Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Fremstilling af rekombinant arenavirus for Vaccine Development i FDA-godkendte Vero celler

Published: August 1, 2013 doi: 10.3791/50662
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1
1Department of Microbiology and Immunology, University of Rochester School of Medicine and Dentistry, 2Departments of Immunology and Microbial Sciences, The Scripps Research Institute
* These authors contributed equally

Summary

Redning af rekombinante arenaviruses fra klonede cDNA'er, en tilgang kaldet reverse genetik, giver forskerne at undersøge betydningen af ​​specifikke virale genprodukter, samt bidrag af deres forskellige specifikke domæner og restprodukter til mange forskellige aspekter af biologi arenavirus . Ligeledes omvendt genetik teknikker i FDA-godkendte cellelinier (Vero) for udvikling af vacciner giver nye muligheder til generering af effektive og sikre vacciner til bekæmpelse af humane patogene arenaviruses.

Abstract

Udviklingen og implementeringen af arenavirus omvendt genetik repræsenterer et betydeligt gennembrud i arenavirus banehalvdel 4. Brugen af ​​cellebaserede arenavirus minigenomplasmiderne systemer sammen med evnen til at generere rekombinante infektiøse arenaviruses med forudbestemte mutationer i deres genomer har lettet undersøgelse af bidraget af virale determinanter til de forskellige trin i arenavirus livscyklus, samt virus-host interaktioner og mekanismer arenavirus patogenese 1, 3, 11. Desuden har udviklingen af trisegmented arenaviruses tilladt brugen af arenavirus genom at udtrykke yderligere fremmede gener af interesse og dermed åbne muligheden for arenavirus-baserede vaccine vektor applikationer 5. Ligeledes er udviklingen af ​​single-cyklus smitsomme arenaviruses stand til at udtrykke reportergener giver et nyt eksperimentelt værktøj til at forbedre sikkerheden for forskning, som involverer highly patogene humane arenaviruses 16.. Den generation af rekombinante arenaviruses hjælp plasmid-baserede teknikker til omvendt genetik har hidtil påberåbt brugen af gnaver cellelinjer 7,19, hvilket skaber nogle barrierer for udviklingen af Food and Drug Administration (FDA)-godkendt vaccine eller vaccine vektorer. For at overvinde denne hindring, vi beskriver her en effektiv generation af rekombinante arenaviruses i FDA-godkendte Vero celler.

Introduction

Arenaviruses er indkapslede vira med bisegmented, negativ-strenget RNA-genom 3, som hører til Arenaviridae familien. Den arenavirus genomet koder fire proteiner i en ambisense mode fra to separate virale segmenter 3. Den store (L) segment koder for RNA-afhængige RNA-polymerase (L) og den lille RING (Virkelig interessant nyt gen) finger protein (Z), der tjener som den vigtigste drivkraft for virus spirende. Den lille (S) segment koder for virale nukleoprotein (NP) og overfladen glycoprotein (GP) (Figur 1).

Adskillige medlemmer af Arenaviridae familien er ansvarlige for dødelig hæmoragisk feber (HF) i mennesker 3. Principielle bekymringer er Lassa virus (LASV), og Junín virus (JUNV), der er kendt for at forårsage høj dødelighed hos indlagte patienter 8, 9. Selv om disse vira er endemiske for Vestafrika og landdistrikter Argentina henholdsvisDer er stigende bekymring for import af LASV og JUNV til ikke-endemiske områder på grund af øget rejse 10. Derudover, selvom ikke normalt er forbundet med alvorlig sygdom hos mennesker, er prototypisk arenavirus lymfatisk choriomeningitisvirus (LCMV) betragtes som en forsømt patogen som der har været tilfælde af dødelig infektion i immunsvækkede patienter 6, 15 og er ansvarlig for medfødte fosterskader og spontane aborter hos gravide kvinder 2, 13. I øjeblikket er der ingen amerikanske FDA-godkendte vacciner mod arenaviruses og behandling er begrænset til nukleosidanalogen ribavirin, som kun er delvist effektiv og ofte forbundet med betydelige bivirkninger.

