Antistoffarging i Published: October 14, 2013 doi: 10.3791/50664

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Janet S. Duerr¹

¹Department of Biological Sciences, Ohio University

Summary

"Fryse-cracking", en fremgangsmåte for å utsette det indre vev av nematode C. elegans til antistoffer for protein lokalisering, er demonstrert.

Abstract

Å farge C. elegans med antistoffer, må den relativt ugjennomtrengelig hårstråene omgås ved kjemiske eller mekaniske metoder. "Freeze-cracking" er en metode som brukes til å fysisk dra hårstråene fra nematoder ved å komprimere nematoder mellom to heft lysbilder, fryse dem, og dra lysbildene fra hverandre. Fryse-cracking er en enkel og rask måte for å få tilgang til vev uten kjemisk behandling, og kan brukes med en rekke fiksativ. Men det fører til tap av mange av prøvene og den nødvendige kompresjon mekanisk forvrenger prøven. Praksis er nødvendig for å maksimere utvinningen av prøver med god morfologi. Fryse-cracking kan optimaliseres for spesifikke fiksering forhold, gjenvinning av prøver, eller lav ikke-spesifikk farging, men ikke for alle parametre samtidig. For antistoffer som krever svært harde festeforhold og tolerere de kjemiske behandlinger for å kjemisk permeabilize skjellaget, treatment av intakte nematoder i løsning kan være å foretrekke. Dersom antistoffet krever en lettere løsning, eller dersom de optimale fiksering betingelser er ukjente, gir fryse-cracking en meget nyttig måte å raskt analysen antistoffet, og kan gi spesifikke subcellulære og cellulær lokalisering informasjon for antigenet av interesse.

Introduction

For å bestemme den cellulære og subcellulære lokalisering av proteiner, har forskere tradisjonelt merket vev med antistoffer valgt å spesifikt gjenkjenne spesielle proteiner ^en. I noen modellorganismer slik som C. elegans, har antistoffarging ofte blitt erstattet av molekylærgenetiske teknikker, som gir resultater raskere. Disse omfatter transformere organismer med konstruksjoner som består av gen-fusjoner mellom promoter og kodende regioner av genet av interesse og grønt fluorescerende protein. Imidlertid molekylære teknikker er gjenstand for en rekke gjenstander, inkludert problemer med å kjenne den virkelige promoter og endringer i ekspresjon av konstruksjoner med høy kopitall (de vanlige teknikkene i C. elegans) ^2,3. Derfor, farging med antistoffer er fortsatt et mål for mange forskere som studerer protein funksjon in vivo.

Beising vev med antistoffer kan være vanskelig, ettersom entibodies kan bare anerkjenne deres antigen i en bestemt konformasjon ^en. For eksempel kan antistoffer gjenkjenne bare denaturert eller intakt antigen fast på en bestemt måte, og kan ikke gjenkjenne antigen in situ. Problemet med antistoffarging i nematoder blir forverret av det faktum at hårstråene av nematode danner en relativt ugjennomtrengelig barriere, blokkerer tilgang av antistoffer til vev.

Det finnes flere ulike metoder som brukes for antistoffarging i C. elegans (anmeldt i vår tidligere arbeid ^4). Å farge intakte 'ormer,' ble metoder utviklet for å fryse og tine i en relativt vanskelig fiksativ (formaldehyd eller glutaraldehyd), fryse-tine sykluser bidra til å knekke hårstråene for å tillate rask penetrering av fiksativ ^fem. Etter fiksering ble hårstråene permeabilized for å tillate gjennomtrengning av antistoffet, inkludert fremgangsmåter behandling med reduksjonsmidler, kollagenase eller begge deler ^5-7. Disse treatments bevart morfologi, men ofte redusert eller ødelagt antistoff anerkjennelse. Alternative metoder omfatter disseksjon ⁸ å tillate antistoff penetrasjon.

"Freeze-cracking" er en måte å få tilgang til det indre av den semi-intakt ormen å tillate antistoffarging ^9-10. Fryse-cracking kan utføres med en rekke festeforhold samtidig unngå kollagenaseklassene og reduksjon behandlinger. De nematoder er plassert mellom to lim lysbilder, frosset, og deretter lysbildene er separert, etterlot det meste av nematode på bunnen lysbilde og mye av skjellaget på toppen lysbilde. Den nedre glide kan plasseres i fiksativ og hele glide med holdes nematoder blir overført gjennom antistoffarging prosedyre. Metoden gjør presentere to store problemer. For det første er det vanskelig å anvende den riktige mengde av trykket er nødvendig for å splitte de nematoder uten alvorlig å deformere dem. For det andre, er mange av ormer vil ikke stick til enten lysbilde, og vil gå tapt i fiksativ eller skyllinger. Imidlertid, med de riktige lysbilder og praksis, metoden vil raskt gi nematoder med rimelig morfologi som kan brukes sammen med et bredt utvalg av fiksativer og antistoffer.

