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Immunology and Infection

Impresión Moldes inversa termosensible para la Creación de modelado hidrogeles de dos componentes para el 3D de cultivo celular

Published: July 10, 2013 doi: 10.3791/50632
Automatic Translation
1, 2, 2, 1
1Department of Health Science & Technology, Cartilage Engineering & Regeneration, 2Biomaterials Department, Innovent e.V.

Summary

Un bioprinter se utilizó para crear hidrogeles modelado basado en un molde de sacrificio. El molde poloxámero se rellenó con un segundo hidrogel y luego se eluyó, dejando huecos que estaban llenos de una tercera hidrogel. Este método utiliza elución rápida y buena capacidad de impresión de poloxámero para generar arquitecturas complejas a partir de biopolímeros.

Abstract

Bioprinting es una tecnología emergente que tiene su origen en la industria del prototipado rápido. Los procesos de impresión diferentes se pueden dividir en bioprinting contacto 1-4 (extrusión, pluma de la inmersión y la litografía blanda), 5-7 (transferencia de láser hacia adelante, la deposición de chorro de tinta) sin contacto bioprinting y técnicas basadas en láser, tales como dos fotones fotopolimerización 8. Se puede utilizar para muchas aplicaciones tales como la ingeniería de tejidos 9-13, 14-16 y microfabricación biosensor como una herramienta para responder a las preguntas biológicas básicas tales como las influencias de co-cultivo de diferentes tipos de células 17. A diferencia de métodos fotolitográficos o suave-litográfica comunes, bioprinting extrusión tiene la ventaja de que no requiere una máscara o sello separado. El uso de software CAD, el diseño de la estructura se puede cambiar rápidamente y ajusta de acuerdo con los requisitos del operador. Esto hace que bioprinting más flexible que la litografía basadaenfoques.

Aquí se demuestra la impresión de un molde de sacrificio para crear una estructura de múltiples materiales 3D utilizando una matriz de pilares dentro de un hidrogel como un ejemplo. Estos pilares podrían representar estructuras huecas de una red vascular o los tubos dentro de un conducto de guía del nervio. El material escogido para el molde de sacrificio era poloxámero 407, un polímero termosensible con excelentes propiedades de impresión que es líquida a 4 ° C y un sólido por encima de su temperatura de gelificación ~ 20 ° C durante 24,5 soluciones w / v 18%. Esta propiedad permite que el molde de sacrificio poloxámero basado en que se eluyó en la demanda y tiene ventajas con respecto a la lenta disolución de un material sólido, especialmente para geometrías estrechas. Poloxámero se imprimió en portaobjetos de vidrio para microscopio para crear el molde de sacrificio. La agarosa se pipeteó en el molde y se enfría hasta la gelificación. Después de la elución de la poloxámero en agua fría de hielo, los huecos en el molde de agarosa se llenaron con alginato de metacrilato spIKED con fibrinógeno marcado con FITC. Los huecos llenos fueron entonces reticuladas con UV y el constructo fue fotografiada con un microscopio de epifluorescencia.

Introduction

Enfoques de ingeniería de tejidos han avanzado mucho en los últimos años con respecto a la regeneración de tejidos y órganos humanos 19,20. Sin embargo, hasta ahora, el enfoque de la ingeniería de tejidos ha sido a menudo limitado a los tejidos que tienen una estructura simple o de pequeñas dimensiones, tales como la vejiga o la piel 21,22 23-25. El cuerpo humano, sin embargo, contiene muchos tejidos tridimensionales complejas en las que las células y la matriz extracelular están dispuestos de una manera espacialmente definido. Para la fabricación de estos tejidos, se requiere una técnica que puede colocar las células y los andamios de matriz extracelular dentro de una construcción de tres dimensiones en las posiciones especificadas. Bioprinting tiene el potencial de ser una técnica tal donde la visión de la fabricación de tejidos tridimensionales complejas puede ser realizado 10,11,26-28.