Indførelsen af plasmid-baserede revers genetik 4 og generering af rekombinante arenaviruses 7, 19 har gjort store fremskridt inden for arenavirus forskning. I øjeblikket er gnaverceller (såsom BHK-21) anvendes til generelttion af rekombinante arenaviruses grund af artsspecifikke murine RNA polymerase I (pol-I) promotor, der styrer den første transkription af S og L segmenter. Men virus redning i BHK-21-celler er ikke en godkendt metode til generering af rekombinante arenaviruses som potentielle vaccine frø kandidater. Her har vi dokumentere brugen af ​​menneskelige pol-I promoter til effektiv redning af prototypisk gamle verden (OW) LCMV og den nye verden (NW) JUNV Candid # 1 stamme i Vero-celler. Ved hjælp af en lignende metode, men vi genererede rekombinant trisegmented LCMV (r3LCMV), og Candid # 1 (r3Candid # 1) arenaviruses, der indeholder yderligere to fremmede gener indkodet i to forskellige S RNA segmenter 5. Dette nye system ikke blot følger en meget reproducerbar og enkel protokol, men umiddelbart kan gennemføres i dannelsen af ​​rekombinante arenaviruses som potentiel vaccine eller vaccine vektor frø.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1.. Arenavirus Rescue Transfektion

Vores rednings-system var baseret på anvendelsen af ​​både polymerase II protein ekspressionsplasmider der koder for nukleoprotein (NP) og RNA-afhængige RNA-polymerase-(L), de virale trans-virkende faktorer, der er nødvendige for RNA-replikation og genekspression af arenavirus genomet 7, 19, og plasmider stand til at styre intracellulær syntese, via cellulært RNA-polymerase I (pol-I), af S-og L antigenom RNA-art 7. I vores undersøgelser har vi bruger pCAGGS protein ekspressionsplasmidet, som anvender kylling β-actin-promotoren og polyadenylanation (Pa) signalsekvenser, og den humane pol-I plasmid, som benytter den humane polymerase I-promotoren og murine terminatorsekvenser (figur 2) . S og L RNA segmenter klonet ind i HPOL-I plasmid i en antigenomisk orientering for at tillade generering af genomiske RNA-segmenter ved transkription af HPOL-I. For at redde wild-type rekombinant LCMV (rLCMV), og Candid # 1 (rCandid # 1) på pCAGGS NP og L fra hver virus blev cotransficeret sammen med deres respektive menneskelige pol-I S-og L-RNA segmenter (figur 3). Generering af rekombinant trisegmented LCMV (r3LCMV), og Candid # 1 (r3Candid # 1) fulgte en lignende protokol, men S-segmentet blev opdelt i to forskellige pol-I S plasmider, der hver koder for en markant reporter gen: i én, NP åben læsning ramme (ORF) blev erstattet med den grønt fluorescerende protein (GFP)-reportergen (HPOL-I S GFP / GP), og i den anden, ORF den virale glycoprotein precursor (GPC) erstattes med Gaussia luciferase (Gluc) reportergen (HPOL-I S NP / Gluc). En skematisk repræsentation af protokollen er illustreret i fig. 4. Følgende transfektion og infektion protokol er blevet fastlagt for 6 brønds-plader.

