Summary
इस लेख में हम उच्च संकल्प, fluorescently लेबल माउस दिमाग के ठीक मस्तिष्क शरीर रचना के साथ, फिर से संगठित करने के लिए पूर्ण प्रयोगात्मक प्रक्रिया का वर्णन. वर्णित प्रोटोकॉल नमूना तैयार करने और समाशोधन, इमेजिंग, डेटा बाद के प्रसंस्करण और बहु पैमाने पर दृश्य के लिए बढ़ते नमूना भी शामिल है.
Abstract
एकल कोशिका प्रस्ताव पर स्तनधारी मस्तिष्क की वास्तुकला को समझना तंत्रिका विज्ञान के प्रमुख मुद्दों में से एक है. हालांकि, पूरे मस्तिष्क में neuronal सोमा और अनुमानों मानचित्रण अभी भी इमेजिंग और डेटा प्रबंधन तकनीकों के लिए चुनौतीपूर्ण है. दरअसल, macroscopic मात्रा में terabyte रेंज में डेटासेट का निर्माण, एक उचित समय में उच्च संकल्प और विपरीत के साथ खंगाला जा करने की जरूरत है. हमने हाल ही में एक ऑप्टिकल विधि बढ़ाया हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (EGFP) के साथ लेबल पूरे माउस दिमाग के माइक्रोन पैमाने पर पुनर्निर्माण प्राप्त करने में सक्षम (confocal प्रकाश चादर माइक्रोस्कोपी, CLSM) का प्रदर्शन किया. प्रकाश चादर रोशनी और confocal का पता लगाने के संयोजन, CLSM उच्च विपरीत और गति के साथ macroscopic को मंजूरी दे दी नमूनों के अंदर गहरी इमेजिंग की अनुमति देता है. यहाँ हम फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ लेबल पूरे माउस दिमाग का व्यापक और मानव पठनीय छवियों को प्राप्त करने के लिए पूरा प्रयोगात्मक पाइपलाइन का वर्णन. समाशोधन और बढ़ते पीrocedures एक साथ कई समानांतर आसन्न ढेर प्राप्त करके अपनी पूरी मात्रा पर एक ऑप्टिकल टोमोग्राफी प्रदर्शन करने के लिए कदम के साथ, वर्णित हैं. हम कई के ढेर और बहु संकल्प डेटा नेविगेशन की सिलाई को सक्षम करने खुला स्रोत कस्टम बनाया सॉफ्टवेयर उपकरण का उपयोग दिखाया. सभी Purkinje कोशिकाओं चुनिंदा चिह्नित कर रहे हैं, जिसमें एक L7-GFP ट्रांसजेनिक माउस,, और एक यादृच्छिक विरल neuronal लेबलिंग की विशेषता Thy1 GFP-M माउस से पूरे दिमाग से सेरिबैलम: अंत में, हम मस्तिष्क नक्शे के कुछ उदाहरण सचित्र.
Introduction
आणविक और सेलुलर तंत्र अंतर्निहित मस्तिष्क समारोह के बारे में हमारी समझ की तुलना में, ठीक neuroanatomy के हमारे ज्ञान अपने शैशव 1 में अभी भी लग रहा है. वास्तव में, हम अभी भी मस्तिष्क में neuronal somata की या लंबी दूरी के अनुमानों की स्थिति की व्यापक नक्शे की कमी है. दरअसल, कई तकनीकी प्रयासों सूक्ष्म संकल्प के साथ माउस मस्तिष्क को फिर से संगठित करने के लिए समर्पित कर रहे हैं. राल एम्बेडेड नमूने के धारावाहिक सेक्शनिंग पर आधारित ऑप्टिकल तरीकों चाकू बढ़त स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी (KESM) के रूप में 2, लघु ऑप्टिकल सेक्शनिंग टोमोग्राफी (सबसे) 3 और प्रतिदीप्ति सबसे अधिक (fMOST) 4, उप माइक्रोन तीन आयामी संकल्प प्रदान कर सकते हैं पूरे माउस दिमाग की इमेजिंग. हालांकि, एक भी नमूने की तैयारी और इमेजिंग के लिए आवश्यक कुल समय इस तरह के तरीकों के व्यावहारिक अनुप्रयोग सीमित, कई हफ्तों के आदेश की है. धारावाहिक सेक्शनिंग पर आधारित एक और तकनीक (लेकिन राल एम्बेडिंग बिना), सीरियल दोफोटॉन टोमोग्राफी (एसटीपी) 5, उच्च तीन आयामी संकल्प इमेजिंग की अनुमति देता है. हालांकि, इस तकनीक के 1 खंड हर 50 माइक्रोन 5 का संग्रह है, केवल एक बहुत ही विरल नमूने के साथ पूरे माउस दिमाग में प्रदर्शन किया गया है, और हमारे ज्ञान करने के लिए एसटीपी अभी तक एक murine मस्तिष्क की एक पूर्ण नमूना पुनर्निर्माण का उत्पादन नहीं किया है.
