Summary
Bruk av en nåleinjeksjonsmetode for å inokulere mais og teosinte planter med det biotrofiske patogenet Ustilago maydis er beskrevet. Nåleinjeksjonsinokuleringsmetoden letter kontrollert levering av sopppatogenet mellom plantebladene der patogenet kommer inn i planten gjennom dannelsen av appresoria. Denne metoden er svært effektiv, noe som muliggjør reproduserbare inokulasjoner med U. maydis.
Abstract
Mais er en stor kornavling over hele verden. Imidlertid er følsomhet for biotrofiske patogener den primære begrensningen for å øke produktiviteten. U. maydis er et biotrofisk sopppatogen og årsaksmiddelet til maissmusk på mais. Denne sykdommen er ansvarlig for betydelige avkastningstap på omtrent $ 1,0 milliarder årlig i USA1 Flere metoder, inkludert veksling, soppdrepende applikasjon og frøbehandlinger, brukes for tiden til å kontrollere maissmut2. Imidlertid er vertsmotstand den eneste praktiske metoden for å håndtere maissmusk. Identifisering av avlingsplanter inkludert mais, hvete og ris som er motstandsdyktige mot ulike biotrofiske patogener, har betydelig redusert utbyttetap årlig3-5. Derfor vil bruken av en patogeninokuleringsmetode som effektivt og reproduserer patogenet mellom plantebladene, lette rask identifisering av maislinjer som er motstandsdyktige mot U. maydis. Som et første skritt mot å rykke inn maislinjer som er motstandsdyktige mot U. maydis, ble en nålinjeksjonsinokuleringsmetode og en motstandsreaksjonsscreeningsmetode brukt til å inokulere mais, teosinte og mais x teosinte introgressionlinjer med en U. maydis-belastning og for å velge resistente planter.
Mais, teosinte og mais x teosinte introgression linjer, bestående av ca 700 planter, ble plantet, inokulert med en stamme av U. maydis, og screenet for motstand. Inokulerings- og screeningmetodene identifiserte vellykket tre teosinte linjer som var motstandsdyktige mot U. maydis. Her presenteres en detaljert sprøyteinjeksjonsinokulerings- og resistensreaksjonsscreeningsprotokoll for mais, teosinte og mais x teosinte introgressionlinjer. Denne studien viser at nåleinjeksjonsinokulering er et uvurderlig verktøy i landbruket som effektivt kan levere U. maydis mellom plantebladene og har gitt plantelinjer som er resistente mot U. maydis som nå kan kombineres og testes i avlsprogrammer for forbedret sykdomsresistens.
Introduction
Soppsykdommer av planter representerer en av de mest fremtredende truslene mot landbruket. Behovet for å utvikle avlinger med forbedret sykdomsresistens øker på grunn av matbehovene til en voksende verdensbefolkning. Plantepatogener smitter naturlig avlingsplanter i feltet og forårsaker sykdommer som negativt påvirker avlingsutbyttet6. Det har vist seg at identifisering og bruk av resistente planter kan forbedre motstanden og redusere utbyttetapet. Resistente kultivarer har blitt identifisert i mange plantearter, inkludert mais, hvete, ris og sorghum ved å inokulere plantene med et plantepatogen og velge for resistente linjer7. Derfor vil utvikling og bruk av en effektiv inokulasjonsmetode tillate mange planter å bli inokulert og screenet for motstand. Ulike inokulasjonsmetoder har blitt brukt, inkludert dip inokulering, pipettering av patogencelleopphengskulturen i plantens virvel og nåleinjeksjonsinokulering8-11. Med hver metode må patogenet på en pålitelig måte innføres mellom plantebladene der patogenet kommer inn i planten gjennom dannelsen av appresoria for å sikre patogenutvikling og planteinfeksjon12,13.