Fremgangsmåten kan varieres noe, avhengig av målet for experimenter. Ved farging av enkelt-nematoder er ønsket (for eksempel for å bestemme om en enkelt transformant har endret antistoff-farging), glir deretter med maksimal adhesjon (men høyere bakgrunnsfarging) kan benyttes, for eksempel laboratorie-fremstilt lysbilder med ekstra polylysin (se nedenfor). For formaldehyd eller glutaraldehyd fiksering, bør høyere vedheft lysbilder (laboratorie forberedt polylysin lysbilder) brukes, siden nematoder holder seg mer dårlig til polylysin etter disse fikseringer. Dersom vill-type nematoder blir fiksert med metanol og / eller aceton, glir da med lavere klebeevne og lavere bakgrunnsfarging skal brukes (kommersielt eller laboratory forberedt lysbilder). Hvis en rekke antistoffer og fiksativ blir brukt i laboratoriet, kan være forberedt på et utvalg av lysbilder på forhånd og lagres inntil nødvendig.

Etter å ha tilgang til nematode vevet har blitt oppnådd, antistoff fargingsprosedyrer følge standard-fremgangsmåter (med lengre inkubasjoner som er karakteristisk for vevet i stedet for cellene ^1,11).

Protocol

MERK: Flere protokoll trinn presenteres med alternativer for oppsett og klargjøring avhengig av de konkrete forholdene i eksperimentet. For disse tilfellene, er alternative fremgangsmåten presentert som A, B, C osv. Den protokoll med alternative fremgangsmåten er skissert i figur 1..

En. Utarbeidelse av polylysin Coated Slides

Tre forskjellige typer av lysbilder kan anvendes, avhengig av det ønskede forhold mellom enkel fremstilling, relative adhesjon, og ikke-spesifikk binding av antistoffet. Detaljer om lysbilde forberedelse alternativer er gitt nedenfor i trinn 1A-1C for å øke vedheft og kompleksitet. Glir fremstilt ved disse forskjellige fremgangsmåter kan benyttes sammen i et enkelt eksperiment.

1A. Ingen lysbilde forberedelse

Kommersielt tilgjengelige polylysin belagt lysbilder gir dårlig feste og lav bakgrunn.

1B. Slide preparation optimal for metanol-aceton fiksering

Medium vedheft og lav bakgrunn.

1. Forbered en polylysin løsning for dipping lysbildene: Legg 400 mg av meget høy molekylvekt (150 000 - 300 000 D) poly-L-lysin til 200 ml dobbelt destillert vann. Tilsett 2 ml 10% natrium-azid lager (sluttkonsentrasjon 0,1%) som et konserveringsmiddel. FORSIKTIG: tørr natriumazid er reaktiv og alle former er giftige. Bruk maske og hansker mens veier pulver til å lage 10% lager i dobbelt destillert vann.
2. Tørk singel end frostet glassplater med lofri kluter, fjerne flekker og partikler. Dette bør gjøres selv på lysbilder kjøpt med betegnelsen "forvasket."
3. Place glir tilbake-til-back i en glassholder, Coplin krukke eller andre skinnen flekker container, holde frostet kanter opp og ikke helt perfekt justert (for å gjøre senere separasjon lettere). Plasser skive holder i begerglass med 70% etanol (reagenskvalitet alkohol ikke er nødvendig) med 1% HCl i distilnet vann eller fylle flekker krukke til nivå av frosting. Fjellskred i løsningen i minst 5 min. FORSIKTIG: Denne løsningen er etsende, bruk hansker. NB: Denne oppløsningen kan brukes om igjen flere ganger (opptil flere måneder).
4. Skyll glir i rennende destillert vann i 1 min.
5. Tørre glir fullstendig i et støvfritt miljø, enten ved å plassere i et 40-60 ° C ovn i 30-60 min, eller ved å holde over natten ved romtemperatur.
6. Inkuber lysbilder i polylysin løsning (som dekker unfrosted deler) på rocker i 15 min.
7. Gjenta tørking av lysbilder.
8. Gjenta polylysin løsning inkubasjon og tørketrinn.
9. Separer lysbilder ved hjelp av en smal metallgjenstand, for eksempel en tynn veier slikkepott. Hvis de er skikkelig holdt, de er vanskelige å separere. Bruk egnet verneutstyr (vernebriller) og arbeide på benken toppen papir (som skal kastes etter bruk), siden små biter av glass kan fly løs når lysbildene er separert.
10. Lagre lysbilder i ren(Støvfritt) lysbilde boksen ved 4 ° C inntil nødvendig.

