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Immunology and Infection

नमूनों का निर्माण 3 डी सेल संस्कृति के लिए दो घटक Hydrogels लिए Thermoresponsive रिवर्स मोल्ड मुद्रण

Published: July 10, 2013 doi: 10.3791/50632
Automatic Translation
1, 2, 2, 1
1Department of Health Science & Technology, Cartilage Engineering & Regeneration, 2Biomaterials Department, Innovent e.V.

Summary

एक bioprinter एक बलि ढालना आधार पर नमूनों हाइड्रोजेल बनाने के लिए इस्तेमाल किया गया था. poloxamer ढालना एक दूसरे हाइड्रोजेल साथ backfilled और फिर एक तिहाई हाइड्रोजेल से भर गया जो रिक्तियों छोड़ने, eluted था. इस विधि जैवपॉलिमरों से जटिल आर्किटेक्चर उत्पन्न करने के लिए तेजी से क्षालन और poloxamer का अच्छा printability का उपयोग करता है.

Abstract

Bioprinting रैपिड प्रोटोटाइप उद्योग में अपने मूल है कि एक उभरती हुई प्रौद्योगिकी है. विभिन्न प्रक्रियाओं मुद्रण संपर्क bioprinting 1-4 (बाहर निकालना, डुबकी कलम और मुलायम लिथोग्राफी), संपर्क bioprinting 5-7 (लेजर आगे हस्तांतरण, स्याही जेट बयान) और इस तरह दो फोटोन photopolymerization 8 के रूप में लेजर आधारित तकनीक में विभाजित किया जा सकता है. यह इस तरह के विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं 17 की सह संवर्धन के प्रभाव के रूप में बुनियादी जैविक सवालों का जवाब देने के लिए ऐसे ऊतक इंजीनियरिंग 9-13, biosensor microfabrication 14-16 के रूप में और एक उपकरण के रूप में कई अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. आम photolithographic या नरम lithographic विधियों के विपरीत, बाहर निकालना bioprinting यह एक अलग मुखौटा या टिकट की आवश्यकता नहीं है कि लाभ है. सीएडी सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, संरचना के डिजाइन जल्दी से ऑपरेटर की जरूरतों के हिसाब से बदल गया है और समायोजित किया जा सकता है. इस लिथोग्राफी आधारित तुलना में अधिक लचीला bioprinting बनाता हैदृष्टिकोण.

यहाँ हम एक उदाहरण के रूप में एक हाइड्रोजेल भीतर स्तंभों में से एक सरणी का उपयोग कर एक बहु सामग्री 3 डी संरचना बनाने के लिए एक बलि ढालना की छपाई का प्रदर्शन. इन स्तंभों में एक तंत्रिका गाइड नाली के भीतर एक संवहनी नेटवर्क या ट्यूब के लिए खोखला संरचनाओं का प्रतिनिधित्व करेगा. बलि मोल्ड के लिए चुना सामग्री poloxamer 407, 4 पर तरल है जो उत्कृष्ट छपाई गुणों के साथ एक thermoresponsive बहुलक था डिग्री सेल्सियस और इसके जमाना तापमान ऊपर एक ठोस ~ 20 डिग्री सेल्सियस 24.5% w / ध् समाधान के लिए 18. इस संपत्ति poloxamer आधारित बलि ढालना मांग पर eluted की अनुमति देता है और विशेष रूप से संकीर्ण geometries के लिए एक ठोस सामग्री की धीमी विघटन से अधिक लाभ है. Poloxamer बलि ढालना बनाने के लिए खुर्दबीन गिलास स्लाइड पर छपा था. Agarose मोल्ड में pipetted और जमाना जब तक ठंडा किया गया था. बर्फ के ठंडे पानी में poloxamer की क्षालन के बाद, agarose के सांचे में रिक्तियों alginate methacrylate सपा से भर गयाFITC लेबल फाइब्रिनोजेन साथ iked. भरी रिक्तियों तो यूवी के साथ पार से जुड़े हुए थे और निर्माण एक महामारी प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के साथ उतारी थी.

Introduction

टिशू इंजीनियरिंग दृष्टिकोण मानव ऊतकों और अंगों 19,20 के उत्थान के संबंध में पिछले वर्षों में बहुत प्रगति की है. हालांकि, अब तक, ऊतक इंजीनियरिंग का ध्यान केंद्रित अक्सर एक सरल संरचना या इस तरह के मूत्राशय 21,22 या त्वचा 23-25 ​​के रूप में छोटे आयाम है कि ऊतकों को सीमित किया गया है. मानव शरीर, तथापि, सेल और बाह्य मैट्रिक्स एक spatially परिभाषित ढंग से व्यवस्थित कर रहे हैं जहां कई जटिल तीन आयामी ऊतकों में शामिल है. इन ऊतकों का निर्माण करने के लिए, एक तकनीक निर्दिष्ट पदों पर एक तीन आयामी निर्माण के भीतर कोशिकाओं और बाह्य मैट्रिक्स मचान जगह कर सकते हैं की आवश्यकता है. Bioprinting निर्माण जटिल तीन आयामी ऊतकों की दृष्टि 10,11,26-28 महसूस किया जा सकता है, जहां ऐसी तकनीक होने की संभावना है.