Dip-inokuleringsmetoden innebærer å nedsenke en planteplante i en patogencellefjæringskultur, mens pipetteringsmetoden krever å plassere patogencellefjæringskulturen i plantens virvel. Det er imidlertid problemer med begge metodene. For det første avhenger begge metodene av patogenets naturlige bevegelse fra bladoverflaten inn i plantevevet som er svært variabelt. De fleste patogener kommer naturlig inn i planten gjennom stomatale åpninger eller sår på plantebladoverflaten. Det er imidlertid betydelig variasjon i patogenenes evne til å trenge inn i plantebladoverflaten gjennom stomata og / eller sår på bladoverflaten. Derfor kan patogen penetrasjon ikke kontrolleres med noen av inokulasjonsmetodene som potensielt resulterer i inkonsekvente data. For det andre, når du screener et stort antall planter, kan det være tidkrevende å senke plantene ned i en patogencellefjæringskultur og kan begrense antall planter som kan screenes. På den annen side gir nåleinjeksjonsinokuleringsprotokollen beskrevet heri patogencellefjæringskulturen mellom plantebladene som letter dannelsen av appressoria14. Patogenet bruker deretter det nyutviklede appressoria for å komme inn i planten og eliminere patogenpenetrasjonsproblemet. I tillegg gir nåleinjeksjonsinokuleringsprotokollen en rekke fenotyper for mais- og teosinteplanter som har blitt inokulert med U. maydis og demonstrere god infeksjon. Fenotypene kan brukes som en markør for å bestemme den beste konsentrasjonen for patogencellefjæringskulturen, noe som resulterer i konsistente plantefenotyper i og mellom forskjellige eksperimenter.
Etter plante inokulering med en patogen celle suspensjon kultur, planter er vanligvis screenet for å oppdage en resistent eller mottakelig fenotype8-11,15. Mens sykdomsvurderingsskalaer har blitt brukt mye til å screene og klassifisere plantefenotyper, varierer vurderingsskalaene avhengig av patogenet som analyseres. Derfor kan en sykdomsvurdering skala protokoll etablering for U. maydis og mais interaksjoner brukes til lignende sopppatogener16.
Den nåværende serien av protokoller detaljer nål injeksjon inokulering med en U. maydis celle suspensjon kultur og sykdom motstand reaksjon screening av mais, teosinte, og mais x teosinte introgression linjer. De nåværende protokollene er ikke begrenset til sprøyteinjeksjonsinokulering av U. kandis i maisplanter, men kan brukes til relativt alle sopppatogener og plantearter. Derfor, inkludert detaljene i begge metodene i samme protokoll, vil forskerne kunne utnytte protokollene for inokulasjon og screening direkte eller å manipulere de opprinnelige protokollene for bedre å passe til patogen- og plantearter av interesse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Vekst av plantemateriale
- Velg plantelinjer for inokulering og screening. To maislinjer, fem teosinte linjer og førti mais x teosinte linjer med ukarakterisert motstand mot U. maydis ble brukt til dette arbeidet (Tabell 1).
- Plantefrø for eksperimentell (U. maydis injeksjon) og kontroll (vanninjeksjon) nåleinjeksjon inokulering eksperimenter. Gjør dette for hver plantelinje.
- Plante fire frø (replikerer) for hver plantelinje i små leiligheter ved å skyve frøene ca 1/2 tomme inn i jorden med finger og dekke med jord lett (Figur 1A og 1B). Ikke pakk jorda over frøet. Plantering av frøet dypere eller pakking av jorda over frøet kan forårsake problemer med frøplante fremveksten.
- Vann frøene i jorda. Forsikre deg om at jorda er gjennomvåt og frøene forblir under jorden etter vanning.
- Etter vanning, plasser planter i et vekstkammer med henholdsvis dag- og nattmiljøer på 28/20 °C temperatur og 14/10 timers fotoperiod og ca. 500 μmol/m2 sek fotosyntetisk aktive strålinger på toppen av baldakinen. Opprettholde den relative fuktigheten i løpet av dagen og natten på henholdsvis ca. 70% og 90%.
- Hold alle planter i samme vekstkammer for å opprettholde et vekstmiljø som er kongruent på tvers av eksperimentet.