  1. OptiMEM-Lipofectamine 2000 (LPF2000) blandingen: Forbered 250 ul OptiMEM medier og afhængigom virusets redning, 10-12 ug af LPF2000 (1 ug / ul) pr transfektion (tabel 1). Et forhold på 2,5 ug LPF2000 pr ug DNA anbefales. Inkuber i 5 - 10 minutter ved stuetemperatur. Tilbered imens plasmidet transfektion blandingen i et separat mikrocentrifugerør (trin 1.2).
  2. Plasmid DNA-transfektion blandingen: Forbered plasmidtransfektion cocktail i et mikrocentrifugerør bruge de anbefalede mængder for hvert virus redning (se tabel 1). Bring det endelige rumfang på 50 pi med OptiMEM.
  3. OptiMEM-LPF2000-DNA-plasmid blanding: Tilføj 250 ul af OptiMEM-LPF2000 blanding (trin 1.1) i plasmidet DNA-transfektion blanding (trin 1.2). Inkuber denne blanding i 20 - 30 minutter ved stuetemperatur. Imens forbereder og tælle 1 x 10 6 Vero celler pr transfektion reaktion. Vero-celler vil blive transficeret i suspension.
  4. Fremstilling af Vero-celler: Vero cells dyrkes i 100 mm skåle. Før start, bringe 1x PBS, DMEM 10% FBS 1% PS medier, og trypsin-EDTA blandingen til 37 ° C.
    1. Vask cellerne to gange med 5 ml 1x PBS.
    2. Trypsinisér celler med 1 ml trypsin-EDTA og vent cellerne detach (ca. 5 min). Bankes let være nødvendig for fuldt ud at frigøre cellerne fra skålene.
    3. Omhyggeligt, cellerne i 10 ml DMEM 10% FBS 1% PS i et 15 ml centrifugerør.
    4. Centrifuger cellerne i 5 minutter ved 1.000 rpm i en centrifuge.
    5. Cellerne i 10 ml DMEM 10% FBS 1% PS og tælle celler ved hjælp af et hæmocytometer og justere koncentrationen til 1 x 10 6 celler / ml. Det blev observeret, at 0,5 - 1 x 10 6 Vero celler pr transfektion gav de bedste resultater.
  5. Bland LPF2000/DNA og celler: Efter 20 - 30 min stuetemperatur inkubation (trin 1.3), 1 ml Vero celler (1 x 10 6) (trin 1.4) føje tilden OptiMEM-LPF2000-DNA-plasmid blandingen og inkuberes i 5 minutter ved stuetemperatur.
  6. Frø LPF2000/DNA-cell blandes i 6-brønds-plader: Tilsæt DNA-LPF2000-Vero blanding (trin 1.5) i brøndene på 6-brønds plade. Ryst 6-brønds-plade og lad transfektion inkuberes natten over i inkubatoren ved 37 ° C og 5% CO2.
  7. Skift transfektion medium: Cirka 16-24 timer efter transfektion, fjerne transfektions medier, tilsættes 2 ml infektion medier og inkuberes transfekterede celler i yderligere 48 timer.
  8. Cell passage: Efter 48 timers inkubation i infektion medier, vævskultursupernatant (TCS) fjerne og passere transfekterede celler i en 100 mm skål. TCS sjældent indeholder infektiøst virus, fordi de transficerede celler har brug for yderligere inkubation for at generere viruspartikler. For cellen passage:
    1. Vask cellerne to gange med 2 ml 1x PBS.
    2. Trypsinisér cellerne w ed 0,5 ml trypsin-EDTA og vent cellerne løsnes.
    3. Cellerne i 1 ml DMEM 10% FBS 1% PS i et 1,5 ml mikrocentrifugerør.
    4. Centrifuger cellerne i 5 minutter ved 5.000 opm, 4 ° C i en mikrocentrifuge.
    5. Omhyggeligt opblande cellerne i 1 ml infektion medier og overføre cellerne til en 100 mm skål. Bring op det samlede volumen i pladen, med infektiøse medier, til 8 ml, en tilstrækkelig mængde til at forhindre udtørring af celler såvel som til koncentrering af virusset.
  9. Ryst 100 mm skål og fortsætte inkubation af Vero-celler i inkubator ved 37 ° C og 5% CO2 i 72 timer.
  10. Indsamling af TCS: Efter 72 timers inkubation TCS samle i et 15 ml centrifugerør. Fjernelse af cellerester ved centrifugering i 5 minutter ved 2.500 rpm i en centrifuge. Infektiøs arenavirus findes i FKS, så fjerne fra cellerester pelleten og opbevares FKS ved -80 ° C.
le "> 2.. Bekræftelse af rekombinant arenavirus Rescue

Påvisning af en vellykket redning af rLCMV og rCandid # 1 er opnået via et fokus danner enhed (FFU) immunofluorescensassay (IFA). For vildtypevirus redning bruger vi antistoffer specifikke for den virale NP. Den r3LCMV og r3Candid # 1 indkode to reportergener (GFP og Gluc), således at viral påvisning og titrering uden brug af antistoffer ved fluorescensmikroskopi (GFP) og / eller luminescens (Gluc).