Bioprinting se define como "el uso de los procesos de transferencia de material para modelar y montaje biológicamente relmateriales nentes - moléculas, células, tejidos y biomateriales biodegradables. - con una organización prescrita para llevar a cabo una o más funciones biológicas "4 abarca varias técnicas diferentes que funcionan a diferentes resoluciones y escalas de longitud, que van desde la resolución sub-micras de dos polimerización de fotón 29 a una resolución de 150 micras a 420 micras para la impresión de extrusión 1,12,30. No es un único material o combinación de materiales va a satisfacer los requisitos de cada método 31. Para la impresión de extrusión, los parámetros clave son la viscosidad y el tiempo de gelificación 32, donde son deseables alta viscosidad y gelificación rápida.

La impresión 3D es una técnica que permite la fácil creación de moldes de sacrificio para crear geometrías complejas 30,33,34. Este proceso se basa en la construcción de un molde usando una técnica de prototipado rápido tal como un bioprinter extrusión. Se utiliza el molde de sacrificio creadopara formar estructuras complejas a partir de materiales que son difíciles de imprimir, debido a su baja viscosidad y tiempo de gelificación lenta. El método que aquí se presenta implica la creación de un molde de sacrificio consiste en un material que se disuelve rápidamente a baja temperatura y puede ser extruido con precisión. El bloque de copolímero de poli (etileno glicol) 99-poli (propilenglicol) 67-poli (etilenglicol) 99 (también conocido como Pluronic F127 o poloxámero 407) cumple estos requisitos. Ya se ha utilizado en una versión modificada en la impresión de extrusión 1, pero, a nuestro conocimiento, nunca se ha utilizado para la impresión en su versión sin modificar debido a su inestabilidad en ambientes líquidos. Poloxámero 407 también muestra un comportamiento de respuesta térmica inversa 18 es decir, que cambia de un gel a un sol tras el enfriamiento. Lo más importante es que se puede imprimir en las estructuras arbitrariamente curvas complejas con muy alta fidelidad. Esto permite la creación de un hidrogel estructurado a partir de unmaterial de baja viscosidad, en este caso de gelificación lenta de agarosa, con la pipeta la solución en el molde de sacrificio impreso. La combinación de la impresión del molde de sacrificio con alta fidelidad, y su elución rápida del hidrogel estructurado fundido hace que sea un método rápido y flexible para crear moldes con diferentes geometrías sin el uso de una máscara o un sello, ya que se requiere a menudo en métodos litográficos. El hidrogel estructurado fundido puede llenarse aún más con otro material que no es adecuado para la impresión de extrusión debido a su baja viscosidad. Esto es, en nuestro caso una solución metacrilato alginato de baja viscosidad. Aquí presentamos el método de sacrificio termosensible moldes inversa para modelar hidrogel utilizando el ejemplo de una matriz de pilar.

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Protocol

1. Preparación de la solución de 407 Poloxámero

Si está disponible, lleve a cabo la preparación de la solución de poloxámero en una habitación fría (4 ° C). Si no está disponible, colocar una botella de vidrio en un vaso de precipitados lleno de agua enfriada con hielo. A temperaturas más altas el poloxámero estará por encima del punto de gel y no se disuelve apropiadamente.

  1. Añadir 60 ml de solución de PBS frío de hielo en una botella de vidrio y se agita vigorosamente con un agitador magnético.
  2. Pesar 24,5 gramos de poloxámero y añadirlo en pequeñas cantidades a la PBS frío. Espere hasta que el poloxámero han disuelto antes de añadir más.
  3. Se agita la solución hasta que se haya disuelto todo el poloxámero.
  4. Añadir PBS frío hasta que se alcanza un volumen final de 100 ml. La concentración final será de 24,5% w / v
  5. Deja de agitar la solución y se deja reposar a 4 ° C hasta que las burbujas y la espuma en la solución han desaparecido. Las burbujas que son atrapadas dentro del gel se transfirieron a la pcartucho IMPRESORA y dará lugar a defectos en los moldes de sacrificio impresos.
  6. Filtro (filtro de 0,22 micras) la solución directamente en el cartucho de impresión para eliminar las partículas no deseadas que podrían obstruir la aguja. La etapa de filtración se debe realizar en una habitación fría (o si no está disponible con las puntas enfriados, filtro, etc) para evitar la gelificación de la poloxámero en el filtro. Mantenga el cartucho cargado a 4 ° C hasta 30 minutos antes del experimento.

