Summary
Burkholderia의 속의 구성원은 임상 중요성 병원균이다. 우리는 기계적 중단하고 후속 단백질체 분석에 2-D 겔 전기 영동을 사용하여, 전체 박테리아 단백질을 추출하는 방법을 설명한다.
Abstract
세균 종의 세포 내 단백질 수준의 조사가 이들 유기체에 기인 한 질병의 발병 기전을 이해하는 데 중요하다. 여기에서 우리는 인산염 완충 생리 식염수에 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 및 페닐 메틸 불소의 존재에 유리 구슬을 사용하여 기계적인 용해에 따라 부르크 홀데 리아 종에서 단백질을 추출하는 절차를 설명합니다. 이 방법은 다른 성장 조건을 위해, 다른 부르크 홀데 종에 사용될 수 있고, 다른 균의 프로테오믹스 연구에 사용하기위한 것으로 적당하다. 단백질 추출 후, 이차원 (2-D) 겔 전기 단백체 기술은 이러한 유기체의 프로테옴에서 해외 변화를 연구하는 기술된다. 이 방법은 분자량에 기초하여 분액하여 제 차원에서 등전위 포커싱에 의해 그들의 등전점에 따라 단백질의 분리, 이루어져두 번째 차원에서 아크릴 아마이드 겔 전기 영동에 의해. 분리 된 단백질의 시각화를 실버 염색으로 수행된다.
Introduction
속 부르크 홀데 이상의 62 종, 틈새의 넓은 범위로부터 분리 그람 음성균를 포함하고, 그것은 두 가지 주요 클러스터 1,2에서 분할된다. 첫번째 클러스터는 인간, 동물 및 phytotrophic 유기체를 포함하고, 대부분의 연구는 그들의 임상 적 중요성이 그룹의 병원성 종에 초점을 맞추고있다. 대부분의 병원성 회원 B.합니다 의 pseudomallei와 B. (각각 melioidosis 및 저병의 원인이됩니다) mallei 3,4 및 낭포 성 섬유증 (CF) 및 만성 육아 종성 질환 (CGD)에 질병을 일으키는 원인이 기회 병원균 5 (Burkholderia의의 세파 시아 단지, BCC의 정의 17 종), 1. 이상의 30 비병원성 종 번째 클러스터는, 식물 또는 환경과 연관된 박테리아를 포함하고, 호스트 (2)에 대한 잠재적으로 유리한 것으로 간주된다.
많은 합병증은 FR 등장이러한 이유로 인해 경우 6-9 대부분의 근절하기 위해 열심히하는 항생제에 내장 함수 나 인수 저항의 환자, 질병의 확산 및 치료 실패의 병원체의 전송로 Burkholderia의 속의 병원성 멤버와 톰 세균 감염. 따라서 세균 감염의 설립을위한 기준의 명확한 이해를 얻는 것은 이러한 생물에 의한 질병의 치료에 매우 중요합니다. 감염의 확립에 대한 통찰력을 얻기 위해, 병인과 관련된 세균 성분에 대한 광범위한 연구가 필요하다. 프로테오믹스 방법을 사용 부르크 홀데 유기체의 프로테옴 분석에 집중 연구는 세균성 병인에 연루뿐만 아니라 프로테옴 변화가 10-16 프로파일 된 단백질을 설명했다.
높은 진한 함유 용해 버퍼에서 초음파 처리 및 동결 해동 사이클을 이용한 단백질 추출 방법요소의 entration, 세제 및 양쪽 성과 함께 티오는 Burkholderia의 프로테오믹스 연구 10-13에 적용되었습니다. 우레아는 단백질 변성에 대해 매우 효율적이지만, 그것에 의해 (의해 carbamylation 반응) 아티팩트 (17)를 형성하는 아미노산 그룹과 반응 할 수있는 암모늄 이소시아네이트와 수용액 평형을 확립 할 수있다. 따라서, 시안의 청소부 역할을 캐리어 양쪽 성을 포함, 37 ° C 17 이상의 온도를하지 않는 것이 좋습니다. 또한, 단백질 정량화 함께 용해 완충액의 화학적 간섭을 방지하기 위해, 동일 용해 완충액은 샘플 및 표준이 동일한 배경 (10)를 가질 수 있도록 표준 곡선을 생성하는데 사용될 수있다. 다른 방법은 열 배양 기간 (17, 18)와 알칼리 버퍼와 세제의 사용을 포함하지만 이러한 조건은 프로테옴의 변화를 유도 할 수 있으며 일부 세제 홍보와 호환되지 않습니다oteomics 출원은 후속 세제 제거 단계 (17, 18)를 포함하지 않는 경우.