1C. Skyv forberedelse optimal for formaldehyd fiksering

Høyeste vedheft men høy bakgrunn.

1. Plasser lysbilder tilberedt med metoden 1B flat i et støvfritt, ovn-safe fatet (for tørking i ovn) eller på en flat støvfritt underlag (for lufttørking).
2. Plasser en 20-60 mL dråpe av polylysin løsning på midten av hvert lysbilde.
3. Tørre glir helt i ovn eller ved romtemperatur. Polylysinet vil etterlate bleke ovaler som det fordamper. Disse ovaler er svært lim. Dessverre har de også binder seg til de primære og sekundære antistoffer, selv etter blokkering.
4. Lagre lysbilder i ren (støvfritt) lysbilde boksen ved 4 ° C inntil nødvendig.

2. Utarbeidelse av Frozen nematode Slides

Forbered nematoder for farging av helt skylle fri for bakterier ved bruk av metoden 2A (for plater av nematoder) eller2B (for enkelte nematoder).

2A. Utarbeidelse av lysbilder fra plater av nematoder

1. Plasser et flatt stykke metall på tørris til prechill.
2. Bruk destillert vann og et glass pipette (reduserer tap av ormer) eller micropipette å skylle ormer fra NGM plate med bakterier inn i en 1,5 ml mikrosentrifugerør. Plater kan synkroniseres eller blandet aldre, ikke bruk plater med mange dauers (vanskelige å knekke) eller sultet ormer (økt autofluorescence) Med mindre det er nødvendig.
3. Skyll ormene 3-4x med destillert vann inntil fritt for bakterier. (For å redusere tap av ormer bruke samme glass pipette.) Til pellets ormer, enten la dem sitte på benken i 3-5 min (for å samle det meste voksne nederst på tube) eller spinne 30 sek på ~ 1000 rpm (~ 500 g) i en bordsentrifuge (for å samle voksne, larve og embryoer).
4. Fjern mesteparten av vannet fra røret med mark, slik at omtrent to ganger volumet av vann som ormer (men minst 25 pl totalt volum).
5. Har like mange vanlige (tørkes, men ikke polylysine behandlede) "topp" lysbilder tilgjengelig.
6. Place ~ 25 mL ormer i vann på "bunnen" vedheftende lysbilde og spre væsken som inneholder de ormer enn det sentrale parti av glide med siden av pipettespissen.
7. La ormer takke med 30 sek til 2 min. Hvis dekselet er tilstrekkelig klebrig, vil endene av ormer stokk som de kontakter lysbildet.
8. Hold den nederste lysbildet i den ene hånden og plassere toppen gli over bunnen lysbilde slik at alle, men de frosne områder er overlappende. Væsken bør holde lysbildene litt fra hverandre, slik at ormer fortsatt flytte litt Ikke la skinnene gli over hverandre -. Dette vrir ormer.
9. Trykk forsiktig rett ned slett på toppen lysbilde, ved å bruke tommelen og pekefingrene på hver hånd. Med den ideelle mengden av press, vil noen av de største hermafroditter på kanten av lysbildene sprekke, mens de fleste av de voksne og larver vil kontakte hvert lysbilde, men forblir intakt.
10. Umiddelbart og forsiktig (uten å skli) satte lysbildene på stykke metall på tørris. Lysbildene bør vises frosset i løpet av ett minutt. Hold på tørris for 5 min før grundig frosset.
11. På dette punktet, kan slides lagres i en merket boks ved -80 ° C i flere dager. (Hvis de holdes uker ved -80 ° C, vil vannet begynne å sublime bort og ormer vil ikke flekker så vel). Hvis lysbilder er lagret ved -80 ° C, la dem 'varme opp' på tørris i 10 min før sprengning.
12. Gå videre til trinn 3 (fiksering).

2B. Utarbeidelse av lysbilder av individuelle nematoder

1. Plasser et flatt stykke metall på tørris til Precåsen.
2. Bruk en orm pick å overføre enkelte nematoder til en dråpe vann på en NGM plate for å frigjøre dem fra bakterier. Nematode (e) bør være godt matet å redusere autofluorescence, hvis mulig. Gjenta overføring til nye flekker av vann etter behov til snekke (e) er fri for bakterier.
3. Etikett frostet side av "bunnen" polylysin lysbilder med uutslettelig blekk og sted lysbilder på disken ved siden av container med tørris, med etikettsiden opp. Har like mange mindre tilhenger "topp" (ubehandlet) lysbilder tilgjengelig.
4. Plasser en 5-10 pl dråpe av vann på området ved den nederste glidedobbelt behandlet med polylysin. Bruk større volum hvis overføringen av flere ormer, for å hindre at vannet fordamper før ferdigstillelse.
5. Overfør ormen (e) til dråpe vann med ormen hakke, bruke mikroskop for å se på som ormer synke ned å ta på den klebrige glideflate. Overfør så få som én orm til så mange som 20 + ormer per dråpe.
6. Hold den nederste sLiDE i den ene hånden og plassere toppen gli over bunnen lysbilde slik at alle, men de frosne områder er overlappende.
7. Umiddelbart og forsiktig (uten å skli eller komprimere) sette lysbildene på stykke metall på tørris. Hold på tørris for 5-30 min. (Ikke oppbevar disse lysbildene lang sikt, som glir lett tørke ut.)
8. Gå videre til trinn 3 (fiksering).