2. Preparación de la impresora 3D

La impresora 3D utilizado en este trabajo fue el "Biofábrica" ​​de regenHU. La parte del sistema de extrusión consta de varias partes. Un cartucho a presión en la parte superior está unida a un conector a través de un adaptador de cierre luer. El conector de puente entre los espacios entre la salida del cartucho y la entrada de una válvula de solenoide. A la salida de la válvula de solenoide, agujas de diferentes diámetros se pueden utilizar. El material se extruye sobre un subtrar que se mantiene a una etapa en movimiento por medio de vacío. Las partes principales del sistema se representan en la Figura 1. Otros sistemas basados ​​en extrusión se pueden utilizar para el proceso de impresión, y el proceso de optimización que hay que hacer para cada sistema.

  1. Coloque la válvula de solenoide (diámetro de la boquilla 0,3 mm) y la aguja (diámetro interior 0,15 mm) en tubos de ensayo separados 1,5 ml llenos con agua ultrapura y colocarlas en un baño de ultrasonidos para limpiar climatizada durante 30 min. Enjuague las válvulas limpias con etanol y secar con una pistola de nitrógeno.
  2. Instalar la válvula y la aguja en la impresora, así como un, cartucho vacía y limpia.
  3. Aplicar 3 bar de presión en el sistema y apagar todos los líquidos residuales de la válvula instalada y la aguja con aire a presión. Para los pequeños diámetros de aguja, se recomienda tener un filtro (filtro de jeringa común, 0,45 micras de tamaño de poro) instalado en la salida del aire comprimido para evitar la entrada de pequeñas partículas que podrían obstruir la aguja. Gire a la presión e instalar el cartucho cargado con el poloxámero. El cartucho se debe tomar de la nevera aproximadamente 30 min antes de montar el cartucho de manera que el poloxámero puede alcanzar la temperatura ambiente y el gel.
  4. Aplicar 3 bar de presión para el sistema y dispensar poloxámero hasta que llega a la punta de la aguja y se extruye en una hebra continua.

3. Optimización de los parámetros de impresión

Para crear estructuras 3D precisos, el proceso de impresión tiene que ser optimizado para el material elegido y de la concentración. Dependiendo de la viscosidad y el sistema de impresión 3D cada material se dió un volumen de dispensación específica y grosor de la línea para un conjunto fijo de parámetros.

  1. Con un software CAD adecuado (capaz de crear archivos ISO de los dibujos), dibujar una sola línea acerca de la misma longitud que la estructura que se va a imprimir.
  2. Coloque un microscopio portaobjetos 25 mm x 75 mm x 1mm o cualquier otro sustrato en la impresora y asegurar que girando en el vacío.
  3. En el software de la impresora, coloque la válvula de solenoide de alta frecuencia de 50 Hz y establecer una alta presión de 3 bar.
  4. Imprimir una capa de una sola línea con una velocidad de fase de 300 mm / min.
  5. Reducir la presión hasta alcanzar el ancho de la línea deseada. También se puede controlar el volumen que se extruye a través del tiempo de apertura de la válvula.
  6. Reducir la frecuencia de la válvula hasta que hay una línea continua se puede imprimir más. Elija una frecuencia por encima de este valor.

Nota: Una vez que se alcanzan el grosor de línea deseado y líneas continuas, determinar la velocidad de fase óptima y espesor de la capa es decir, la elevación de la aguja después de una capa impresa.