적절한 추출 및 정량 한 결과, 각각의 단백질의 해외 단백질 발현은 이차원 (2-D) 겔 전기 영동 등 프로테오믹스 방법을 사용하여 조사 할 수있다. 이 기술은 제 O'Farell 19에 의해 설명되고 제 차원에서 아크릴 아마이드 겔 전기 영동에 의해 제 차원에서 등전위 포커싱에 의해 그들의 등전점에 따라 단백질을 분리 한 다음 그 분자량에 따른 것으로 구성 하였다. 그것의 해상도와 감도로,이 기술은 복잡한 생물학적 소스 (19, 20)에서 단백질의 분석 및 검출을위한 강력한 도구입니다. 이 분리 기술은 전사 후 수정이나 단백질 분해 처리에 의한 단백질 이소 해결의 큰 장점과 단백질 중심의 접근 방식에서 현재 사용할 수 있습니다. 양 변경겔 (20)의 염색 후에 해당 스팟의 강도를 비교함으로써 검출 될 수있다. 그러나,이 기술은 매우 큰 단백질, 막 단백질, 매우 염기성 및 산성 또는 소수성 단백질의 식별에 적합하고, 다소 힘들고 시간 소모적 기법 20 아니다. 보다 강력하고 객관적 새로운 펩타이드 중심의 접근 방식 (비 젤 기준) 사용할 수있게하고 (ICAT) 21에 태그를 동위 원소 코드 친화력에 의해 시스테인 라벨 및 아미노기로 차등 안정 동위 원소 표지 방법으로 정량적 비교를 위해 사용될 수있다 상대 및 절대 정량 (iTRAQ) 22 동위 원소의 태그에 의해 표시. 하나의 프로테오믹스 기술의 사용은 충분한 정보를 줄 수도 있으므로 두 개의 보완적인 단백질 체학 접근 방법의 사용은 프로테옴에서 가장 완벽하게 평가하는 변화가 필요합니다. 그럼에도 불구하고, 2-D 겔 전기 널리 사용되며 일상적 콴 적용될 수있다다른 생물의 여러 단백질의 발현을 titative.
여기에 우리가 적응하고 최적화 된 GE 헬스 케어 2-D 전기 원리 및 방법 핸드북 80-6429-60AC 2004 (한 부르크 홀데 리아 종에 대한 전체 세포 단백질 추출 및 2-D 겔 전기 영동 절차에 대해 설명 www.amershambiosciences.com )를. 단백질 추출은 5 mM의 EDTA (에틸렌 디아민 테트라 아세트산) 및 1mM의 PMSF (페닐 메틸 설 포닐 플루오 라이드)를 함유하는 PBS의 존재하에 유리 비드와 비드 비터를 사용하여 실시 하였다. 이 절차는 최소한의 분해와 단백질의 정량화를 허용하고 이전에보고 15,23,24 등 프로테오믹스 방법에 대한 수정할 수있는 것입니다. 2-D 겔 전기 영동은 24 ㎝ 길이 고정화 pH를 4-7 구배 및 단백질을 사용하여 수행된다 그들의 등전점에 따라 분리 하였다. 그런 단백질은 자신의 molec에 따라 분리SDS-폴리 아크릴 아마이드 젤에 의해 신경근 무게. 또한, 우리는 자리 단백질의 시각화 및 질량 분석기 분석을위한 호환 실버 얼룩 방법을은 염색 방법을 설명했다. 함께 이러한 절차는 병인에 관여 할 수 부르크 홀데 리아 종에서 중요한 단백질의 식별을 허용 할 수 있습니다.
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Protocol
1. 문화의 성장 (일 1 +2)
- 밤새 37 ° C의 회전에 스냅 상위 15 ML 튜브에 루리아 베르 타니 (LB) 국물 3 ㎖ : 스타터 문화를 성장. OD 0.6의 600 하룻밤 성장을 희석. 250 ㎖의 삼각 플라스크에 LB 액체 배지 100 ㎖에이 희석 1 ML을 추가합니다. 더 나은 약을, 고정상 (SP)에 16 시간 동안 250 rpm으로 진탕 37 ° C에서 알을 품다 배치 문화, 감염 조건과 같은 업무를 간소화하고 쿼럼 정지상 신호 요인의 통제하에 그 박테리아 독성 요인을 보장하기 위해 감지, 표현된다. 대안 적으로, 초기 SP 또는 중간 또는 늦게 대수 성장 단계에서 박테리아 박테리아 적응 위상에 대한 정보를 얻기 위해 사용될 수있다.