Bioprinting patterning के लिए सामग्री हस्तांतरण प्रक्रियाओं के प्रयोग 'के रूप में परिभाषित किया गया है और जैविक रिलायंस एनर्जी संयोजन हैevant सामग्री - अणु, कोशिकाओं, ऊतकों, और biodegradable biomaterials -. एक या एक से अधिक जैविक कार्यों "4 पूरा करने के लिए एक निर्धारित संगठन के साथ यह कई विभिन्न तकनीकों शामिल दो के उप माइक्रोन संकल्प से लेकर विभिन्न प्रस्तावों और लंबाई तराजू, पर है कि काम बाहर निकालना मुद्रण 1,12,30 के लिए 420 माइक्रोन से 150 माइक्रोन के एक प्रस्ताव को फोटॉन polymerization के 29. नहीं एक भी सामग्री या सामग्री संयोजन प्रत्येक विधि 31 की आवश्यकताओं को पूरा करेगा. बाहर निकालना मुद्रण के लिए, मुख्य मापदंडों चिपचिपाहट और जमाना समय कर रहे हैं उच्च चिपचिपापन और तेजी से जमाना वांछित हैं जहां 32,.

3 डी मुद्रण जटिल geometries 30,33,34 बनाने के लिए बलि सांचों की आसान निर्माण की अनुमति देता है जो एक तकनीक है. यह प्रक्रिया एक बाहर निकालना bioprinter के रूप में इस तरह के एक रैपिड प्रोटोटाइप तकनीक का उपयोग कर एक मोल्ड के निर्माण पर आधारित है. बनाया बलि ढालना प्रयोग किया जाता हैउनके कम चिपचिपाहट और धीमी जमाना समय की वजह से मुद्रित करने के लिए मुश्किल हो जाता है, जो सामग्री से जटिल संरचना बनाने के लिए. यहाँ प्रस्तुत विधि कम तापमान पर जल्दी घुल और सही extruded हो सकता है कि एक सामग्री से मिलकर बलि मोल्ड के निर्माण शामिल है. ब्लॉक copolymer पाली (इथाइलीन ग्लाइकॉल) 99-पाली (propylene glycol) 67 पाली (इथाइलीन ग्लाइकॉल) 99 (भी Pluronic F127 या poloxamer 407 के रूप में जाना जाता है) इन आवश्यकताओं को पूरा. यह पहले से ही हमारे ज्ञान करने के लिए, तरल वातावरण में अपने अस्थिरता की वजह से अपने असंशोधित संस्करण में छपाई के लिए इस्तेमाल कभी नहीं किया गया, बाहर निकालना मुद्रण 1 में एक संशोधित संस्करण में इस्तेमाल किया, लेकिन किया गया है. Poloxamer 407 भी एक व्युत्क्रम थर्मल संवेदनशील व्यवहार 18 यानी ठंडा करने पर एक प को एक जेल से यह परिवर्तन दिखाता है. सबसे महत्वपूर्ण बात यह है कि यह बहुत ही उच्च निष्ठा के साथ परिसर में मनमाने ढंग से घुमावदार संरचना में मुद्रित किया जा सकता है. यह अनुमति देता है एक से एक संरचित हाइड्रोजेल का निर्माणकम चिपचिपापन सामग्री, इस मामले धीमी बीच बढ़िया तालमेल agarose में, मुद्रित बलि मोल्ड में समाधान pipetting द्वारा. उच्च निष्ठा और casted संरचित हाइड्रोजेल से इसकी त्वरित क्षालन यह एक मुखौटा या यह अक्सर lithographic तरीकों में आवश्यक है के रूप में एक डाक टिकट के उपयोग के बिना विभिन्न geometries के साथ नए नए साँचे बनाने के लिए एक तेज और लचीला तरीका बनाता साथ बलि ढालना छपाई का संयोजन. casted संरचित हाइड्रोजेल आगे अपनी कम चिपचिपाहट की वजह से बाहर निकालना मुद्रण के लिए उपयुक्त नहीं है कि एक और सामग्री के साथ भरा जा सकता है. यह हमारे मामले में एक कम चिपचिपापन alginate methacrylate समाधान है. यहाँ हम एक स्तंभ सरणी के उदाहरण का उपयोग कर हाइड्रोजेल patterning के लिए thermoresponsive रिवर्स बलि सांचों की विधि प्रस्तुत करते हैं.

