Summary
أعضاء من جنس بيركولديريا هي مسببات الأمراض ذات الأهمية السريرية. نحن تصف طريقة لاستخراج البروتين الكلي البكتيري، وذلك باستخدام اضطراب الميكانيكية، و 2-D الكهربائي للهلام لتحليل البروتين اللاحقة.
Abstract
التحقيق في مستويات البروتين داخل الخلايا من الأنواع البكتيرية من الأهمية لفهم الآليات المسببة للأمراض من الأمراض التي تسببها هذه الكائنات. نحن هنا وصف الإجراء لاستخراج البروتين من الأنواع بيركولديريا على أساس تحلل الميكانيكية باستخدام الخرز الزجاجي في وجود حمض tetraacetic الإيثيلين وphenylmethylsulfonyl الفلوريد في الفوسفات مخزنة المالحة. هذه الطريقة يمكن استخدامها لأنواع مختلفة بيركولديريا، لظروف النمو المختلفة، وانها مناسبة المحتمل للاستخدام في الدراسات البروتين من البكتيريا الأخرى. بعد استخراج البروتين، ويوصف (2-D) هلام الكهربائي تقنية البروتين ثنائي الأبعاد لدراسة التغيرات العالمية في proteomes من هذه الكائنات. يتكون هذا الأسلوب من فصل البروتينات وفقا لجهة نظرهم كهرساوي بواسطة كهرساوي التركيز في البعد الأول، تليها الفصل على أساس الوزن الجزيئيبواسطة الأكريلاميد هلام الكهربائي في البعد الثاني. ويتم فصل التصور من البروتينات بها الفضة تلطيخ.
Introduction
تضم بيركولديريا جنس أكثر من 62 نوعا، والكائنات السلبية الغرام معزولة عن مجموعة واسعة من المنافذ، ويتم تقسيمها في مجموعتين رئيسيتين 1،2. وتشمل المجموعة الأولى phytotrophic الكائنات البشرية والحيوانية و، وركزت معظم الدراسات على الأنواع المسببة للأمراض من هذه المجموعة نظرا لأهميتها السريرية الخاصة بهم. الأعضاء الأكثر الممرضة هي B. الراعومية وباء. المطرقة (الذي يسبب راعوم والرعام على التوالي) 3،4 ومسببات الأمراض الانتهازية (17 أنواع محددة من مجمع الشرهة بيركولديريا، BCC) 5، والتي تسبب المرض في التليف الكيسي (CF) والداء الحبيبي المزمن (CGD) 1. المجموعة الثانية، مع أكثر من 30 نوعا غير إمراضية، وتشمل البكتيريا المرتبطة النباتات أو مع البيئة، وتعتبر قد تكون مفيدة إلى المضيف 2.
مضاعفات عديدة تظهر الابعدوى بكتيرية ام مع أعضاء المسببة للأمراض من جنس بيركولديريا، مثل نقل مسببات المرض بين المرضى، وانتشار المرض وفشل العلاج بسبب المقاومة الذاتية أو المكتسبة للمضادات الحيوية مما يجعل من الصعب للقضاء في معظم الحالات 6-9. لذا، والحصول على فهم أوضح لأساس لإنشاء عدوى بكتيرية أمر حيوي لعلاج الأمراض التي تسببها هذه الكائنات. من أجل الحصول على نظرة ثاقبة إنشاء العدوى، وهناك حاجة إلى إجراء تحقيقات واسعة النطاق على المكونات البكتيرية المرتبطة المرضية. وصف الدراسات التي تركز على تحليل البروتين من الكائنات الحية بيركولديريا باستخدام نهج البروتين البروتينات التي قد تورطت في المرضية البكتيرية وكذلك التغيرات في بروتيوم بهم لمحات 10-16.
طرق استخراج البروتين باستخدام صوتنة ودورات إذابة تجميد في تحلل العازلة التي تحتوي اضرب عاليةentration من اليوريا، وقد تم تطبيق ثيوريا في تركيبة مع المنظفات وampholytes في بيركولديريا الدراسات البروتين 10-13. على الرغم من اليوريا هي فعالة جدا للبروتين تمسخ، فإنه يمكن إقامة التوازن في محلول مائي مع الإيزوسيانات الأمونيوم، والتي يمكن أن تتفاعل مع مجموعات من الأحماض الأمينية، وبالتالي تشكيل التحف (carbamylation رد فعل) 17. وبالتالي، فمن المستحسن أن تشمل ampholytes الناقل، والتي تكون بمثابة الزبالين سيانات وتجنب درجات الحرارة فوق 37 درجة مئوية 17. علاوة على ذلك، لمنع أي تدخل الكيميائي للتحلل العازلة مع البروتين الكمي، وهو نفس العازلة تحلل يمكن استخدامها لتوليد منحنى القياسية بحيث العينات والمعايير لديهم نفس الخلفية 10. تنطوي منهجيات أخرى استخدام مخازن القلوية والمنظفات مع فترات الحضانة حرارة 17،18، ولكن هذه الظروف قد تحدث تغييرات في بروتيوم وبعض المنظفات غير متوافقة مع العلاقات العامةتطبيق oteomics ما لم يتم تضمين الخطوات اللاحقة إزالة المنظفات 17،18.