- 16 시간이 OD 600을 측정하고 확인 후 문화는 동일한 조건에서 이전에 생성 된 성장 곡선과 비교하여 SP에 도달하였습니다.
2. 단백질 추출 (3 일)
- 신선한 0.1 M 페닐 메탄, 불화 PMSF ( '주의'PMSF가 사용 얼굴 방패와 장갑 독성과 부식성이)입니다 ( '주의'아세톤 아세톤 1 ㎖에서의 0.0174 g을 용해하여 아세톤 (PMSF, 174.19 g / 몰) 솔루션을 준비합니다 독성 및 가연성) 얼굴 방패와 장갑을 사용합니다.
- 0.1 ml의 0.1 M PMSF, 0.5 M EDTA 0.1 ml의 PBS의 9.8 ML : PBS / EDTA / PMSF 솔루션을 구성한다. 이 SP에 있어야 할 곳에 16 시간 문화의 OD는 약 확인합니다.
- 4 ℃에서 20 분 동안 4,500 × g에서 오크 릿지의 원심 분리기 튜브와 원심 분리기 문화 박테리아 문화와 전송의 35 mL를 취하여
- 폐기물 용기에 상층 액을 제거하고냉각 PBS의 35 ML을 추가하고 펠렛을 재현 탁. 원심 분리기 다시 20 분 동안 4,500 × g에서 4 ℃에서
- 차가운 PBS 1 ㎖에 뜨는에 resuspend를 제거합니다. 2 ㎖ 에펜 도르프, 4 ℃에서 14,000 × g에서 마이크로 원심 높은에 원심 분리기 1 분 멸균로 전송 제거하고 상층 액을 버린다.
- PBS / EDTA / PMSF 용액 1 ㎖를 추가, 2 ㎖에 펠릿 및 전송 ~ 0.5 ㎖의 유리 구슬 (presterilized)를 포함 (O-링) 캡 튜브를 나사를 resuspend. 유리 구슬과 구슬 차가운 방에서 1 분 동안 4 ° C에서 그들을 비난이 들어있는 튜브에 다시 중단 펠렛을 추가합니다. 각 강타 후 얼음에 샘플을 넣고,이 배를 수행합니다.
- 마이크로 원심에서 1 분 동안 14,000 XG에 원심 분리기. 뜨는을 제거하고 멸균 5 ML의 폴리스티렌 튜브에 넣어.
- 수율이 같은 튜브에 PBS / EDTA / PMSF 용액 1 ㎖를 추가 높이려면 다시 유리 구슬을 포함한다. 구슬 bash는 1 분 4 ° C에서 튜브. 이 배는 얼음 AF에 샘플을 넣어 마십시오타 강타. 원심 분리기의 한 분 14,000 XG에 원심 분리기 및 뜨는을 제거하고 단계 2.8에서 뜨는을 추가 할 수 있습니다. 새로운 멸균 2 ㎖ 에펜 도르프 튜브에 폴리스티렌 튜브에서 1 ML의 주사기와 0.20 μm의 필터 뜨는을 사용합니다.
- 이때 시료는 피어스 MicroBCA 단백질 추출 키트 및 200 μg의 분취 량을 사용하여, 단백질의 양에 대해 분석한다은 냉동되어야 -80 ° C까지 필요한.
3. 샘플 준비 (4 일)
- 25 ml의 수분 보충 주식 솔루션을 준비합니다 (8 M 요소, 2 % CHAPS, 2 % IPG 버퍼, 블루 0.002 % 브로 모 페놀) -20 ℃에서 2.5 ㎖를 분취에 저장 수분 보충 원액 2.5 ㎖를 분취에 사용하기 바로 전에 7 MG 디티 오 트레이 톨 (DTT, 154.2 g / 몰)를 추가합니다.
- 프로세스 단계 3.1에서 제조 한 수분 보충 원액 450 μL의 최종 재 부상과 장비를 2-D 클린을 사용하여 단계 2.10에서 샘플을 해동.
4. 처음으로집중 차원 등전점 (IEF) (주 4)
이 섹션의 모든 단계는 Ettan IGPhor IEF 시스템을 사용하고 있습니다.
- IPG 첫 번째 차원 스트립 설정 : 지구 청소 솔루션으로 깨끗한 스트립 홀더를 한 후 건조 거꾸로두고, 밀리 Q 물에 씻는다. 겔 스트립 홀더 번호로 각 샘플을 할당합니다.