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Protocol

1. Poloxamer 407 समाधान की तैयारी

यदि उपलब्ध है, एक ठंडे कमरे (4 डिग्री सेल्सियस) में poloxamer समाधान की तैयारी करते हैं. उपलब्ध नहीं है, तो बर्फ के ठंडे पानी से भरा एक बीकर में एक कांच की बोतल रखें. उच्च तापमान पर poloxamer जेल बिंदु से ऊपर हो जाएगा और ठीक से भंग नहीं होगी.

  1. एक कांच की बोतल में बर्फ ठंड पीबीएस समाधान के 60 मिलीलीटर जोड़ें और एक चुंबकीय उत्तेजक का उपयोग कर सख्ती हलचल.
  2. Poloxamer के 24.5 ग्राम वजन और ठंड पीबीएस के लिए कम मात्रा में जोड़ें. Poloxamer आंशिक रूप से अधिक जोड़ने से पहले भंग कर दिया है जब तक प्रतीक्षा करें.
  3. सभी poloxamer भंग कर दिया है जब तक समाधान हिलाओ.
  4. 100 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा तक पहुँच जाता है जब तक ठंड पीबीएस जोड़ें. अंतिम एकाग्रता 24.5% डब्ल्यू / वी. होगा
  5. समाधान सरगर्मी बंद करो और डिग्री सेल्सियस समाधान में बुलबुले और फोम तक गायब हो गए 4 में आराम करते हैं. जेल के अंदर फंस रहे हैं कि बुलबुले पी करने के लिए स्थानांतरित कर दिया जाएगाrinter कारतूस और मुद्रित बलि सांचों में दोष को बढ़ावा मिलेगा.
  6. फ़िल्टर (0.22 माइक्रोन फिल्टर) सुई रोकना सकता है कि किसी भी अवांछित कणों को दूर करने के लिए सीधे मुद्रण कारतूस में समाधान. फ़िल्टरिंग कदम फिल्टर में poloxamer के बीच बढ़िया तालमेल से बचने के लिए (या नहीं तो ठंडा टिप्स, फिल्टर आदि के साथ उपलब्ध है) एक ठंडे कमरे में प्रदर्शन किया जाना चाहिए. डिग्री सेल्सियस तक 30 मिनट के प्रयोग से पहले 4 में लोड कारतूस रखें.

2. 3 डी प्रिंटर की तैयारी

इस काम में इस्तेमाल 3 डी प्रिंटर regenHU से "BioFactory" था. प्रणाली के बाहर निकालना हिस्सा कई हिस्से होते हैं. शीर्ष पर दबाव में एक कारतूस एक luer ताला एडाप्टर के माध्यम से एक संबंधक से जुड़ा हुआ है. कनेक्टर कारतूस की दुकान और एक solenoid वाल्व के इनलेट के बीच रिक्त स्थान के पुल. Solenoid वाल्व की दुकान पर, अलग व्यास के साथ सुइयों का इस्तेमाल किया जा सकता है. सामग्री एक उप पर निकाली जाती हैवैक्यूम द्वारा एक चलती चरण के लिए आयोजित किया जाता है कि रणनीतियां. प्रणाली के प्रमुख भागों चित्र 1 में चित्रित कर रहे हैं. अन्य बाहर निकालना आधारित सिस्टम मुद्रण प्रक्रिया के लिए प्रयोग किया जाता है, और अनुकूलन प्रक्रिया के प्रत्येक प्रणाली के लिए किया जाना चाहिए किया जा सकता है.

  1. Ultrapure पानी से भरा अलग 1.5 मिलीलीटर टेस्ट ट्यूब में solenoid वाल्व (नोक व्यास 0.3 मिमी) और सुई (भीतरी व्यास 0.15 मिमी) प्लेस और 30 मिनट के लिए साफ करने के लिए एक गर्म अल्ट्रासोनिक स्नान में उन्हें जगह है. इथेनॉल के साथ साफ वाल्व कुल्ला और एक नाइट्रोजन बंदूक के साथ उन्हें सूखी.
  2. वाल्व और सुई प्रिंटर में और साथ ही एक खाली, साफ कारतूस स्थापित करें.
  3. प्रणाली के लिए 3 बार दबाव लागू करें और संपीड़ित हवा के साथ स्थापित वाल्व और सुई से किसी भी अवशिष्ट तरल पदार्थ बाहर उड़ा. छोटी सुई व्यास के लिए, यह सुई रोकना सकता है कि छोटे कणों के प्रवेश से बचने के लिए संपीड़ित हवा के बाहर निकलने पर स्थापित एक फिल्टर (सामान्य सिरिंज फिल्टर, 0.45 सुक्ष्ममापी ताकना आकार) की सिफारिश की है. Poloxamer साथ भरा हुआ कारतूस दबाव बंद करें और स्थापित करें. poloxamer कमरे के तापमान और जेल तक पहुँच सकते हैं ताकि कारतूस कारतूस बढ़ते से पहले फ्रिज के लगभग 30 मिनट से बाहर रखा जाना चाहिए.
  4. प्रणाली के लिए 3 बार दबाव लागू करें और यह सुई टिप पहुँचता है और एक निरंतर किनारा में निकाली जाती है जब तक poloxamer बांटना.