بعد استخراج والكمي كافية، والتعبير البروتين العالمي لكل فرد البروتين يمكن دراستها باستخدام نهج البروتين مثل ثنائي الأبعاد (2-D) هلام الكهربائي. وقد وصفت هذه التقنية أول مرة من قبل O'Farell 19 وتتكون في فصل البروتينات وفقا لجهة نظرهم كهرساوي بواسطة كهرساوي التركيز في البعد الأول، ومن ثم وفقا لوزنهم الجزيئي بواسطة مادة الأكريلاميد هلام الكهربائي في البعد الثاني. بسبب قرارها والحساسية، وهذا الأسلوب هو أداة قوية لتحليل والكشف عن البروتينات من مصادر بيولوجية معقدة 19،20. هذه التقنية الانفصال هو متاح حاليا في النهج التي تركز البروتين مع ميزة كبيرة في حل الأشكال الإسوية البروتين الناجمة عن التعديلات بعد النسخي أو تجهيز بروتين. التغيرات الكميةويمكن الكشف عن طريق مقارنة شدة البقعة المقابلة بعد تلطيخ من هلام 20. ومع ذلك، لا تناسب هذه التقنية لتحديد البروتينات كبيرة جدا، والبروتينات الغشاء، والبروتينات الأساسية للغاية والحمضية أو مسعور، وتقنية شاقة وتستغرق وقتا طويلا إلى حد ما 20. النهج الببتيد مركزية جديدة (بناء هلام غير) التي هي أكثر قوة وموضوعية تصبح متاحة ويمكن استخدامها للمقارنة الكمي بالطرق وضع العلامات النظائر مستقرة التفاضلية مثل وضع العلامات السيستين من قبل تلوينها نظير تقارب الجغرافية (ICAT) 21، والمجموعة الأمينية وضع العلامات النظائر الجغرافية لتحديد الكميات النسبية والمطلقة (iTRAQ) 22. استخدام تقنية البروتين واحد قد يعطي معلومات كافية، وبالتالي استخدام نهجين البروتين التكميلية ضروري لمعظم التغييرات تقييم كامل في بروتيوم. ومع ذلك، يتم استخدام على نطاق واسع 2-D الكهربائي للهلام ويمكن تطبيقها بشكل روتيني لتشيوانالكمي المنجز التعبير عن العديد من البروتينات في الكائنات الحية المختلفة.
نحن هنا وصف استخراج البروتين خلية كاملة و 2-D إجراءات هلام الكهربائي عن الأنواع التي تم تكييفها بيركولديريا والأمثل من الرعاية الصحية GE 2-D المبادئ الكهربائي وطرق كتيب 80-6429-60AC عام 2004 ( www.amershambiosciences.com ). تم تنفيذ استخراج البروتين من استخدام الخافق حبة مع الخرز الزجاجي في وجود برنامج تلفزيوني يحتوي على 5 ملي EDTA (الإيثيلين حمض tetraacetic) و 1 ملي PMSF (phenylmethylsulfonyl الفلورايد). يسمح هذا الإجراء الكمي للبروتينات مع الحد الأدنى من التدهور وغير قابلة للتعديل لنهج البروتين كما ذكرت سابقا 15،23،24. تم تنفيذ 2-D الكهربائي للهلام خارج باستخدام 24 سم يجمد طويلة درجة الحموضة 4-7 التدرج وتم فصل البروتينات وفقا لجهة نظرهم كهرساوي. ثم تم فصل البروتينات وفقا لmolec بهمالوزن جزيئية بواسطة هلام SDS-بولكرلميد. بالإضافة إلى ذلك، وصفنا طريقة الفضة تلطيخ لرؤية البروتينات بقعة، وطريقة وصمة عار الفضة والتي تتوافق لتحليل الطيف الكتلي. معا هذه الإجراءات يمكن أن تسمح بتحديد البروتينات الهامة من الأنواع بيركولديريا التي يمكن أن تشارك في التسبب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. الثقافة النمو (يوم 1 +2)
- تنمو ثقافة كاتب: 3 مل من لوريا BERTANI (LB) مرق في قمة مبكرة 15 مل أنبوب، عند 37 درجة مئوية المدورة بين عشية وضحاها. تمييع النمو بين عشية وضحاها إلى OD 600 من 0.6. إضافة 1 مل من هذا التخفيف إلى 100 مل من مرق LB في قارورة 250 مل مخروطي. احتضان عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز عند 250 دورة في الدقيقة لمدة 16 ساعة في الطور الثابت (SP)، لأفضل تقريبية، في الثقافة دفعة وظروف الإصابة وأؤكد أن عوامل الفوعة البكتيرية تحت سيطرة العوامل إشارة مرحلة ثابتة مثل rpoS والنصاب القانوني الاستشعار عن بعد، يتم التعبير. بدلا من ذلك، نمت البكتيريا في SP المبكر أو مرحلة منتصف أو أواخر وغاريتمي يمكن استخدامها للحصول على معلومات عن مرحلة التكيف البكتيرية.
- بعد 16 ساعة قياس OD 600 وضمان وصلت ثقافة SP بالمقارنة مع منحنى النمو التي شيدت سابقا في ظل ظروف مماثلة.
2. استخراج البروتين (اليوم 3)
- إعداد الطازجة 0.1 M phenylmethanesulfonyl الفلورايد (PMSF، 174.19 جم / مول) حل في الأسيتون عن طريق إذابة 0.0174 غرام من PMSF ('تنبيه' PMSF هو السامة والمسببة للتآكل، واستخدام دروع لحماية الوجه والقفازات) في 1 مل من الأسيتون ('تنبيه' الأسيتون السامة والقابلة للاشتعال، واستخدام دروع لحماية الوجه والقفازات).
- تشكل الحل PBS / EDTA / PMSF: 0.1 مل من 0.1 M PMSF، 0.1 مل من EDTA M 0.5، و 9.8 مل من برنامج تلفزيوني. التحقق من OD للثقافة ساعة 16 تقريبا حيث ينبغي أن يكون في SP.