उच्च गति पर तीन आयामों में पूरी नमूनों को फिर से संगठित करने के लिए एक अत्याधुनिक ऑप्टिकल विधि प्रकाश चादर माइक्रोस्कोपी 6 है. इस ऑप्टिकल योजना में नमूना प्रकाश की एक पतली शीट के साथ प्रबुद्ध है और प्रतिदीप्ति उत्सर्जन रोशनी विमान को सीधा एक धुरी के साथ एकत्र किया जाता है. इस तरह केवल में फोकस fluorophores उत्साहित कर रहे हैं और यह उच्च फ्रेम दर की गारंटी, व्यापक क्षेत्र विन्यास में ऑप्टिकल सेक्शनिंग हासिल करना संभव है. एक अपवर्तनांक मिलान तरल 7 के साथ पानी के प्रतिस्थापन पर आधारित प्रोटोकॉल समाशोधन के लिए युग्मित, प्रकाश चादर माइक्रोस्कोपी के लिए लागू किया गया हैपूरे माउस दिमाग 8 के रूप में macroscopic नमूनों. हालांकि, अधिग्रहण कर लिया छवियों को धुंधला एक समग्र कहते हैं जो बाहर का ध्यान केंद्रित fluorophores की उत्तेजना के लिए अग्रणी प्रकाश चादर degrades, भी मंजूरी दे दी नमूनों को प्रभावित करता है जो प्रकाश बिखरने, नमूना प्रेरित.
चुनिंदा ही में फोकस फोटॉनों इकट्ठा करने के लिए, हमने हाल ही में एक confocal पहचान योजना 9 को प्रकाश चादर रोशनी युग्मित. Confocal प्रकाश चादर माइक्रोस्कोपी (CLSM) में, बाहर का ध्यान और बिखरे हुए फोटॉनों एक रेखीय स्थानिक फिल्टर (भट्ठा) से पहले का पता लगाने के लिए (चित्रा 1) द्वारा खारिज कर रहे हैं. प्रकाश चादर वास्तुकला में confocal ऑपरेशन को प्राप्त करने के लिए, रोशनी एक स्कैनिंग लाइन के माध्यम से उत्पादन किया, और पता लगाने के रास्ते में एक de-स्कैनिंग सिस्टम भट्ठा के स्थान पर उत्तेजना स्कैनिंग लाइन की एक स्थिर छवि बनाता है. एक तीसरा स्कैनिंग सिस्टम कैमरा संवेदक पर एक दो आयामी छवि reconstructs. CLSM मंजूरी दे दी माउस में एक 100% विपरीत वृद्धि परमिटपारंपरिक प्रकाश चादर माइक्रोस्कोपी के लिए सम्मान के साथ दिमाग, एक 10 हर्ट्ज फ्रेम दर को बनाए रखते हुए. CLSM के साथ यह Z में 2 XY में माइक्रोन और 9 मीटर के संकल्प के साथ पूरे माउस दिमाग का पुनर्निर्माण, और एकल fluorescently लेबल न्यूरॉन्स विचार करने के लिए पर्याप्त विपरीत के साथ संभव है.
इस लेख में हम CLSM के साथ एक माउस मस्तिष्क को फिर से संगठित करने के लिए प्रयोगात्मक पाइपलाइन का वर्णन. एल्डिहाइड तय माउस दिमाग पेरोक्साइड मुक्त tetrahydrofuran के एक वर्गीकृत श्रृंखला में निर्जलित रहे हैं और बाद में बेकर एट अल. 10 को मंजूरी दे दी नमूना द्वारा विकसित प्रोटोकॉल के बाद, पेरोक्साइड मुक्त dibenzyl आकाश (चित्रा 2) में मंजूरी दे दी तो ध्यान से एक इत्तला दे दी पर मुहिम शुरू की है थाली और एक कस्टम बनाया confocal प्रकाश चादर माइक्रोस्कोप की इमेजिंग कक्ष में तैनात. वैकल्पिक रूप से इसे मंजूरी दे दी agarose जेल की एक डिस्क (चित्रा पर चिपके जा सकता है, नमूना सीधे प्लेट (चित्रा 3 ए) के एक सिरे पर यह डूबनेवाला द्वारा रखा जा सकता है3 बी) या मंजूरी दे दी agarose जेल (चित्रा -3 सी) से बना एक बीकर की गुहा में रखा. कई समानांतर आसन्न ढेर सब मस्तिष्क की मात्रा (चित्रा 4) को कवर करने के लिए अर्जित कर रहे हैं के रूप में पूरे मस्तिष्क के एक ऑप्टिकल टोमोग्राफी तब किया जाता है. नमूना स्थिति और आकार का एक मोटा नक्शा पैदा करता है जो एक पूर्व टोमोग्राफी नमूने, इमेजिंग ही नमूना के कब्जे मात्रा में किया जाता है कि गारंटी देता है. टोमोग्राफी ढेर बाद में कस्टम के बनाए सॉफ्टवेयर के साथ एक साथ सिले और एक बहु संकल्प श्रेणीबद्ध योजना 11 में बच रहे हैं. माउस दिमाग अंततः मूलरूप बहु संकल्प गूगल मैप्स की तरह दृश्य सॉफ्टवेयर से पता लगाया जा सकता है. ये दोनों सॉफ्टवेयर उपकरणों खुला स्रोत मंच Vaa3D 12 में plugins के रूप में एकीकृत कर रहे हैं.
