Summary
好気的条件下で細菌の付着および浸潤を調べるための細胞培養アッセイを行うと、通常の典型的である
Abstract
宿主細胞と細菌性病原体の相互作用は、in vitro細胞培養法での使用広範囲に研究されてきた。例えば、細胞培養アッセイは好気的条件下で行われるしかし、これらは、in vitroモデルにおいて正確にホスト病原体の相互作用が行われたインビボ環境では表していない可能性がある。我々は、異なる媒体とガス条件下で細菌および宿主細胞の共培養を可能にする感染のインビトロのモデルを開発した。垂直拡散室（VDC）のモデルは、細菌が非常に低酸素ながら組織の条件の下になり、人間の腸内での条件が血流からの酸素が供給される模倣。 VDCにSnapwellを挿入で栽培偏腸管上皮細胞（IEC）単層を配置すると、別個の頂端と基底外側の区画を作成します。基底外側区画は、細胞培養培地で充填密封し、酸素ワットで灌流されている微好気条件下でのオープンとインキュベート保ち、頂端区画はスープで満たされているhilst。両方のCaco-2およびT84 IECSは、細胞生存または単層の整合性に明らかな悪影響することなく、これらの条件下で、VDCに維持することができる。異なるCで行わ共培養実験頂端側画分における微好気条件でジェジュニ野生株とVDCモデルにおける異なるIEC線は再現性好気培養条件と比較して、相互作用の数（約10倍）の増加および細胞内（略100倍）細菌をもたらす1。 VDCモデルで作成した環境は、より密接にCで遭遇する環境を模倣人間の腸内ジェジュニとより密接に生体現実に模倣するという条件の下でのin vitro感染アッセイを行うことの重要性を強調しています。私たちは、VDCモデルの使用は、相互作用の新たな解釈は賭けることができますことを提案細菌性病原体と宿主細胞を予期する。
Introduction
宿主細胞と細菌性病原体の相互作用は、in vitro細胞培養法での使用広範囲に研究されてきた。例えば、細胞培養アッセイを用いて、宿主細胞、宿主細胞受容体の同定、宿主細胞シグナル伝達経路および宿主細胞の細菌侵入に対する細菌の付着は、すべての多くの重要な観察結果として、詳細に研究されている。しかしながら、細胞培養アッセイは、インビボ環境を代表しないかもしれない好気的条件下で行われる。胃腸感染を研究するために使用されるin vitroモデルの主な制限は、高い酸素レベルを含む培養条件は、一般に、真核細胞の生存を支持することである。しかし腸管腔の状況はほぼ嫌気性になります。非常に低酸素環境での腸内病原体はその発現が変化する好気的条件下で2病原性遺伝子を発現する。このように、データは、標準的な細胞培養モデルを用いて得メートルAYは、宿主細胞と細菌相互作用の不正確な表示を与える。
カンピロバクターは、軽度の下痢から重度の炎症性腸炎に及ぶという症状を、世界的な細菌性急性胃腸炎の主要な原因物質である。 C.の大半合併症のない胃腸炎でジェジュニ感染の結果、しかし、C.ジェジュニは、ギラ ン·バレー症候群（GBS）を含む末梢神経障害でも最も一般的に同定され感染性病原体である。英国では、C.によって引き起こされる腸炎の50万人以上のケースがあると推定されているポンド5.8億の英国経済への予測コストジェジュニ感染毎年。発展途上国では、C.ジェジュニは、子どもの死亡の主要な原因である。紛れもカンピロバクター感染症の重要性と徹底したゲノムベースの分析、C.含む研究の数十年にもかかわらず、 ジェジュニ病因は依然として不十分understですOOD、そのようなサルモネラ 、 大腸菌 、 赤痢菌 、およびコレラ菌などの他の腸の病原体とは対照的である。便利な小さな動物モデルの欠如は、この3つの主な理由です。も広くビトロ感染モデルで使用気性Cを研究するためのより多くの不適切な通性嫌気性菌であり、他の腸内病原体のためのよりジェジュニ 。ながらC.ジェジュニは侵襲的な病原体、Cのメカニズムとして認識されている腸上皮細胞のジェジュニ侵攻（IECS）は依然として不明である4,5。C.ジェジュニ侵入はマイクロフィラメント、微小管、両方またはどちらも5の組み合わせのどちらかに依存することが示されている。このエリアの混乱はおそらくビトロアッセイ条件の通報を使用することによるものである。