- Etter 10 dager, fjern plantene fra vekstkammeret og inokuler plantene med U. maydis celle suspensjon kultur ved hjelp av en nål injeksjon inokulering metode. Merk: Maisplanter kan inokuleres 7 dager etter planting8-10. Teosinte plantene er imidlertid for små etter 7 dager. Inokuler derfor både mais og teosinte planter 10 dager etter planting for konsistens i forsøket (se trinn 2.12).
2. Inokulering av nåleinjeksjon
- Gjør alt arbeid i en laminær strømningshette. Fjern U. maydis glyserollagre fra fryselageret. Bruk en steril sløyfe og strek glyserol lagre av U. maydis wild-type stammer 1/2 (parring type a1b1) og 2/9 (parring type a2b2, nær isogene til 1/2) på potet dextrose agar (PDA) plater. Oppretthold stammer separat.
- Plasser PDA-plater strødd med U. maydis i en 30 °C inkubator i to dager. Hvis du bruker et annet biotrofisk patogen, bruk riktig stamme, media og vekstforhold. Overvåk veksten av patogenet i løpet av to dager for å sikre at U. maydis-stammen vokser godt.
- Fjern PDA-platene fra inkubatoren etter to dager. Platene skal ha god patogenvekst og inneholde enkeltkolonier (Figur 2A). Det er viktig å skaffe enkeltkolonier. Hvis enkle kolonier ikke er til stede, gjenta platene i lavere konsentrasjon.
- Gjør alt arbeidet i en laminær strømningshette. Bruk en steril tannpirker til å velge en enkelt koloni for hver stamme fra PDA-platene. Legg tannpirkeren som inneholder en enkelt koloni, i en 3 ml potetdekstrosebuljong (PDB). Det anbefales å ha 2-3 kulturer.
- Plasser 3 ml PDB-kulturer i en 30 °C inkubator/shaker i to dager ved 200 o/min. Overvåk kulturens vekst over todagersperioden for å sikre vekst i kulturen. Kulturen skal virke veldig overskyet.
- Fjern væskekulturene fra inkubatoren/shakeren og mål konsentrasjonen ved OD600 for å sikre at cellene ble dyrket til en OD på 1,0 (~1 x 107 celler/ml)17.
- Bring U. maydis celle suspensjon kulturer til en endelig konsentrasjon på 1 x 106 celler / ml, ved hjelp av vann i et endelig 30 ml kulturvolum. Denne konsentrasjonen resulterer konsekvent i god infeksjon av plantene med patogencellefjæringskulturen. 17
Merk: Ulike cellefjæringskonsentrasjoner bør testes ved bruk av forskjellige patogenstammer for å bestemme riktig celletitrering som trengs for inokulering18,19. Den gitte endelige konsentrasjonen for cellefjæringskulturen kan brukes som utgangspunkt for tittering. Riktig konsentrasjon av patogencellefjæringskulturen bør verifiseres ved å visualisere plantefenotypene med god infeksjon (Figur 3A-E).
- Bland like store mengder av de to U. maydisstammene før inokulering. Hvis du bruker en patogenstamme, fortsett til trinn 2.9. Forbered ferske U. maydis celle suspensjon kulturer for hver inokulasjon eksperiment og kaste celle suspensjon kulturer etter to dager.
- For eksperimentell kanyleinjeksjonsinokulering, fyll en 3 ml sprøyte med U. maydis celle suspensjon kultur ved å trekke celle suspensjon kultur inn i sprøyten.
- For kontrollnålinjeksjonsinokulering, fyll en 3 ml sprøyte med vann17. Bruk samme prosedyre for eksperimentell nåleinjeksjonsinokulering.
- Fest en hypodermisk kanyle på 0,457 mm x 1,3 cm til enden av hver 3 ml sprøyte. Den valgte nålestørrelsen vil levere cellefjæringskulturen mellom plantebladene med minimal skade på plantevevet.
- Fjern eksperimentelle og kontrollplanter fra vekstkammeret 10 dager etter planting som forberedelse til sprøyteinduksjonsinokulering (Figur 2B) (se trinn 1.7).
- Sett forsiktig den hypodermiske nålen som inneholder U. maydis cellefjæringskulturen inn i stammen av en eksperimentell plante i en 90° vinkel like over jordlinjen. Sett inn nålen til den er midt i stammen. Ikke skyv kanylen gjennom stammen (Figur 2C).