Tre. Fiksering

Bindemiddel er nødvendig for å "fikse" antigenet på plass i cellen, enten ved utløsende ("light fiksering") eller tverrbinding ("hard fiksering") antigen. Fiksering kan forstyrre antigenisiteten; mest kjente antistoffer fungerer best med en spesiell fiksering tilstand. For nye antistoffer, må en rekke festeforhold skal testes.

For en hvilken som helst fiksering, er det første trinnet for å gjøre fosfat-bufret saltløsning. Neste fix lysbilder med nematoder for antistoffarging bruker metode A (lysfastsette ved hjelp av metanol og aceton) eller B (vanskeligere fastsette ved hjelp av formaldehyd eller glutaraldehyd).

1. Forbered en steril 10x PBS (fosfat saltvann) lager løsning ved å legge til 80 g NaCl, 2,0 g KCl, 27,2 g Na ₂ HPO ₄ • H ₂ 0, 2,4 g KH ₂ PO _4, 20 ml 10% natriumazid lager. For å gjøre denne stamløsning, veie ut natriumazid pulver slik at 10% løsning i dobbelt destillert vann. Rør saltvann med svak varme til det er oppløst. FORSIKTIG: tørr natriumazid er reaktiv og alle former er giftige. Bruk halvmaske og hansker når du arbeider med tørr natriumazid eller løsninger.
2. Let saltvann kule (Tris pH er temperaturfølsom), deretter pH til 7,2 med 1 til 10 M NaOH. Topp til en L med dobbelt destillert vann og autoklav å sterilisere. Oppbevares i romtemperatur og fortynnet til 1x som nødvendig med sterilt dobbelt destillert vann. FORSIKTIG: NaOH er etsende - bruk hansker under bruk.

3A. Lett fikse ved hjelp av metanol-aceton

1. Sett 100% metanol, 100% aceton, og 1 x fosfatbufret saltvann (PBS) i fargings krukker på is for å prechill i minst 10 min. FORSIKTIG: Metanol og aceton er giftig, bruk hansker.
2. Ta et par bunn-og topp lysbilder fra tørris, raskt vri dem fra hverandre, og umiddelbart senkes ned "bunnen" slide i iskald metanol i 2 min. "Toppen" slide kan kastes.
3. Overfør lysbilder fra metanol til is kald aceton for 4 min. Hvis skinnene hadde mange ormer, vil de fleste (90%) faller av i reparasjonen, selv med de best preparerte lysbilder. Hvis enkelt orm lysbilder ble skikkelig forberedt, bør ormer holde levd.
4. Plasser eller dyppe lysbildene i glasset med PBS (for å skylle av fiksativ) og fortsett til trinn 4 (flekker).

3B. Hard fix bruker formaldehyd eller glutaraldehyd

1. Fortynne reagenskvalitet formaldehyd eller glutaraldehydløsning i 1x PBS til 0,5-4% endelig konsentrasjon. Alikvoter (1,5 ml) may settes tett avkortet ved -20 til -30 ° C, tines alikvoter på is like før bruk. MERK: formaldehydløsninger brytes ned over tid og med eksponering til luft. FORSIKTIG: formaldehyd og glutaraldehyd er giftig, bruk hansker og arbeide i panseret.
2. Ta et par bunn og topp lysbilder fra tørris, raskt vri dem fra hverandre, og umiddelbart plassere "bunnen" slide med ormer i flat form med lokk. (Den øverste lysbilde kan kastes).
3. Umiddelbart pipette 200 mL giftig fiksativ over midten av området av lysbildet med ormer. Fiksativ vil delvis fryse på plass, deretter smelte å dekke et større område av raset.
4. Hvis ormer ikke er helt dekket med fiksativ, umiddelbart og forsiktig legge mer fiksativ bruker en micropipette. Ikke la fiksativ til å flyte over kanten av rasgropa.
5. Dekk formen med et lokk og la stå i 10 min til over natten i romtemperatur. Vær sikker på at parabolen er fuktet hvis lengre inkubasjoner are brukes - dette kan gjøres ved å legge brettet våte lofri kluter til parabolen. Ikke la kluter berøre lysbildene.
6. Etter fiksering er fullført, nøye pipette fiksativ med løse ormer inn i en 1,5 ml tube og dyppe raset i en flekker krukke med PBS.
7. Spin røret med ormer som løsnet ved høy hastighet i 30 sekunder til pellet. Skyll ormer to ganger med PBS, deretter behandle parallelt med ormer på skinnene (gjør fremgangsmåten i mikrofugerør, i stedet for på objektglass).
8. Gå videre til trinn 4 (flekker).