हम अंत में ठीक murine neuroanatom अध्ययन में वर्णित प्रयोगात्मक पाइपलाइन की क्षमताओं का प्रदर्शन करने के लिए माउस दिमाग के प्रतिनिधि छवियों को दिखानेवाई.
Protocol
1. ऊतक तैयारी और संग्रहण
- 0.01 एम पीबीएस में paraformaldehyde 4% की 100 मिलीलीटर के द्वारा पीछा किया 20 मिलीलीटर 0.01 एम फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) समाधान, साथ मानक transcardial छिड़काव 13 के माध्यम से माउस मस्तिष्क को ठीक करें. ध्यान से 7.6 करने के लिए दोनों के समाधान के पीएच को समायोजित: पीएच का थोड़ा कम मूल्यों EGFP के प्रतिदीप्ति बुझाने सकता है.
- 4 डिग्री सेल्सियस पर paraformaldehyde 4% में रात भर excised दिमाग परसर्ग
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 0.01 एम पीबीएस में 0.01 एम पीबीएस और दुकान में दो बार (30 मिनट प्रत्येक) कुल्ला
2. निर्जलीकरण और क्लियरिंग
नोट:. निर्जलीकरण और समाशोधन के लिए प्रोटोकॉल बारीकी बेकर एट अल 10 द्वारा वर्णित एक इस प्रकार है
- दृढ़ता से एक chroma का उपयोग बुनियादी सक्रिय एल्यूमीनियम ऑक्साइड (गतिविधि ग्रेड Brockman मैं, THF के बारे में 250 छ / एल) के साथ XFP प्रतिदीप्ति, फिल्टर THF बुझाने जो निर्जलीकरण विलायक (tetrahydrofuran, THF), से peroxides निकालने के लिएस्तंभ tography. पेरोक्साइड हटाने को कम करेगा, जो स्तंभ के खुर से बचें.
- THF पहले से ही निस्पंदन से पहले स्थिर हो गया था, भले ही अंतिम समाधान के लिए स्टेबलाइजर (butylated hydroxytoluene, 250 मिलीग्राम / एल) जोड़ें. स्टेबलाइजर बिना THF peroxides की बड़ी मात्रा में विकसित हो सकता है और विस्फोटक और खतरनाक हो सकता है: स्थिरता एल्यूमीनियम ऑक्साइड द्वारा बनाए रखा वास्तव में है.
- तो 50%, 70%, 80%, 90%, 96%, 100%, 1 घंटा प्रत्येक, 100% रातोंरात: पूरे माउस शुद्ध पानी में THF की एक वर्गीकृत श्रृंखला में मस्तिष्क निर्जलीकरण. एक घूर्णन पहिया पर नमूने के साथ शीशी रखें. प्रकाश जोखिम से बचने के लिए, एक एल्यूमीनियम पन्नी के साथ शीशियों लपेटो.
- एल्यूमीनियम ऑक्साइड के साथ समाशोधन विलायक (dibenzyl ईथर, DBE) फ़िल्टर (सक्रिय बुनियादी, गतिविधि ग्रेड Brockman मैं, DBE के बारे में 250 छ / एल) एक फ़िल्टरिंग चिमनी का उपयोग कर.
- 100% DBE में नमूना साफ़ करें. 3 और 6 घंटे के बाद समाधान बदलें.
3. बढ़ते नमूना
- मस्तिष्क आंख (typi द्वारा पारदर्शी लग रहा हैदूसरी DBE परिवर्तन के बाद बड़ी सफाई से 1 घंटा), निम्न विधियों में से एक ने इत्तला दे दी इमेजिंग थाली पर माउंट:
- प्रत्यक्ष बढ़ते - धीरे सुझावों में से एक (चित्रा 3 ए) पर नमूना उतर रही.
- Agarose डिस्क - सुझावों पर 6% agarose जेल से बना एक डिस्क डुबकी. धीरे ऐक्रेलिक गोंद के साथ agarose डिस्क पर नमूना ठीक कर (चित्रा 3 बी). इलाज के लिए लगभग 1 मिनट तक प्रतीक्षा करें.
- Agarose बीकर - सुझावों पर 3% agarose जेल से बना एक बीकर डुबकी. धीरे बीकर के नीचे (चित्रा -3 सी) पर नमूना जगह है.