3. मुद्रण पैरामीटर्स का अनुकूलन

सही 3 डी संरचनाओं बनाने के लिए, मुद्रण प्रक्रिया चुना सामग्री और एकाग्रता के लिए अनुकूलित किया जाना है. चिपचिपाहट और 3 डी मुद्रण प्रणाली के आधार पर प्रत्येक सामग्री मानकों का एक निश्चित सेट के लिए एक विशेष वितरण मात्रा और रेखा मोटाई निकलेगा.

  1. एक उपयुक्त सीएडी सॉफ्टवेयर (चित्र से आईएसओ फ़ाइलें बनाने के लिए सक्षम) के साथ, आप मुद्रित करना चाहते हैं कि संरचना के रूप में एक ही लंबाई के बारे में एक रेखा खींचना.
  2. एक खुर्दबीन गिलास स्लाइड 25 मिमी x 75 मिमी x 1 जगहमिमी या प्रिंटर में किसी भी अन्य सब्सट्रेट और वैक्यूम पर बदल कर इसे सुरक्षित.
  3. प्रिंटर सॉफ्टवेयर में, 50 हर्ट्ज की एक उच्च आवृत्ति के लिए solenoid वाल्व सेट और 3 बार के एक उच्च दबाव सेट.
  4. 300 मिमी / मिनट की एक मंच गति के साथ एक ही पंक्ति में से एक परत प्रिंट.
  5. वांछित पंक्ति चौड़ाई तक पहुँच जाता है जब तक दबाव कम करें. तुम भी वाल्व के उद्घाटन के समय के माध्यम से निकाली जाती है कि मात्रा को नियंत्रित कर सकते हैं.
  6. कोई निरंतर लाइन अब और मुद्रित किया जा सकता जब तक वाल्व की आवृत्ति कम करें. इस मूल्य से ऊपर एक आवृत्ति चुनें.

नोट: वांछित पंक्ति चौड़ाई और निरंतर लाइनों प्राप्त कर रहे हैं एक बार, एक मुद्रित परत के बाद इष्टतम चरण गति और सुई की लिफ्ट यानी परत मोटाई निर्धारित करते हैं.

  1. एक दूसरे के शीर्ष पर कई परतों प्रिंट और सुई कई मुद्रित परतों के बाद पिछले परत के ऊपर सही स्थिति में है देखने. परत मोटाई (सुई लिफ्ट समायोजित करें) तो प्रत्येक परत अगले एक (चित्रा 3) के शीर्ष पर छपा हुआ है कि.
  2. 300 मिमी / extruded परतों पिछले वाले (चित्रा 4) के रूप में एक ही स्थिति में शुरू और अंत ताकि मिनट कदम के लिहाज से मंच के मंच गति कम होती है. बहुत उच्च स्तर की गति extruded सामग्री पिछले परत को छुआ है पहले चरण में आगे बढ़ होने का कारण.
  3. मुद्रण के लिए स्तंभ संरचनाओं. कदम 3.1.-3.8 का पालन करें, लेकिन बजाय एक भी लाइन ड्राइंग का एक बिंदु आकर्षित. खंभे जब मुद्रण पर ध्यान केंद्रित करने के लिए पैरामीटर स्तंभ जमा किया जाना चाहिए जहां स्थिति पर प्रिंट सिर के दबाव (परत मोटाई और poloxamer के खम्भे व्यास को नियंत्रित करता है), वाल्व के उद्घाटन के समय (extruded मात्रा) और निवास समय कर रहे हैं .
  4. मापदंडों अनुकूलित कर रहे हैं, एक लाइन की कई परतों मुद्रण एक ठोस दीवार में, या अंक, एक स्तंभ के मामले में परिणाम चाहिए. बाद में उपयोग के लिए मापदंडों को बचाओ.

इस बिंदु पर से अनुकूलन प्रक्रिया के दौरान पाया मापदंडों का उपयोग करें.

  1. एक गिलास खुर्दबीन स्लाइड पर आंतरिक संरचना (यहाँ यह एक स्तंभ सरणी है) प्रिंट और इसे रात भर सूखा. यह एक) संरचनाओं का आकार और मोटाई कम कर देता है और ख) से बचा जा सकता लिफ्ट बंद भराव के दौरान तो, संरचना और सब्सट्रेट के बीच बेहतर आसंजन प्रदान करता है.
  2. सीएडी सॉफ्टवेयर के साथ, आप दूर eluted और भर दिया है करने का इरादा संरचना आसपास के एक बाहरी दीवार के होते हैं कि एक संरचना आकर्षित. Poloxamer साथ संरचना प्रिंट. दीवार की छपाई 6 मिनट का समय लगेगा.