- Injiser den eksperimentelle planten med ca 100 μl av U. maydis celle suspensjon kultur18,19. Dette vil variere litt avhengig av frøplantens høyde. Cellefjæringskulturen vil presse gjennom stammen og bevege seg inn i plantens virvel. Cellefjæringskulturen vil være synlig i plantens virvel. Fortsett å injisere 100 μl av cellefjæringskulturen i hver enkelt plante til 3 ml sprøyten er tom.
- Etter injeksjonen, fjern forsiktig nålen fra plantestammen. Fjern kanylen fra den nå tomme 3 ml sprøyten og fyll med vann. Fest kanylen tilbake til sprøyten og skyv vannet gjennom nålen for å fjerne plantevev som kan bli fanget i nålespissen.
- Gjenta trinn 2.9-2.15 for hver eksperimentelle plante. Følg samme protokoll for kontrollanleggene ved å injisere vann.
- Plasser de inokulerte eksperimentelle og kontrollanleggene tilbake i vekstkammeret. Vann plantene daglig ved å fukte jorda, ikke plantevevet.
- Sjekk plantene daglig for å oppdage patogenutvikling og plantemotstandsreaksjoner.
3. Motstand Reaksjon Screening
- Skår og registrer motstandsreaksjonene for hver plante 7, 10, 14 og 21 dager etter inokulering (dpi) ved hjelp av en 1 til 5 motstandsreaksjonsvurderingsskala. Alvorlighetsgraden for sykdommen øker etter hvert som de numeriske verdiene på vurderingsskalaen øker (Tabell 2). En 1C (Leaf klorose), 1A (Leaf anthocyanin produksjon), eller 2 (små blad galls) motstand reaksjon indikerer motstand. En 3 (stamme galls), 4 (basal gall) eller 5 (plantedød) motstand reaksjon indikerer følsomhet (Figur 3A-E og Tabell 2)18,19.
- Skår både eksperimentelle og kontrollanlegg og registrer resistensreaksjonsvurderinger.
- Sammenlign motstandsreaksjonene til eksperimentelle og kontrollanlegg. Velg eksperimentelle planter med en reaksjonsrangering på 1C, 1A eller 2. Disse plantene anses å være motstandsdyktige mot U. maydis18,19.
- Gjenta hele eksperimentet for å verifisere plantens fenotyper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En vellykket nåleinjeksjonsinokulering kan bestemmes ved å visualisere fenotypen til plantene inokulert med U. maydis (eksperimentell). Flertallet av de eksperimentelle plantene var utsatt for U. maydis-infeksjon. De mottakelige plantene viste svært alvorlig sykdomsutvikling demonstrert ved stamme- og basal galledannelse med svarte teliosporer (Figur 3D og 3E, Tabell 2). Flere planter var døde etter inokulasjon på grunn av alvorlighetsgraden av sykdommen. Tre mais x teosinte introgresjonslinjer som var motstandsdyktige mot U. maydis ble identifisert. For planter som er resistente mot U. maydis, ble en vellykket inokulasjon demonstrert ved mindre klorose, antocyaniinproduksjon eller mindre blad galledannelse. (Figur 3A-C og Tabell 2).
For å verifisere at fenotypen som ble observert for de eksperimentelle plantene var et resultat av inokulasjonen, ble fenotypene til eksperimentelle og kontrollanlegg (vanninokulert) sammenlignet. De eksperimentelle plantene viste patogenutvikling på blad- og/eller stammeområdet som beskrevet ovenfor for de resistente og mottakelige plantene. Omvendt viste kontrollanleggene ikke en fenotype. Kontrollene plantene var veldig rene og viste ikke patogenutvikling på noen del av planten, noe som indikerer at patogenutvikling på eksperimentelle planter skyldtes nåleinjeksjonsinokulering med U. maydis.
