Summary
bioprinter、犠牲型に基づいてパターン化されたハイドロゲルを作成するために使用された。ポロキサマー型は第二のヒドロゲルで埋め戻した後、溶出し、第三のハイドロゲルを充填した空隙を残していた。この方法では、生体高分子から複雑なアーキテクチャを生成する高速溶出及びポロキサマーの良い印刷適性を使用しています。
Abstract
Bioprintingは、ラピッドプロトタイピング業界にその起源を持っている新興の技術です。異なる印刷プロセスは、コンタクトbioprinting 1-4（押し出し、ディップペンとソフトリソグラフィ）、非接触bioprinting 5-7（レーザフォワード転写、インクジェット法）、例えば2光子光重合8、レーザベースの技術に分けることができる。そのような組織工学9-13、バイオセンサー微細加工14-16として、例えば、異なる細胞型17の共培養の影響などの基本的な生物学的質問に答えるためのツールとして多くの用途に使用することができる。一般的なフォトリソグラフィーまたはソフトリソグラフィー法とは異なり、押出bioprintingは、別個のマスクやスタンプを必要としないという利点を有する。 CADソフトウェアを使用して、構造の設計を迅速に、オペレータの要求に応じて変更して調整することができる。これは、リソグラフィベースより柔軟bioprintingなりアプローチ。
ここでは一例としてヒドロゲル内にピラーのアレイを用いて多重材料の3D構造を作成するために、犠牲モールドの印刷を示す。これらの柱は神経ガイド導管内血管網やチューブのための中空構造を表すことができます。犠牲型のために選択された材料は、ポロキサマー407、4で24.5％w / vのソリューション18℃で、そのゲル化温度〜20℃上記の固体、液体である優れた印刷特性を持つ熱応答性ポリマーであった。このプロパティは、ポロキサマーベースの犠牲型はオンデマンドで溶出することができ、特に狭いジオメトリのための固体材料の溶解が遅い上の利点があります。ポロキサマーは、犠牲モールドを作成するために、顕微鏡ガラススライド上に印刷した。アガロースを金型にピペットでゲル化するまで冷却した。冷たい水の中ポロキサマーの溶出した後、アガロース型内ボイドがアルギン酸メタクリルSPに満ちていたFITCラベルされたフィブリノゲンとiked。いっぱいボイドは、その後UVを架橋された及び構築物は落射蛍光顕微鏡で画像化した。
Introduction
組織工学アプローチは、ヒト組織および器官の再生19,20に対して過去数年にわたって多くの進歩を遂げている。しかし、今まで、組織工学の焦点は、しばしば簡単な構造、又は膀胱21,22または皮膚23-25 のような小さな寸法を有する組織に限定されている。人間の体は、しかしながら、細胞と細胞外マトリックスは、空間的に定義された方法で配置されている多くの複雑な三次元組織を含んでいる。これらの組織を製造するために、技術が所定位置に3次元構造物内の細胞と細胞外マトリックスの足場を配置することが要求される。 Bioprintingは、製造の複雑な三次元組織のビジョンは10,11,26-28を実現できるような技術になる可能性を持っています。
Bioprintingをパターニングするための物質移動プロセスの使用 "として定義され、相対生物学的に組み立てされているエバント材料-分子、細胞、組織、および生物分解性の生体材料-所定の組織との一つ以上の生物学的機能を達成するために"4これは、2つのサブミクロンの分解能に至るまで、異なる解像度および長さスケールで動作するいくつかの異なる技法を包含する押出印刷1,12,30用420ミクロン〜150ミクロンの解像度に光子重合29。ない単一の材料または材料の組み合わせは、それぞれの方法31の要件を満たします。押し出し印刷の場合、重要なパラメータは、粘度とゲル化時間です高粘度と迅速なゲル化が望まれている32。