4. Antistoffarging

Den antistoffarging protokoll er lik standardprotokoller for en hvilken som helst vev på objektglass. Denne protokollen er den samme for alle glir uavhengig av blandingen i trinn 1-3.

1. Forbered Antistoff-buffer ved å blande 700 ml dobbelt destillert vann, 100 ml 10 x PBS, 5 ml Triton X-100 (0,5% endelig), 2 ml 0,5 M EDTA pH 8 (1 mM endelig), 1 g BSA (0,1% endelig) 5 ml 10% natrium-azide løsning (0,05% finalen). pH til 7,2 med HCl, og deretter legge dobbelt destillert vann til en l; oppbevares ved 4 ° C.
2. Forbered Block ved rekonstituering esel serum med dobbelt destillert vann, deretter tilsetning av 5 ml serum i 45 ml antistoffbuffer (sluttende 10% serum).
3. Forbered primære og sekundære Antistoff Solutions ved å fortynne antistoff i antistoff buffer pluss 1% BSA. Anbefalte fortynninger er 1:50-1:2,000 for primære antistoffer og 1:1,000-1:5,000 for sekundære antistoffer (Cy3or OG488 konjugerte esel antistoffer mot arter som brukes til å heve primære antistoff).
4. Forbered DAPI lager ved å blande 2,5 mg / ml i dobbelt destillert vann; butikk i 8 ul delprøver fryses ved -30 ° C. FORSIKTIG: DAPI er en giftig DNA bindende fargestoff, bruk hansker mens veier og utlevering i mengdene.
5. Forbered 10 ml Monterings medium ved å blande 200 mg n-propylgallat, 0,3 ml 1 M Tris pH 9, 2,7 ml dobbelt destillert vann i et 15 ml konisk rør. Oppvarm til 65 ° C i ca 10 minutter til det er oppløst.Legg 7 ml glyserol og en 8 mL delmengde av DAPI og vortex godt. Delmengde medium til 1,5 ml rør, pakk i folie, og oppbevar i mørke ved 4 ° C (både luft og lys dårligere medium - hvis det blir mer gul, kast i Biohazard avfall). FORSIKTIG: n-propyl gallate er en reaktiv antioksidant, hansker mens veier.
6. Overfør lysbilder til en flekker krukke med blokk for en time ved romtemperatur eller over natten ved 4 ° C (over natten å foretrekke for hardt fix). Unngå å riste å unngå å miste ormer.
7. Overføring lysbilder for flekker krukke med primær antistoff eller sted lysbilder flate i en fuktet tallerken og topp hver med 100-500 mL primær antistoff. Inkuber lysbilder over natten ved 4 ° C uten risting.
8. Etter primær antistoff inkubasjon, glir overføring til farging krukke av PBS.
9. Filter blokk gjennom trakt foret med filterpapir og lagres ved 4 ° C, hvis sterile filtrerte hver 1-2 uker, kan blokk brukes om igjen for en eller flere måneder. Tilsvarende, filtrere og lagreprimært antistoff ved 4 ° C for senere bruk (i opp til 10 eller flere runder med farging).
10. Skyll glir tre ganger (~ 20 min hver) i antistoff buffer.
11. Plasser glir i sekundært antistoff i en lys-tett fargingsbeholder og inkuberes 4 timer ved romtemperatur eller over natten ved 4 ° C.
12. Overføring lysbilder for flekker krukke av PBS. Filter og lagre sekundært antistoff ved 4 ° C for gjenbruk (for opp til 10 eller flere runder med farging).
13. Skyll glir tre ganger (~ 20 min hver) i antistoff buffer.
14. Transfer glir til PBS og la i PBS (minutter til over natten ved 4 ° C) før du er klar til å montere.
15. Arbeid raskt på individuelle lysbilder, slik at ormer på forsiden av lysbildet bli våt. Fjern ett lysbilde fra PBS, tørke tilbake av lysbildet med en lofri tørk, og legg på kjøkkenpapir.
16. Place ~ 20 mL av monterings mediet over ormer, slik at det er omtrent like deler middels og PBS på lysbilde og tilt lysbilde forsiktig for å blande de to oppløsningene. CAUTION: Montering medium er giftig.
17. Tilt lysbilde slik frostet kanten er lavere og løsningen samler nær frosting, deretter plassere den ene kanten av 24 x 60 mm dekkglass på løsning.
18. Senk forsiktig dekkglass for å minimere luftbobler (som øker bleking og forstyrre visning). Hvis det dannes bobler, løfte kanten av dekk sakte, deretter relower det uten å skyve dekkglass på tvers av ormer.
19. Forsiktig tørke av kanten av raset uten å flytte dekkglass, ved å komprimere kantene med en lofri tørk. Den relativt tørre kanten av rasgropa må være synlig rundt hele kanten av dekk
20. Tett dekkglass med 2-3 lag med neglelakk. Lysbilder kan plasseres på en flat glassholder i løpet av fremstilling og lagring for å beskytte mot lys. Når dekselet er godt forseglet og tørt, rent dekkglass og baksiden av raset.
21. Godt forseglet lysbilder kan bli holdt i mørket i flere dager ved 4 ° C eller uker ved -20 ° C. Over lengre perioder, DAPI staining av DNA og de ​​fleste grønne fargestoffer (f.eks 488 nm eksitasjon) fade. Tett dekkglass med mer neglelakk etter behov, for eksempel etter å ha brukt noe olje nedsenking objektiv.