異なる細胞培養アッセイの数は、C.の相互作用を調査するために使用されているジェジュニ宿主細胞である。のCaco-2 6、INT 407 7、およびT84 8細胞株は、すべての異なる℃の接着および浸潤能力を研究するために使用されているジェジュニ菌株。しかし、Cの細菌の付着と侵入のレベルIECSとジェジュニは他の腸病原体9に比べ劇的に低くなっています。 Cの共培養IECSとジェジュニは、通常IECSの生存に必要な、大気中の酸素濃度に近い条件下で、CO 2インキュベーター内で行われる。℃でジェジュニ遺伝子の発現は、大気中の酸素条件と比較して腸管腔の低酸素環境において非常に異なるであろう。
垂直方向の拡散室（VDC）システムの使用は、異なる媒体とガス条件1,10,11で細菌および宿主細胞の共培養を可能に開発されている。このシステムは、細菌が解除になり、人間の腸内の条件を模倣非常に低い酸素ながら組織のファンデ条件は、血流からの酸素が供給される。特別0.4μmのフィルターで増殖偏IEC単層をそれぞれ個別細菌ブロスおよび細胞培養培地が充填され（ 図1）とした頂端側底区画を作成VDCに入れた。 VDCは、変数雰囲気のインキュベーターは、37℃で85％のN 2、5％O 2、10％CO 2を含有する°C、Cの最適条件を表すに入れたジェジュニ 。頂端側画分が開いたままと可変雰囲気のインキュベーター内で微好気雰囲気にさらされた、密封された側底区画をしながら、5％CO 2 /圧力の蓄積を防止する出口管と、95％O 2ガス混合物の一定の投与により酸素を供給した。これらの条件下でのCaco-2細胞の生存および単層の完全性が経上皮エレメントを監視することによって確認されたのCaco-2細胞単層と頂端コンパートメント内低酸素条件下での頂端と基底外側区画の物理的な分離の生存を実証するため、24時間以上の単層にわたるctrical抵抗（TEER）。変数雰囲気インキュベーター（微好気条件）で、標準的な細胞培養CO 2インキュベーター（好気的条件）で維持のVDCで単層のTEERは異なる大気条件1の下で細胞単層の完全性を示す有意な差は認められなかった。微好気条件下では、タイトジャンクションが存在し、均等に好気性条件1の下で維持された細胞に類似オクルディン染色パターンでセルの枠線との間で分配さ残った。
Cの相互作用VDC内のCaco-2とT84細胞とジェジュニは、細菌の相互作用（接着と浸潤）と浸潤を評価することによって調べた。二つの異なるC.ジェジュニ野生型straiNSは、1を使用しました。Cでジェジュニ 11168Hは、元のシーケンス株NCTC11168のhypermotile誘導体である。 11168H株はひよこ植民モデルではるかに高い植民地化レベルを示し、したがって、宿主 - 病原体相互作用の研究のために使用するのに適した菌株と考えられている。 81から176を分離人間であり、ほとんどの侵襲広く研究されている実験室株の一つである。C.ジェジュニ株は微好気性の条件のどちらかまたは下VDCの頂端の区画に追加されました。我々は相互作用と侵略の両方に高いレートはCのために記録された観察微好気条件1の下ジェジュニ 。増加したC.ジェジュニ相互作用は微好気条件1の下での細菌数の増加によるものではなかった。このデータは、VDCの先端コンパートメントにおける低酸素環境が細菌-宿主相互作用を強化し、示していると我々の仮説をサポートするCの侵襲的な性質ジェジュニは INCRですこれらの条件下で緩和。これは、侵襲的な細菌性病原体を研究するVDCモデルの使用の最初の報告書だったとより密接に生体状況で模倣するという条件の下でのin vitro感染アッセイで行うの意義を強調しています。 VDCモデルは、多くの異なる細菌種のホスト病原体の相互作用を研究するために使用することができる。
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Protocol
1。特別な0.4μmのフィルタでIECの単分子膜の成長