- تأخذ 35 مل من ثقافة البكتيرية ونقل إلى أنبوب الطرد المركزي وأجهزة الطرد المركزي OAKRIDGE الثقافة في 4،500 × ز لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية.
- إزالة طاف إلى حاوية النفايات وإضافة 35 مل من برنامج تلفزيوني تبريد و resuspend بيليه. الطرد المركزي مرة أخرى في 4،500 × ز لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية.
- إزالة طاف و resuspend في 1 مل من برنامج تلفزيوني الباردة. نقل إلى 2 مل إيبندورف عقيمة وأجهزة الطرد المركزي 1 دقيقة على ارتفاع في microcentrifuge في 14،000 × غرام عند 4 درجات مئوية. إزالة وتجاهل طاف.
- إضافة 1 مل من محلول PBS / EDTA / PMSF، resuspend الكرية ونقل إلى 2 مل أنبوب المسمار غطاء (مع عصابة س) التي تحتوي على الخرز الزجاجي ~ 0.5 مل (presterilized). إضافة بيليه إعادة علقت في أنبوب يحتوي على حبات الزجاج وحبة سحق لهم في 4 درجات مئوية لمدة 1 دقيقة في غرفة باردة. القيام بذلك 3X، وضع العينة على الجليد بعد كل باش.
- أجهزة الطرد المركزي في 14،000 x ج لمدة 1 دقيقة في ميكروسنتريفوج. إزالة طاف ووضعه في العقيمة 5 مل أنبوب البوليسترين.
- لزيادة الغلة إضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني / EDTA / حل PMSF لنفس أنبوب يحتوي على حبات الزجاج مرة أخرى. حبة باش الأنبوب عند 4 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة. لا هذا 2X وضع العينة على الجليد بالعربيةثالثا باش. أجهزة الطرد المركزي في 14،000 x ج لمدة دقيقة واحدة على أجهزة الطرد المركزي وإزالة طاف وإضافة لطاف من الخطوة 2.8. استخدام حقنة 1 مل ومرشح 0.20 ميكرون طاف من أنبوب البوليسترين لأنبوب معقم 2 مل إيبندورف جديدة.
- عند هذه النقطة يجب أن يعاير العينات للكمية البروتين، وذلك باستخدام بيرس MicroBCA البروتين عدة استخراج وaliquots من 200 ميكروغرام ينبغي تجميدها في -80 درجة مئوية حتى المطلوبة.
3. تحضير العينة (اليوم 4)
- تحضير 25 مل محلول المخزون الإماهة (8 M اليوريا و 2٪ CHAPS، 2٪ IPG العازلة، 0.002٪ برموفينول الأزرق) وتخزينها في 2.5 مل aliquots في -20 درجة مئوية. إضافة 7 ملغ dithiothreitol (التلفزيون الرقمي الأرضي، 154.2 غرام / مول) فقط قبل استخدامه إلى 2.5 مل قسامة من محلول المخزون الإماهة.
- إذابة عملية عينات من الخطوة 2.10 باستخدام 2-D تنظيف عدة مع إعادة تعليق النهائية في 450 ميكرولتر من محلول المخزون الإماهة أعدت في الخطوة 3.1.
4. الأولالبعد كهرساوي التركيز (منتدى الطاقة الدولي) (اليوم 4)
جميع الخطوات في هذا المقطع تستخدم نظام IEF Ettan IGPhor.
- إعداد أول IPG الشرائط البعد: أصحاب الشريط نظيفة بمحلول تنظيف الشريط ثم يغسل بالماء ملي-Q، وترك رأسا على عقب لتجف. تعيين كل عينة إلى عدد حامل الشريط هلام.
- تحميل عينة من الخطوة الإماهة في مساحة أوسع من الثانية (-) نهاية. استخدام ملقط نظيفة لسحب شرائط هلام من التعبئة والتغليف. تأخذ بها طبقة واقية من شرائط هلام. خط يجرد الوجه الخشن لأسفل في بطء، حركة انزلاق للحصول على شرائط الرطب على طول الطريق من (-) إلى نهاية (+) نهاية.
- وضع ورق نشاف مبللة بالماء المعقم على قمة القطب وتحت شرائط هلام لمنع نضوب. شطف ملاقط في الفترات الفاصلة بين جولات مع الماء النقي والايثانول. إزالة جميع فقاعات، تراكب رقيقة مع الزيوت المعدنية لمنع الرافضة الجافة. تبطن أصحاب الشريط هلام على الجهاز.
- تشغيل 12 ساعة على 20 درجة مئوية لمدة rehydالتموينية، 1 ساعة عند 200 V، 1 ساعة عند 500 V، 1 ساعة عند 1،000 V، 0.5 ساعة عند 4،000 V، 12 ساعة في 8،000 V، 24 ساعة في عقد 300 V ويمكن أن يؤخذ بها في هذا الوقت.
- بعد الانتهاء من منتدى الطاقة الدولي، فمن المستحسن لأداء الكهربائي للهلام SDS-بولكرلميد ثاني البعد، ما لم يتم تجميد الشريط IPG في -80 درجة مئوية في ساران التفاف المغلفة مع الزيوت المعدنية لتحليل المستقبل. بدلا من ذلك، من أجل تجنب نقطة streaking بسبب الوصول DTT أنه من الممكن أن تشمل الخطوة الثانية من موازنة IPG الشرائط قبل البعد الثاني مع العازلة التي تحتوي iodoacetamide.
5. ثاني البعد SDS-بولكرلميد جل الكهربائي (يوم 5)
جميع الخطوات في هذا المقطع تستخدم الجهاز الكهربائي Ettan DALTsix.