  1. Bekræft vildtype rekombinant arenavirus redning: Dagen før titreringen, vaskes Vero-celler to gange med PBS, Trypsinisér og forberede 96-brønds plader for at nå 80-90% sammenflydning næste dag (4 x 10 4 celler / brønd). Ryst forsigtigt pladerne med hånden for at få en ensartet fordeling af cellerne. Kultur cellerne natten over i 37 ° C inkubator med 5% CO2. Kontroller celler under mikroskop for at bekræfte et monolag, før du fortsætter med infektionen:
    1. Serielt fortyndet (10 gange fortyndinger) virus-holdige FKS udvundet fra de transficerede celler i 100 mm skål (trin 1.10) i OptiMEM.
    2. Fjern medier fra seedede Vero celler, vaskes to gange med 50 pi 1x PBS, og inficere celler med 50 ul af seriefortyndet virus (trin 2.1). Inficere celler i 1,5 timer ved 37 ° C og 5% CO2.
    3. Efter infektion, fjerne virus inokulum, tilsættes 100 ul infektion media / brønd og inkuberes cellerne i 16-18 timer. Viral re-infektion kan forekomme efter 18 timer inkubation, hvilket kan resultere i en overvurdering af de virustitere.
    4. Ved 16-18 timer efter infektion, skal du fjerne TCS fra hver brønd og fikseres cellerne med 4% formaldehyd fortyndet i 1x PBS, i 15 min ved RT.
    5. Dernæst fjerner fikseringsopløsning og permeabilisere cellerne med 0,1% Triton X-100 fortyndet i 1x PBS i 10 minutter ved stuetemperatur.
    6. Aspirer permeabilization opløsningen, derefter vaskes cellerne 3 gange with 1x PBS.
    7. Blokere cellerne med 2,5% albumin bovint serum (BSA) i 1x PBS (blokerende opløsning) i 1 time ved stuetemperatur. Alternativt kan cellerne blokeret natten over ved 4 ° C og fortsatte med antistof inkubation den følgende dag.
    8. I mellemtiden forberede det primære antistof. Fortynde LCMV-og Candid # 1-specifikke primære antistoffer i blokerende opløsning, og derefter centrifugeres antistof / blokerende opløsning i 15 minutter ved 3.500 rpm. Det monoklonale anti-LCMV NP antistof klon 1.1.3 (1:30 fortynding) 16 og det monoklonale anti-JUNV NP antistof SA02-BG12 fra BEI Resources (1:500 fortynding) kan anvendes til påvisning af rLCMV og rCandid # 1 hhv.
    9. Efter 1 times inkubation, opsug blokerende opløsning og tilsættes 50 pi af det primære antistof til cellerne og inkuberes i 1 time ved 37 ° C.
    10. På dette tidspunkt, fortyndes det sekundære antistof i blokerende opløsning, og derefter centrifugeres antistof / blokerende opløsning i 15 minutter ved 3.500 rpm. Polyklonal kanin-anti-muse IgG FITC sekundært antistof til påvisning af primære monoklonale antistoffer blev anvendt til at opnå billeder observeret i fig. 5.
    11. Efter 1 times inkubation, aspireres det primære antistof, vaskes 3 gange med 1x PBS, og tilføje det sekundære antistof i 30 min ved 37 ° C.
    12. Efter 30 minutters inkubation, det sekundære antistof aspirere og vaskes 3 gange med 1x PBS. Cellerne er nu klar til at blive observeret ved hjælp af fluorescensmikroskopi til både bestemme succes viral redning og titrering ved at tælle fokus-dannende enheder pr ml (FFU / ml).
  2. r3LCMV og r3Candid # 1 viral redning: Da disse vira udtrykke to reportergener, deres redninger kan overvåges ved fluorescensmikroskopi til påvisning GFP-ekspression eller Gluc udtryk i FKS. Rescue kan også bekræftet ved ekspression af Gluc i FKS. At titrere trisegmented vira, vi følger trin 2.1 til 2.1.4, men cellerne behøver ikke at be fastgjort til bestemme en succesfuld viral redning grund af GFP-ekspression. Titrering af virus vil blive bestemt ved at tælle FFU / ml. At bestemme vellykket viral redning af Gluc udtryk, Gluc ekspression fra FKS kan måles ved hjælp af en Gluc assaykit (Biolux Gaussia Luciferase Assay kit, New England Biolabs). Med henblik herpå:
    1. Pipette 100 ul FKS i en 96-brønds hvid plade (Fladbundede mikrotiterplader, Fisher Scientific).
    2. Opsæt luminometer (LumiCount, Packard Biosciences).
    3. Tilføj 50-100 pi Gluc Assay opløsning (som anbefalet af producenten) til hver prøve og måle Gluc reporter genekspression med luminometeret. Som en negativ kontrol blev Gluc udtryk for FKS fra vildtypevira inficerede celler måles.

3.. Passage af vævskultursupernatanter

Viral redning afhænger transfektionseffektiviteter. Vero-celler har vistat have lavere transfektionseffektiviteter end andre cellelinjer 14.. Hvis virustitere i FKS er lave, inficere friske Vero-celler ved en multiplicitet af infektion (MOI) på 0,01 (LCMV) eller 0,1 (Candid # 1) i 72 timer til at forstærke virussen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vellykket redning af en rekombinant vildtype arenavirus vil blive bekræftet ved tilstedeværelsen af virale antigener ved hjælp af IFA (figur 5). I tilfælde af rekombinante trisegmented vira, kan vellykket viral redning vurderes ved at observere GFP-ekspression ved fluorescensmikroskopi (Figur 6A). Vellykket redning vil blive yderligere bekræftet ved at vurdere Gluc udtryk (figur 6B). Repræsentative resultater illustrerer vellykket redning af vildtype og trisegmented arenavirus blev opnået ved anvendelse af ovenstående angivne protokol.