- 10％（v / v）のウシ胎児血清、100 U / mlのペニシリン、100μg/mlの/ mlのストレプトマイシンおよび1％（v / v）の内の非必須アミノ酸を補充したダルベッコ改変必須培地で培養のCaco-2細胞（DMEM） 37℃で標準組織培養インキュベーター℃、5％CO 2、95％空気中のC。種子は、0.4μmのあたり4×10 5のCaco-2 IECSは2〜3日ごとにメディアを変え、21日間にわたってフィルタと偏光に成長。
- ボルト - オーム抵抗計を用いて単層の偏光状態を確認するTEERを測定する。我々の研究では、21日のTEERはのCaco-2これらの0.4μmのフィルタで増殖した細胞は700-800Ωcmで2です。
2。 C.の調製ジェジュニと共培養アッセイ用細菌培地
- VDCの共培養アッセイの所望の出発点の前に24時間は、Cの新鮮な血液寒天プレートの準備。 37℃ジェジュニとインキュベート℃の可変雰囲気インキュベーターで微好気条件（85％N 2、5％O 2、10％CO 2）下。
- 同時に、可変雰囲気のインキュベーター中で微好気条件下で37℃でブルセラ菌培養液を30mlのpreincubate。
3。アッセイに先立ちVDCハーフチェンバースの準備と滅菌
- 完全に浸すVDC半分室と同様、Oリング、滅菌溶液中のプラグ。
- 無菌の20ml注射器を使用して、半室の両方でガス注入口を通して殺菌液をフラッシュします。これを怠ると、共培養中に、サンプルの汚染が発生することがあります。
- > 1時間消毒液に浸漬し、すべてのコンポーネントにしておきます。
- ガス注入口を洗浄するための別の滅菌20ミリリットル注射器を使用して、新鮮な滅菌水ですべてのコンポーネントをすすぐ。
4。準備細菌接種の
- Cの半分のプレートを収穫血液寒天プレートからジェジュニの成長は前インキュベートブルセラブロス1mlのに前日用意しました。これは、〜10 10 CFU / mlに得られるはず。
- 細菌のコロニー形成単位（CFUの）をsemiquantifyする600nmで細菌懸濁液の光学密度を測定します。
- プレインキュベートブルセラブロス4mlの中で希望の接種レベルに細菌懸濁液を調整します。
- その後接種に存在する細菌のCFUの数を定量化するために48時間変数雰囲気インキュベーター中37℃でインキュベート三重における血液寒天プレート上で適切な希釈のメッキに続いて、この最後の細菌懸濁液からの段階希釈を行います。
5。 VDCを設定する
- ベンチの上にVDCフラットの下半分室を配置します。下半分室にOリングを取り付けます。
- TからIECSを運ぶつのフィルタを切り離す彼のキャリアとは、無菌のPBSを400μlで3回洗浄する。 Oリングが所定の位置に残っていることを確認し、下半分室の上にフィルターを置きます。
- 優しく場所に上半分室を下げる。つの半室が組み立てられた後、リングクランプを使用して一緒にクランプします。上向きに直面している二つの開口部と、作業台の上に水平にVDCを置きます。
- 尖半室に細菌接種4 mlを加え。
- 基底外側半分室に細胞培養培地4 mlを加える。
- 両方の半室の開口部に、エンドピースを置きます。
6。可変雰囲気インキュベーター内ガスマニホールドにVDCを取り付ける
- ガスマニホールドに近接変数雰囲気インキュベーターにVDCを置きます。
- ガスマニホールドに接続されたガス供給レギュレータを開く。 VDCの基底外側半分室のガス入口にマニホールドからチューブを取り付けます。 GAを取り付けSアウトレットパイプは基底外側半室でエンドピースでアウトレットのいずれかに可変雰囲気インキュベータの導出。
- 基底外側半室でエンドピース内の他の出口を閉鎖。これは、側底媒体の放出をもたらすことができるように、過剰な気体圧力を避けるために非常にゆっくりと開くように注意しながら、ガスマニホールドにガスの流れを開く。
- 目的は、すべての2-5秒1バブルのガス流量である。定期的に、実験の過程でガスの流れを確認し、必要に応じて調整します。
7。共培養後VDCの分解
- 適切な共培養期間後に、ガスマニホールドに接続されたガス供給レギュレータを閉じる。マニホールドでVDC内にガスの流れを遮断する。ガス入口、ガス出口とVDCからストッパーを外します。
- 変数大気インキュベーターからVDCを削除します。 subsequenため-80℃で頂端および基底外側清や店舗°Cを削除するT分析。