नोट 1: यह अपनी संपूर्णता में नमूना इमेजिंग महत्वपूर्ण है जब agarose बीकर में बढ़ते प्राथमिकता दी जानी चाहिए, लेकिन, नमूना आसपास agarose जेल छवि गुणवत्ता के लिए हानिकारक हो सकता है जो अतिरिक्त प्रकाश बिखरने को जन्म देता है. नमूना का एक छोटा सा हिस्सा इमेजिंग से बाहर रखा जा सकता है, यह कल्पना माउंट करने के लिए बेहतर हैagarose डिस्क पर या सीधे नोक पर imen. पूर्व विधि सबसे अच्छा (घ्राण बल्ब का एक हिस्सा इमेजिंग से या रीढ़ की हड्डी के छोड़कर) कार्यक्षेत्र मस्तिष्क रखने के लिए क्षैतिज मस्तिष्क (ब्रेन का एक उदर या पृष्ठीय भाग इमेजिंग से छोड़कर), बाद रखने के लिए उपयुक्त है.
नोट 2: यह स्पष्ट रूप से पारदर्शी लग रहा है जब तक agarose जेल (50% और 100% 4 घंटा प्रत्येक) THF साथ तो निर्जलित, पानी में तैयार और DBE 100% में मंजूरी दे दी 4 घंटे के लिए या किया जाना चाहिए.
- पिछले विधियों में से एक निम्न नमूना बढ़ते के बाद, चिमटी का उपयोग नमूना कक्ष के अंदर इमेजिंग प्लेट की स्थिति. समाधान समाशोधन के साथ चैम्बर भरें.
4. टोमोग्राफी तैयारी
- जितना संभव हो उतना प्रतिदीप्ति एकत्र करने के लिए भट्ठा निकालें.
- Photobleaching को रोकने के लिए कम लेजर शक्ति के साथ नमूना रोशन.
- सॉफ्टवेयर संचालित micropositioning syste का उपयोग कर तीन दिशाओं में नमूना ले जाएँएम. प्रत्येक दिशा के लिए नमूना प्रबुद्ध और कैमरा (चित्रा -4 ए) के देखने के क्षेत्र के भीतर है जिसके लिए न्यूनतम और अधिकतम निर्देशांक पहचानें.
- 'पूर्व टोमोग्राफी' उपनेमका के लिए मानकों के रूप में ऊपर निर्देशांक डालें. भी टोमोग्राफी में इस्तेमाल किया जा करने के लिए आसन्न के ढेर के बीच की दूरी, और Z दिशा में पूर्व टोमोग्राफी नमूना कदम निर्दिष्ट करें.
- (4.4) में निर्दिष्ट Z नमूने के साथ हर ढेर में छवियों को इकट्ठा जो पूर्व टोमोग्राफी, शुरू करो.
नोट: एकत्र छवियों नमूना आकार और स्थिति का एक मोटा नक्शा इमेजिंग समय को कम करने और इस प्रकार photobleaching, केवल वास्तव में नमूना के कब्जे मात्रा को टोमोग्राफी अधिग्रहण सीमित अनुमति देता है (चित्रा 4 बी), तैयार करने के लिए एक सॉफ्टवेयर के द्वारा किया जाता है.
5. टोमोग्राफी अधिग्रहण
- Micropositioning प्रणाली का उपयोग कर प्रकाश चादर के बाहर नमूना ले जाएँ.
- इंकrease लेजर शक्ति और देखने के क्षेत्र के केंद्र में केवल एक फिक्स्ड लाइन रोशन करने के क्रम में, सभी स्कैनिंग सिस्टम की गति को रोकने के.
- भट्ठा माउंट और समाशोधन समाधान से autofluorescence संकेत का उपयोग कर यह पंक्ति. आप स्पष्ट रूप से देखने के क्षेत्र के केंद्र में भट्ठा लाइन देखना चाहिए.
- , स्कैनिंग सिस्टम को फिर से सक्रिय लेजर शक्ति को कम करने और micropositioning प्रणाली का उपयोग कर प्रकाश चादर के अंदर नमूना चाल है. भट्ठा के साथ इस्तेमाल किया लेजर बिजली, प्रकाश की स्थानिक फिल्टर ब्लॉकों के बाद से एक गैर नगण्य अंश इसके बिना इस्तेमाल किया है कि अधिक से अधिक हो जाएगा कि नोट.
- छवियाँ स्पष्ट और चमकदार लग रही है, जब तक आयाम को समायोजित और नियंत्रण सॉफ्टवेयर के साथ स्कैनिंग और डी स्कैनिंग सिस्टम की ऑफसेट.
- प्रयोग के लिए उपयुक्त Z कदम स्थापित करने के बाद, टोमोग्राफी अधिग्रहण सॉफ्टवेयर चलाएँ. मात्रा कई समानांतर, आंशिक रूप से अतिव्यापी ढेर (चित्रा 5A) में imaged किया जाएगा, और छवियों में सहेजा जाएगाएक पदानुक्रम फ़ोल्डर संरचना.