  1. Imprima varias capas una encima de la otra y ver si la aguja está en la posición correcta sobre la capa anterior después de varias capas impresas. Ajustar el espesor de la capa (ascensor aguja) De modo que cada capa se imprime en la parte superior de la siguiente (Figura 3).
  2. Reduzca la velocidad de fase de la etapa de 300 mm / min paso a paso de manera que las capas extruidas comienzan y terminan en las mismas posiciones que los anteriores (Figura 4). Velocidades demasiado altas escenario hacen que el escenario para estar en movimiento antes de que el material extruido ha tocado la capa anterior.
  3. Para la impresión de las estructuras pilar siguen los pasos 3.1.-3.8., Pero en vez de dibujar una sola línea dibujan un solo punto. Los parámetros para centrarse en la hora de imprimir los pilares son la presión (regula espesor de la capa y el diámetro del pilar de poloxámero), el tiempo de apertura de la válvula (volumen extruido) y el tiempo de residencia de la cabeza de impresión en la posición donde el pilar debe ser depositado .
  4. Cuando se optimizan los parámetros, la impresión de varias capas de una línea debe resultar en una pared sólida, o en el caso de los puntos, un pilar. Guardar los parámetros para su uso posterior.

Utilice los parámetros encontrados durante el proceso de optimización a partir de ahora.

  1. Imprimir la estructura interna (en este caso se trata de una matriz pilar) sobre un portaobjetos de vidrio y deje que se seque durante la noche. Esto a) reduce el tamaño y el grosor de las estructuras y b) proporciona una mejor adhesión entre la estructura y el sustrato, por lo que el despegue durante el relleno puede ser evitado.
  2. Con el software de CAD, dibuje una estructura que consiste en una pared exterior que rodea la estructura va a haber eluido lejos y lleno. Imprimir la estructura con poloxámero. La impresión de la pared tendrá 6 min.

Atención: La pared tiene que ser impresa al menos 3,5 mm de la estructura interna, debido a las dimensiones de la aguja. De lo contrario la impresión de la pared exterior va a destruir la estructura interna

  1. Preparar la solución que desea rellenar el sacrmolde ificial con (aquí agarosa al 1% en agua desionizada). La solución de agarosa debe tener una temperatura entre 35 ° C y 45 ° C. Por debajo de esta temperatura, la agarosa se solidifica demasiado rápidamente; encima de esta temperatura, que podría destruir los pilares impresos debido a que la estructura de poloxámero se ablandará.
  2. Llene lentamente el molde de sacrificio con la solución de relleno con una pipeta. Esto se debe hacer lentamente para evitar la destrucción de la estructura dentro de la pared.
  3. Deje que el gel de solución rellenada o reticular que dependiendo del polímero utilizado. En el caso de la solidificación de agarosa se llevó a cabo a 4 º C durante 10 min.
  4. Colocar el molde de sacrificio rellenada en un baño de hielo durante 10 min para eluir la estructura de poloxámero.
  5. Seque la estructura rellenada con un pañuelo de papel y colocarlo en un nuevo portaobjetos de vidrio. Pulse la estructura cuidadosamente sobre el portaobjetos de microscopio de vidrio para evitar la fuga de la tercera hidrogel desde el vacío en el espacio entrela estructura rellenada y el portaobjetos de microscopio de vidrio.

5. El llenado de los huecos

  1. Para llenar los huecos dejados por el poloxámero eluido, llenar la solución de polímero deseado en una jeringa equipada con una aguja de 30 G. En este ejemplo, se utilizó un metacrilato de alginato al 1% en solución 0,15 M de NaCl con la adición de 0,05% w / v de litio fenil-2, 4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) y 2,5% v / v de Alexa-488 fibrinógeno conjugado . El Alexa-488 conjugado fibrinógeno fue agregada para fines de visualización.
  2. Fotopolimerizar el polímero con una lámpara de UV de alta intensidad (100 vatios, 365 nm, distancia del substrato fue de 3,5 cm) durante 5 min y la imagen de la construcción usando un microscopio de epi-fluorescencia o confocal.