ध्यान दें: दीवार क्योंकि सुई के आयामों के भीतर की संरचना से कम से कम 3.5 मिमी दूर मुद्रित किया जाना है. अन्यथा बाहरी दीवार की छपाई आंतरिक संरचना को नष्ट कर देगा

  1. आप अपने SACR backfill करना चाहते समाधान तैयारसाथ ificial ढालना (विआयनीकृत पानी में यहां 1% agarose). agarose समाधान 35 डिग्री सेल्सियस और 45 डिग्री सेल्सियस के बीच तापमान होना चाहिए इस तापमान के नीचे, agarose भी जल्दी जमना, poloxamer संरचना नरम होगी क्योंकि इस तापमान से ऊपर, यह मुद्रित खंभे को नष्ट कर सकता है.
  2. धीरे धीरे एक पिपेट का उपयोग भराव समाधान के साथ बलि ढालना भरें. इस दीवार के अंदर संरचना के विनाश से बचने के लिए धीरे से किया जाना चाहिए.
  3. Backfilled समाधान के जेल जाने या इसे इस्तेमाल बहुलक के आधार पर crosslink. Agarose के मामले में ठोस 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर जगह ले ली.
  4. Poloxamer संरचना elute से 10 मिनट के लिए एक बर्फ स्नान में backfilled बलि मोल्ड रखें.
  5. एक कागज ऊतक के साथ backfilled संरचना दाग और एक नया गिलास खुर्दबीन स्लाइड पर जगह है. के बीच अंतरिक्ष में शून्य से तीसरे hydrogel के रिसाव से बचने के लिए गिलास खुर्दबीन स्लाइड पर ध्यान संरचना दबाएंbackfilled संरचना और गिलास खुर्दबीन स्लाइड.

5. की voids भरने

  1. Eluted poloxamer द्वारा छोड़ा रिक्तियों को भरने के लिए, एक 30 जी सुई से लैस एक सिरिंज में इरादा बहुलक समाधान भरें. इस उदाहरण में, हम 0.05% के अलावा के साथ 0.15 एम NaCl समाधान में 1% alginate methacrylate इस्तेमाल किया w / वी लिथियम फिनाइल-2 ,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (एलएपी) और 2.5% v / वी एलेक्सा-488 संयुग्मित फाइब्रिनोजेन . एलेक्सा-488 संयुग्मित फाइब्रिनोजेन दृश्य प्रयोजनों के लिए जोड़ा गया है.
  2. 5 मिनट और छवि के लिए एक उच्च तीव्रता यूवी लैंप (100 वाट, 365 एनएम, सब्सट्रेट से दूरी 3.5 सेमी था) के साथ बहुलक Photopolymerize एक महामारी प्रतिदीप्ति या confocal खुर्दबीन का उपयोग निर्माण.

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Representative Results

प्रतिनिधि परिणाम रिवर्स ढालना तकनीक (चित्रा 2 में दिखाया गया है) एक दूसरी सामग्री से भरा जा सकता है कि एक संरचित जेल बनाएगा दिखा. हर मुद्रण प्रक्रिया की शुरुआत में मुद्रण मापदंडों पहली अनुकूलित कर रहे हैं. मापदंडों के चरण वार समायोजन चित्रा 3 और एकल लाइनों मुद्रित कर रहे हैं जब चित्रा 4 में दिखाया गया मुद्रित बहुपरती निर्माणों में परिणाम होगा. परत मोटाई (एक मुद्रित परत के बाद सुई लिफ्ट) बहुत कम है, एक सुई पूर्ववर्ती परतों को छू जाएगा कि निरीक्षण करेंगे. सुई बहुत अधिक है, मुद्रित निर्माण की सतह पर एक लहर पैटर्न दिखाई देगा. यह आंकड़े सभी परीक्षण परत मोटाई दी मंच गति के लिए बहुत बड़े थे जहां 3A-3 डी में देखा जा सकता है. एक उच्च मंच गति परत मोटाई कम कर देता है, सेट और वास्तविक परत मोटाई के बीच छोटे मतभेदों जमा और लहर पैटर्न शुरू होता हैनिर्माण बढ़ जाती है की ऊंचाई के रूप में प्रदर्शित करने के लिए. परत मोटाई कम करके, मतभेद छोटे हो जाते हैं और लहर पैटर्न पहले की तुलना में एक उच्च पद (चित्रा -3 सी और चित्रा 3 डी में बिंदीदार रेखा से संकेत) में दिखाई देता है. मंच गति बहुत तेज है अगर में दिखाया के रूप में एक निश्चित परत मोटाई के लिए, यह ऊपर की ओर संकीर्ण और निर्माण (मुद्रित संरचना के ठीक किनारे) की शुरुआत में एक उभार है कि या तो एक लहर पैटर्न में या निर्माणों में परिणाम होगा आंकड़े 4A-4C. Poloxamer के लिए अनुकूलित मापदंडों 0.2 मिसे के एक खोलने के समय, 31.14 हर्ट्ज की एक आवृत्ति, 0.15 मिमी, 1.5 बार के दबाव और 75 मिमी / मिनट की गति की एक परत मोटाई थे. इन मानकों के साथ मुद्रण चित्रा 4D में चिकनी के रूप में ठोस दीवारों में हुई. हालांकि, 100 मिमी / मिनट की एक उच्च मंच गति दीवारों का उत्पादन समय को कम करने की प्रक्रिया के लिए चुना गया था.