- リングクランプを外し、静かにVDCを離れて取る。半室と無菌6ウェル細胞培養皿への転送からフィルタを削除します。滅菌PBS400μlのでIECS 3回洗浄する。
- 相互作用する細菌の総数の計数のため、IECを溶解し、室温で20分間インキュベートしIECSに0.1％を含有する滅菌PBS400μlの（v / v）のトリトンX-100を加える。その後、細菌CFUの相互作用の数を定量化するために48時間変数雰囲気インキュベーター中37℃でインキュベート三重における血液寒天プレート上で適切な希釈のメッキに続いて、この細胞溶解物から段階希釈を行います。
- 侵入した細菌の総数を列挙するために、IECSに150μgの/ mlのゲンタマイシンを含むDMEM細胞培養培地を400μlを加え、37℃で標準的な組織培養インキュベータ中で2時間インキュベート℃のCO 2、5％C、95％細胞外の細菌を殺すために、空気、その後、上記のステップ7.4の場合とフォロー。
8。共培養後VDCのクリーニング
実験の次のラウンドのために滅菌水や店舗でVDCを洗ってください。
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Representative Results
Cで行われる共培養実験ジェジュニ野生型株および頂端側画分における微好気条件でVDCモデルにおけるIECSは時間内に好気培養条件と比較して、相互作用の数の増加（約10倍）および細胞内（略100倍）細菌を実証している依存性の様式1。この観察は、2つの異なるC.を用いて再現可能であったジェジュニは、野生型株（11168H及び81-176）および2つの異なるIEC線（のCaco-2およびT84）、VDCモデル1の有効性を強調する。
ここで紹介する代表的な結果は、Cの数との比較ですジェジュニはとの対話やのCaco-2 3後の細胞、6、CO 2インキュベーター（ 図2AおよびB）で、または尖COMで微好気条件でVDCモデルで標準的な細胞培養アッセイ条件のいずれかの下で共培養の24時間を侵略コンパートメントか（ 図2CおよびD）。二つの異なるCのデータジェジュニ野生型株（11168Hと81から176まで）が掲載されています。科学文献中の研究の大部分で使用される標準的な細胞培養条件下で、<10 7 cfuではcfuでは、VDCでのCaco-2細胞との相互作用が観察〜10 8と比較したCaco-2細胞（ 図2A）との相互作用が観察された24時間後のモデル（ 図2C）。 VDCモデルにおける共培養した後、〜10 7細胞内のcfuのみと比較したCaco-2細胞（ 図2D）、〜のための標準的な細胞培養条件下で同時培養後のCaco-2細胞（ 図2B）から単離された10 5細胞内のcfuから分離された24時間。
C.の数と直接比較ジェジュニはとの対話または微好気性または条件のいずれかでVDCモデルで共培養後IECSを侵略アピカルコンパートメント内tionsは、以前1行われている。 C.相互作用の増加VDCモデルの結果を使用することほぼ10倍、細胞内での増加ジェジュニ 24時間共培養1後ほぼ100倍のジェジュニ 。
図1。垂直拡散室（VDC）モデルの概略。腸管上皮細胞（IECS）透過性0.4μmのフィルター支持体上に成長し、VDCに挿入し、このように頂端および基底外側コンパートメントを作成している。これらの区画は、次いで、個別にC. IECSとの共培養を可能にするために媒体およびガス組成物に対して調整することができるIECSの基底外側表面でIECSと好気的条件下の先端面に微好気条件でジェジュニ 。
図2。 C.の数を比較描写結果共培養アッセイは、COで標準的な細胞培養条件のいずれかで実行されたとき（およびC）と相互作用又は3,6又は24時間後（BおよびD）のCaco-2細胞に侵入ジェジュニ 11168H又は81-176野生株2インキュベーター（AとB）または尖コンパートメント（CおよびD）で微好気条件でVDCモデルですべての実験は、各実験で重複して行わ少なくとも三つの生物学的な複製を表しています。 より大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください 。