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Representative Results

Los resultados representativos muestran que la técnica inversa del molde (representado en la Figura 2) va a crear un gel estructurada que puede ser llenado con un segundo material. Al comienzo de cada proceso de impresión los parámetros de impresión están optimizados primero. Ajustes paso a paso de los parámetros darán como resultado construcciones multicapa impresos representadas en la Figura 3 y la Figura 4 cuando se imprimen líneas individuales. Si el espesor de la capa (el ascensor aguja después de una capa impresa) es demasiado bajo, se observará que la aguja toque las capas anteriores. Si la aguja es demasiado alto, aparecerá un patrón de onda en la superficie de la construcción impresa. Esto se puede ver en las figuras 3A-3D, donde todas las capas probado espesores eran demasiado grandes para la velocidad etapa dada. Debido a una alta velocidad de fase reduce el espesor de la capa, las pequeñas diferencias entre el conjunto y el espesor real de la capa se acumulan y se inicia el patrón de ondapara aparecer como la altura de los aumentos de constructo. Al reducir el espesor de la capa, las diferencias se hacen más pequeñas y el patrón de onda aparece en una posición más alta que antes (indicado por las líneas de puntos en la Figura 3C y Figura 3D). Para un espesor de capa fija, si la velocidad de fase es demasiado rápido esto dará como resultado ya sea en un patrón de onda o en construcciones que se estrechan hacia la parte superior y tiene una protuberancia en el comienzo de la construcción (borde derecho de la estructura impresa) como se muestra en Las figuras 4A-4C. Parámetros optimizados para el poloxámero fueron un tiempo de apertura de 0,2 ms, una frecuencia de 31,14 Hz, un espesor de capa de 0,15 mm, una presión de 1,5 bar y una velocidad de 75 mm / min. Impresión con estos parámetros se tradujo en sólidos muros lisos como en la figura 4D. Sin embargo, se eligió una velocidad superior etapa de 100 mm / min para el proceso para reducir el tiempo de producción de las paredes.

Con los parámetros optimizados para pillar impresión (tiempo de apertura de 0,2 mseg, frecuencia de 31,14 Hz, espesor de capa 0,08 mm, presión de 1,5 bar, la velocidad de fase de 200 mm / min, tiempo de residencia de 0,3 segundos) que crea una matriz de pilares, como se muestra en la Figura 5A. Efectos de secado de la matriz pilar desembocaron en la flexión de los pilares hacia el centro. Este efecto se puede reducir, pero no se evita, mediante la colocación de los pilares más separados el uno del otro. Una pared a continuación, se imprime alrededor de los pilares como se muestra en la Figura 5B.

Después de la elución del molde de sacrificio poloxámero en agua fría, se han creado hidrogeles de agarosa estructurados como el que se muestra en la Figura 5C. Después de llenar los huecos con la solución de alginato de metacrilato fluorescente y la posterior reticulación, una novela de hidrogel en la matriz de hidrogel de pilar, como se puede hacer la que se muestra en la Figura 6. La reconstrucción z-stack 3D ilustra claramente los pilares fluorescentes que fueron creados. Figura 7 fuerte> ilustra la posibilidad de esta técnica para crear arbitrariamente también moldes curvados.

Figura 1
Figura 1. Representación de la bioprinter. A) Una imagen de la bioprinter "Biofábrica". La aguja y la válvula no son visibles en esta imagen, pero se representan en B). Hasta 8 cabezales de impresión están montados en una torreta de giro que permite cambiar rápidamente entre los materiales. La impresión se realiza en un escenario móvil que se puede mover en x-, y-y z-dirección. Haz clic aquí para ver más grande la figura .

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Figura 2. Esquema del proceso de la producción de moldes de sacrificio para la fabricación de hidrogeles estructurados.

Figura 3
Figura 3. Optimización Espesor de capa. Capas Poloxamer impresos a una velocidad de fase fija (250 mm / min) con la disminución del espesor de la capa. Cuando el espesor de la capa es demasiado alto, emerge un patrón de onda. Este desaparece gradualmente con la disminución de espesor de la capa. Las líneas continuas rojas indican la parte inferior de la construcción impresa mientras que las líneas de puntos rojos indican la altura de la parte libre de la construcción impresa defecto. Espesores de capa son A) 0,18 mm, B) 0,16 mm C) 0,15 mm y D) 0,13 mm. La barra roja indica que 2 mm.