3Dプリントは、複雑な形状30,33,34を作成するための犠牲型を簡単に作成可能にする技術です。このプロセスは、押出bioprinterなどのラピッドプロトタイピング技術を用いて金型の構造に基づいている。作成された犠牲鋳型が使用されそれらの低粘度およびゲル化遅い時間に起因する印刷することが困難である材料から複雑な構造を形成する。ここに示された方法は、低温で迅速に溶解かつ正確に押し出すことができる材料からなる犠牲鋳型の生成を伴う。ブロック共重合体、ポリ（エチレングリコール）99 -ポリ（プロピレングリコール）67 -ポリ（エチレングリコール）99（また、プルロニックF127又はポロクサマー407とも呼ばれる）これらの要件を満たす。それは、すでに我々の知る限り、液体環境でその不安定性のためにその変更されていないバージョンで印刷するために使用されていない、押出印刷1で修正されたバージョンで使用されますが、されています。ポロクサマー407はまた、逆の熱応答挙動18 すなわち冷却時にゾルにゲルから、それが変化を示している。最も重要なのは、それは非常に高い忠実度で複雑な任意に湾曲構造に印刷することができます。これはから構造化ヒドロゲルの作成を可能に低粘度材料、この場合遅いゲル化アガロースで、印刷された犠牲鋳型にソリューションをピペッティングにより。鋳物構造化されたハイドロゲルからの高忠実度とその迅速な溶出犠牲型の印刷の組み合わせは、そのマスクまたはそれはしばしばリソグラフィー法で必要とされるようにタイムスタンプを使用することなく、異なる形状を持つ金型を作成するために、迅速かつ柔軟な方法になります。鋳造構造化されたヒドロゲルは、さらに、その低粘度のため、押出印刷に適していない別の材料を充填することができる。これは、我々の場合には低粘度のアルギン酸メタクリルソリューションです。ここでは、ピラーの配列の一例を用いてヒドロゲルをパターニングするための逆温度応答性犠牲鋳型の方法を提案する。
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Protocol
1。ポロキサマー407溶液の調製
可能であれば、寒い部屋（4℃）でポロキサマー溶液の調製を行います。利用できない場合には、氷のように冷たい水で満たされたビーカーにガラスボトルを置きます。より高い温度では、ポロキサマーは、ゲル化点の上になり、適切に溶解しない。
- ガラス瓶に氷冷PBS溶液を60mlを加え、マグネチックスターラーを用いて積極的にかき混ぜる。
- ポロキサマーの24.5グラムを秤量し、冷PBSに少量でそれを追加。ポロキサマーは、部分的に、よりを追加する前に溶解するまで待ちます。
- すべてのポロキサマーが溶解するまでのソリューションをかき混ぜる。
- 100mlと最終体積になるまで冷PBSを加える。最終濃度は24.5％W / Vになります
- 溶液を攪拌停止し、溶液中の気泡や泡が消失するまで4℃で残り、それを聞かせて。ゲル内に捕捉された気泡は、pに転送されるrinterカートリッジとプリント犠牲型の欠陥につながる。
- フィルター（0.22μmのフィルター）を直接針を詰まらせる可能性のある不要な粒子を除去するために、印刷カートリッジにソリューション。フィルタリングステップは、フィルタ内のポロキサマーのゲル化を回避するために、低温室（またはいない場合は冷却のヒント、フィルタなどで使用可能）で実行する必要があります。 °Cまで30分実験前4にロードされたカートリッジを保管してください。
2。 3Dプリンタの準備
この研究で使用される3DプリンタはregenHUから "BioFactory"だった。システムの押し出し部分はいくつかの部分から構成されています。上部の圧力下カートリッジはルアーロックアダプタを介してコネクタに取り付けられている。コネクタは、カートリッジの出口と電磁弁の入口との間のスペースを埋める。電磁弁の出口で、異なる直径を有する針を使用することができる。材料はサブに押し出され真空により移動ステージに保持されている戦略。システムの主要な部分は、図1に示されている。他の押し出しベースのシステムは、印刷処理に使用され、最適化プロセスは、システムごとに行う必要があることができる。
- 超純水で満たされた別の1.5ml試験管に電磁弁（ノズル径0.3ミリメートル）と針（内径0.15ミリメートル）を配置し、30分間洗浄する温水超音波浴中に置いてください。エタノールで洗浄バルブを洗浄し、窒素銃でそれらを乾燥させます。
- バルブとニードルプリンタと同様、空、きれいなカートリッジを取り付けます。
- システムに3バールの圧力を適用し、圧縮空気でインストールバルブとニードルから任意の残留液体を吹き消す。小さな針径のために、針を詰まらせる可能性が小さい粒子の侵入を避けるために、圧縮空気の出口に設置されたフィルタ（共通シリンジフィルター、0.45μmの孔径）を有することが推奨される。 圧力をオフにして、ポロキサマーでロードカートリッジを取り付けます。ポロキサマーは、室温とゲルに達することができるので、カートリッジがカートリッジを取り付ける前に、約30分冷蔵庫から取り出しておく必要があります。