- لتجميع جهاز هلام العجلات، وتنظيف جيدا جميع المكونات وضمان أن جل العجلات هو مستوى ومشحم المطاط الرمادي ملزم مع هلام السيليكون. وضع فرك السوداءالبر سدادة الثلاثي على الجزء السفلي. ثم، وضع بالتناوب فاصل وألواح الزجاج مع لوحة أقصر من الزجاج الأمامية التي تواجه. تأكد من الفواصل هي على الظهر والجبهة. ملء المساحة المتبقية مع الحشو (حوالي 5 أوراق) حتى أعلى مسطح. وضع اللوحة الأمامية مع طرف على أحمر من الخارج. استخدام المشابك لتشديد كل جانب وتضييق الخناق أسفل.
- إعداد جل: إضافة 297.3 مل من Duracryl، ('تنبيه' Duracryl هو استخدام السامة دروع لحماية الوجه والقفازات)، 147 مل من تريس العازلة 1.5 M الرقم الهيدروجيني 8.8، و143.3 مل من الماء ملي-Q في قارورة فراغ مع تلميح تحتوي على بقضيب. وضع غطاء على رأس والحل المزيج بسرعة معتدلة مع الفراغ على لمدة 20 دقيقة. يتم استخدام الفراغ لإزالة الغاز الحل. جعل الطازجة 10٪ من محلول فوق كبريتات الأمونيوم (الجزائرية، 218.8 غرام / مول): 0.2 غرام من وكالة الأنباء الجزائرية إلى 2 مل من الماء الملة، س.
- إضافة الخليط إلى هلام هلام العجلات: عندما يتم الفراغ إضافة 6 مل من 10٪ دوديسيل كبريتات الصوديوم (SDS، 228.38 جم / مول)إلى جانب القارورة لتجنب وضع أكثر من فقاعات في الحل. إضافة APS، وإثارة، إضافة 0.25 مل N، N، N '، N'-tetramethylethylenediamine (TEMED، 116.20 جم / مول) (' تنبيه 'TEMED هو استخدام قابلة للاشتعال دروع لحماية الوجه والقفازات) ويقلب.
- صب الخليط في هلام هلام العجلات من خلال قمع إدراجها في الجزء الخلفي من الجهاز. صب حتى شبر واحد تحت لوحة قصيرة. إضافة 1.5 مل من الماء المشبع بيوتانول إلى الأعلى من هلام والتفاف أعلى مع التفاف ساران لتجنب الجفاف. الانتظار لمدة 1 ساعة لضمان البلمرة الكامل.
- التحقق من هلام: عند الانتهاء من هلام (فحص القارورة)، تفكيك عجلة هلام من قبل المصارف. تحقق من سلامة هلام بينما الشطف لوحات الزجاج مع الماء الدافئ، لا تسمح للماء بالدخول إلى لوحة. من اجل الخروج من بيوتانول وشطف الجزء العلوي من هلام مرتين بالماء للتخلص من بيوتانول. ملء أعلى مع الماء مرة أخرى وترك الجلوس إذا لم يتم استخدام المواد الهلامية على الفور.
- إعداد شرائط: إعداد موازنة حل العازلة منالفريزر (6 M اليوريا، و 75 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8.8، 29.9٪ SDS، 0.002٪ برموفينول الأزرق). هذا يمكن أن يكون معد مسبقا وتخزينها في 10 مل aliquots في -20 درجة مئوية. حل 0.1 غرام من التلفزيون الرقمي الأرضي إلى 10 مل من حل العازلة موازنة. أنبوب واحد يمكن استخدامها لمدة شرائط IPG. وضع المواد الهلامية من الوجه إلى أسفل على الشريط المخزن المؤقت وترك الجلوس لمدة 30 دقيقة. تذكر أي نهاية هو الذي.
- إعداد وحدة الكهربائي (2-D جهاز فصل): إضافة 4.5 لتر من 1X العازلة الكهربائي (25 ملي تريس قاعدة [121.1 جم / مول]، 192 ملي جليكاين [288.38 غ / مول]، و 0.1٪ ث / ت SDS [288.38 ز / مول]) إلى خزان على التوالي. هذا المخزن المؤقت يمكن استخدامه لمدة تصل إلى 3x. تحويل وحدة الكهربائي جرا. فحص مستوى الماء في جهاز تبريد المياه وملئه حتى مع الماء إذا كانت منخفضة. تحويل على الجهاز، اضغط على الوضع للتحقق من درجة حرارة معينة، والتي ينبغي أن تكون 10 درجة مئوية.
- جعل 1 L من 2X العازلة تشغيل و1 لتر من 1X تشغيل العازلة وتخزينها في 4 درجات مئوية. جعل الختم الاغاروز الحل: الوزن 0.25 غرام من agarosه وتذوب في 50 مل من 1X العازلة على التوالي. النبض لمدة 15 ثانية لكل منهما.
- إنشاء وحدة الكهربائي: استخدام ملاقط لإخراج كل قطاع وإزالة الزائدة عازلة على جانبي مع منشفة ورقية نظيفة. لا تلمس شرائط. تخلصي من الماء على رأس الجل وتبطن هلام أعلى مع تشغيل 1X العازلة. استخدام ملاقط نظيفة ووضع شرائط على رأس لوحة طويلة، مع الجانب هلام تواجه نحوك. إضافة 1X العازلة للشرائط لتليين ذلك. شرائح الشريحة إلى مزيد من الانخفاض باستخدام شرائط من البلاستيك. إزالة جميع فقاعات في بين الشريط وهلام.