"> Figura 4
La Figura 4. Optimización de la etapa de velocidad. Capas Poloxamer impresos con un espesor de capa de 0,15 mm con diferentes velocidades de la etapa A) 250 mm / min, B) 200 mm / min, C) 150 mm / min y D) 75 mm / min. Mediante la reducción de la velocidad de fase, el punto de partida del proceso de impresión es para todas las capas de la misma y una pared sólida se puede imprimir. La barra roja indica que 2 mm.

La figura 5
Figura 5. Producción de hidrogeles estampadas. A) matriz Pilar de poloxámero se secó con pilares separados 1,75 mm uno de otro. La flexión de los pilares es causado por efectos de secado. B) array Pilar delimitada por un muro de poloxámero antes de pipetear la agarosa. C) Structuredhidrogel de agarosa después de la extracción del molde de sacrificio.

La figura 6
La Figura 6. 3D z-pila reconstrucción de pilares de la etiqueta fluorescente incrustada en un andamio de agarosa.

La figura 7
Figura 7. Círculos concéntricos imprimir desde poloxámero. Capas individuales son visibles. La barra roja indica que 2 mm.

Criterios de diseño Parámetros de impresión
Espesor de la capa más fina
  • Presión ↓
  • Velocidad Stage ↑
  • Tiempo de apertura ↓
  • Frecuencia ↓
Grosor de la línea más pequeña
  • Presión ↓
  • Velocidad Stage ↑
  • Tiempo de apertura ↓
  • Frecuencia ↓
Extrusión continuo
  • Presión ↑
  • Velocidad Stage ↓
  • Tiempo de apertura ↑
  • Frecuencia ↑
Velocidad de construcción más rápido
  • Presión ↑
  • Velocidad Stage ↑
  • Tiempo de apertura ↑
  • Frecuencia ↑

Tabla 1. Cuatro parámetros de diseño para la extrusión de las líneas de poloxámero y la forma en que pueden ser influenciados por diferentes parámetros de impresión.

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Discussion

Aquí se presenta, por primera vez, el uso de un polímero termosensible para un molde de sacrificio que se pueden eluyó rápidamente en agua fría debido a la transición de gel-sol de poloxámero de ~ 20 ° C. La velocidad de todo el proceso de poloxámero hace interesante para la rápida creación de estructuras de biopolímeros que no se puede imprimir con una resolución adecuada. La técnica descrita aquí puede ser utilizado para modelar un hidrogel dentro de otro hidrogel o para la creación de canales de microfluidos como se ha informado anteriormente para otros materiales 35. La ventaja de la poloxámero como un molde de sacrificio es que puede ser impreso en geometrías arbitrarias en construcciones de capa por capa de sólidos que pueden ser llenados y se eluyeron después.

Se describe aquí el proceso de creación de un molde de sacrificio con poloxámero con posterior rellenado de un segundo hidrogel para crear hidrogeles estructurados. El material para el hidrogel estructurado puede ser CHOsen con restricciones en lo que respecta a la viscosidad y la temperatura en el punto de llenado. Soluciones precursoras de baja viscosidad de los polímeros de uso común, tales como el polietileno glicol diacrilato 36,37, 38,39 alginato, agarosa 40 y biopolímeros metacrilados 41-43 son sólo algunos ejemplos de materiales de relleno adecuados. Los materiales de alta viscosidad sin embargo pueden no llenar geometrías estrechas o podrían destruir el molde de sacrificio en el caso de estructuras delgadas y frágiles, como los pilares impresos aquí. Por tanto, una solución de agarosa de bajo porcentaje fue elegido para el rellenado. Otra ventaja del uso de agarosa en combinación con poloxámero es que gelifica por enfriamiento. Por lo tanto, cuando se sumerge en agua fría, agarosa conserva su estado gelificado, un estado que refleje con precisión el patrón impreso poloxámero inversa.