For å verifisere reproduserbarheten og effektiviteten til nåleinjeksjonsinokuleringsmetoden ble eksperimentet utført to ganger bestående av 700 planter og sammenlignet motstandsreaksjonspoengene (fenotyper) for eksperimentelle planter i og mellom eksperimenter for hver plantelinje. De fire replikerer planter fra samme plantelinje i ett eksperiment viste samme motstandsreaksjonsscore for 99,8% av plantene. I tillegg ble de fire replikeringsanleggene sammenlignet mellom eksperimenter og indikerte at 99,4% av plantene viste samme motstandsreaksjonspoeng. Dette antyder at nåleinjeksjonsinokuleringsmetoden effektivt kan levere U. maydis cellefjæringskulturen mellom plantebladene og at inokulasjonene og fenotypene var konsistente i og mellom eksperimenter.
Figur 1. Maisfrø plantet for inokulasjon. A) Seks maisfrø plassert på toppen av jord for planting. B) Skyv frøene 1/2 tomme ned i jorden med fingeren.
Figur 2. Strømningsskjema over nåleinjeksjonsinokuleringsprosessen. A) Veksten av U. maydis stripet på PDA-plater etter to dagers inkubasjon ved 30 °C. B) Flat av uinokulerte 10 dager gamle frøplanter fjernet fra vekstkammeret. C) Nål injeksjon inokulering i stammen av ti dager gammel frøplante med 100 μl av U. maydis celle suspensjon kultur.
Figur 3. Plante fenotypiske responser på U. maydis injeksjon inokulering. A) Motstandsdyktige teosinte planter med mindre bladklorose utstilt av hvite striper på bladene. Fenotypen tilsvarer en 1C-resistensreaksjonsrangeringspoengsum. B) Motstandsdyktige teosinte planter med Anthocyanin produksjon utstilt av lilla bladfarge. Fenotypen tilsvarer en 1A motstandsreaksjonsvurderingspoengsum. C) Motstandsdyktige teosinte planter med mindre blad gall utvikling. Fenotypen tilsvarer en 2 motstandsreaksjonsrangeringspoeng. D) Mottakelige maisplanter med alvorlig stamme galle utvikling og svarte teliosporer. Fenotypen tilsvarer en 3 motstandsreaksjonsrangeringspoeng. E) Mottakelige maisplanter med alvorlig basal galleutvikling. Fenotypen tilsvarer en 4 motstandsreaksjonsrangeringspoengsum. Fenotyper tilsvarer resistensreaksjonsskalaen og sykdomssymptomene i tabell 2. Klikk her for å vise større figur.
| Plante linjer | planteart | Motstandsrespons |
| 1. Zea mays (NSL 30060) | mais | motstandsdyktig |
| 2. Zea mays subsp. mays (PI511562) | Teosinte | mottakelig |
| 3. Zea mays subsp. Parviglumis | Teosinte | mottakelig |
| 4. Zea mays subsp. Diploperennis | Teosinte | motstandsdyktig |
| 5. Zea mays subsp. Luxurians | Teosinte | motstandsdyktig |
| 6. B73 (P1) | mais | mottakelig |
| 7. Parviglumis (P2) | Teosinte | mottakelig |
| 8. Z031E0560 | Mais x Teosinte NIL | motstandsdyktig |
| 9. Z031E0560 | Mais x Teosinte NIL | motstandsdyktig |
| 10. Z031E0068 | Mais x Teosinte NIL | motstandsdyktig |
| 11. 37 mais x teosinte NILs | Mais x Teosinte NILs | mottakelig |
Tabell 1. Motstandsresponser av mais og teosinte linjer inokulert med U. maydis. P1 angir nils overordnede. P2 angir nils overordnede. NIL indikerer nærisogene linjer.