- إضافة حل ختم الاغاروز إلى الجزء العلوي من شريط لختم عليها. أكرر لبقية الشرائط. وضع لوحات زجاجية تحتوي على المواد الهلامية في هلام مهد وانخفاض في خزان هلام. ضمان مستوى 1X العازلة في الغرفة الخارجي هو على خط القاع المعينة قبل وضع مجلس الشيوخ على.
- وضع الإطار لغرفة عازلة العلوي على رأس من لوحات الزجاج وضمان كل ذلك هو واذ أسفل عن طريق الضغط على الجزء السفلي لأسفل. استخدام القمع وإضافة العازلة 2X الوقوع في الغرفة العليا حتى خط الوسط. استخدام القمع وإضافة 1X العازلة على التوالي إلى غرفة الخارجي حتى تصل إلى السطر العلوي. وضع غطاء على رأس وتشغيل وحدة الكهربائي وحزمة الطاقة.
- تشغيل بين عشية وضحاها في 52 V، 96 أمبير، 5 دبليو تحقق مما إذا كان التيار يسير من خلال البحث عن فقاعات على السلك الفضة قرب أعلى. تشغيل هلام حتى خط الرائدة هو 1 سم من القاع.
- ويمكن أيضا أن تحلل البروتينات باستخدام المعدات والكواشف من شركات أخرى مثل BIORAD أو Hoefer، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
6. الفضة تلطيخ من الهلام لجل التصور (اليوم 5-6)
- يعد حل الإصلاح 1 (800 مل إيثانول، 200 مل حامض الخليك، و 1،000 مل من الماء ملي-Q في غطاء الدخان في دلو من البلاستيك). الحل هو جيد لمدة 6 المواد الهلامية. تحويل جميع الأجهزة وإيقاف إخراج الجزء الأوسط كله وحدة الكهربائي وبوليرة لبنانية في بالوعة. أيضا وضع الوقوف بيضاء في الحوض. سحب علبة تحتوي على أعلى العازلة 2X التوالي.
- تفكيك الجهاز وإزالة المواد الهلامية من لوحات الزجاج في الإصلاح حل 1. ويمكن تحديد المواد الهلامية بقطع زوايا عندما يتم إزالتها من ألواح الزجاج، وقطع عدد من الزوايا المقابلة لأجل هلام في عجلة.
- وضع الحاوية مع الحل الإصلاح والمواد الهلامية على الكرسي الهزاز لا يقل عن 1 ساعة بين عشية وضحاها لفي 4 درجات مئوية.
- نقل المواد الهلامية لإصلاح الحل 2 (20 مل من 50٪ غلوتارالدهيد، 600 مل من الايثانول و 5 غرام من البوتاسيوم التتراثيونات (302.46 جم / مول)، و 136 غرام من خلات الصوديوم (82.03 جم / مول)، والمياه الملة، س ل 2،000 مل) ووضعت على الكرسي الهزاز لمدة 1 ساعة.
- غسل المواد الهلامية 4X لمدة 15 دقيقة في كل من المياه الملة، س.
- وصمة عار على المواد الهلامية في نترات الفضة الحل (4 غرام من نترات الفضة (169.87 جم / مول)، و 500 ميكرولتر من الفورمالديهايد، والمياه الملة، س إلى 2،000 مل) لمدة 30 دقيقة أو ما يصل إلى 48 ساعة.
- غسل هلام ل1دقيقة في المياه الملة، س.
- نقل إلى الحل المطور (60 غرام من كربونات الصوديوم (105.99 جم / مول)، و 300 ميكرولتر من الفورمالديهايد، 15 ملغ من الصوديوم وحمض (158.11 جم / مول)، والمياه الملة، س إلى 2،000 مل) ل5-30 دقائق حتى اتسخت الجل.
- وضع المواد الهلامية في وقف الحل (100 غرام من تريس، قاعدة (121.14 جم / مول)، و 40 مل من حمض الخليك، والمياه الملة، س إلى 2،000 مل) لمدة 10 دقيقة.
- للتخزين، ونقل المواد الهلامية إلى الجلسرين الحل (40 مل من الجلسرين أو 400 مل إذا كان المطلوب تخزين على المدى الطويل، و 1،600 مل من الماء الملة، س) لمدة 10 دقيقة ثم تجفيفها باستخدام مجفف هلام.
- المواد الهلامية يمكن تصور بعد تلطيخ باستخدام أنظمة التصوير مثل الماسح الضوئي / قياس شدة الضوء وتصويرها باستخدام transilluminator الضوء أو جل تصوير. ويمكن بعد ذلك برنامج تحليل الصور مثل PDQuest تحليل 2-D من BIORAD أن تستخدم للحصول على المعلومات الكمية والنوعية من البروتينات في عينة.
7. هلام الفضة تلطيخ لتحليل الطيف الكتلي
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وأظهر تحليل مقارن لمحات البروتين المستخرج من نفس الثقافة البكتيرية في مناسبتين مختلفة أنماط مماثلة النطاقات تشير الاستخراج البروتين ناجحة. تراوحت البروتينات الوزن الجزيئي المستخرجة 10-150 كيلو دالتون. الشكل 1 يبين ممثل Coomassie هلام تلطيخ الزرقاء في الاستخراج البروتين خلية كاملة من الشرهة بيركولديريا (عضو في BCC) العزلات السريرية التي تزرع في LB أو الخميرة / Manitol (YEM) مرق و تحصد من الطور الثابت.