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Discussion
宿主細胞と細菌性病原体の相互作用を研究するためのin vitro細胞培養法での使用が広く多くの研究室で用いられる技術である。例えば、細胞培養アッセイは好気的条件下で行われるしかし、これらは、in vitroモデルにおいて正確にホスト病原体の相互作用が行われたインビボ環境では表していない可能性がある。広く試験管内感染モデルで使用される微好気性Cを研究するために特に不適切であるジェジュニは通性嫌気性菌であり、他の腸内病原体に比べて。 C.によって人間IECSの侵入のメカニズムに関する文献で かなりの混乱があるジェジュニ 4,5。我々は、これらの研究で用いインビトロのモデルが正確に生体状況で反映していないので、侵入のメカニズムはとてもよく理解されていない理由があることを示唆している。レベルは、標準的な細胞培養アッセイを用いてCの IECSのジェジュニ侵攻は常に9非常に低いです。 VDCモデルの開発は、この問題に対処するための対応だった。
我々は2つの異なるIECラインが24時間期間1以上の任意の観察された不利な影響を与えることなく先端面に微好気条件でVDCに維持することができることを確立した。相互作用および細胞内Cの両方数の時間依存的な増加ジェジュニ 11168H野生株の細菌が根尖コンパートメント1で微好気条件とVDC内のCaco-2 IECSと共培養後に観察された。これらの観察結果は、第2 IECライン（T84）と同様に、第二のCを使用して確認されたジェジュニは、野生型株（81から176）の場合、細胞株や菌株の特定のエフェクト1がないことを示す。細菌の相互作用および浸潤これらの増加したレベルはIECS 1から増加し、偏先天性免疫応答をもたらした。 HIGIL-8の彼女のレベルが増大した細菌チャレンジが増加した宿主反応によって照合されたことを示す、微好気共培養した後に検出された。 IL-8の高レベルはIECSによるIL-8分泌が基底IEC表面から主に発生している。示し、尖清に比べて基底上清中に検出されたIL-8は、腸内腔における限られた用途であろう好中球誘引、のようになります。このデータは、VDCの二コンパートメントセットアップも偏宿主応答の効率的な識別を可能にすることを示しています。
VDCモデルの技術的/セットアップ側に関するいくつかの機能は、前に、病原体を研究するためのモデルを適用するには考慮しなければならない。まず、IECSは特別な0.4μmのフィルターで不浸透性の単分子層を形成するために成長する必要があります。これは、使用細胞株に応じて14-21日の間にかかり、クラシカルcocultuに比べて実験がかなり長くなりますリング実験は、細胞培養プレート中で行われ、1-7日の間に成長させIECSを使用する。一方、唯一の成長のような長い期間の後IECSは、完全に偏単層を形成することが実証されている。このような偏光単層がはるかに密接にいくつかの研究で使用され、そのようにVDCモデルのもう一つの利点を提供する無極性、非融合IECラインよりヒト腸上皮に、生体内での状況を模倣する。第二に、特別0.4μmのフィルターは標準24ウェル細胞培養プレートよりもかなり高価である。 VDCの主な制限は、比較的低いスループットです。これは主に、VDC室の可用性とガスマニホールドを要する設定に起因します。並列複製するだけの比較的低い数字は、古典的な細胞培養方法とは対照的に、一度に行うことができる。 VDCモデルは、したがって、レプリカの多数を必要とする大規模なスクリーニング実験または実験にはあまり適していTES。考慮すべきもう一つの要因は、VDCモデルで共培養アッセイを実施するの重力効果は時間の経過とともに細菌がIEC単層との相互作用のために減少の機会をもたらしアピカルコンパートメントの底に凝集して開始されることを意味するということです。しかしVDCモデル使用、我々は11168H rpoN変異をnonaggregating非運動性の相互作用は、劇的に6時間1日以降11168H野生型株を集約する、運動性と比較して減少していることが示されている。我々は現在より密接に腸管内腔に蠕動運動を模倣するであろう頂端の区画のいくつかの混合ができるようになるVDCモデルへの変更に取り組んでいます。したがって、VDCモデルは特に、Cなどの細菌に対して、より密接に生体状況で模倣のための古典的な、好気性細胞培養法よりも優れていながら、厳しい大気の要件を持っているジェジュニは 、VDCモデルはまだ取られる必要があり、一定の制限がありますアカウントに実験を設計する際に。