6. सिलाई और विज़ुअलाइज़ेशन
- एक स्वचालित सॉफ्टवेयर (चित्रा 4C) का उपयोग सिंथेटिक काले छवियों के साथ (एकत्र की एक ही प्रकार के और आयाम की यानी छवियों वाले, लेकिन शून्य तीव्रता के साथ) का अधिग्रहण मात्रा को पूरा करें. यह कदम एक पूर्ण घन मात्रा के साथ सौदा करने के लिए सिलाई सॉफ्टवेयर के लिए आदेश में अनिवार्य है.
- लॉन्च Vaa3D सॉफ्टवेयर (आज़ादी से डाउनलोड http://www.vaa3d.org/ TeraStitcher और TeraManager स्थापित plugins के साथ).
- TeraStitcher प्लगइन लोड. Imaged मात्रा युक्त निर्देशिका का चयन करें, (एक संदर्भ के लिए सम्मान के साथ समन्वय प्रणाली दाएं हाथ) कुल्हाड़ियों के रिश्तेदार झुकाव का संकेत मिलता है और voxel आकार.
- सिलाई का पहला हिस्सा लॉन्च. सॉफ्टवेयर के ढेर के जोड़े के बीच सापेक्ष विस्थापन की गणना, और एक समग्र इष्टतम placem मिलेगाएक साथ सभी के ढेर के लिए ईएनटी (चित्रा 5 ब).
- एकल संकल्प में या बहु संकल्प प्रारूप में सिले मात्रा को बचाने के लिए चयन करें. उत्तरार्द्ध TeraManager प्लगइन के साथ बहु - संकल्प दृश्य के लिए सक्षम बनाता है. उच्च संकल्प छवि कुछ गीगाबाइट से बड़ा है, तो दोनों ही मामलों में, यह भी साधन सेव बहु ढेर का चयन करें और व्यक्तिगत substacks का आकार निर्दिष्ट करें. इस संग्रहित आंकड़ों के कुशल उपयोग को सक्षम होगा.
- सिलाई के दूसरे भाग लॉन्च. सॉफ्टवेयर गठबंधन के ढेर विलय, और या तो एकल या बहु ढेर मोड (आंकड़े 5C और 5D) में उन्हें बचाने के लिए होगा. अंत में TeraStitcher प्लगइन बंद करें.
- TeraManager प्लगइन लोड. बहु खड़ी बहु संकल्प की मात्रा के साथ फ़ोल्डर का चयन करें, और voxel आकार से संकेत मिलता है और झुकाव अक्ष. मात्रा न्यूनतम संकल्प पर लोड किया जाएगा.
- एक उच्च संकल्प ज़ूम करने के लिए राइट क्लिक modalit का उपयोग कर एक मील का पत्थर का चयनVaa3D के वाई, तो माउस स्क्रॉल का उपयोग करने में ज़ूम. वैकल्पिक रूप से आप सीधे एक सही क्लिक के साथ ज़ूम करने के लिए आरओआई का चयन करें, या ब्याज की मात्रा के निर्देशांक निर्दिष्ट कर सकते हैं.
- कम संकल्प को वापस ज़ूम करने के लिए, बस माउस स्क्रॉल का उपयोग करें.
Representative Results
वर्णित प्रोटोकॉल शारीरिक सेक्शनिंग के लिए आवश्यकता के बिना, माइक्रोन पैमाने संकल्प पूरे माउस दिमाग या excised भागों के साथ या तो फिर से संगठित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. एक प्रतिनिधि परिणाम के रूप में, चित्रा 6 में एक L7-GFP माउस (प्रसवोत्तर दिन 10) के पूरे सेरिबैलम दिखाया गया है. इस जानवर में सभी Purkinje न्यूरॉन्स EGFP के साथ लेबल रहे हैं. हम में ज़ूम, अनुमस्तिष्क प्रांतस्था के विशिष्ट परतदार संरचना (चित्रा 7) देखा जा सकता है. इसके अलावा में zooming स्पष्ट रूप से प्रत्येक Purkinje सेल सोमा (चित्रा 8) भेद देता है. वर्णित प्रोटोकॉल इस प्रकार विभिन्न सक्षम के चिकित्सकों के अध्ययन में neuronal स्थानिक संगठन स्क्रीन इस्तेमाल किया जा सकता है.