- システムに3バールの圧力を印加して、針の先端に到達し、連続ストランドに押出されるまで、ポロキサマーを分配する。
3。印刷パラメータの最適化
正確な3次元構造を作成するには、印刷プロセスは、選択された材料および濃度を最適化しなければならない。粘度および3D印刷システムに応じて、各材料は、パラメータの固定されたセットのための特定の小出し体積と線の太さが得られます。
- 適切なCADソフト（図面からISOファイルを作成することができる）を使用すると、印刷しようとしている構造と同じ長さについて、単一の線を引く。
- 顕微鏡のスライドガラス25ミリメートル×75ミリメートル×1を置きミリメートルまたはプリンタ内の他の基板と真空をオンにすることによって固定します。
- プリンタソフトウェアでは、50ヘルツの高周波に電磁弁を設定し、3バールの高圧に設定してください。
- 300mm /分のステージ速度を持つ単一の行の一つの層を印刷します。
- 所望の線幅に到達するまで圧力を減らす。また、バルブの開放時間を経由して押出されるボリュームを制御することができます。
- 連続的なラインはもう印刷できなくなるまでバルブの頻度を減らす。この値以上の周波数を選択してください。
注：所望の線幅と実線が達成されると、ある印刷層の後に最適なステージ速度とニードルのリフトすなわち、層の厚さを決定する。
- 互いの上にいくつかの層を印刷して、針がいくつかの印刷層の後に前の層の上の正しい位置にあるかどうか。層の厚さ（ニードルリフトを調整する）が各層は次のもの（ 図3）の上に印刷されている。
- 300mm /分からのステージのステージ速度を下げ押出層は以前のもの（ 図4）と同じ位置で開始および終了するように段階的に。高すぎるステージ速度は、押出材は、前の層に触れた前にステージが動いているように原因となる。
- 。柱構造は3.1.-3.8の手順に従って印刷するためではなく、単一の行を描画する単一のポイントを描画します。柱を印刷する際に集中するパラメータは、柱が堆積されるべき位置に印字ヘッドの圧力（層厚およびポロキサマーの柱の直径を調節）、弁の開時間（押出量）と滞留時間である。
- パラメータが最適化されるときに、ラインのいくつかの層を印刷すると、固体壁に、またはポイント、ピラーの場合にもたらすべきである。後で使用するためのパラメータを保存します。
この点についての最適化手順の間に発見されたパラメタを使用します。
- ガラス顕微鏡スライド上の内部構造（ここでは、それは柱の配列です）を印刷して、それが一晩乾燥させます。この）は、構造体のサイズおよび厚さを減少させ、b）に回避することができるリフトオフ埋め戻し時のように、構造体と基板との間のより良好な接着を提供する。
- CADソフトウェアでは、あなたが離れて溶出し、記入したつもりな構造を囲む外壁で構成されて構造を描画します。ポロキサマーを持つ構造体を印刷します。壁の印刷は6分かかります。
注意：壁があるため、針の大きさの内部構造から少なくとも3.5 mmの距離まで印刷する必要があります。そうしないと外壁の印刷は内部構造を破壊する
- あなたSACRバックフィルしたい溶液を調製とificial型（ここでは1％の脱イオン水でアガロース）。アガロース溶液は、35℃と45℃の間の温度を持っている必要がありこの温度の下には、アガロースは早すぎる固化う。ポロキサマー構造が柔らかくなりますので、この温度を超える、それが印刷された柱を破壊する可能性があります。
- ゆっくりとピペットを用いて埋め戻し液で犠牲金型を埋める。これは、壁の内部構造の破壊を避けるためにゆっくりと行われるべきである。
- 埋め戻しソリューションゲルを聞かせたり、それが使用されるポリマーに応じて架橋する。アガロースの場合、凝固は、10分間、4℃で行われた。
- ポロキサマー構造を溶出するために10分間、氷浴中で埋め戻し犠牲型を置きます。
- ティッシュペーパーで埋め戻し構造をブロットおよび新しいガラス顕微鏡スライド上に置きます。との間に空隙から第三ヒドロゲルの漏れを回避するために、ガラス顕微鏡スライド上に注意深く構造を押す埋め戻し構造とガラス顕微鏡スライド。
5。ボイドの充填