- (-) 끝에서 두 번째 넓은 지역에서 재수 단계에서 샘플을로드합니다. 포장 중 젤 스트립을 당겨 깨끗한 집게를 사용합니다. 겔 스트립에서 보호 층을 가지고. (+) 끝과 끝 (-) 선에서 길을 따라 젖은 스트립을 얻을 수있는 느린, 슬라이딩 동작으로 거친면을 제거합니다.
- 소모를 방지하기 위해 전극 위에 겔 스트립에서 멸균 물에 젖은 모래 바닥 용지를 넣습니다. 정제수, 에탄올와 라운드 사이에 핀셋을 씻어. 모든 거품을 제거 건조 아웃을 방지하기 위해 미네랄 오일을 얇게 오버레이. 시스템에 겔 스트립 홀더 라인.
- rehyd 20 ° C에서 12 시간을 실행식량, 200 V에서 1 시간, 500 V에서 1 시간, 1,000 V에서 1 시간, 4,000 V에서 0.5 시간, 8,000 V에서 12 시간, 300 V 및 24 시간 파악이 시간에 밖으로 가지고 갈 수있다.
- IEF가 완료된 후 IPG 스트립 향후 분석을 위해 미네랄 오일로 코팅 사란 랩 -80 ° C에서 동결되지 않는 한, 그것은 제 차원 SDS-폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동을 수행하는 것이 추천된다. 대안으로 인해 DTT 액세스 포인트에 스트리킹을 피하기 위하여는 IPG는 요오도 아세트 아미드를 포함하는 완충액으로 종래 초 차원 스트립 제 평형화 단계를 더 포함 할 수있다.
5. 두 번째 차원 SDS-폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동 (5 일)
이 섹션의 모든 단계는 Ettan DALTsix 전기 영동 장치를 사용하고 있습니다.
- 젤 캐스터 장치를 조립하기 위해, 철저하게 모든 구성 요소를 청소하고 있는지 확인 겔 캐스터 수준 및 바인딩 회색 고무 실리콘 젤로 윤활된다. 블랙 마찰을 넣어바닥에 삼각형 마개를 발상지. 그런 다음, 교대 유리 전면을 마주의 짧은 플레이트를 분리하고 유리판을 배치합니다. 구분은 뒷면과 앞면에 있는지 확인합니다. 필러 (약 5 매)에 남아있는 공간을 채우기 때문에 정상은 평평하다. 외부에 레드 팁에 전면 패널을 넣어. 사용은 각 측면을 강화하고 하단 나사를 조여 클램프.
- 젤 준비 : Duracryl의 297.3 ML을 추가, 트리스 버퍼의 147 ml의 1.5 M 산도 8.8, 진공 팁이 포함와 플라스크에 밀리 Q 물 143.3 ㎖ ( '주의'Duracryl 독성 사용 얼굴 방패와 장갑입니다) 교반 막대. 상단에 뚜껑을 넣고 20 분간의 진공 적당한 속도로 솔루션을 섞는다. 진공이 용액을 탈 가스보기 위해 사용된다. 밀리 Q 물 2 ㎖에 APS 0.2 g : 황산 암모늄 용액 (APS, 218.8 g / 몰)의 새로운 10 %를합니다.
- 겔 캐스터 겔 혼합물을 추가 : 진공이 완료되면 10 % 황산 도데 실 나트륨 6 ㎖ (SDS, 228.38 g / 몰) 부가플라스크의 측면에 솔루션에 더 많은 거품을 가하고 방지 할 수 있습니다. , APS를 추가 저어 ', N'-테트라 메틸 에틸렌 디아민 (TEMED, 116.20 g / 몰)을 0.25 ㎖의 N, N, N을 추가합니다 ('주의 'TEMED 가연성 사용 얼굴 방패와 장갑입니다) 및 교반.
- 장치의 뒷면에 삽입 된 깔때기를 통해 젤 캐스터로 젤 혼합물을 부어. 짧은 플레이트 아래 인치까지 붓는다. 젤의 상단에 물 포화 부탄올 1.5 mL를 넣고 탈수를 방지하기 위해 사란 랩으로 정상을 감싸줍니다. 전체 중합을 보장하기 위해 1 시간 동안 기다립니다.
- 젤을 확인 : 젤이 (플라스크 확인) 완료되면, 싱크 겔 캐스터를 분해. 따뜻한 물 유리 접시를 세척하는 동안 젤 무결성 확인, 물이 판을 입력 할 수 없습니다. 부탄올을 붓고 부탄올를 제거하기 위해 물로 2 회 젤의 상단을 씻어. 다시 물에 정상을 입력하고 젤을 바로 사용하지 않으면 앉아 보자.