एक दूसरा प्रतिनिधि परिणाम के रूप में, हम एक वयस्क Thy1 GFP-एम माउस का unsectioned मस्तिष्क से छवियों को प्रस्तुत करते हैं. इस ट्रांसजेनिक पशु में EGFP एक यादृच्छिक विरल neuronal सबसेट में व्यक्त किया है. मस्तिष्क के ठीक आधे 9 चित्र में दिखाया गया है. जैसा कि हमआगे ज़ूम में और आगे (10 और 11 के आंकड़े), neuronal प्रक्रियाओं अलग पहचाना हो गया है. इस परिणाम में वर्णित प्रोटोकॉल neurodegenerative रोग के माउस मॉडल में सेलुलर संकल्प पर पूरे मस्तिष्क शरीर रचना का अध्ययन करने की संभावना खोलने पूरे वयस्क माउस दिमाग में माइक्रोन पैमाने संकल्प इमेजिंग की अनुमति देता है कि यह दर्शाता है.
चित्रा 1. उत्तेजना मार्ग दिखा तंत्र के confocal प्रकाश चादर माइक्रोस्कोपी (CLSM) की ऑप्टिकल योजना. (क) ऊपर देखने के लिए,. एक 488 एनएम डायोड पंप ठोस राज्य (DPSS) लेजर से लेजर उत्सर्जन, एक पहली दूरबीन से विस्तार और संधान के बाद, बीम तीव्रता को नियंत्रित करता है, जो एक acousto ऑप्टिक tunable फ़िल्टर (AOTF) में प्रवेश करती है. तो, एक दूसरे दूरबीन आगे बीम फैलता है. (Y साथ) खड़ी एक galvo दर्पण हो स्कैन करता है पता लगाने के मार्ग दिखा तंत्र का नमूना कक्ष के अंदर एक लेंस से ध्यान केंद्रित किया है जो AM,. (ख) पार्श्व दृश्य,. पता लगाने के उद्देश्य से एकत्र लाइट खड़ी एक galvo दर्पण द्वारा descanned और बढ़ उत्तेजना लाइन का एक निश्चित छवि का निर्माण, एक लेंस से ध्यान केंद्रित किया है. निश्चित छवि की स्थिति पर एक रेखीय स्थानिक फिल्टर (भट्ठा) रखा गया है. भट्ठा के बाद, एक 4F लेंस प्रणाली के अंदर रखा एक galvo दर्पण एक इलेक्ट्रॉन गुणा प्रभारी युग्मित डिवाइस (ईएम सीसीडी) की चिप पर एक 2 आयामी छवि reconstructs. एक प्रतिदीप्ति bandpass फिल्टर का पता लगाने से पहले सभी उत्तेजना आवारा प्रकाश को हटा दें. उत्तेजना, का पता लगाने और bandpass फ़िल्टर का पता लगाने के प्रकाश का प्रतिनिधि किरणों क्रमशः, नीले, हल्के नीले और हरे रंग की किरणों द्वारा चित्रित कर रहे हैं. वास्तव में माइक्रोस्कोप में इस्तेमाल सभी लेंस के फोकल लंबाई संकेत कर रहे हैं. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
चित्रा 2. नमूना समाशोधन. Formaldehyde तय माउस दिमाग, 4 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस 0.1 एम में जमा हो जाती है जो (क), ((THF, ख) और बाद में 100% dibenzyl आकाश में मंजूरी दे दी tetrahydrofuran के एक वर्गीकृत श्रृंखला में निर्जलित हैं DBE , सी). निर्जलीकरण कदम भी कुछ ऊतक संकोचन का कारण बनता है.
चित्रा 3. नमूना CLSM इमेजिंग के लिए बढ़ते. मंजूरी दे दी मस्तिष्क सीधे (एक), एक को मंजूरी दे दी agarose डिस्क (बी) पर चिपके, या एक को मंजूरी दे दी agarose बीकर (ग) में डाला इत्तला दे दी बढ़ते प्लेट पर डूब जा सकता है.
चित्रा 4. टोमोग्राफी अधिग्रहण. पूर्व टोमोग्राफी दिनचर्या नमूने मस्तिष्क (क) छवि के लिए सभी नमूना जरूरत समानांतर आसन्न ढेर की संख्या और लंबाई को परिभाषित करने के लिए युक्त एक समानांतर खात (ख). टोमोग्राफी के बाद, काला छवियों को एक समानांतर खात के लिए आभासी हासिल कर ली मात्रा को पूरा करने के लिए उत्पन्न कर रहे हैं (ग).
चित्रा 5. वॉल्यूम सिलाई. एकत्र छवि आंशिक रूप से TeraStitcher प्लगइन (बी) के साथ उनकी सटीक संरेखण की अनुमति, (एक) एक दूसरे के बीच ओवरलैप के ढेर. प्लगइन तो एक एकल खड़ी (ग) या बहु - स्टेशन या तो गठबंधन में ढेर विलीन हो जाती हैcked (डी) बहु संकल्प प्रतिनिधित्व.
चित्रा 6. सभी Purkinje न्यूरॉन्स EGFP. स्केल बार, 1 मिमी के साथ चिह्नित कर रहे हैं, जिसमें एक P10 L7-GFP माउस, की पूरी सेरिबैलम.