Figur 1
Figur 1. Arenavirus genom organisation og virion-struktur. Arenaviruses er indhyllet, negative-sense RNA-virus med bisegmented genomer 3. Hvert segment bruger en ambisense kodningsstrategi at styre syntesen af ​​to viral Proteins i modsat retning 3.. Large (L) segment (7,2 kb) koder for RNA-afhængige-RNA-polymerase (L), og den lille ring finger protein (Z), der har matrix-lignende funktioner, herunder dirigere den spirende proces 3.. The Small (S) segment (3,5 kb) koder for glycoprotein forstadium (GPC) og nukleoprotein (NP). GPC er posttranslationelt forarbejdes til GP-1 og GP-2, der associerer for at danne glycoproteinkompleks (GP), som udgør pigge på overfladen af virion struktur er ansvarlig for receptorgenkendelse og celleindtastning 17, 18. NP encapsidates den virale RNA (vRNA) genom og sammen med L proteinform de virale ribonucleoproteins (vRNPs), som er de minimale komponenter til viral replikation og transskription 12.. IGR: intergeniske region.

Figur 2
Figur 2. Arenavirus rescue plasmider. Diagram af de anvendte plasmider til frembringelse af rekombinant arenavirus i Vero-celler. Protein udtryk pCAGGS plasmid anvender kylling β-actin-promotoren og kanin β-globin polyadenylerings (Pa) signalsekvenser at styre syntesen af virale L og NP 4, 7. CMV-IE-enhanceren: cytomegalovirus immediate early enhanceren. Intron: kylling β-actin-intronsekvens. Den HPOL-I plasmider benytter den humane polymerase I-promotoren og murine polymerase terminatorsekvenser at styre syntesen af ​​de virale RNA segmenter. Både pCAGGS og HPOL-I plasmider er ampicillinresistente (Ampr).

Figur 3
Figur 3. . Vildtype og trisegmented arenavirus redning i den sorte ovale er plasmiderne kræves til generering af rekombinante vildtype arenavirus: pCAGGS NP og L, og HPOL-I S og L. NP og L kræved at initiere viral transskription og replikation. Den HPOL-I S og L direkte intracellulær syntese via pol-I, S og L antigenomiske RNA-species. I den røde ovale er plasmiderne nødvendige for generering af trisegmented arenaviruses: pCAGGS NP og L, samt HPOL-I L plasmid, som er de samme som dem beskrevet for vildtype-arenavirus redning. Den HPOL-I S adskilles i to plasmider: i en plasmid, der er NP erstattet med GFP (HPOL-I S GFP / GP), og i den anden plasmid Er GP erstattet af Gluc genet (HPOL-I S NP / Gluc ).

Figur 4
Figur 4.. Arenavirus redning protokol. Arenavirus redning sker i Vero-celler under anvendelse af en 6-brønds plade-format. Kort fortalt Vero-celler transficeret i suspension på dag 1 under anvendelse af Lipofectamine 2000. Ved 24 timer efter transfektion, er mediet erstattet med frisk infektiøse medier. Transficerede celler inkuberes i yderligere 48 timer og derefter opskaleret i en 100 mm skåle (dag 4). Vero-celler i 100 mm skåle inkuberes i yderligere 72 timer. På dag 7 efter transfektion FKS samles for viral påvisning ved enten IFA (rLCMV og rCandid # 1) eller fluorescens mikroskopi (r3LCMV og r3Candid # 1), efter infektion i friske Vero celler. Hvis de virale titere er lavere end forventet, kan FKS kan anvendes til at inficere friske Vero-celler at opformere virussen.

Figur 5
Figur 5. Bekræftelse af en vellykket vildtype viral redning. FKS fra celle passage (100 mm skåle) anvendes til at inficere friske Vero-celler i 96-brønds plader. På 24 timer efter infektion, celler fast, permeabiliseres, og blokeret før farvning med LCMV-eller Candid # 1-specifikke antistoffer. Tilstedeværelse af virale antigener er observeret ved hjælp af fluorescensmikroskopi. Skalapanelerne, 100 um.

telt "fo: keep-together.within-page =" altid "> Figur 6
Figur 6.. Vellykket redning af trisegmented vira. Rekombinant trisegmented LCMV (r3LCMV), og Candid # 1 (r3Candid # 1) indkode både GFP og Gluc. Vellykket viral redning kan hurtigt bestemmes ved fluorescensmikroskopi (A). Gluc reporter-genekspression kan anvendes som en sekundær bekræftelse af viral redning. Fold induktion blev bestemt ved normalisering af gluc luminescens værdier vildtype virusinfektioner (B). Skalapanelerne, 100 um.