- 스트립을 준비 :에서 평형 완충 용액을 준비냉동고 (6 M 우레아, 75 MM 트리스 - 염산의 pH 8.8, 29.9 % SDS, 블루 0.002 % 브로 모 페놀). 이 -20 ℃에서 preprepared 및 10 ㎖ 분량 씩 저장할 수 있습니다 평형 완충액 10 ml로 DTT 0.1 g을 녹이고. 하나의 튜브는이 IPG 스트립을 위해 사용될 수있다. 버퍼에 내려 스트립 얼굴의 젤을 넣고 30 분 동안 앉아 보자. 어떤 어떤 말을 기억하십시오.
- 전기 장치 (2-D 분리 장치)를 준비한다 : 1x 전기 영동 버퍼 (25 MM 트리스 자료 [121.1 g / 몰], 192 mM의 글리신 [288.38 g / 몰], 0.1 % W / V SDS [288.38 4.5 L 추가 g / 몰]) 실행중인 탱크. 이 버퍼는 3 배까지 사용될 수있다. 전기 영동 장치를 켭니다. 물 냉각 시스템의 수위를 확인하고이 낮 으면 물을 채워. 10 ° C.해야 지정된 온도를 확인 키를 눌러 모드에서 컴퓨터를 켭니다
- 배 실행 버퍼의 1 L 버퍼를 실행의 1 배 1 L를 확인하고 4 ℃에서 보관 무게 agaros 0.25 G : 아가로 오스 밀봉 솔루션 확인전자 및 1X 실행 버퍼 50 ㎖에 용해. 15 초마다 펄스.
- 전기 장치 설정 : 사용 핀셋 각 스트립을 꺼내 깨끗한 종이 타월로 양쪽에 여분의 버퍼를 제거 할 수 있습니다. 스트립을 만지지 마십시오. 젤 위에 물을 붓고 1X 실행 버퍼 젤 톱 라인. 깨끗한 핀셋을 사용하여 겔 측면쪽으로 향, 긴 접시 위쪽에 스트립을 배치합니다. 그것을 윤활 스트립에 1X 버퍼를 추가합니다. 슬라이드 스트립 더 아래 플라스틱 스트립을 사용하여. 지구와 젤 사이에있는 모든 거품을 제거합니다.
- 그것을 밀봉 스트립의 상단에 아가로 오스 밀봉 솔루션을 추가합니다. 스트립의 나머지 부분에 대해 반복합니다. 젤 탱크에 유리 겔 크래들에 젤을 포함하는 플레이트와 하부를 놓습니다. 외부 챔버에 1X 버퍼 수준에 다락방을 놓기 전에 지정된 맨 아래 줄에 있는지 확인하십시오.
- 유리판 위에 상부 버퍼 챔버의 프레임을 배치하고 모든 서호주 확인바닥을 아래로 눌러 Y 다운. 깔때기를 사용하여 중간 선까지 상부 챔버에 2 배 실행 버퍼를 추가합니다. 깔때기를 사용하고 베스트 라인에 도달 할 때까지 외부 챔버에 1X 실행 버퍼를 추가합니다. 상단에 뚜껑을 배치하고 전기 장치와 파워 팩의 전원을 켭니다.
- , 52 V에서 하룻밤 96mA, 5 W. 현재는 상단에있는 실버 와이어에 거품을 찾아가는 경우 검사를 실행합니다. 최고의 선이 바닥에서 1cm 때까지 젤을 실행합니다.
- 단백질은 제조자의 지시에 따라, 장비 및 다른 회사와 같은 BIORAD 또는 호 우퍼에서 시약을 사용하여 분석 할 수있다.
6. 젤 시각화를위한 젤의 실버 스테 이닝 (일 5-6)
- (플라스틱 양동이에 800 ㎖의 에탄올, 200 ㎖의 아세트산 및 흄 후드에서 밀리 Q 물 1,000 ml)을 수정 솔루션 1을 준비합니다. 해결 방법 6 젤 좋다. 오프 모든 컴퓨터의 전원을 켜고 전기 장치와 PU의 전체 중간 부분을 가지고싱크대에 게요. 또한 싱크대에 흰색 스탠드를 넣어. 2X 실행 버퍼를 포함하는 상부 트레이를 잡아 당깁니다.
- 장치를 분해 및 수정 솔루션 1에 유리 접시에서 젤을 제거합니다. 젤 그들이 유리판으로부터 제거 될 때 코너를 절단에 의해 식별 될 수 있고, 모서리의 개수는 캐스터의 겔의 순서에 대응 잘랐다.