चित्रा 7. अनुमस्तिष्क प्रांतस्था. स्केल बार, 500 माइक्रोन के विशिष्ट परतदार संरचना दिखा 6 चित्र में दिखाया सेरिबैलम के एक हिस्से के ज़ूम में.
चित्रा 8. 6 चित्र में दिखाया सेरिबैलम के एक हिस्से के आगे ज़ूम में. Purkinje कोशिकाओं सोमा स्पष्ट रूप से भेद किया जा सकता हैएड. स्केल बार, 200 माइक्रोन.
चित्रा 9. एक विरल unspecific neuronal EGFP लेबलिंग. स्केल बार, 1 मिमी की विशेषता वयस्क Thy1 GFP-M माउस, से मस्तिष्क के दाएँ आधा.
चित्रा 10. ज़ूम में 9 चित्र में दिखाया आधे मस्तिष्क के एक हिस्से की,. स्केल बार, 200 माइक्रोन हिप्पोकैम्पस की और प्रांतस्था का हिस्सा दिखा.
चित्रा 11. प्रांतस्था में 9 चित्र में दिखाया आधे मस्तिष्क के एक हिस्से के आगे ज़ूम में. कई neurites स्पष्ट रूप से प्रतिष्ठित किया जा सकता है. स्केल बार, 50 माइक्रोन.
Discussion
रासायनिक समाशोधन के साथ मिलकर CLSM फ्लोरोसेंट जांच, प्रोटीन या सिंथेटिक रंगों के साथ लेबल पूरे माउस दिमाग की neuroanatomy अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण का प्रतिनिधित्व करते हैं. फोकल हवाई जहाज़ के बाहर उत्सर्जित प्रकाश एक शारीरिक स्थानिक फिल्टर द्वारा अवरुद्ध है के बाद से प्रकाश चादर वास्तुकला की विशिष्ट उच्च फ्रेम दर को बनाए रखते हुए, उच्च विपरीत इमेजिंग, मोटी नमूनों में भी संभव है.
वर्णित तरीकों का उपयोग कर जब से निपटने के लिए मुख्य मुद्दा विपरीत को अधिकतम है. वास्तव में, उपलब्ध संकेत रासायनिक और ऑप्टिकल कारकों से दोनों कम हो जाता है. देखने के रासायनिक बिंदु से, कार्बनिक विलायक के आधार पर समाशोधन प्रक्रियाओं फ्लोरोसेंट प्रोटीन और अन्य फ्लोरोसेंट रंगों 7 से उत्सर्जन बुझाने सकता है. बेकर एट अल. 10 द्वारा वर्णित के रूप में विलायक निस्पंदन, peroxides दूर करने के लिए, विलायक को मंजूरी दे दी ऊतकों में भी प्रतिदीप्ति के एक अच्छे स्तर को बनाए रखने की अनुमति देता है. प्रकाशित करनापूरे murine दिमाग के साथ काम कर जब एड पानी आधारित समाशोधन विधियों 14 में कम से कम रैखिक ऑप्टिकल तकनीक के साथ, प्रतिदीप्ति क्षमता कम हो, लेकिन गरीब पारदर्शिता में परिणाम नहीं है.
दूसरी ओर, इस समय उच्च अपवर्तक सूचकांक (एन ≈ 1.56) का इस्तेमाल किया समाधान समाशोधन के लिए सही लंबी दूरी काम के साथ कोई व्यावसायिक उद्देश्यों रहे हैं. इस प्रकार, नमूना डूब जाता है, जिसमें मध्यम और उद्देश्य के डिजाइन एक के बीच अपवर्तनांक बेमेल मजबूत गोलाकार aberrations को जन्म देता है. माइक्रोस्कोप के प्रस्ताव को कम करने के अलावा, इस तरह के aberrations प्रकाश एक व्यापक क्षेत्र पर फैला हुआ है के बाद से, छवि तीव्रता और इसके विपरीत की एक बूंद में परिणाम. इस मुद्दे पर संभावित समाधानों अनुकूली प्रकाशिकी 15 और / या स्थिर aspheric correctors का उपयोग शामिल है.
में एक छोटी बाद छवि के विपरीत और तीव्रता में कोई सुधार आसानी से भी इमेजिंग गति को प्रभावित करता हैछवि प्रति tegration समय चुना जा सकता है. फिलहाल CLSM 100 मिसे 9 के एक कैमरा जोखिम समय के साथ, के बारे में 10 6 माइक्रोन 3 / सेकंड की एक इमेजिंग गति खर्च कर सकते हैं. इस गति से यह नमूना आकार पर निर्भर करता है, 1-3 दिन से छवि के लिए एक पूरे माउस मस्तिष्क लेता है. छवि गुणवत्ता में कोई महत्वपूर्ण गिरावट की वजह से ज्यादातर प्रकाश चादर रोशनी 6 की आंतरिक कम photobleaching के ऐसे लंबे इमेजिंग सत्र के दौरान मनाया जाता है, लंबे समय से एक माउस मस्तिष्क अभ्यास में CLSM की प्रयोज्यता कम कर सकता छवि की जरूरत है. पता लगाने के लिए एक उच्च गति कैमरा के उपयोग के साथ युग्मित प्रणाली दक्षता में 10 गुना वृद्धि हुई है, वर्णित प्रोटोकॉल का एक नियमित प्रयोग की अनुमति, कई घंटे इमेजिंग समय को कम करेगा.