| Svar fra vert | Sykdomsvurdering* | Sykdom Symptomer* |
| motstandsdyktig | 1C | Få klorotiske områder, ingen galledannelse. |
| motstandsdyktig | 1A | Mørk lilla antocyaniinproduksjon, få galls dannet. |
| motstandsdyktig | 2 | Mindre blad galls. |
| mottakelig | 3 | Alvorlige stamme galls med dannelsen av svarte teliosporer. |
| mottakelig | 4 | Store basale galls med dannelse av svarte teliosporer |
| mottakelig | 5 | Død av planter med alvorlig blad, stamme og basale galls. |
Tabell 2. Motstand reaksjon rating system som brukes for U. maydis scoring. *Vurderings- og sykdomssymptomer tilsvarer fenotypene i figur 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne studien var nåleinjeksjonsinokuleringsmetoden som brukes til å levere en stamme av U. maydis i stammen av 700 mais- og teosinteplanter vellykket. I tillegg ble en revidert sykdomsresistensvurderingsskala brukt til å screene plantene og oppdage patogenutvikling. Som et resultat av bruk av begge metodene ble plantelinjer som er resistente mot U. maydis identifisert blant 700 mais- og teosinteplanter som nå kan kombineres og testes i avlsprogrammer for forbedret sykdomsresistens.
Som med de fleste inokulasjonsmetoder er evnen til å reprodusere samme motstand fenotype blant planter fra samme linje viktig. I tillegg må de samme resistensfenotypene observeres i minst to separate eksperimenter20,21. Fordi evnen til å oppnå en plantefenotype, enten den er resistent eller utsatt, først og fremst bestemmes av patogenets evne til å få tilgang til plantevevet, er det svært viktig å velge en inokulasjonsmetode som leverer patogenet mellom planten forlater hver inokulasjon. Noen av de vanligste problemene forskere har møtt med sprøyteinjeksjonsinokuleringsmetoder ved hjelp av biotrofiske sopppatogener som U. maydis er: 1) Upassende konsentrasjon av sopppatogen som brukes til inokulasjon, 2) mangel på reproduserbare fenotyper i flere eksperimenter, og 3) mangel på en etablert resistensreaksjonsscoringsmetode. Her løses hvert av problemene separat.
Det er viktig å bestemme riktig konsentrasjon av sopppatogencellefjæringskulturen som brukes til inokulasjon8-11,22. Inokulering med høye konsentrasjoner av patogencellefjæringskulturen vil føre til død av både resistente og mottakelige planter, mens lave konsentrasjoner ikke vil vise en fenotype på noen av plantetypene. Imidlertid vil den aktuelle konsentrasjonen av sopppatogencellefjæringskulturen som brukes til inokulering variere avhengig av flere faktorer, inkludert patogen, patogenstamme, plantearter og plantetiltredelse. De nåværende protokollene gir fenotyper og en konsentrasjon for U. maydis celle suspensjon kultur som skal brukes som utgangspunkt for å teste titeret for nål injeksjon inokulering. Dette resulterer i konsistente plantefenotyper i og mellom ulike eksperimenter. Cellefjæringskulturkonsentrasjonen som brukes til U. maydis-inokuleringer kan også brukes som startkonsentrasjon for inokulasjoner med andre biotrofiske sopppatogener. Det anbefales å teste forskjellige fortynninger av patogencellefjæringskulturen ved bruk av andre biotrofiske sopppatogener. Dette vil lette valget av den beste konsentrasjonen for patogencellefjæringskulturen som brukes til inokulasjon.
Et stort antall planter må vanligvis inokuleres og screenes fra en plantepopulasjon for å potensielt identifisere planter som er resistente mot patogenet av interesse6,23. Derfor er det viktig å bruke en inokulasjonsmetode som på en pålitelig måte leverer patogencellefjæringskulturen mellom plantebladene, og at dette gjøres med relativt letthet og liten manipulering av plantene. Dette vil lette reproduserbare fenotyper i flere eksperimenter. De nåværende protokollene gir en detaljert oversikt over en nåleinjeksjonsinokulering i stammen av mais- og teosinteplanter med en U. maydis cellefjæringskultur. Denne metoden kan også brukes til inokulering av andre plantearter som ligner mais og teosinte. For å forårsake sykdom i planten, må U. maydis flytte inn i plantevevet7,21,24. Under naturlig infeksjon beveger U. maydis seg inn i plantevevet gjennom stomatale åpninger eller sår på plantebladoverflaten. En dip inokulering og plante virvel pipettering metode har også blitt brukt til å etterligne U. maydis naturlig infeksjonsprosess, men har hatt begrenset suksess på grunn av variasjonen i patogenene evne til å trenge inn i plantevevet8-10,25. Nåleinjeksjonsinokuleringsmetoden leverer imidlertid U. maydis cellefjæringskulturen mellom plantebladene og eliminerer patogenpenetrasjonsproblemet.