- 적어도 1 시간에 4 박 ° C에서의 로커에 수정 솔루션 및 젤과 용기를 올려
- (50 % 글 루타 알데하이드 (glutaraldehyde), 에탄올 600 ㎖, 5 칼륨 tetrathionate의 G (302.46 g / 몰), 136 아세트산 나트륨 (82.03 g / 몰)의 G, 그리고 밀리 Q 물에 20 ㎖를 해결 방법 2를 해결하기 위해 젤로 이동 2,000 ml)에 1 시간 동안 로커에 장소.
- 젤이 밀리 Q 물에 15 분마다 4 배 씻으십시오.
- 30 분 또는 최대 48 시간 동안은 질산염 용액 (2,000 ML에 질산은 (169.87 g / 몰), 포름 알데히드 500 μL, 그리고 밀리 Q 물 4g)에 젤을 얼룩.
- 1 젤을 씻으분 밀리 Q 물에.
- 5-30 분 (2,000 밀리리터에 탄산나트륨 60g (105.99 g / 몰), 포름 알데히드 300 μL, 티오 황산나트륨 (158.11 g / 몰) 15 ㎎, 및 밀리-Q 물) 현상액에 전송 될 때까지 겔을 염색한다.
- 10 분 동안 (2000 ㎖의 트리스 - 염기 (121.14 g / 몰), 아세트산 40 ㎖ 100 g을 밀리-Q 물) 정지 용액에서 겔을 넣어.
- (장기 저장이 요구되는 경우에, 글리세롤 40 ㎖ 또는 400 ㎖, 및 밀리 Q 물 1600 ㎖)에 저장을 위해, 글리세롤 용액에 겔을 전송할 10 분간 후 겔 건조기를 사용하여 건조.
- 젤은 광 트랜스 일루미네이터 또는 젤 화상 카메라를 사용하여 촬영 스캐너 / 농도계로 영상 시스템을 사용하여 염색 한 후 시각화 할 수 있습니다. 그러한 BIORAD에서 PDQuest 2-D 분석과 같은 이미지 분석 소프트웨어는 다음 샘플의 단백질에서 정량적 정보를 얻기 위해 사용될 수있다.
7. 질량 분석기 분석을위한 젤은 염색
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Representative Results
두 개의 서로 다른 경우에 동일한 균 배양에서 추출 된 단백질 프로파일의 비교 분석은 성공적인 단백질 추출을 나타내는 유사한 패턴 밴딩을 보여 주었다. 추출 된 분자량 단백질은 10-150 kDa의에서였다. Burkholderia의의 multivorans에서 전체 세포 단백질 추출의 1은 대표 쿠마시 블루 염색 젤 (BCC의 구성원)도 LB 또는 효모 / Manitol (YEM) 국물과 성장 임상 분리 정지 단계에서 수확.
2-D 겔 전기 영동 분석을 위해, 부르크 홀데의 pseudomallei에서 총 단백질 200 μg을 (도 2)를 사용 하였다. 이 병원체는 질병 통제 및 예방 (25)에 대한 미국 센터에 의해 B 형 생물 전쟁 에이전트로 인식되어 있기 때문에, 단백질의 준비 절차는 생물 안전 수준 3 봉쇄 실험실에서 수행하고 그에 따라 표준 작업 절차에 있었다.단백질은 재수 화 용액에 재현 탁하고 그들의 등전점 (PI)에 따라 분리시키고, pH가 4-7 긴 구배 및 단백질을 고정화 24cm에 적용 하였다. 그 다음 스트립은 SDS-폴리 아크릴 아미드 겔 및 단백질에 넣었다 그들의 분자량 (MW)에 따라 분리 하였다. 그 후, 겔은 단백질 자리 시각화를위한 스테인드은 있었다. 결과는 개별적으로 질량 분석으로 식별 할 수있는 500 개 이상의 단백질 반점의 풍요 로움을 보여 주었다.
그림 1. 부르크 홀데 리아의 multivorans의 총 단백질 프로파일을 분리합니다. D-2214과 D-2094는 LB 또는 두 개의 서로 다른 경우에 효모 / Manitol (YEM) 국물에 성장 균주에서 정지 단계에서 추출 된 단백질의 SDS-PAGE 분석 (1과 2). 단백질의 4 μg 무선을 12.5 % 젤의 각 레인에로드 및 염색쿠마시 블루 토륨. 레인 M, 단백질 마커.