Representative Results

Når ormer er riktig komprimert, sprakk, og lett fast, kan praktisk talt hele ormen være tilgjengelig for antistoffarging (se figur 2). Plasseringen av kjernen som antydet med DAPI farging indikerer hvilke deler av spiralen er intakte Når ormer er utsatt for en hardere fikseringsmiddel, som for eksempel formaldehyd, kan morfologien av ormen bli forvrengt (sett fra unaturlig bølget utseende Musklene i figurene 3A-D). Et annet vanlig problem er ujevn fiksering eller penetrasjon av bestemte vev. Et eksempel på dette er vist i figurene 3E-H, der muskelen er farget bare i en del av snekken, til tross for at tilstedeværelsen av andre flekker, inkludert DNA-farging, indikerer at i det minste en del av kroppen var tilstede ( dvs. ikke fjernet under fryse cracking). Det resulterende mønster av flekker delvis lett kan identifiseres med praksis, slik at hele distribution av fargingen kan bestemmes selv om en hvilken som helst enkelt orm viser ujevn farging.

Vanlige problemer oppstår med fryse-sprengning ved hjelp av en fiksering tilstand er illustrert i det endelige tallet (figur 4). Det mest vanlige problemet er vridning av prøven på grunn av relativ bevegelse av de to objektglass under kompresjon. Det faktum at hoveddelen av snekken er vridd like posterior i svelget kan sees av morfologien av de fargede vev. Dette bildet viser også problemet med bakgrunnsfarging, på grunn av antistoff stikker til poly-lysin belegg lysbildet. Vær imidlertid oppmerksom på at alle disse bildene ble samlet inn ved hjelp av lysbilder gjort i løpet av de første antistoffarging forsøk på studenter i en cellebiologi laboratoriekurset. Selv med praksis vil mange individuelle ormer vise problemene som sett i figur 4. Men på ett lysbilde, kan ormer som de sett i figur 2 og 3 være løstd og undersøkt.

Figur 1. Omrisset av prosedyrer. Flytskjema som viser fremgangsmåten for å utføre hele fryse-cracking prosedyre. Alternativer for varierte festeforhold og antall ormer er indikert.

Figur 2. Lett fast, godt farget ormer Lederne for to voksne hermafroditter fast med metanol-aceton og merket med flere antistoffer og fargestoffer:. A) Primær antistoff å chatte (choline acetyltransferase) og Cy3-konjugert sekundært antistoff, B) DAPI (blå DNA) , C) Malmgon Grønn 488-anti-GFP (grønt fluorescerende protein), D) viser overlegg (med to kolinerge markører, Cy3-anti-chat og Cy5-anti-VAChT (vesikulært acetylkolin transporter) vist som røde). Dette transgen belastning (PS4657) uttrykker en oversettelse fusjon mellom GFP og AJM-en, finnes på svelg apikale veikryss. Bildene er maksimal projeksjoner av serie confocal bilder; skala bar er 50 mikrometer.