ل2-D التحليل الكهربائي للهلام، تم استخدام 200 ميكروغرام من مجموع البروتينات من بيركولديريا الراعومية (الشكل 2). منذ يتم التعرف على هذا العامل الممرض بأنه نوع B-كيل الحرب البيولوجية من قبل مراكز الامريكية لمكافحة الامراض والوقاية منها 25، ونفذت إجراءات إعداد البروتين الحيوي في مستوى السلامة المخبرية 3 الاحتواء وفقا لذلك مع إجراءات التشغيل القياسية.تم معلق البروتينات في حل الإماهة وتطبيقها على 24 سم يجمد طويلة درجة الحموضة 4-7 التدرج وتم فصل البروتينات حسب وجهة كهرساوي بهم (PI). ثم وضعت الشرائط على هلام SDS-بولكرلميد وتم فصل البروتينات وفقا لوزنهم الجزيئي (MW). في وقت لاحق، وكان جل الفضة الملون للبقعة التصور البروتين. وأظهرت النتائج وفرة أكثر من 500 بقع البروتين الذي يمكن التعرف عليه من قبل مطياف الكتلة.
الشكل 1. مجموع محات من البروتين الشرهة بيركولديريا يعزل. تحليل SDS-PAGE من البروتين المستخرج في مرحلة ثابتة من D-2214 وD-2094 العزلات نمت في LB أو الخميرة / Manitol (YEM) مرق في مناسبتين مختلفة (1 و 2). تم تحميل 4 ميكروغرام من البروتين في كل حارة من هلام 12.5٪ والملون وايال Coomassie الأزرق. حارة M، البروتين علامة.
الشكل 2. 2-D التحليل الكهربائي للهلام من بيركولديريا الراعومية 1234B عزل. الممثل الملطخة الفضة 2-D هلام بروتين تبين الانفصال في PI 4-7 المدى القطاع. واستخدمت مقتطفات البروتين خلية كاملة (200 ميكروغرام) في الطور الثابت وفصل على 15٪ هلام SDS-PAGE.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد وصفت طريقة لتحضير البروتينات التي يمكن استخراج معظم البروتينات بيركولديريا مع استنساخ جيدة. ويتجلى ذلك من خلال الحصول على نفس التشكيل الجانبي البروتين من اثنين الاستعدادات مستقلة أجريت في أيام مختلفة باستخدام نفس الثقافة البكتيرية التي تزرع في مرق LB أو YEM كما هو مبين في الشكل 1. وكان استخراج فعالة للبكتيريا نمت في وسائل الإعلام السائل، ولكن نحن لم نجرب هذه الطريقة للبكتيريا نمت على لوحات. وقد استخدم هذا الأسلوب أيضا لمزيد من توصيف البروتين باستخدام أدوات البروتين؛ درست مجموعتنا بنجاح التغييرات بروتيوم باستخدام 2-D الكهربائي للهلام والنظائر الجغرافية لتحديد الكميات النسبية والمطلقة (iTRAQ) تقنيات البروتين 15،23،24. لهذا الأخير، تم استخراج البروتينات في العازلة التي تحتوي على 0.5 M EDTA في برنامج تلفزيوني لتفادي أي تدخل من PMSF مع التجارب iTRAQ 15.
من المهم أن عينيتابوت أنه خلال عملية استخلاص البروتين و 2-D الكهربائي للهلام، وينبغي إجراء جميع الخطوات للخروج في 4 درجات مئوية أو في الظروف الباردة باستخدام دلاء الثلج للحد من تدهور البروتين، وكذلك لاستخدام نصائح صوم وارتداء القفازات النتريل وتغطية جميع قطع الجلد لمنع التلوث الكيراتين من أي بقع من اصل لتحديد اللاحقة مطياف الكتلة. عند تنفيذ عمليات الاستخراج البروتين، فمن المهم أيضا أن نعتبر أن PMSF لديه وقت قصير نصف العمر في المحاليل المائية، وفقا لالصانع، وبالتالي فإن حل ملي 0.1 الأسهم في الأسيتون وينبغي بذل فورا قبل الاستخدام. بدلا من ذلك، مثبطات سيرين أخرى أو مثبطات الأنزيم البروتيني التي هي أكثر قابلية للذوبان ومستقرة، وأقل سمية يمكن استخدامها، على الرغم من أننا لم تختبر منهم في تجاربنا.
وتحلل العازلة المستخدمة في هذا الإجراء لا يحتوي على اليوريا، وهو أمر مهم لكلا الانحلالية لاستخراج مائي (عصاري خلوي) البروتينات والبروتوكول الاضافي أقل للذوبانEINS، بما في ذلك بعض البروتينات الغشاء 17. ولكن، خلال إعداد نموذج لالبعد الأول كهرساوي التركيز (الخطوة 3 من هذا البروتوكول)، ومعلق في عينات العازلة الإماهة الذي يحتوي اليوريا. كما تشمل تقنيات البروتين غيره من ضروب المعاملة مماثلة 26. قبل الخطوة التالية مع الإماهة، يبدو أن إزالة المواد التدخل أو منخفضة الوزن الجزيئي الشوائب أمر حاسم لارتفاع القرار، ونحن نوصي لاستخدام 2-D تنظيف كيت في كل عينات البروتين عن تحسين النتائج. قبل تحميل عينات لالبعد الأول كهرساوي فصل التركيز، تأكد من أن يكون على استعداد شرائط من الورق النشاف حق حجم أصحاب الشريط، لأن هذا هو إشكالية لخفض حجم الحق في الأزياء العقيم على الفور (للخطوة 3.4 من هذا بروتوكول).