Etablering av en motstandsreaksjonsvurderingsskala for U. maydis i hovedsak for å identifisere planter som er resistente mot patogenet25. De nåværende protokollene gir en detaljert beskrivelse av 1 (resistent) til 5 (utsatt) sykdomsvurderingsskala etablert for U. maydis infeksjon av mais og teosinte planter. Det er impotent å først utføre en testinokulasjon og screene et lite antall planter før du starter et stort eksperiment med hundrevis av planter. Motstandsreaksjonsvurderingsskalaen som er etablert i den nåværende protokollen, består av fenotyper for 700 planter i to forskjellige eksperimenter. Det anbefales å gjenta inokulasjons- og screeningprotokollene minst to ganger for å demonstrere konsistens og reproduserbarhet av resultatene.
Den nåværende nåleinjeksjonsinokuleringsmetoden og den etablerte resistente reaksjonsvurderingsskalaen vil fortsatt bli brukt til å screene og velge mais- og/ eller teosinteplanter som er resistente mot U. maydis-infeksjon. Som et resultat har de to metodene mange viktige implikasjoner i landbruket som kan brukes i avlsprogrammer for forbedret motstand mot U. maydis infeksjon avtagende avkastningstap i USA og internasjonalt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfattere har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Emir Islamovic for laboratorie- og drivhusassistanse. Vi takker også Dr. Sherry Flint-Garcia for å ha gitt mais x teosinte introgression linjer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Seed for plants | Collected from original crosses | ||
| Growth chamber | Conviron | PGR14 REACH-IN | |
| Planting flats | Hummert International | 14-3385-2 | |
| Soil (3 parts pine bark; 1 part peat moss with perlite) | Hummert International | 10-1059-2 | |
| Laminar flow hood | Lab Conoco | 70875372 | |
| Glycerol stock of pathogen (U. maydis) or fungal pathogen of interest | Stocks were grown from original culture | ||
| Sterile loop | Fisher Scientific | S17356A | |
| Potato dextrose agar (PDA) plates | Fisher Scientific | R454311 | |
| Incubator set to 30 °C | Fisher Scientific | 11-690-650F | |
| Sterile toothpicks | Walmart | Purchased from Walmart and sterilized by autoclave | |
| Potato dextrose broth (PDB) | Fisher Scientific | ICN1008617 | |
| Incubator-shaker set to 30 °C | New Brunswick | 14-278-179 | |
| Spectrophotometer | Fisher Scientific | 4001000 | |
| U. maydis cell suspension culture (1 x 106 cells/ml) | Grown from glycerol stock as described in the methods | ||
| 3 ml Syringes | Becton Dickinson | 309606 | |
| .457 mm x 1.3 cm Hypodermic needles | Kendall Brands | 8881250321 |
References
- Smith, J. T. Crop fungal resistance developed using genetic engineering and antifungal proteins from viruses. , ISB News. report http://www.isb.vt.edu/news/2011/nov/cropfungalresistance.pdf (2011).
- Sher, A. F., MacNab, A. A. Vegetable diseases and their control. , 2, John Wiley & Sons Inc. New York, NY. 223-226 (1986).
- Crepet, W. L., Feldman, G. D. The earliest remains of grasses in the fossil record. Am. J. Bot. 78, 1010-1014 (1991).
- Iltis, H. H. Maize evolution and agricultural origins. Grass systematic and evolution. Scoderstrom, T. R., Hilu, K. W., Campbell, C. S., Barkworth, M. E. , Smithsonian Institution Press. Washington D.C.. 195-213 (1997).
- Mangelsdorf, P. C., Reeves, R. G. The origin of corn. III. Modern races, the product of tesonite. Bot. Mus. Leafl.. 18, 389-411 (1957).
- Agrios, G. N. Plant Pathology. , Academic Press. New York. (1997).