Figur 3. Formaldehyd-forbundet forvrengninger. Formaldehyd faste voksne farget med Cy3-phalloidin (binder trådformede aktin), DAPI (blå DNA), og Oregon Grønn 488-anti-GFP. AD) Fours-bilder av kroppen bare posterior av vulva (helt til venstre) i samme nematode, som viser en unaturlig bølget morfologi grunn av forvrengning iredusert ved fiksering. A) Red-phalloidin viser litt uregelmessig muskel morfologi. B) Nuclei (blå) er jevnt spredt over hele ormen. C) Grønn viser fordelingen av et CED-1 :: GFP fusion protein i plasma membran av gonadisk skjede celle, drevet av lim-7 promoter (stamme MD701). D) Viser overlapping av disse tre fargestoffer. EH) Merking kan variere med ulike fargestoffer på samme nematode. E) Phalloidin (rød) merker bare en del av muskelen på den ene side av snekken. F) Nuclei (blå) er til stede i hele snekke (selv farget med ujevn intensitet). G) Den OG488-anti-GFP etiketter kollagen-19 :: GFP i hårstråene på en side av ormen som mangler farging av de mer sentrale muskelvevet, noe som indikerer at muskelen er tilstede, men ikke setter flekker på den ene overflate. H) Viser overlapping av de tre fargestoffer. Bildene er maksimal projeksjoner av serie confocal bilder; skala barer er 50 mikrometer.

Figur 4. Compression-forbundet forvrengninger. Formaldehyd fast larve farget med A) Cy3-phalloidin (binder trådformede aktin), B) DAPI (blå DNA), C) Oregon-Grønn 488-anti-GFP, D) overlegg. Den vridning i kroppen bare posterior i svelget er åpenbar, da den grønne utførsels cellen og ventral nerveledning kryss over resten av kroppen. Høy bakgrunnsfarging er også tydelig med Cy3-phallodin. Denne stamme uttrykker et VHA-8 :: GFP fusjonsprotein, som ligger hovedsakelig i utførsels cellen. Bildene er maksimal projeksjoner av serie confocal bilder som strakte seg til overflaten av dekselet (som fører til høye bakgrunnsfarging); målestokken er 50 mikrometer.

Discussion

Det fryse cracking protokoll er en av flere metoder for antistoffarging i C. elegans. Den gir en relativt enkel måte å farge ormer, men krever spesifikke reagenser og øve for å oppnå optimale resultater. Kritiske trinn (skissert i figur 1) er: 1) glide preparat (se trinn 1 og 2) manuell kompresjon av nematoder (se trinn 2 og 3) hurtig fiksering (se trinn 3). Først, for å øke adhesjonen av de nematoder til skinnene, er det best å forberede slides med høy molekylvekt (long polymer) polylysin, i stedet for å stole på kommersielt tilberedt lysbilder. Kommersielle lysbilder er belagt med polylysin å tillate celler til å overholde, mens fryse-cracking lysbilder er utformet for å holde seg til skjellaget av hele nematoder. For det andre, er fremgangsmåten for den riktige sammentrykking av ormer mellom skinnene før frysing kritisk. Det krever stødige hender og praksis å trykke lysbildene sammen med riktig mengdetrykk, slik at de enkelte ormer kontakt med begge sider uten å ødelegge deres morfologi. Enten for mye eller for lite komprimering fører til økt tap av ormer under fiksering. Videre behandling er nødvendig for å bevege skinnene på tørris avkjølt overflate for frysing uten å bevege skinnene i forhold til hverandre. Enhver slik bevegelse vil føre til at ormene å rive eller vri. Tredje, som med alle fiksering teknikk, de frosne ormer bør plasseres direkte inn fiksativ før tining. Ellers kan antigen diffuse, gir misvisende informasjon om subcellulære lokalisering. Hvis disse kritiske trinn er alt gjort riktig, for best mulig resultat er det fortsatt nødvendig å skanne flere farget lysbilder å finne ormer med den beste morfologi.

En uunngåelig aspekt ved denne teknikken er at de ormer vil bli komprimert i en dimensjon. Kompresjonen er mest merkbar i voksne, hvor den tilsynelatende diameter av det runde legeme i z-aksen kan være bare 1-4th at sett i x-og y-aksene. Denne komprimeringen en tendens til å avta i mindre larver, og kan være ubetydelig i embryoer. På grunn av måten de levende nematoder flytte under lysbilde forberedelse, de fargede ormer er ofte på sine sider. Dette etterligner orienteringen av ormer på agar-retter, med den sideveis liggende midtlinje som strekker seg ned på midten av de flekker ormen (se figurene 2-4). Således er kompresjons generelt i lateral dimensjon. Selv om dette faktisk gjør standard fluorescerende mikros enklere (mer av prøven vil være i fokus samtidig), betyr det at 3-D rekonstruksjoner ikke vil være nøyaktig.

Som med en hvilken som helst antistoff farging, er det viktig å undersøke spesifisiteten av binding. I de fleste arter, gjøres dette ved kontroller som affinitet tappe din antistoff eller bruker ingen primære. I C. elegans, mer spesifikke middel for å sjekke for spesifisitet er ofte tilgjengelig. Null-mutanter for genet og proteinet av interesse giren utmerket kontroll for farging spesifisitet. Begge stammer bør fastsettes under identiske forhold før sammenligning, siden farging er vanligvis fiksering avhengig. Hvis ingen null mutant er tilgjengelig, så er det relativt lett i C. elegans å redusere protein nivåer med RNAi (RNA hemming ¹²⁾ og ser for redusert flekker i RNAi behandlet ormer.