- 溶出ポロキサマーが残した空隙を埋めるために、30 G針を搭載したシリンジに、意図したポリマー溶液を埋める。この例では、0.05％w / vのリチウムフェニル-2,4,6 - trimethylbenzoylphosphinate（LAP）およびアレクサ488共役フィブリノゲンの2.5％v / vの添加で0.15MのNaCl溶液中1％アルギン酸メタクリレートを用いる。アレクサ-488共役フィブリノゲンは、可視化の目的のために追加されました。
- 5分間画像に対して高輝度UVランプを有するポリマーを光重合（100ワット、365nmで、基板からの距離が3.5 cmであった）は、エピ蛍光または共焦点顕微鏡を使用して構築する。
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Representative Results
代表的な結果は、逆型技術は、（ 図2に示す）は、第2の材料で充填することができる構造化されたゲルを作成することを示している。すべての印刷処理の最初に印刷パラメータが最初に最適化される。パラメータの段階的な調整は、 図3および単一の行が印刷され、図4に示されている印刷された多層構造体になります。層の厚さは（一方の後に印刷層ニードルリフト）が低すぎる場合、一針が先行する層に触れることを観察する。針が高すぎると、印刷された構築物の表面上の波形が表示されます。これは、すべてのテストされたフィギュア層厚さが所定のステージ速度に対して大きすぎる3A〜3Dに見られる。高段速度が層の厚さが減少するため、セットと実際の層厚とのわずかな差が蓄積し波のパターンが開始構造物の高さが増加として現れています。層の厚さを下げることにより、違いが小さくなると波のパターンが以前よりも高い位置（ 図3Cおよび図3Dに点線で示す）に現れる。ステージ速度が速すぎるに示すように、固定層の厚さについては、これは、上部に向かって幅狭とはコンストラクト（印刷構造の右端）の冒頭に膨らみを有することのいずれか波パターン、または構築物中にもたらす図4A-4C。ポロキサマーのための最適化されたパラメータは、0.2ミリ秒の開時間、31.14 Hz]の周波数、0.15ミリメートル、1.5バールの圧力および75 50mm /分の速度の層厚であった。これらのパラメータを使用したプリントは、 図4Dのようになめらかな固体壁になった。しかし、100mm /分の高段速度が壁の製造時間を短縮するために、プロセスのために選択した。
πのために最適化されたパラメータを持つ図5Aに示すようにウサリャル印刷（開放時間0.2ミリ秒、周波数31.14 Hzで、層の厚さ0.08ミリメートル、圧力1.5バール、ステージ速度200mm /分、滞留時間0.3秒）私たちは、柱の配列を作成しました。ピラー配列の乾燥効果が中心に向かってピラーの曲がりを生じた。この効果は、互いからさらに離れ柱を配置することにより、減少したが、避けられないことができる。 図5Bに示すように、壁は、その後、柱の周りに印刷される。
冷たい水の中に犠牲ポロキサマー型の溶出後、 図5Cに示すような構造化されたアガロースヒドロゲルは作成されていました。蛍光アルギン酸メタクリル酸溶液およびその後の架橋に空隙を充填した後、例えば図6に示すような新規なヒドロゲルインヒドロゲルピラーアレイを作製することができる。 3D zスタック再建は明らかに作成された蛍光灯の柱を示し、図7 強い>はまた、任意に湾曲した金型を作成するには、この技術の可能性を示しています。
図1。 bioprinterの描写。bioprinter "BioFactory"の）絵。針とバルブ）この画像では見えないですが、Bに示されている。最大8つのプリントヘッドには、一つはすぐに材料の間に変更することができターニング砲塔に搭載されている。印刷は、x軸、y軸およびz方向に移動させることができ、移動ステージ上に行われているのは大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください 。
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図2。構造化されたヒドロゲルを作製するための犠牲鋳型の製造方法のスキーム。
図3。層の厚さの減少とともに、層厚の最適化 、 固定ステージ速度で印刷ポロキサマー層（250mL 50mm /分）。層の厚さが高すぎると、波のパターンが現れる。これにより、徐々に層の厚さの減少とともに消える。赤い点線は印刷コンストラクトの欠陥部分の高さを示しているのに対し、赤実線は印刷構造の下部を示す。層））0.18ミリメートル、BはC）が 0.15ミリメートルとD）0.13ミリメートル0.16ミリメートルの厚さ。赤いバーは2mmを示します。