قبل تشغيل 2-D SDS-بولكرلميد هلام الكهربائي، فمن الضروري للتأكد من أن نسبة الجل يناسب أحجام المتوقع في المصالح (أ 12يمكن .5٪ هلام نسبة البروتين في حل مجموعة من 14-100 كيلو دالتون). بعد اكتمال الثانية الكهربائي هلام البعد، والتصور من البروتينات يمكن تحقيقه عن طريق تلطيخ Coomassie الأزرق أو الفضة، وتلطيخ الأخير هو أكثر حساسية مع حد الكشف منخفضة مثل 0.1 نانوغرام / البروتين / بقعة 20. بقع البروتين تصور مع الفضة تلطيخ هي مناسبة لمزيد من التحليل بواسطة مطياف الكتلة. ومع ذلك، فمن المهم الإشارة إلى أن الحل وصمة عار الفضة يجب أن لا يحتوي غلوتارالدهيد لأن هذا الوكيل crosslinks مع البروتينات، وبالتالي فإنه غير متوافق مع مزيد من التحليل قياس الطيف الكتلي 20. بدلا من ذلك، لكشف وتحديد البروتينات وأعرب تفاضلي، النهج القائم على هلام أخرى مثل اثنين من الأبعاد، الفرق في جل الكهربائي (2D-DIGE) جنبا إلى جنب مع برامج الحاسوب الآلي يمكن استخدامها. هذا النهج يعمل به نيون متميزة (مثل قبرصي 2 3 و 5 و) التي تستخدم لعينات التسمية والعلاقات العامة القياسية الداخلية عالميةIOR الى المركز الثاني بعد التغلب الكهربائي، إلى حد ما، مساوئ الاختلاف واستنساخ 2-D الكهربائي 27. بالإضافة إلى ذلك، يمكن ملطخة المواد الهلامية بعد البعد الثاني مع SyproRuby، وهو وصمة عار العضويه الروثينيوم كلاب المصممة للتطبيقات البروتين. فإنه يمكن الكشف عن بقع البروتين مع حساسية مماثلة لتلك التي تلطيخ الفضة، ولكن مع حساسية أكبر من Coomassie الأزرق. بعد ويمكن تصويرها المواد الهلامية تلطيخ مع الماسح الضوئي ليزر أو transilluminator 28.
في الختام، يصف هذا الفيديو على البروتين البكتيري الإجراء استخراج خلية كاملة و 2-D طريقة الكهربائي للهلام التي يمكن أن تسمح دراسة التغيرات العالمية في بروتيوم في الأنواع بيركولديريا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل studentship من جامعة كولومبيا البريطانية (لBV) والمنح المقدمة من التليف الكيسي كندا والكندية معاهد أبحاث الصحة (لDPS). نشكر جاكلين تشونغ لإعداد الأولي من البروتوكولات.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma | P7626 | Toxic, corrosive |
| Acetone | Fisher | A18-1 | Flammable |
| PBS Buffer | Bioscience | R028 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher | BP118-500 | toxic |
| Glass beads (0.1 mm) | BioSpec Products | 11079101 | |
| Nalgene Oak Ridge Centrifuge tubes, polycarbonate (50 ml) | VWR | 21009-342 | |
| MicroBCA protein extraction kit | Pierce | 23235 | |
| Microcentrifuge Tubes 2.0 ml conical Screw cap Tubes with Cap and O-Ring | Fisher | 02-681-375 | |
| 2-D Clean-Up kit | GE Healthcare | 80-6484-51 | |
| Urea | Invitrogen | 15505-050 | Irritant |
| CHAPS | Amersham Biosciences | 17-1314-01 | |
| Dithiothreitol (DTT) | MPBiomedical, LCC | 856126 | Irritant |
| Immobiline DryStrips pH 4-7 24 cm | Amersham Biosciences | 176002-46 | |
| Duracryl | Proteomic Solutions | 80-0148 | Very toxic, carcinogen |
| Ammonium persulfate | Fisher | BP179-100 | Flammable, toxic, corrosive |
| N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine (TEMED) | Invitrogen | 15524-010 | Flammable |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Fisher | BP166-500 | Acute toxicity, flammable |
| Agarose | Invitrogen | 15510-027 | |
| Ethanol | Fisher | HC1100-1GL | Flammable, toxic |
| Acetic acid | Fisher | A491-212 | Flammable, corrosive |
| Glutaraldehyde | Fisher | G151-1 | Very toxic, corrosive, dangerous for the environment |
| Potassium tetrathionate | Sigma | P2926 | Irritant |
| Sodium acetate | EM Science | 7510 | |
| Silver nitrate | Sigma | 209139 | Corrosive, dangerous for the environment |
| Formaldehyde | Sigma | 252549 | Toxic |
| Sodium thiosulfate | Sigma | S7026 | |
| Tris Base | EMD | 9230 | |
| Glycine | MPBiomedical, LCC | 808831 | |
| Glycerol | MPBiomedical, LCC | 800688 | |
| Methanol | Fisher | A412-4 | Flammable, toxic, health hazard |
| Sodium carbonate anhydrous | EMD | SX0400-3 | Toxic |
| Mineral oil | ACROS | 415080010 | |
| Equipment | |||
| JA-20 ultracentrifuge rotor | Beckman Coulter | 334831 | |
| Mini Beadbeater | Biospec Products | 3110BX | |
| Ettan IPGphor II Isoelectric Focusing System and accessories | GE Healthcare | 80-6505-03 | www.amershambiosciences.com |
| Ettan DALT Large Vertical electrophoresis system | GE Healthcare | 80-6485-27 | www.amershambiosciences.com |
References
- Drevinek, P., Mahenthiralingam, E. Burkholderia cenocepacia in cystic fibrosis: epidemiology and molecular mechanisms of virulence. Clin. Microbiol. Infect. 16, 821-830 (2010).