सभी उपरोक्त सीमाओं के बावजूद, कम से कम एक में माइक्रोन पैमाने संकल्प के साथ पूरे माउस दिमाग को फिर से संगठित करने के लिए ऊतकों परमिट की रासायनिक समाशोधन के लिए युग्मित CLSM इमेजिंगसप्ताह. पूरे मस्तिष्क इमेजिंग के लिए अन्य तरीकों ऑप्टिकल CLSM से अधिक संकल्प बर्दाश्त, लेकिन लंबे समय तक तैयारी और / या इमेजिंग समय 2-4 की कीमत पर, या एक विरल Z नमूने 5.
इस आलेख में वर्णित तरीकों फ्लोरोसेंट लेबलिंग के लिए विभिन्न रणनीतियों के साथ संयोजन में उपयोग किया जा सकता है: ट्रांसजेनिक जानवर आदि चयनित neuronal सबसेट, वायरल अभिकर्मक, intraparenchymal डाई इंजेक्शन, में फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त अभ्यास में, पशु बलि पूर्ववर्ती सभी धुंधला रणनीतियों CLSM के साथ संगत कर रहे हैं . , धुंधला के इस तरह निकट भविष्य में संभव होगा, वैसे भी, CLSM साथ खंगाला जा सकता है कि नमूनों की संख्या ज्यादा बड़ा हो जाएगा, वास्तव में, पूरे माउस दिमाग का पोस्टमार्टम फ्लोरोसेंट लेबलिंग अब तक का प्रदर्शन नहीं किया गया है संभावित मानव मस्तिष्क के ऊतकों सहित.
अंत में, confocal प्रकाश चादर माइक्रोस्कोपी आज़ादी के साथ संयोजन में उपयोग कियामुकदमा समाशोधन और बहु संकल्प डेटा प्रबंधन शोधकर्ताओं सबसे प्रयोगशालाओं के हाथ में अच्छी तरह से कर रहे हैं कि तकनीकी प्रयासों के साथ, माइक्रोन पैमाने में संकल्प के साथ macroscopic नमूनों को फिर से संगठित और विश्लेषण करने की अनुमति दे सकता है. CLSM के संभावित अनुप्रयोगों के तंत्रिका विज्ञान तक ही सीमित नहीं कोर्स कर रहे हैं, लेकिन 16,17 और छोटे जानवरों को 18 वर्ष की शारीरिक रचना embryogenesis के रूप में, प्रकाश चादर माइक्रोस्कोपी पहले से ही इस्तेमाल किया गया है जिसमें सभी अनुसंधान क्षेत्रों तक फैला है.
Disclosures
लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.
Acknowledgments
इन परिणामों के लिए अग्रणी अनुसंधान n अनुदान समझौते के तहत यूरोपीय संघ के सातवें फ्रेमवर्क कार्यक्रम (FP7/2007-2013) से धन प्राप्त हुआ है. 228334 और 241526. इस शोध परियोजना भी मानव फ्रंटियर विज्ञान कार्यक्रम अनुसंधान अनुदान (RGP0027/2009) द्वारा समर्थित किया गया है और प्रमुख परियोजना Nanomax के ढांचे में शिक्षा, विश्वविद्यालय और अनुसंधान के लिए इतालवी मंत्रालय द्वारा और के ढांचे में स्वास्थ्य के इतालवी मंत्रालय द्वारा "स्टेम सेल प्रस्तावों के लिए कॉल". इस शोध "Ente Cassa di Risparmio di Firenze" द्वारा समर्थित नायक फाउंडेशन के अनुसंधान गतिविधियों के ढांचे में बाहर किया गया है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate Buffered Saline Tablets | Sigma-Aldrich | P4417_100TAB | |
| Paraformaldehyde | Agar Scientific | R1018 | |
| Peroxide-free Tetrahydrofuran | Sigma-Aldrich | 186562 | |
| Aluminum oxide activated, basic, Brockmann I | Sigma-Aldrich | 199443 | |
| Dibenzyl ether | Sigma-Aldrich | 108014 | |
| Butylated hydroxytoluene | Sigma-Aldrich | W218405 | |
| Agarose Type III-A, High EEO | Sigma-Aldrich | A9793 | |
| Acrylic glue | Bostik | D2498 | |
| Vaa3D software | open source | freely downloadable from http://www.vaa3d.org/ |
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