Los pasos importantes en este procedimiento incluyen la optimización de los parámetros de impresión, el llenado del molde de sacrificio y de lael llenado de los huecos. Los parámetros de impresión que fueron optimizados fueron el tiempo y la frecuencia de apertura de la válvula, la presión, la velocidad de fase y el espesor de la capa. El espesor de la capa se define como la elevación de la aguja después de cada capa impresa. En el caso de los pilares, el tiempo de residencia, es decir, el tiempo material es extruido sobre un punto sin moverse del escenario, también había que ajustarse. El proceso de optimización puede llevar mucho tiempo porque los cambios en un parámetro puede tener efectos sobre varios parámetros de diseño de las líneas de extrusión. Los parámetros clave para los diferentes criterios de diseño se describen en la Tabla 1.

El segundo paso importante en el proceso es el llenado del molde de sacrificio. El llenado del molde sacrificial es un paso delicado. Estructuras pequeñas y estrechas deben llenarse cuidadosamente, a menudo de forma manual y sencilla de fundición de soluciones no siempre es posible.

Relleno cuidadoso de la spor lo tanto, molde acrificial con agarosa se realizó utilizando un pipeta de 100 para evitar la destrucción de los pilares. El último paso, el relleno de los huecos, requiere el uso de una jeringa equipada con una aguja de 30 G. Se debe tener cuidado para evitar la formación de burbujas durante el llenado.

Los diferentes geles en el constructo presentados aquí también pueden contener células. Mediante la colocación de un tipo de célula en los hidrogeles dentro de los huecos y otro tipo de célula en el interior del hidrogel estructurado, una configuración de co-cultivo definida espacialmente puede ser creado. Interconectado red 3D como en la publicación de Miller et al. 30, redes vasculares o neurales también son posibles. Un enfoque posible a tales redes sería imprimir líneas dentro de una pared que rodea y llenar los vacíos con el segundo hidrogel, reticular el segundo hidrogel y continuar con la impresión de los próximos girar capa por 90 °. La ventaja de la impresión poloxámero como molde sacrificial es que no requiereun molde maestro o una máscara. También no requiere un cabezal de impresión térmico para extruir el material y la obstrucción del sistema no ha sido observado en nuestros experimentos.

Las construcciones tales como las que se presentan aquí pueden ser utilizados en el futuro como 3D espacialmente organizado co-cultivos para estudiar las interacciones célula-célula basados ​​en difusión o para el descubrimiento de fármacos. Sin embargo, una versión completamente automatizada del procedimiento que aquí se presenta es necesario desarrollar para tener éxito en el campo de la investigación de la droga.

En resumen, hemos presentado un método que permite la impresión de geometrías arbitrarias que se pueden llenar con hidrogeles y se eluyen posteriormente. De esta manera, las arquitecturas de hidrogel-en-estructurados de hidrogel se puede crear de una manera sencilla y rentable.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que declarar.

Acknowledgments

Agradecemos a Deborah Studer para la ayuda con el bioprinter.

El trabajo fue financiado por el Séptimo Programa Marco de la Unión Europea (FP7/2007-2013), bajo acuerdo de subvención n ° NMP4-SL-2009 hasta 229.292.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
Poloxamer (Pluronic F127) Sigma P2443
PBS Invitrogen 10010-015
CAD software regenHU BioCAD
Alginate methacrylate Innovent e.V Technologieentwicklung Jena Synthesized by Innovent for the FP7 Project Nr NMP4-SL-2009-229292
Fibrinogen From Human Plasma, Alexa Fluor 488 Conjugate Invitrogen F13191
Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) Innovent e.V Technologieentwicklung Jena Synthesized by Innovent for the FP7 Project Nr NMP4-SL-2009-229292
Agarose Lonza 50004
EQUIPMENT
Bioprinter regenHU Biofactory
Valve regenHU 300 μm Nozzel Diameter
Needle regenHU 150 μm Inner Diameter
Zeiss Axioobserver with ApoTome Zeiss
UV Light Source UVP Blak-Ray B-100AP High Intensity UV Lamp 100 W

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Müller, M., Becher, J., Schnabelrauch, M., Zenobi-Wong, M. Printing Thermoresponsive Reverse Molds for the Creation of Patterned Two-component Hydrogels for 3D Cell Culture. J. Vis. Exp. (77), e50632, doi:10.3791/50632 (2013).

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