図4。ステージ速度の最適化。ステージの速度の異なる0.15ミリメートルの層厚が印刷ポロキサマー層）250ミリメートル/分、B）200mm /分、C）150 50mm /分およびD）100 50mm /分。ステージ速度を下げることにより、印刷処理の開始点は、全ての層で同じであり、固体壁を印刷することができる。赤いバーは2mmを示します。
図5。パターン化ヒドロゲルの製造。）お互いから1.75ミリメートル分離柱と乾燥ポロキサマーの柱配列。柱の曲げは効果を乾燥させることによって引き起こされます。アガロース。Cピペッティング前ポロクサマーで作られた壁に囲まれたB）柱配列）ストラクチャード犠牲モールドを除去した後、アガロースヒドロゲル。
図6。 3Dアガロース足場に埋め込 まれている蛍光標識柱の再建をzはスタック。
図7。ポロキサマーから印刷同心円。シングル層が表示されます。赤いバーは2mmを示します。
| 設計基準 | 印刷パラメーター |
| 微細な層の厚さ |
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| 小さい線の太さ |
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| 連続押し出し |
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| 速い建設速度 |
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表1。ポロキサマーラインおよびそれらがどのように異なる印刷パラメータの影響を受けることがありますの押出四つ設計パラメータ。
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Discussion
ここでは、初めて、すぐに〜のポロキサマーのゲル - ゾル転移点20℃のために冷たい水に溶出させることができる犠牲型のため熱応答性ポリマーの使用を提示プロセス全体の速度は十分な解像度で印刷することができません生体高分子構造を迅速に作成するためのポロキサマー興味深い。以前に他の材料35について報告されているとしてここに記載された技術は、他のヒドロゲル内またはマイクロ流体チャネルを作成する毎にヒドロゲルのパターニングに使用することができる。犠牲鋳型としてポロキサマーの利点は、それが充填され、その後溶出させることができる固体層毎の構築物中に任意の幾何学的形状で印刷することができることである。
我々はここで構造化されたハイドロゲルを作成するために第二ヒドロゲルのその後の埋め戻しとポロクサマーと犠牲型を作成するプロセスを説明します。構造化されたハイドロゲルの材料としては、CHすることができます充填した時点で粘度や温度に関しての制限がオーセン。ポリエチレングリコールジアクリレート36,37、アルギン酸38,39、アガロース40およびメタクリル生体高分子などの一般的に使用されるポリマーの低粘度前駆体溶液は41-43適し充填材料のほんの一例です。高粘度材料は、しかし狭い形状を記入しないことや、ここに印刷された柱のような薄い脆弱な構造の場合には犠牲型を破壊する可能性があります。割合が低いアガロース溶液したがって、バックフィルのために選ばれた。ポロキサマーと組み合わせてアガロースを使用することの別の利点は、それが冷却によりゲル化することである。そのため、冷たい水の中に沈めたとき、アガロースはゲル状態、正確に逆に印刷ポロキサマーパターンを反映した状態を保持します。
この手順の重要なステップは、印刷パラメータの最適化、犠牲型の充填と関与ボイドの充填。最適化された印刷パラメータは、バルブ、圧力、ステージ速度と層厚の周波数と開放時間であった。層の厚さは、すべての印刷層の後にニードルのリフト量として定義される。ピラーの場合、滞留時間は、時間材料は、ステージを移動させずに点上に押し出され、 すなわちも調整しなければならなかった。一つのパラメータの変化は押出しラインのいくつかの設計パラメータに影響を与えることができるので、最適化プロセスは、時間がかかる可能性があります。別の設計基準のキーパラメータを表1に記載されている。
プロセスの第二の重要なステップは、犠牲型の充填である。犠牲型の充填は繊細ステップです。小型で狭い構造は慎重に記入する必要がある、多くの場合、手動およびソリューションのシンプルなキャスティングは必ずしも可能ではないかもしれません。