गड़बड़ी के लिए अनुकूलित मापदंडों के साथचित्रा 5 ए के रूप में दिखाया Llar मुद्रण (समय 0.2 मिसे, आवृत्ति 31.14 हर्ट्ज, परत मोटाई 0.08 मिमी, दबाव 1.5 बार, मंच गति 200 मिमी / मिनट, निवास समय 0.3 सेकंड खोलने) हम स्तंभों में से एक सरणी बनाया. स्तंभ सरणी के सूखने प्रभाव केंद्र की ओर स्तंभों में से झुकने में हुई. इस आशय का एक दूसरे से आगे के अलावा खंभे रखकर, कम है, लेकिन बचा नहीं जा सकता. चित्रा 5B में दिखाया के रूप में एक दीवार तो खंभे के आसपास छपा हुआ है.

ठंडे पानी में बलि poloxamer मोल्ड के क्षालन के बाद, चित्रा 5C में दिखाया गया है एक तरह संरचित agarose हाइड्रोजेल बनाए गए थे. फ्लोरोसेंट alginate methacrylate समाधान और बाद तिर्यक, जैसे एक उपन्यास हाइड्रोजेल में हाइड्रोजेल स्तंभ सरणी के साथ रिक्तियों को भरने के बाद चित्रा 6 में दिखाया गया है एक बनाया जा सकता है. 3 डी z ढेर पुनर्निर्माण स्पष्ट रूप से बनाया गया था कि फ्लोरोसेंट खंभे दिखाता है. 7 चित्रा मजबूत> भी मनमाने ढंग से घुमावदार नए साँचे बनाने के लिए इस तकनीक की संभावना दिखाता है.

चित्रा 1
चित्रा 1. Bioprinter का चित्रण. Bioprinter "BioFactory" की ए) एक तस्वीर. सुई और वाल्व) इस छवि में दिखाई नहीं देते हैं, लेकिन बी में चित्रित कर रहे हैं. ऊपर 8 प्रिंट सिर के लिए एक जल्दी से सामग्री के बीच बदलने के लिए अनुमति देता है एक मोड़ बुर्ज पर बढ़ रहे हैं. मुद्रण में ले जाया जा सकता है कि एक चलती मंच पर किया जाता है एक्स, वाई और जेड दिशा. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

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चित्रा 2. संरचित hydrogels के निर्माण के लिए बलि molds के उत्पादन की प्रक्रिया की योजना.

चित्रा 3
चित्रा 3. परत मोटाई में कमी के साथ परत मोटाई अनुकूलन. एक निश्चित मंच गति से मुद्रित Poloxamer परतों (250 मिमी / मिनट). परत मोटाई भी अधिक है, एक लहर पैटर्न उभर रहे हैं. यह धीरे - धीरे परत की मोटाई में कमी के साथ गायब हो जाता है. लाल बिंदीदार रेखा मुद्रित निर्माण का दोष मुक्त भाग की ऊंचाई से संकेत मिलता है जबकि लाल ठोस लाइनों मुद्रित निर्माण के नीचे से संकेत मिलता है. लेयर) ए) 0.18 मिमी, बी सी) 0.15 मिमी और डी) 0.13 मिमी 0.16 मिमी मोटाई. लाल पट्टी 2 मिमी इंगित करता है.

"> चित्रा 4
4 चित्रा. स्टेज गति अनुकूलन. चरण की अलग गति ए) 250 मिमी / मिनट, बी) 200 मिमी / मिनट, सी) 150 मिमी / मिनट और डी के साथ 0.15 मिमी की एक परत मोटाई के साथ छपी Poloxamer परतों) 75 मिमी / मिनट. मंच गति को कम करके, मुद्रण प्रक्रिया के शुरुआती बिंदु के सभी परतों के लिए एक ही है और एक ठोस दीवार मुद्रित किया जा सकता है. लाल पट्टी 2 मिमी इंगित करता है.

चित्रा 5
चित्रा 5. खंभे एक दूसरे से 1.75 मिमी अलग से सूखे poloxamer के नमूनों हाइड्रोजेल का उत्पादन. ए) स्तंभ सरणी. खंभे के झुकने प्रभाव सूखने के कारण होता है. agarose. सी pipetting से पहले poloxamer की बनी एक दीवार से घिरा बी) स्तंभ सरणी) स्ट्रक्चर्डबलि मोल्ड हटाने के बाद agarose हाइड्रोजेल.