我々のデータは、宿主細胞に増加した細菌の付着が認められた人間の胃の病原体ヘリコバクターピロリを研究するために使用される類似のVDCモデルの報告の知見をサポートする細菌の病原因子の合成と同様に増加した宿主自然免疫応答Hを増加ピロリ菌は、好気的条件11に比べ、微好気下で上皮細胞と共培養した。 H.両方としてピロリ菌とC.ジェジュニが成長のための微好気条件を必要とする、微好気条件が宿主細胞と生物の相互作用を促進するという発見は驚くある。しかし、IECSで通性嫌気性腸管出血性大腸菌の相互作用を分析するためにVDCシステムを使用して別の研究では、VDC頂端側画分25.4微好気/嫌気共存条件下で細菌相互作用のレベルの増加を示した。 T彼は、微好気/嫌気条件下IECSと共培養したときに大気中の酸素条件下での増殖が可能な細菌の挙動も変更されていることを示します。これは、VDCモデルがより忠実にヒト腸管腔におけるインビボ状況で似ている条件下で、多くの異なる病原性細菌の宿主-病原体相互作用の分析のための改良された貴重なモデルであることを示唆している。
モデルの観点から、VDCモデルは、in vitro C.ジェジュニ -IECの共培養モデルで好気性の上にいくつかの明確な利点を有することが証明されている。 VDCモデルで作成した環境は、より密接C.中に人間の腸内環境を模倣カンピロバクター感染症は、と相互作用IECSに侵入細菌の数が非常に有意な増加につながる。この現在のフォーマットでVDCモデルは胃や腸と腸内細菌の相互作用を研究するのが理想的です上皮細胞が、糞便サンプルからか、単に二つの例のような経口微生物サンプルのための厳格な嫌気性菌の研究のためのVDCモデルを適応させる可能性があります。重要な原則は、常により密接生体状況で模倣するという条件の下でこれらの共培養実験を行うことを目指してする必要があります。 VDCモデルは、Cのさらなる研究のための重要なツールとなるでしょうジェジュニ宿主-病原体の相互作用とは、さまざまな細菌の病原性のメカニズムの研究に適用する必要があります。
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Disclosures
我々は、開示することは何もありません。
Acknowledgments
ドミニクミルズはブルームズベリー大学博士学生の身分（2007-2010年）のによってサポートされていました。著者は、VDCのモデルを開発する上で彼らの支援のためにルブラGundogduとアブディエルミ両方に感謝したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Speciality vertical diffusion system for use with Snapwell inserts | Harvard Apparatus | 66-0001 | Manifold & six Snapwell chambers |
| Caps | Harvard Apparatus | 66-0020 | |
| O-rings | Harvard Apparatus | 66-0007 | |
| Clamps | Harvard Apparatus | 66-0012 | |
| Snapwell filters (pore size 0.4 μm) | Corning Costar | 3407 | |
| Millicell ERS-2 Volt-Ohm resistance meter | Millipore | MERS00002 | |
| WPA Lightwave II spectrophotometer | Biochrom | 80-3003-72 |
References
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