Polyklonale antistoffer ofte viser ikke-spesifikk farging, selv om affinitets-renset med antigenet. Ofte lette fiksering ved hjelp av metanol og aceton (som fikse proteiner ved utfelling av dem i stedet for tverrbindings dem) gir mindre ikke-spesifikk farging enn formaldehyd eller glutaraldehyd (som genererer flere variant epitoper på grunn variert kryssbinding) ^1,11. Men i C. elegans ikke-spesifikk farging er svært vanlig i henhold til en hvilken som helst feste tilstand, særlig i tarmen. Hvis antigen er uttrykt i tarmen, så denne ikke-spesifikk farging kan skjule din spesifikke staining. Hvis null mutanter er tilgjengelig for din protein, deretter ormer fast med denne metoden kan brukes til å affinitet tømme din serum. Siden antigenisitet avhenger festeforhold, bør ormer som du bruker til å tømme din antistoff være forberedt på samme måte som de vill type ormer du flekker. Etter en runde med uttømming av ikke-spesifikk farging, mutant-og vill-type ormer kan farges parallelt med utarmet serum for en utmerket kontroll. Ekstra runde av uttømming med mutanter kan gjøres etter behov.

Denne teknikken er svært nyttig for å teste nye antistoffer for spesifikk farging under en rekke forhold. Disse kan være antistoffer som er generert mot C. elegans proteiner eller antistoffer som er generert mot konserverte proteiner fra andre arter. Selv om denne metoden gir den beste morfologi med lett faste nematoder, er det relativt enkelt å prøve et utvalg av fiksativ for å avgjøre hvilke forhold, om noen, gi konkret resultats. I motsetning til andre metoder for fiksering ved hjelp av harde formaldehyd eller glutaraldehyd, enzymatisk eller reduserende behandlinger er ikke nødvendig for prøvepreparering. Siden disse behandlingene kan redusere antigenisiteten, øker dette muligheten til å identifisere spesifikke antistoffer og deres optimale festeforhold. Hvis harde festeforhold fungerer best, kan eksperimentator deretter slå til metoder utført på intakte ormer for å få bedre morfologi (oppsummert i vår tidligere arbeid ^4). Dersom lys fiksering bevarer antigenisitet, så denne teknikken kan anvendes for alle ytterligere farging for lysmikroskopi.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
poly-L-lysine slide (ESCO brand)	Fisher	12-545-78	Sigma brand slides also suitable
poly-L-lysine hydrobromide	Sigma	P1524	IMPORTANT: Brand and high molecular weight of polylysine critical
single frosted edge slides	Fisher	48312-002	Other brands are suitable
sodium azide	Sigma	S2002-25G	TOXIC, wear gloves and mask while weighing out powder to make 10% stock. Wear gloves when pipeting stock solution
coplin staining jar	VWR	47751-792	Other brands are suitable
5-slide mailer	Electron Microscopy Science	71549-01	One of many different brands of small slide holder, suitable for staining
Paraformaldehyde	VWR	MK262159	IMPORTANT: Regular formalin solutions (37% formaldehyde) are NOT suitable. Either 1) Dissolve crysatlaline paraformaldehyde in phosphate buffer and store in small aliquots frozen. Or 2) buy electron microscopy grade paraformaldehyde in aliquots. TOXIC -wear gloves; dispose of excess down sink with water.
Glutaraldehyde solution, 25% in water	Sigma	G 5882	IMPORTANT: purchase electron microscopy grade glutaraldehyde in ampules; TOXIC -wear gloves; dispose of excess down sink with water.
Triton X-100	VWR	EM-9410	Other brands are suitable
Bovine Serum Albumin	Fisher	ICN820451	Other brands are suitable
Donkey Serum, lyophilized	Jackson Immunoresearch	017-000-121	Other brands are suitable
Cy3 Donkey anti-Mouse IgG multi-labeling	Jackson Immunoresearch	715-165-150	This company is recommended for high quality multi-label (affinity depleted) antibodies. Select appropriate dye and antigen (animal used to raise primary antibody).
n-propyl gallate	Fisher	ICN10274750	Other brands are suitable
DAPI, 4’,6’-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride	Sigma	D 9542	TOXIC. Wear gloves and dispense into small aliquots and feeze to minimize exposure
Whatman #1 15 cm diameter filters	Fisher	09805G
Coverslip #1 1/2 rectangle 24 x 60 mm	VWR	48393-252	#1 1/2 thickness is optically best
Microscope slide folder	VWR	48429-092	Other brands are suitable