그림 2. Burkholderia의의 pseudomallei 1234B의 2-D 겔 전기 영동 분석은 분리. 7 범위 스트립 파이 4 대표적인 실버 스테인드 2-D 젤 보여주는 단백질 분리. 정지상의 전체 세포의 단백질 추출물 (200 μg)을 15 % SDS-PAGE 겔상에서 사용하고 분리 하였다.
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Discussion
단백질의 제조 방법은 재현성 좋게 부르크 홀데 단백질의 대부분을 추출 할 수있는 것을 설명 하였다. 이는 그림 1과 같이 LB 또는 YEM 배양액에서 성장 같은 세균 배양을 사용하여 다른 일을 수행 두 개의 독립적 인 준비에서 같은 단백질 프로파일을 획득하여 보여줍니다. 그러나 우리가 접시에 성장 세균이 방법을 시험하지 않았다; 추출 액체 배지에서 자란 박테리아 효율적이었다. 이 방법은 프로 테오 믹 도구를 사용하여 더 단백질 특성 분석에 사용 된, 우리의 그룹은 성공적으로 (iTRAQ) 프로테오믹스 기술 15,23,24 상대 및 절대 정량을위한 2-D 겔 전기 영동 및 동위 원소의 태그를 사용하여 프로테옴의 변화를 연구했다. 후자의 경우, 단백질 iTRAQ 실험 15 PMSF와의 간섭을 피하기 위해 PBS에 0.5 M EDTA를 함유하는 완충액으로 추출 하였다.
그것은 REM하는 것이 중요합니다단백질 추출 처리 및 2-D 겔 전기 영동시, 모든 단계는 4 ℃에서 또는 단백질 분해를 최소화 할뿐만 아니라, 연결 팁을 사용하여 니트릴 장갑을 착용하고, 모두 커버하는 아이스 버킷을 사용하여 저온에서 실시되어야한다고 아크 어떤 반점의 각질 오염을 방지하기 위해 피부는 질량 분석에 의해 이후의 식별을 위해 잘라. 단백질 추출을 수행 할 때, PMSF 따라서 아세톤 0.1 mM의 스톡 용액을 사용 직전에 이루어져야, 제조에있어서, 수용액에서 짧은 반감기 시간에 있음을 고려하는 것도 중요하다. 우리가 우리의 실험을 시험하지 않았다하더라도 다른 방법으로, 더 가용성과 안정성, 그리고 독성이 적은 다른 세린 억제제 또는 단백 분해 효소 억제제를 사용할 수있다.
이 절차에 사용 된 세포 용해 완충액은 수성 (세포질) 단백질 및 덜 수용성 PROT를 모두 추출 가용화를위한 중요 요소를 포함하지 않는다일부 막 단백질 17을 포함 아인스. 하지만, (이 프로토콜의 3 단계)를 중심으로 첫 번째 차원의 등전점에 대한 샘플 준비하는 동안, 샘플 요소가 포함되어 재수 완충액됩니다. 다른 프로테오믹스 기술은 유사한 처리 (26)를 포함한다. 재수의 단계를 수행하기 전에, 그것은 간섭 물질 또는 저 분자량 불순물의 제거는 높은 해상도 중요한 것 같다, 우리는 결과를 향상 각 단백질 시료의 2-D 정리 도구를 사용하는 것이 좋습니다. 이 자리에서 무균 방식으로 적당한 크기를 절단하는 문제이기 때문에 이전에 첫 번째 차원의 등전위 집중 분리를위한 샘플을로드 (압지 스트립 홀더의 적당한 크기의 준비 스트립을 가지고 있는지 확인이 단계 3.4에 대한 프로토콜).