sを慎重充填アガロースとacrificialモールド従って、柱の破壊を避けるために、100μlのピペットを用いて行った。最後のステップ、空隙の充填は、30 G針を備えた注射器の使用を必要とした。注意が充填時の気泡形成を避けるために注意すべきである。
ここで紹介する構築物中の異なるゲルは、細胞を含むことができます。構造化されたヒドロゲルの内部空隙と他の細胞型内のヒドロゲルの1つの細胞型を置くことによって、空間的に定義された共培養のセットアップを作成することができる。ミラーらから出版のように3Dネットワークを相互接続。30、血管や神経回路網もまた可能である。このようなネットワークへの可能なアプローチは、周囲の壁内の行を印刷し、第二のヒドロゲルとの空隙を埋めるため、第二のヒドロゲルを架橋し、90°回転させ次の層の印刷を継続することであろう。犠牲モールド等の印刷ポロキサマーの利点は、どちらも必要としないことであるマスター型またはマスク。また、材料を押し出すために加熱されたプリントヘッドを必要とせず、システムの目詰まりが実験で観察されていない。
空間的に拡散ベースの細胞間相互作用を研究したり、創薬のために3Dの共培養組織化など、ここで提示されたものと構築物が、将来的に使用されるかもしれません。しかしながら、ここに提示プロシージャの完全に自動化されたバージョンは、薬物スクリーニングの分野で成功を収めるために開発する必要がある。
要約すると、我々はハイドロゲルを充填し、その後溶出させることができる任意の形状の印刷を可能にする方法を提示しました。そのように、構造化されたヒドロゲルインヒドロゲルアーキテクチャは簡単かつ費用対効果の高い方法で作成することができる。
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Disclosures
著者は宣言することは何もない。
Acknowledgments
我々はbioprinterのヘルプはデボラステューダーに感謝します。
作業は、付与契約にN下、欧州連合第七フレームワークプログラム（FP7/2007-2013）°NMP4-SL-2009から229292によって資金を供給された。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Poloxamer (Pluronic F127) | Sigma | P2443 | |
| PBS | Invitrogen | 10010-015 | |
| CAD software | regenHU | BioCAD | |
| Alginate methacrylate | Innovent e.V Technologieentwicklung Jena | Synthesized by Innovent for the FP7 Project Nr NMP4-SL-2009-229292 | |
| Fibrinogen From Human Plasma, Alexa Fluor 488 Conjugate | Invitrogen | F13191 | |
| Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) | Innovent e.V Technologieentwicklung Jena | Synthesized by Innovent for the FP7 Project Nr NMP4-SL-2009-229292 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| EQUIPMENT | |||
| Bioprinter | regenHU | Biofactory | |
| Valve | regenHU | 300 μm Nozzel Diameter | |
| Needle | regenHU | 150 μm Inner Diameter | |
| Zeiss Axioobserver with ApoTome | Zeiss | ||
| UV Light Source | UVP | Blak-Ray B-100AP High Intensity UV Lamp | 100 W |
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