Tabel 1
Tabel 1. Lipofectamine / plasmid DNA-koncentration for arenavirus redning. Anbefalet DNA og LPF2000 koncentrationer til generering af rekombinant WilD-type og trisegmented arenaviruses i Vero-celler er vist.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Generering af rekombinante arenaviruses hjælp plasmid-baserede teknikker til omvendt genetik er blevet en udbredt metode til undersøgelse af mange forskellige facetter af arenavirus biologi. Her har vi dokumentere en afgørende forbedring af det nuværende system ved at udføre arenavirus redninger i Vero-celler, der giver mulighed for den potentielle produktion af FDA-godkendte vaccinekandidater mod arenaviruses og vaccine vektorer mod andre smitsomme sygdomme.

De eksperimentelle involveret procedurer er generelt godt etableret og bør ikke give anledning til store forhindringer. Der er dog flere faktorer, der bør overvåges nøje for at sikre en konsekvent succes. Korrekt vedligeholdelse af Vero-celler er afgørende for en succesfuld viral redning. Desuden er det bydende nødvendigt at have gode plasmidpræparater at generere rekombinante arenavirus (se Protokol for korrekt celle vedligeholdelse og plasmid forberedelse). For at redde rLCMV og rCandid # 1 vildtype eller deres trisegmented versioner anbefales det tre uafhængige transfektioner for hver rekombinant virus for at øge sandsynligheden for en vellykket redning, da Vero celler ikke er let transfekteres 14.. Hvis mere end en rekombinant virus redning forsøges, skalere følgende trin i overensstemmelse med antallet af vira, der skal reddes. Som en negativ kontrol, omfatter vi en transfektion i fravær af pCAGGS NP (-pCAGGS NP).

Da LCMV-og Candid # 1-inficerede celler ikke vises klassiske cytopatisk effekt (CPE), succesfuld viral redning af vildtype rLCMV og rCandid nr.1 vira skal vurderes gennem påvisning af infektiøst afkom, hvilket kunne ske ved hjælp af en klassiker plakassay eller via IFA. Vi anbefaler brugen af ​​IFA over klassiske plakassay fordi de førstnævnte kan være afsluttet inden for 24 timer i stedet for de 5 - 6 dage kræves for udvikling af plaques. Den r3LCMV eller r3Candid # 1 reddet indkode to reportergener (GFP og Gluc), således at viral påvisning og titrering uden brug af antistoffer ved fluorescensmikroskopi (GFP) og / eller luminescens (Gluc). Som i redningen af ​​rekombinant LCMV og Candid # 1 vildtype redning, vil et mislykket trisegmented virus redning resultere i manglende fluorescerende Vero celler ved podning med TCS fra transficerede celler.

Eftersom S og L segmenterne er drevet af den humane polyermase I-promotoren, kan denne redningssystem anvendes i andre humane celler. Faktisk har vi også succes skabt både rekombinant vildtype og trisegmented rLCMV og rCandid nr.1 virus i 293T humane embryonale nyreceller ved høj virkningsgrad. Derudover transfektion i cellemonolag resulterede også i virus redning, omend ikke så effektivt som ved transfektion Vero og 293T-celler i suspension. Med hensyn til påvisning af vildtype-LCMV og Candid # 1 viral redning, kunne primære antistoffer mod andre virale proteiner også anvendes. Itilfælde af R3 vira, kunne vi påvise Gluc ved luminescens i stedet for GFP-ekspression. Alternativt kan andre reportergener anvendes i stedet for Gluc og GFP 5..

Vores virus rednings-systemet har vist sig at være yderst effektiv i vore hænder, og her giver vi de bedste transfektionsfremgangsmåder vilkår. Det anbefales at bruge de angivne mængder af plasmider. Hvis virus redning udføres i andre humane cellelinjer, mængden af ​​celler, DNA og / eller LPF2000 bør afprøves.

Generering af vildtype-og trisegmented arenavirus anvendelse af plasmid-baserede revers genetik i Vero-celler vil give mulighed for at studere flere aspekter af biologi arenavirus samt for den fremtidige udvikling af FDA-godkendte vacciner og vaccine-vektorer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklæret.

