una opción común es un puerto serie o USB. Con el fin de garantizar una comunicación rápida dedicamos un puerto serie a cada controlador manipulador. La característica más útil de posicionamiento automático es, probablemente, la eliminación de la mayor parte del movimiento lateral y vertical de los electrodos en el interior del tejido y que limitan su distorsión. Como el movimiento de los electrodos en el interior del tejido se lleva a cabo casi exclusivamente a lo largo de la dirección axial, se minimiza la interferencia mecánica. Los movimientos laterales sólo son necesarias para evitar ocasionalmente vasos sanguíneos y células.

Visualizar posiciones de los electrodos

Es muy útil ser capaz de seguir la posición de cada electrodo durante un experimento. En una configuración tradicional de perder la vista de un electrodo puede convertirse rápidamente en un problema. Cuando se utiliza un gran número de electrodos no esposible mantener todos los electrodos dentro del campo de visión en todo momento. Basándose en una representación gráfica es la alternativa más intuitivo y también ayuda a mantener un seguimiento de los progresos del experimento, al instante mostrando que los electrodos ya se han posicionado en su configuración final y cuáles no lo tienen.

Adquisición de vídeo y superposición

La capacidad de mostrar vídeo en directo desde el campo del microscopio de vista de una ventana de aplicación es muy útil. La ventana de visualización fue programado para responder a los clics del ratón que permite el almacenamiento de las posiciones de interés (somata celular), así como la actualización rápida de las posiciones relativas entre microscopio y electrodos eliminando errores acumulados cada vez que aparecen. También implementamos la superposición de información práctica sobre el vídeo en directo, como la trayectoria de aproximación para cada electrodo hacia células elegidas o el marcado de estas células (Figura 3). Registro ofunciones f y superposición de imágenes auxiliares, tales como las cifras de los atlas anatómicos también se puso en marcha para ayudar a que las regiones de interés no son inmediatamente claro.

Amplificadores

Amplificadores microscopio controlados por ordenador pueden permitir el control se lleve a cabo desde otras aplicaciones también. Esto aumenta drásticamente la velocidad y fiabilidad con la que múltiples células pueden efectuarse simultáneamente y elimina la mayor fuente de errores humanos. Después de la colocación y la presión de la pipeta de control asistido por ordenador este es el paso que produce los aumentos más notables en el tiempo, pero los avances en la fiabilidad son aún más importantes.

Osciloscopios

La garantía de que las señales de prueba se puede visualizar en tiempo real en la escala apropiada y resolución temporal aumenta en gran medida la eficiencia con que un experimentador puede ejecutar medidas experimentales. Al acoplar el conjunto osciloscopioTings al amplificador modos (como pinza de corriente o voltaje) nos aseguramos de que los pasos críticos en el tiempo fueron ejecutados y visualizados con poco esfuerzo, como las celdas de detención en los potenciales de membrana apropiados inmediatamente después de lograr la configuración de conexión celular. Visualización correcta se asegura mediante el envío de la escala y de acoplamiento comandos apropiados a través del puerto serie en el propio protocolo del osciloscopio para ajustar la amplitud y el desplazamiento de las señales de prueba dentro de la pantalla del osciloscopio.

Control de la presión de la pipeta

Como el número de electrodos empleados en un experimento aumenta, lo que garantiza que la presión positiva se aplica de forma permanente para mantener la punta de los electrodos de vidrio limpio se vuelve más exigente hasta el punto de que constituye un obstáculo importante. De presión positiva y negativa suficiente (unos pocos cientos de mbar) puede ser generada por bombas de membrana simples. Con el fin de estabilizar la presión, estas bombas se acoplaron a volverservoirs de aproximadamente 100 ml, cuya apertura y cierre fue controlado por válvulas neumáticas. Las válvulas a su vez eran controlados por computadora usando una tarjeta de adquisición de datos. El diagrama del circuito neumático se puede ver en la Figura 4. El controlador de presión realiza un papel importante no sólo asegurando puntas de pipeta permanecen limpias, pero también permite la formación de sellos GigaOhm rápidamente, en la observación de hoyuelos en la membrana celular como pipetas toquen las células, acelerando aún más el procedimiento.

El dispositivo de interfaz humana

La mayoría de los montajes experimentales tienen los mandos del equipo experimental muy dispersas sobre un área grande. Concentramos los controles más utilizados en un solo gamepad inalámbrico (Figura 5) que reduce considerablemente el tiempo y el esfuerzo requeridos para registrar cada celda, pero lo más importante, la eliminación de las fuentes de error humano que a menudo puede traer grandes experimentos a una prematura end.

Lenguaje de programación

Tuvimos muy pocas opciones en términos del lenguaje de programación para esta aplicación ya que el único lenguaje que apoya la integración de todo el equipamiento necesario era C / C + +. Una gran ventaja de C / C + + es la posibilidad de ejecutar múltiples hilos de procesamiento y beneficiarse plenamente de la mejora del rendimiento permitido por los procesadores de múltiples núcleos.

Adquisición de datos electrofisiológico

El sistema que describimos deja la elección de software de registro electrofisiológico y el sistema de adquisición de datos hasta que el experimentador. El intercambio de comunicaciones entre el software de adquisición de datos y nuestra aplicación puede tener lugar a través de puertos seriales o por comunicación socket través de la red.

Perspectivas de futuro

Más de 30 años desde Sakmann y de Neher experimentos seminales, la técnica de patch-clamp es stilL solo en el suministro de datos con una combinación particular de resolución de la señal y la frecuencia de muestreo que se requieren para una amplia variedad de experimentos, en particular los que implican la detección de corrientes o potenciales postsinápticos individuales. Mediante el desarrollo de un sistema asistido por ordenador que permite la grabación de muchas neuronas simultáneamente apuntamos a ampliar las posibilidades experimentales de la técnica de patch-clamp. La combinación de estas nuevas posibilidades con la evolución reciente de la neurociencia experimental ^8-13 puede abrir el camino hacia una comprensión más profunda de los circuitos neuronales con una velocidad sin precedentes y detalle.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscope	Olympus	BX51WI	40X Immersion Objective
Manipulators	Luigs Neumann	SM-5	Serial protocol used
Amplifiers	Axon Instruments	MultiClamp 700B	SDK used
Camera	Till Photonics	VS 55	BNC analog output
Framegrabber	Data Translation	DT3120	SDK used
Oscilloscopes	Tektronix	TDS 2014	Serial communication
Data acquisition	InstruTECH	ITC 1600
Data acquisition	National Instruments	PCI-6221	Library used (.dll)
Pressure valve	SMC	SMC070C-6BG-32
Pressure sensor	Honeywell	24PCDFA6G
Membrane pump	Schego	Optimal