- Suarez-Moreno, Z. R., et al. Common Features of Environmental and Potentially Beneficial Plant-Associated Burkholderia. Microb. Ecol. , (2011).
- Wiersinga, W. J., van der Poll, T., White, N. J., Day, N. P., Peacock, S. J. Melioidosis: insights into the pathogenicity of Burkholderia pseudomallei. Nat. Rev. Microbiol. 4, 272-282 (2006).
- White, N. J.
- Mahenthiralingam, E., Urban, T. A., Goldberg, J. B. The multifarious, multireplicon Burkholderia cepacia complex. Nat. Rev. Microbiol. 3, 144-156 (2005).
- Speert, D. P., Henry, D., Vandamme, P., Corey, M., Mahenthiralingam, E. Epidemiology of Burkholderia cepacia complex in patients with cystic fibrosis. Canada. Emerg. Infect. Dis. 8, 181-187 (2002).
- Dance, D. A., Wuthiekanun, V., Chaowagul, W., White, N. J. The antimicrobial susceptibility of Pseudomonas pseudomallei. Emergence of resistance in vitro and during treatment. J. Antimicrob. Chemother. 24, 295-309 (1989).
- Thibault, F. M., Hernandez, E., Vidal, D. R., Girardet, M., Cavallo, J. D. Antibiotic susceptibility of 65 isolates of Burkholderia pseudomallei and Burkholderia mallei to 35 antimicrobial agents. J. Antimicrob. Chemother. 54, 1134-1138 (2004).
- Govan, J. R. W., et al. Evidence for transmission of Pseudomonas cepacia by social contact in cystic fibrosis. Lancet. 342, 15-19 (1993).
- Thongboonkerd, V., et al. Altered proteome in Burkholderia pseudomallei rpoE operon knockout mutant: insights into mechanisms of rpoE operon in stress tolerance, survival, and virulence. J. Proteome. Res. 6, 1334-1341 (2007).
- Park, K. H., Lipuma, J. J., Lubman, D. M. Comparative proteomic analysis of B. cenocepacia using two-dimensional liquid separations coupled with mass spectrometry. Anal Chim. Acta. 592, 91-100 (2007).
- Wongtrakoongate, P., Mongkoldhumrongkul, N., Chaijan, S., Kamchonwongpaisan, S., Tungpradabkul, S. Comparative proteomic profiles and the potential markers between Burkholderia pseudomallei and Burkholderia thailandensis. Mol. Cell Probes. 21, 81-91 (2007).
- Harding, S. V., et al. The identification of surface proteins of Burkholderia pseudomallei. Vaccine. 25, 2664-2672 (2007).
- Madeira, A., Santos, P. M., Coutinho, C. P., Pinto-de-Oliveira, A., Sa-Correia, I. Quantitative proteomics (2-D DIGE) reveals molecular strategies employed by Burkholderia cenocepacia to adapt to the airways of cystic fibrosis patients under antimicrobial therapy. Proteomics. 11, 1313-1328 (2011).
- Zlosnik, J. E. A., Speert, D. P. The Role of Mucoidy in Virulence of Bacteria from the Burkholderia cepacia Complex: A Systematic Proteomic and Transcriptomic Analysis. J. Infect. Dis. 202, 770-781 (2010).
- Riedel, K., Carranza, P., Gehrig, P., Potthast, F., Eberl, L. Towards the proteome of Burkholderia cenocepacia H111: setting up a 2-DE reference map. Proteomics. 6, 207-216 (2006).
- Weiss, W., Gorg, A. Sample solublization buffers for two-dimensional electrophoresis. Methods Mol. Biol. 424, 35-42 (2008).
- von der Haar, T. Optimized protein extraction for quantitative proteomics of yeasts. PLoS One. 2, e1078 (2007).
- O'Farrell, P. H. High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. J. Biol. Chem. 250, 4007-4021 (1975).
- Gorg, A., Weiss, W., Dunn, M. J. Current two-dimensional electrophoresis technology for proteomics. Proteomics. 4, 3665-3685 (2004).
- Gygi, S. P., Rist, B., Griffin, T. J., Eng, J., Aebersold, R. Proteome analysis of low-abundance proteins using multidimensional chromatography and isotope-coded affinity tags. J. Proteome Res. 1, 47-54 (2002).
- Ross, P. L., et al. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Mol. Cell Proteomics. 3, 1154-1169 (2004).
- Velapatiño, B., Limmathurotsakul, D., Peacock, S. J., Speert, D. P. Identification of differentially expressed proteins from Burkholderia pseudomallei isolated during primary and relapsing melioidosis. Microbes. Infect. 14, 335-340 (2012).
- Chung, J. W., Speert, D. P. Proteomic identification and characterization of bacterial factors associated with Burkholderia cenocepacia survival in a murine host. Microbiology. 153, 206-214 (2007).
- Rotz, L. D., Khan, A. S., Lillibridge, S. R., Ostroff, S. M., Hughes, J. M. Public health assessment of potential biological terrorism agents. Emerg. Infect. Dis. 8, 225-230 (2002).
- Thon, J. N., et al. Comprehensive proteomic analysis of protein changes during platelet storage requires complementary proteomic approaches. Transfusion. 48, 425-435 (2008).
- Wu, T. In New and Emerging Proteomic Techniques. Methods Mol. Biol. 328, 71-95 (2006).
- Lopez, M. F., et al. A comparison of silver stain and SYPRO Ruby Protein Gel Stain with respect to protein detection in two-dimensional gels and identification by peptide mass profiling. Electrophoresis. 21, 3673-3683 (2000).