Acknowledgments

Vi takker tidligere og nuværende medlemmer i JCT og LM-S laboratorier til udvikling og forbedring af arenavirus teknikker til omvendt genetik og plasmider. Vi takker også Snezhana Dimitrova for teknisk support. Det monoklonale antistof rettet mod JUNV NP (SA02-BG12) blev opnået fra BEI Resources (NIAID Biodefense og Emerging Infektioner Research Resources Repository). BYHC blev støttet af Grant Number GM068411 fra Institutional Ruth L. Kirschstein National Research Service Award. EO-R er en Fullbright-Conicyt (BIO 2008) og et Rochester Vaccine Fellowship (2012) modtager. EO-R nuværende støtte ydes af en postdoc Fellowship for Mangfoldighed og Academic Excellence fra Kontoret for Faculty Development & Mangfoldighed på University of Rochester. Forskning i LM-S laboratorium er finansieret af NIH tilskud RO1 AI077719, R21NS075611-01, R03AI099681-01A1, NIAID Centers of Excellence for Influenza Forskning og overvågning (HHSN266200700008C), ogThe University of Rochester Center for Biodefense Immun Modeling (HHSN272201000055C).

Forskning på JCT Laboratoriet blev støttet af tilskud RO1 AI047140, RO1 AI077719 og RO1 AI079665 fra NIH.

Materials

Material and methods
Cell lines
Vero E6 (African green monkey kidney epithelial cells) are maintained in a 37 °C incubator with 5 % CO2 in DMEM 10 % FBS 1 % PS. Cells are available from the American Type Culture Collection (ATCC, catalogue number CRL-1586).

Plasmids
All plasmids, with the exception of hpol-I L, can be grown at 37 °C, for 16-18 hr. We recommend that cultures of the hpol-I L be grown at 30 °C for 24 hr. Plasmids are prepared using a plasmid maxi kit (EZNA Fastfilter Plasmid Maxi Kit, Omega Bio-tek) following the manufacturer's recommendations and stored at -20 °C. The concentration of the purified DNA plasmid is determined by spectrophotometry at 260 nm, with purity being estimated using the 260:280 nm ratio. Preparations with 1.8-2.0 260:280 nm ratios are considered appropriate for virus rescue purposes. Additionally, plasmid concentration and purity should be confirmed with agarose gel electrophoresis.

Viruses
The described protocol for rescuing rLCMV (Armstrong 53b) and rCandid#1 can be executed under biosafety level (BSL) 2 conditions. Contaminated material, including TCS and cells should be sterilized before disposal. Rescue of other arenavirus may require higher BSL facilities so proper safety/security measures must be followed.

Tissue culture media and solutions
DMEM 10 %FBS 1 %PS: 445 ml Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), 50 ml of Fetal Bovine Serum (FBS), and 5 ml of 100X Penicillin/Streptomycin (PS). Store at 4 °C. This media will be used for maintenance of Vero cells.

Infectious Media: 2-to-1 mixture of OptiMEM and DMEM 10 %FBS 1 %PS. Store at 4 °C. This media will be used during viral infections.