चित्रा 6
6 चित्रा. Fluorescently लेबल स्तंभों में से 3 डी z ढेर पुनर्निर्माण एक agarose पाड़ में एम्बेडेड.

7 चित्रा
चित्रा 7. गाढ़ा हलकों poloxamer से छपी. एकल परतें दिखाई दे रहे हैं. लाल पट्टी 2 मिमी इंगित करता है.

डिजाइन मानदंडों मुद्रण पैरामीटर
महीन परत मोटाई
  • दबाव ↓
  • स्टेज गति ↑
  • समय खुलने ↓
  • फ्रीक्वेंसी ↓
छोटे रेखा मोटाई
  • दबाव ↓
  • स्टेज गति ↑
  • समय खुलने ↓
  • फ्रीक्वेंसी ↓
सतत बाहर निकालना
  • दबाव ↑
  • स्टेज गति ↓
  • समय ↑ खुलने
  • फ्रीक्वेंसी ↑
तेजी से निर्माण की गति
  • दबाव ↑
  • स्टेज गति ↑
  • समय ↑ खुलने
  • फ्रीक्वेंसी ↑

तालिका 1. Poloxamer लाइनों के बाहर निकालना के लिए और कैसे वे अलग मुद्रण मापदंडों से प्रभावित हो सकते हैं चार डिजाइन मानकों.

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Discussion

यहाँ हम पहली बार के लिए, वर्तमान, जल्दी कारण ~ 20 डिग्री सेल्सियस के poloxamer की जेल प संक्रमण के लिए ठंडे पानी में eluted जा सकता है कि एक बलि आचारण के लिए एक thermoresponsive बहुलक का उपयोग पूरी प्रक्रिया की गति पर्याप्त संकल्प के साथ मुद्रित नहीं किया जा सकता जो biopolymer संरचनाओं का तेजी से निर्माण के लिए poloxamer रोचक बना देता है. यहाँ वर्णित तकनीक का एक और हाइड्रोजेल भीतर या पहले से अन्य सामग्री 35 के लिए सूचित किया गया है के रूप में microfluidic चैनलों के निर्माण के लिए patterning के एक हाइड्रोजेल के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. एक बलि मोल्ड के रूप में poloxamer का लाभ यह भर जाता है और बाद में eluted जा सकता है कि ठोस परत दर परत निर्माणों में मनमाना geometries में मुद्रित किया जा सकता है.

हम यहाँ संरचित हाइड्रोजेल बनाने के लिए एक दूसरे hydrogel के बाद भराव के साथ poloxamer साथ एक बलि मोल्ड बनाने की प्रक्रिया का वर्णन है. संरचित हाइड्रोजेल के लिए सामग्री चर्चा हो सकती हैभरने के बिंदु पर चिपचिपाहट और तापमान के संबंध में प्रतिबंध के साथ Osen. ऐसे पॉलीथीन ग्लाइकोल diacrylate 36,37, alginate 38,39, agarose 40 और methacrylated जैवपॉलिमरों के रूप में आमतौर पर इस्तेमाल पॉलिमर के कम चिपचिपा अग्रदूत समाधान 41-43 उपयुक्त भरने सामग्री के लिए बस कुछ ही उदाहरण हैं. उच्च चिपचिपा सामग्री तथापि संकीर्ण geometries नहीं भर सकता है या इस तरह के यहाँ मुद्रित खंभे के रूप में पतली नाजुक संरचनाओं के मामले में बलि ढालना नष्ट कर सकता है. एक कम प्रतिशत agarose समाधान इसलिए भराव के लिए चुना गया था. Poloxamer साथ संयोजन में agarose का उपयोग करने का एक और लाभ यह ठंडा द्वारा जैल है. इसलिए, ठंडे पानी में डुबकी लगाये हुए है, जब agarose अपने gelled राज्य, सही उलटा मुद्रित poloxamer पैटर्न को दर्शाता है जो एक राज्य को बरकरार रखे.

इस प्रक्रिया में महत्वपूर्ण कदम मुद्रण मानकों के अनुकूलन, बलि मोल्ड के भरने और शामिलरिक्तियों के भरने. अनुकूलित थे कि मुद्रण मापदंडों वाल्व, दबाव, मंच गति और परत मोटाई की आवृत्ति और उद्घाटन के समय थे. परत मोटाई हर मुद्रित परत के बाद सुई की लिफ्ट के रूप में परिभाषित किया गया है. खंभे के मामले में, निवास समय, समायोजित करने की भी समय सामग्री चरण चलते बिना एक बिंदु पर निकाली जाती है था अर्थात्. एक पैरामीटर में परिवर्तन extruded लाइनों के कई डिजाइन मानकों पर प्रभाव हो सकता है क्योंकि अनुकूलन प्रक्रिया में समय लग सकता है. विभिन्न डिजाइन मानदंडों के लिए मुख्य मापदंडों तालिका 1 में वर्णित हैं.