2-D SDS-폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동을 실행하기 전에, 겔 분율이 12 (또한 예상 크기가 맞는지 확인하는 것이 필요하다의 0.5 % 비율 젤) 14-100 kDa의 범위에서 단백질을 해결할 수 있습니다. 제 차원 겔 전기 영동이 완료된 후, 단백질의 시각화는 쿠마시 블루 또는은 염색에 의해 달성 될 수 있으며, 후자의 염색은 검출 한계에 더 민감한 것은 0.1 NG / 단백질 / 스폿 20만큼 낮다. 실버 염색으로 시각화 단백질 반점은 질량 분석으로 추가 분석을 위해 적합하다. 그러나,이 에이전트는 단백질과 가교 결합 이후 실버 얼룩 솔루션은 글 루타 알데하이드 (glutaraldehyde)를 포함 할 수 없습니다 것을 언급하는 것이 중요하다, 따라서 그것은 더 질량 분석 분석 (20)와 호환되지 않습니다. 대안 적으로, 차별적으로 발현 된 단백질을 검출하고 정량화하기 위해, 이러한 자동화 된 소프트웨어와 함께 젤 전기 영동 (2D-DIGE) 중 두 차원 차분 같은 다른 겔 - 기반 방법이 사용될 수있다. 이 방법은 서로 다른 형광 태그 라벨 샘플 및 보편적 내부 표준 홍보하는 데 사용됩니다 (예를 들어, 사이 영상 3, 5, 2)를 사용한다IOR 두 번째 차원 전기 영동 극복에, 어느 정도, 2-D 전기 영동 (27)의 변화와 재현성의 단점. 또한, 겔은 단백질 체학 응용 프로그램을 위해 설계 유기 금속 루테늄 킬레이트 얼룩입니다 SyproRuby와 두 번째 차원 후 염색 할 수 있습니다. 그것은 그 실버 염색과 유사한 감도 단백질 반점을 감지하지만, 쿠마시 블루보다 더 큰 감도를 할 수 있습니다. 염색 젤은 레이저 스캐너 또는 트랜스 일루미네이터 (28) 촬영 할 수 있습니다 후.
결론적으로,이 비디오는 전체 세포 세균의 단백질 추출 절차 및 Burkholderia의 종의 프로테옴 글로벌 변화의 연구를 허용 할 수 있습니다 2-D 겔 전기 영동 방법을 설명합니다.
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Disclosures
저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.
Acknowledgments
이 작품은 (BV에) 브리티시 컬럼비아 대학에서 재학하고 (DPS에) 건강 연구의 낭포 성 섬유증 캐나다와 캐나다 연구소에서 교부금에 의해 지원되었다. 우리는 프로토콜의 초기 준비를 위해 재클린 정 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma | P7626 | Toxic, corrosive |
| Acetone | Fisher | A18-1 | Flammable |
| PBS Buffer | Bioscience | R028 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher | BP118-500 | toxic |
| Glass beads (0.1 mm) | BioSpec Products | 11079101 | |
| Nalgene Oak Ridge Centrifuge tubes, polycarbonate (50 ml) | VWR | 21009-342 | |
| MicroBCA protein extraction kit | Pierce | 23235 | |
| Microcentrifuge Tubes 2.0 ml conical Screw cap Tubes with Cap and O-Ring | Fisher | 02-681-375 | |
| 2-D Clean-Up kit | GE Healthcare | 80-6484-51 | |
| Urea | Invitrogen | 15505-050 | Irritant |
| CHAPS | Amersham Biosciences | 17-1314-01 | |
| Dithiothreitol (DTT) | MPBiomedical, LCC | 856126 | Irritant |
| Immobiline DryStrips pH 4-7 24 cm | Amersham Biosciences | 176002-46 | |
| Duracryl | Proteomic Solutions | 80-0148 | Very toxic, carcinogen |
| Ammonium persulfate | Fisher | BP179-100 | Flammable, toxic, corrosive |
| N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine (TEMED) | Invitrogen | 15524-010 | Flammable |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Fisher | BP166-500 | Acute toxicity, flammable |
| Agarose | Invitrogen | 15510-027 | |
| Ethanol | Fisher | HC1100-1GL | Flammable, toxic |
| Acetic acid | Fisher | A491-212 | Flammable, corrosive |
| Glutaraldehyde | Fisher | G151-1 | Very toxic, corrosive, dangerous for the environment |
| Potassium tetrathionate | Sigma | P2926 | Irritant |
| Sodium acetate | EM Science | 7510 | |
| Silver nitrate | Sigma | 209139 | Corrosive, dangerous for the environment |
| Formaldehyde | Sigma | 252549 | Toxic |
| Sodium thiosulfate | Sigma | S7026 | |
| Tris Base | EMD | 9230 | |
| Glycine | MPBiomedical, LCC | 808831 | |
| Glycerol | MPBiomedical, LCC | 800688 | |
| Methanol | Fisher | A412-4 | Flammable, toxic, health hazard |
| Sodium carbonate anhydrous | EMD | SX0400-3 | Toxic |
| Mineral oil | ACROS | 415080010 | |
| Equipment | |||
| JA-20 ultracentrifuge rotor | Beckman Coulter | 334831 | |
| Mini Beadbeater | Biospec Products | 3110BX | |
| Ettan IPGphor II Isoelectric Focusing System and accessories | GE Healthcare | 80-6505-03 | www.amershambiosciences.com |
| Ettan DALT Large Vertical electrophoresis system | GE Healthcare | 80-6485-27 | www.amershambiosciences.com |
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