- Dean, R., et al. The top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology. Mol. Plant. Pathol. 13, 414-430 (2012).
- Estrada, A. E., Jonkers, W., Kistler, H. C., May, G. Interactions beteen Fusarium verticillioides, Ustilago maydis, and Zea mays: An endophyte, a pathogen, and their shared plant host. Fung. Genet. Biol. 49, 578-587 (2012).
- Freeman, S., Rodriguez, R. J. A rapid technique for assessing pathogenicity of Fusarium oxysporum f. sp niveum and F. o. melonis on cucrbits. Plant Dis. 77, 1198-1201 (1993).
- Gottwald, T. R., Graham, J. H. A device for precise and nondisruptive stomatal inoculation of leaf tissue with bacterial pathogens. Phytopathol. 82, 930-935 (1992).
- Posada, F., Aime, M. C., Peterson, S. W., Rehner, S. A., Vega, F. E. Inoculation of coffee plants with the fungal entomopathogen Beauveria bassiana (Asomycota: Hypocreales). Mycolog. Res. 111, 748-757 (2007).
- Bolker, M., Bohnert, H. U., Braun, K. H., Gorl, J., Kahmann, R. Tagging pathogenicity genes in Ustilago maydis by restriction enzyme-mediated intergratior (REMI). Mol. Gen. Genet. 6, 274-283 (1991).
- Brachmann, A., Weinzierl, G., Kamper, J., Kahmann, R. Identification of genes in the bW/bE regulatory cascade in Ustilago maydis. Mol. Microbiol. 42, 1047-1063 (2001).
- Christensen, J. J. Corn smut caused by Ustilago maydis. Monograph number 2. , The American Phytopathological Society. (1963).
- Skibbe, D. S., Doehlemann, G., Fernandes, J., Walbot, V. Maize tumors caused by Ustilago maydis require organ-specific genes in host and pathogen. Sci.. 328, 89-92 (2010).
- Kamper, J., et al. Insights from the genome of the biotrophic fungal plant pathogen Ustilago maydis. Nature. 444, 97-101 (2006).
- Allen, A., Kaur, J., Gold, S., Shah, D., Smith, T. J. Transgenic maize plants expressing the Totivirus antifungal protein, KP4, are highly resistant to corn smut. Plant Biotechnol. J. 8, 857-864 (2011).
- Gold, S. E., Brogdon, S. M., Mayorga, M. E., Kronstad, J. W. The Ustilago maydis regulatory subunit of a cAMP-Dependent protein kinase is required for gall formation in maize. , (1997).
- Gold, S. E., Kronstad, J. W. Disruption of two chitin syn- thase genes in the phytopathogenic fungus Ustilago maydis. Mol. Microbiol. 11, 897-902 (1994).
- Brefort, T., Doehlemann, G., Mendoza-Mendoza, A., Reissmann, S., Djamei, A., Kahmann, R. Ustilago maydis as a Pathogen. Annu. Rev. Phytopathol. 47, 423-445 (2005).
- Doehlemann, G., Wahl, R., Vranes, M., de Vries, R., Kämper, J., Kahmann, R. Establishment of compatibility in the Ustilago maydis/maize pathosystems. J. Plant Physiol. 165, 29-40 (2008).
- Reineke, G., Heinze, B., Schirawski, J., Buettner, H., Kahmann, R., Base, C. W. Indole-3-acetic acid (IAA) biosynthesis in the smut fungus Ustilago maydis and its relevance for increased IAA levels in infected tissue and host tumor formation. Mol. Plant Pathol. 9, 339-355 (2008).
- Martínez-Espinoza, A., García-Pedrajas, M. D., Gold, S. E. The Ustilaginales as Plant Pests and Model Systems. Fungal Genet. Biol. 35, 1-20 (2002).
- Banuett, F. Genetics of Ustilago maydis, a fungal pathogen that induces tumors in maize. Annu. Rev. Genet. 29, 179-208 (1995).
- Keen, N. T. A century of plant pathology: a retrospective view on understanding host-parasite interactions. Annu. Rev. Phytopathol. 38, 31-48 (2000).