प्रक्रिया में दूसरा महत्वपूर्ण कदम बलि मोल्ड के भरने है. बलि मोल्ड के भरने के एक नाजुक कदम है. छोटे और संकीर्ण संरचनाओं अक्सर मैन्युअल, ध्यान से भरा जाना है, और समाधान की सरल कास्टिंग हमेशा संभव नहीं हो सकता है की जरूरत है.

एस की सावधानी से भरनेagarose के साथ acrificial ढालना इसलिए खंभे के विनाश से बचने के लिए एक 100 μl विंदुक का उपयोग किया गया था. अंतिम चरण, रिक्तियों के भरने, एक 30 जी सुई से लैस एक सिरिंज के उपयोग की आवश्यकता है. केयर भरने के दौरान बुलबुला गठन से बचने के लिए लिया जाना चाहिए.

यहाँ प्रस्तुत निर्माण में विभिन्न जैल भी कोशिकाओं को शामिल कर सकते हैं. संरचित हाइड्रोजेल अंदर रिक्तियों और अन्य प्रकार की कोशिका के भीतर हाइड्रोजेल में एक कोशिका प्रकार रखने से, एक spatially परिभाषित सह संस्कृति सेटअप बनाया जा सकता है. मिलर एट अल से प्रकाशन में के रूप में 3 डी नेटवर्क परस्पर. 30, नाड़ी या तंत्रिका नेटवर्क भी ​​संभव हैं. इस तरह के नेटवर्क के लिए एक संभव दृष्टिकोण एक आसपास के दीवार के भीतर लाइनों प्रिंट और दूसरा हाइड्रोजेल, crosslink दूसरी हाइड्रोजेल साथ रिक्तियों को भरने और 90 डिग्री से अगले परत घुमाया मुद्रण के साथ जारी रखने के लिए किया जाएगा. एक बलि मोल्ड के रूप में मुद्रण poloxamer का लाभ यह है कि न तो आवश्यकता हैएक मास्टर मोल्ड या एक मुखौटा. यह भी एक गर्म प्रिंट सिर प्रणाली की सामग्री और clogging हमारे प्रयोगों में नहीं रखा गया है हटा करने की आवश्यकता नहीं है.

इस तरह यहां प्रस्तुत लोगों के रूप में निर्माणों प्रसार आधारित सेल सेल बातचीत या दवाओं की खोज के लिए अध्ययन करने के लिए सह संस्कृतियों स्थानिक आयोजन 3 डी के रूप में भविष्य में इस्तेमाल किया जा सकता है. हालांकि, यहां प्रस्तुत प्रक्रिया की एक पूरी तरह से स्वचालित संस्करण दवा स्क्रीनिंग के क्षेत्र में सफल बनने के लिए विकसित करने की आवश्यकता है.

संक्षेप में, हम की अनुमति देता है कि हाइड्रोजेल से भरा है और बाद में eluted जा सकता है कि मनमाने ढंग से geometries के मुद्रण. एक विधि प्रस्तुत है इस तरह, संरचित हाइड्रोजेल में हाइड्रोजेल आर्किटेक्चर एक सरल और लागत प्रभावी ढंग से बनाया जा सकता है.

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Disclosures

लेखकों घोषित करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

हम bioprinter के साथ मदद के लिए दबोरा Studer धन्यवाद.

काम अनुदान समझौता एन के तहत यूरोपीय संघ के सातवें फ्रेमवर्क कार्यक्रम (FP7/2007-2013) ° NMP4-SL-2009-229292 द्वारा वित्त पोषित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
Poloxamer (Pluronic F127) Sigma P2443
PBS Invitrogen 10010-015
CAD software regenHU BioCAD
Alginate methacrylate Innovent e.V Technologieentwicklung Jena Synthesized by Innovent for the FP7 Project Nr NMP4-SL-2009-229292
Fibrinogen From Human Plasma, Alexa Fluor 488 Conjugate Invitrogen F13191
Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) Innovent e.V Technologieentwicklung Jena Synthesized by Innovent for the FP7 Project Nr NMP4-SL-2009-229292
Agarose Lonza 50004
EQUIPMENT
Bioprinter regenHU Biofactory
Valve regenHU 300 μm Nozzel Diameter
Needle regenHU 150 μm Inner Diameter
Zeiss Axioobserver with ApoTome Zeiss
UV Light Source UVP Blak-Ray B-100AP High Intensity UV Lamp 100 W

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नमूनों का निर्माण 3 डी सेल संस्कृति के लिए दो घटक Hydrogels लिए Thermoresponsive रिवर्स मोल्ड मुद्रण
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Müller, M., Becher, J., Schnabelrauch, M., Zenobi-Wong, M. Printing Thermoresponsive Reverse Molds for the Creation of Patterned Two-component Hydrogels for 3D Cell Culture. J. Vis. Exp. (77), e50632, doi:10.3791/50632 (2013).

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