10X Phosphate buffered saline (PBS): 80 g of NaCl, 2 g of KCl, 11.5 g of Na2HPO4.7H2O, 2 g of KH2PO4. Add ddH2O up to 1 liter. Adjust pH to 7.3. Sterilize by autoclave. Store at room temperature.
1X PBS: Dilute 10X PBS 1:10 with ddH2O. Sterilize by autoclave and store at room temperature.
2.5 % BSA: 2.5 g of BSA in 97.5 ml of 1X PBS. Store at 4 °C. This is used as a blocking solution for IFA.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Albarino, C. G., Bird, B. H., Chakrabarti, A. K., Dodd, K. A., Flint, M., Bergeron, E., White, D. M., Nichol, S. T. The major determinant of attenuation in mice of the Candid1 vaccine for Argentine hemorrhagic fever is located in the G2 glycoprotein transmembrane domain. Journal of Virology. 85, 10404-10408 (2011).
  2. Barton, L. L. Lymphocytic choriomeningitis virus: a neglected central nervous system pathogen. Clinical Infectious Diseases: an official publication of the Infectious Diseases Society of America. 22, 197 (1996).
  3. Buchmeier, M. J., Peter, C. J., de la Torre, J. C. Arenaviridae: The viruses and their replication. Fields' Virology. Fields, B. N., Knipe, D. M., Howley, P. M. 2, Fifth, 179201827 (2007).
  4. Emonet, S. E., Urata, S., de la Torre, J. C. Arenavirus reverse genetics: new approaches for the investigation of arenavirus biology and development of antiviral strategies. Virology. 411, 416-425 (2011).
  5. Emonet, S. F., Garidou, L., McGavern, D. B., de la Torre, J. C. Generation of recombinant lymphocytic choriomeningitis viruses with trisegmented genomes stably expressing two additional genes of interest. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 3473-3478 (2009).
  6. Fischer, S. A., Graham, M. B., Kuehnert, M. J., Kotton, C. N., Srinivasan, A., Marty, F. M., Comer, J. A., Guarner, J., Paddock, C. D., DeMeo, D. L., et al. Transmission of lymphocytic choriomeningitis virus by organ transplantation. The New England Journal of Medicine. 354, 2235-2249 (2006).
  7. Flatz, L., Bergthaler, A., de la Torre, J. C., Pinschewer, D. D. Recovery of an arenavirus entirely from RNA polymerase I/II-driven cDNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 4663-4668 (2006).
  8. Gunther, S., Lenz, O. Lassa virus. Critical reviews in clinical laboratory sciences. 41, 339-390 (2004).
  9. Harrison, L. H., Halsey, N. A., McKee, K. T., Peters, C. J., Barrera Oro, J. G., Briggiler, A. M., Feuillade, M. R., Maiztegui, J. I. Clinical case definitions for Argentine hemorrhagic fever. Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America. 28, 1091-1094 (1999).
  10. Isaacson, M. Viral hemorrhagic fever hazards for travelers in Africa. Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America. 33, 1707-1712 (2001).
  11. Kerber, R., Rieger, T., Busch, C., Flatz, L., Pinschewer, D. D., Kummerer, B. M., Gunther, S. Cross-species analysis of the replication complex of Old World arenaviruses reveals two nucleoprotein sites involved in L protein function. Journal of Virology. 85, 12518-12528 (2011).
  12. Lee, K. J., Novella, I. S., Teng, M. N., Oldstone, M. B., de La Torre, J. C. NP and L proteins of lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) are sufficient for efficient transcription and replication of LCMV genomic RNA analogs. Journal of Virology. 74, 3470-3477 (2000).
  13. Mets, M. B., Barton, L. L., Khan, A. S., Ksiazek, T. G. Lymphocytic choriomeningitis virus: an underdiagnosed cause of congenital chorioretinitis. American Journal of Ophthalmology. 130, 209-215 (2000).
  14. Murakami, S., Horimoto, T., Yamada, S., Kakugawa, S., Goto, H., Kawaoka, Y. Establishment of canine RNA polymerase I-driven reverse genetics for influenza A virus: its application for H5N1 vaccine production. Journal of Virology. 82, 1605-1609 (2008).
  15. Palacios, G., Druce, J., Du, L., Tran, T., Birch, C., Briese, T., Conlan, S., Quan, P. L., Hui, J., Marshall, J., et al. A new arenavirus in a cluster of fatal transplant-associated diseases. The New England Journal of Medicine. 358, 991-998 (2008).
  16. Rodrigo, W. W., de la Torre, J. C., Martinez-Sobrido, L. Use of single-cycle infectious lymphocytic choriomeningitis virus to study hemorrhagic fever arenaviruses. Journal of Virology. 85, 1684-1695 (2011).
  17. Rojek, J. M., Kunz, S. Cell entry by human pathogenic arenaviruses. Cellular Microbiology. 10, 828-835 (2008).
  18. Rojek, J. M., Sanchez, A. B., Nguyen, N. T., de la Torre, J. C., Kunz, S. Different mechanisms of cell entry by human-pathogenic Old World and New World arenaviruses. Journal of Virology. 82, 7677-7687 (2008).
  19. Sanchez, A. B., de la Torre, J. C. Rescue of the prototypic Arenavirus LCMV entirely from plasmid. Virology. 350, 370-380 (2006).

Tags

Virology infektion Infektionsmedicinsk molekylærbiologi cellebiologi medicin medicoteknik vira arenaviruses plasmid transfektion rekombinant virus omvendt genetik teknikker vaccine / vaccinevektor frøudvikling kliniske applikationer
Fremstilling af rekombinant arenavirus for Vaccine Development i FDA-godkendte Vero celler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cheng, B. Y. H., Ortiz-Riaño,… More

Cheng, B. Y. H., Ortiz-Riaño, E., de la Torre, J. C., Martínez-Sobrido, L. Generation of Recombinant Arenavirus for Vaccine Development in FDA-Approved Vero Cells. J. Vis. Exp. (78), e50662, doi:10.3791/50662 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter