Summary
Vi presenterar en förberedelse för att visualisera och manipulera kalciumsignalering i native, intakt mikrokärlendotel. Endothelial rör nyligen isolerade från mus motstånds artärer levererar skelettmuskulaturen behålla in vivo morfologi och dynamisk signalering inom och mellan angränsande celler. Endothelial tuber kan framställas från mikrokärl i andra vävnader och organ.
Abstract
Styrningen av blodflödet genom motståndet kärl reglerar tillförseln av syre och näringsämnen samtidigt med avlägsnandet av metaboliska biprodukter, som exemplifieras genom att utöva skelettmuskulaturen. Endotelceller (ECS) linje intima av alla motståndsfartyg och tjäna en viktig roll i kontrollen diameter (t.ex. endotelberoende vasodilatation) och därmed omfattningen och fördelningen av vävnad blodflödet. Regleringen av vaskulär resistens av ECS åstadkommes genom intracellulära Ca2 +-signalering, vilket leder till produktion av diffunderbart autakoider (t.ex. kväveoxid och arakidonsyrametaboliter) 1-3 och hyperpolarisation 4,5 att framkalla glatta muskelceller avkoppling. Således förstå dynamiken i endothelial Ca2 +-signalering är ett viktigt steg mot att förstå mekanismerna som styr blodflödet kontroll. Isolera endothelial tuber eliminerar störande variabler i samband med blood i kärlets lumen och med närliggande glatta muskelceller och perivaskulära nerverna, som annars påverkar EG struktur och funktion. Här presenterar vi isoleringen av endothelial rör från den överlägsna epigastrisk artär (SEA) med hjälp av ett protokoll optimerat för detta fartyg.
För att isolera endothelial rör från en sövda mus, är SMB ligeras på plats för att hålla blodet i kärllumen (för att underlätta visualisera det under dissektion), och hela ark magmuskel skärs. Havet är dissekeras fri från omgivande skelettmuskelfibrerna och bindväv, blod spolas från lumen, och mild enzymatisk digerering utförs för att möjliggöra avlägsnande av adventitia, nerver och glatt muskel-celler med användning av mild triturering. Dessa färska isolerade preparat av intakt endotel behåller sitt eget morfologi, med individuell EC förblir funktionellt kopplade till varandra, kunna överföra kemiska och elektriska signals intercellularly genom gap-junctions 6,7. Förutom att ge nya insikter i kalcium signalering och membran biofysik, dessa preparat möjliggör molekylära studier av genuttryck och protein lokalisering inom infödda mikrokärlendotel.
Introduction
I detta protokoll, beskriver vi isolering av endothelial cell rör från musen SEA. Den SEA uppstår från den interna bröstkorg artären och förnödenheter syresatt blod till den anteriora bukmuskulaturen. Vårt arbete med havet som en modell är hänförlig till det som ger relativt långa, ogrenade mikrokärls segment som är väl lämpade för att studera intercellulära signaler händelser som ligger till grund roll endotelet i styr och samordnar glatta muskelceller avkoppling. För dem som är intresserade av andra än skelettmuskler vävnad, har vi funnit denna teknik för att lätt anpassas för att erhålla endothelial tuber från mikrokärl i hjärnan, tarmen och det lymfatiska systemet.
De viktigaste funktionerna i denna metod är att intakta längder (1-3 mm) av mikrokärlendotel isoleras, säkrade mot ett täckglas i en flödeskammare där de superfuseras med PSS, och avbildas för Ca2 + signalering 7-9 ellerspetsad för elektrisk signalering 6,8. Inom flödeskammaren är den övre halvan av ett rör som utsätts för den superfusionslösningen och reagerar på experimentella ingrepp, medan den nedre halvan (i kontakt med täckglas) skyddas och förblir stilla. Förutom att studera både intra-och intercellulära Ca2 + signaleringshändelser kan endotela tuber användas för kvantitativ realtids-PCR för att utvärdera genuttryck 6,10, immunhistokemi för att undersöka proteinuttryck 6,10, och elektrofysiologiska studier att definiera biofysiska egenskaper av elektrisk ledning 6,11.
Det finns flera fördelar med att endothelial rör förberedelse för att studera endotelfunktion det. Först är att isoleringsprocessen ger en enkel distinktion mellan två cellpopulationer: endotelceller (som finns kvar i röret bildning) och glatta muskelceller (individuellt dissocierade, vanligtvis "C" formad näravslappnad). Detta möjliggör selektiv provtagning och undersökning av unika egenskaper som ligger bakom respektive celler bidrag till fartygets funktion. För det andra möjliggör denna modell lösningen av signaleringshändelser inneboende till endotelet, oberoende av påverkan av blodflödet, omgivande glatta muskler, nerver och parenkymet. För det tredje är den endotel studerades medan nyisolerade och därigenom undvika förändringar i gen-eller proteinexpression associeras med cellkultur.
Protocol
1. Beredning av utrustning: Flow avdelningen, pipetter och lösningar
- Flödes kammare: Använd en flödeskammare med en 24 mm x 50 mm täckglas på botten för att superfuse de isolerade endothelial rören (se figur 1 A). Innan montering kammaren, tvätta täckglas med både 3% HCl och 70% etanol, spola med ultrarent vatten, och torka med kvävgas.
- Pipetter: Tre olika typer av pipetter används under protokollet: kanyle, fördelning, och fastlåsning. Både kanyler och fastlåsning pipetter kan göras före dagen för experimentet, men det pulverisering pipetten bör göras samma dag som det krävs kunskap om diametern på kärlets storlek lumen lämpligt.
- Kanylepipetter: För att spola röda blodkroppar från lumen, drar borosilikatglas kapillärrör med hjälp av en mikropipett avdragare för att ha långa, avsmalnande ändar. Bryt ändarna med pincett till en ytterdiameter ~ 30% less än den för de artärer (~ 50 till 80 mikrometer), och brand polish spetsen för att vara släta (se figur 1b). Det är bra att även vinkel spetsarna på pipetterna till ungefär 45 °.
- Pulverisering pipetter: För att mekaniskt dissociera glatta muskelceller och adventitia från de endothelial rören, gör finfördelning pipetter från borosilikatglas kapillärrör. Förbered kapillärrör som ovan, och bryta i slutet med pincett. Tips: Använd en glas scoring enhet för att göra det lättare att bryta den tjockare väggen av finfördelning pipetten glaset rent. Bryt pipetten till den inre diametern fastställs på dagen för experimentet, cirka 10-20 um större än ytterdiametern på det fartyg från vilket endothelial rör ska isoleras. Brand polera de trasiga ändarna tills slät (se figur 1C).
- Pinning pipetter: För att stabilisera endothelial röret i flödet kammaren, gör sätter pipetter för att säkra endothelial tUBE mot täckglaset botten av kammaren. Dra glas kapillärrören på samma sätt som de kanylepipetter. Då bryter ändarna med pincett till en diameter på ~ 100 nm, och brand polera tills spetsarna är förseglade, rundade och släta (se figur 1D). OBS: Om spetsen på pinning pipetten inte är helt tät, kommer vätska in i lumen och kan förbrylla experimentella resultat.
- Lösningar: Förbered alla lösningar i ultrarent (18,2 Mohm) H 2 O och sterilisera dem genom ett 0,2 ìm filter. Se till att osmolaliteten av lösningarna är mellan 285-300 mOsm. Lösningar fortsatt bra i ungefär två veckor vid förvaring vid 4 ° C.
- Dissection lösning: Saltlösningen som används under dissektion av överlägsen epigastrisk artär är sammansatt av (i mmol / liter): 137 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl2, 10 N-2-hydroxietylpiperazin-N'-2-etansulfonsyra ( HEPES), 10 glukos, 0,01 natriumnitroprussid (SNP), end 0,1% bovint serumalbumin (BSA) med ett pH på 7,4. NO-donator SNP ingår att hjälpa till att slappna av glatta muskelceller, vilket gör dem lättare att kanylera artären och underlätta glatta muskelceller bort under rivning.
- Dissociation lösning: Saltlösningen som används under dissociation av endotelial röret är sammansatt av (i mmol / liter): 137 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl2, 10 HEPES, 10 glukos, 2 CaCl2 och 0,1% BSA, med ett pH av 7,4. Till en 1 ml alikvot av denna buffert och tillsätt: 0,62 mg / ml papain, 1,5 mg / ml kollagenas och 1,0 mg / ml ditioerytritol. Eftersom enzymer från olika leverantörer kan ha olika nivåer av enzymatisk aktivitet, produktnummer som används för detta arbete ingår som referens i tabellen av material. OBS: Under protokollet både dissociation buffert och dissociation buffert med enzymer används vid olika steg.
- Superlösning: Den fysiologisk saltlösning (PSS) som används för superfusing av den isolerade endotelcell röret är sammansatt av (i mmol / liter): 137 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl2, 10 HEPES, 10 glukos och 2 CaCl 2, med ett pH på 7,4.
- Förbered buffertar och lösningar innan kirurgiska ingrepp. Ta lösningarna från 4 ° C och delprov 50 ml Dissection buffert i en 200 ml E-kolv och placera den på is. Dessutom lika stora 50 ml Dissociation buffert utan enzymer och placera den på bänken topp till jämvikt vid rumstemperatur. Avlägsna superfusionslösningen från 4 ° C och låt den anta rumstemperatur på bänken toppen.
2. Djurpreparering
Se till att alla procedurer och protokoll som involverar djur är i överensstämmelse med National Institutes of Health Guide för skötsel och användning av försöksdjur. De förfaranden som beskrivs här godkändes av Animal Care och användning kommittén vid universitetet iMissouri.
- Använd manliga eller kvinnliga möss minst 9 veckor gammal och studerar varje individuellt. Bedöva en mus med pentobarbital-natrium (60 mg / kg) via intraperitoneal (ip) injektion. Tips: Utspädning av pentobarbital till 10 mg / ml i steril koksaltlösning före injektion minskar risken för överdosering.
- Anestesi äventyrar temperaturreglering, så håll musen varm direkt efter den första injektionen av pentobarbital. Med användning av en metallbärare (ventilerad aluminium korg) på toppen av en värmeplatta (kalibrerad till ~ 37 ° C) fungerar bra för att hålla temperaturen hos musen stabil. Alternativt kan du använda en värmelampa, var noga med att placera den på ett lämpligt avstånd från musen. Övervaka musen varje 5-10 min tills en lämplig nivå av anestesi uppnås (brist på uttag till tå eller svans nypa). En kompletterande dos kan behövas efter 15-20 min. Det är bäst att gå långsamt och försiktigt för att undvika överdosering, speciellt med överviktiga, äldre, eller djurs annars stressad.
- Ta bort håret från den ventrala sidan genom att försiktigt raka den med små sällskapsdjur hårklippningsmaskiner. Särskild uppmärksamhet bör iakttas för att undvika skador på djuret. Det är bra att ta bort allt hår från ett område som sträcker sig över armhålorna till skrevet. Ta bort eventuellt löst klängande hår med en fräsch alkoholservett.
- Placera musen på rygg, liggande med både fram-och bakbenen utspridda för att exponera så mycket av bukväggen som möjligt. Använd vid behov laboratorie tejp för att fästa benen i en spread-eagle sätt.
3. Isolering av Superior Epigastrisk Artery
- Gör ett litet snitt genom huden precis ovanför det område av blygd regionen. Se till att endast huden skärs samtidigt undvika skador på underliggande magmuskeln, förlänga snittet i sidled i varje riktning ut till respektive bakben. Fortsätt snittet rostrally längs ventrala mittlinjen till den övre delen av bröstkorgen och denn förlänga snittet i sidled i varje riktning till respektive framben.
- Lyft försiktigt huden och använda sax för att kapa bindväven som håller huden till den underliggande muskeln, och därigenom exponerar hela ytan av den abdominala muskulaturen (se figur 3A). Skölj det exponerade muskel med rumstemperatur 0,9% saltlösning.
- På grund av den begränsade storleken på SEA, placera djuret under ett stereomikroskop för ytterligare förfaranden. Lyft fettkudden belägen vid botten av bröstbenet med pincett, och göra ett snitt genom den. Fortsätt snittet längs den nedre revbenet, och se till att inte skära för djupt i den underliggande vävnaden. SEA ska vara synlig, vara noga med att inte skada den. När snittet är färdigt, skölj den exponerade vävnaden med rumstemperatur 0,9% saltlösning.
- När det översta lagret av skelettmuskel har dragits tillbaka, är SEA och underliggande muskeln lätt identifieras. Tips: Observera att längden påSMB in vivo innan isolera förlänga endothelial rör (som förkortar längs sin axel vid isolering) att närma sin ursprungliga längd. Med hjälp av pincett och sax, skära försiktigt den tunna muskellagret under SEA.
- Med hjälp av vinklade pincett, passera en längd på 6-0 silke sutur under SEA och ligate artären och dess intilliggande ven för att hålla den trycksatt och blod kvar i kärllumen för att underlätta visualisering under efterföljande isolering och rengöring.
- Upprepa SEA ligation proceduren på den kontralaterala sidan.
- När båda socio har ligeras, gör ett snitt längs mittlinjen av magmusklerna för att åtskilja respektive sidor.
- Förläng snittet i sidled i varje riktning som utförd för huden, då fortsätter incisionen vertikalt längs den yttre kanten för att fullständigt separera den abdominala muskeln från kroppen. Undvik skador på kärl matas av SMB för att bibehålla de trycksatta lumen.
- Cut SMB ovan ligeringen för att bibehålla tätningen, och placera den isolerade muskel-och artär i en 50 ml bägare innehållande 10 ml av en 4 ° C dissektion buffert.
- Upprepa proceduren på den andra sidan av buken och inkubera vävnaden i dissektion buffert under 10 min.
- Placera magmuskel innehåller SMB i en kyld (4 ° C) dissektion kammare som innehåller dissektion buffert (se figur 3B). Den dissektion Kammaren består av en petriskål med ett lager av Sylgard (polydimetylsiloxan [PDMS]) i botten.
- Använda insekt stift (0,15 mm), sträcka isolerade SEA och magmuskel ut att närma in vivo längder (som nämnts ovan) och fäst den Sylgard. Tips: Orientera muskeln så att det tunna lagret inför bukhinnan är på toppen gör SMB väl synlig med hjälp av genomlysning.
- Använda fina microdissection instrument och arbetar från uppströms platsen för ligation motnedströms ände, rensa havet från sin parade ven och den omgivande vävnaden tills den första stora grenen webbplats (1-2 cm). Sedan skära SMB genom att klippa den precis ovanför gren platsen och strax under ligation.
- För att ta bort blod kvar i kärllumen, kanylera SEA och spola den med iskall dissektion buffert. Med hjälp av en bit silastic slang, fästa den bakre änden av en kanyle pipett till en 5 ml spruta med iskall dissektion buffert och säkra mikropipett i en mikromanipulator att placera sin spets i dissekering kammaren att kanylera SEA.
- När alla erytrocyter spolas ut, ta bort havet från kanyle pipett och lyft pipetten ur dissekering skålen.
- Skär SEA i mindre segment vardera 1-3 mm i längd. Dessa kortare segment underlätta isolering av endoteliala rör.
4. Isolering av Endothelial Tube
- Fyll en 12 mm x 75 mm glaskulture röret till hälften med is kall dissektion buffert. Med hjälp av vinklade pincett, överföra arteriella bitarna i odlingsröret och placera på is. Vid denna tidpunkt, kombinera de uppslutnings enzymer med Dissociation buffert till en slutvolym av 1 ml i en separat 12 mm x 75 mm odlingsrör (se 1.3.2 Solutions) och värm lösningen till 37 ° C med ett värmeblock.
- Medan dissociationsbuffert och enzymer är att värma upp försiktigt aspirera dissektion buffert från odlingsröret lämnar en liten volym som innehåller fartygssegmenten.
- Försiktigt lägga rumstemperatur dissociation buffert utan enzymer för att tvätta bort kvarvarande dissektion buffert. Tips: Lägg till dissociationsbuffert långsamt så att de arteriella bitarna kvar på botten av odlingsröret för att spara tid på att vänta för dem att åter bosätta sig. Höj bufferttemperaturer över flera steg från is (4 ° C), till rumstemperatur (~ 24 ° C), till 37 ° C för att minimera vibrationer.
- Försiktigt aspirera dissociation buffert från odlingsröret, återigen vara noga med att lämna en liten volym som innehåller fartygssegment.
- Avlägsna förvärmning dissociationsbuffert med enzymer från värmeblocket och överför sedan en ml av enzymlösning till odlingsröret som innehåller de fartygssegment och placera odlingsrör tillbaka i värmeblocket. Inkubera vid 37 ° C under 30 min.
- Under inkubationen med enzymer, förbereda pulverisering pipett, återfylla den med mineralolja och fäst den på en mikrospruta som är monterad i en mikromanipulator. Sedan dra in mikro kolven för att fylla pipetten med 2 nl av dissociation buffert och placera pipettspetsen över flödet kammaren.
- Vid slutet av 30 minuters inkubation, avlägsna odlingsröret från värmeblocket och försiktigt aspirera buffert som ovan.
- Tvätta arteriella segment med 4 ml rumstemperatur dissociation buffert. OBS: Det är inte längre nödvändigt att hålla fartyget segment på botten av odlingsröret; störa de arteriella bitar faktiskt bidrar till att säkerställa att kvarvarande enzymer avlägsnas effektivt.
- Överför ett fartyg segment till flödet kammaren genom att försiktigt aspirera det med en 1 ml mikropipett, och placera den i flödet kammaren med 1 ml av dissociation buffert.
- Använda mikromanipulator som innehåller mikro, placera spetsen på pulverisering pipetten nära ena änden av kärlet segmentet.
- Sug fartyget segmentet (500 nl dras) till finfördelning pipetten långsamt (225 nl / sek), för att inte orsaka mekanisk påfrestning till EC, och sedan mata tillbaka in i kammaren. Om matsmältningen var framgångsrik, kommer de glatta muskelceller och adventitia skiljas från endothelial röret.
- Upprepa pulverisering tills alla glatta muskelceller är dissocierade. Var medveten om att överdriven finfördelning (4x eller mer) kan skada ECS och göra dem svarar på agonister. Tips:hjälp av triturering pipett flytta adventitia bort från endotelial röret så snart som möjligt för att hålla den från hoptrassling röret. Anm: Med hjälp av pulverisering pipett, kan den isolerade endothelial röret aspireras och överförs till en separat kammare.
- Placera endothelial röret i mitten av flödet kammaren, i linje längs flödesriktningen, och ta bort finfördelning pipett.
- Säker nålning pipetter i mikromanipulatorer monterad vid vardera änden av flödeskammaren och placera sina spetsar vid respektive ändar av den endoteliala röret.
- Sänk en pinning pipett över en ände av röret för att trycka den mot botten av kammaren. Placera den andra nålning pipett på samma sätt vid den motsatta änden av röret. OBS: Placering av pinning pipetter är en avvägning mellan att säkra röret (placera dem längre bort från slutet av röret) och möjliggöra en mer bildbehandling / försöksområdet (placera dem närmare slutet av röret). Lokalisera tfåll ~ 50 ^ m från varje ände av röret fungerar bra. Precis som sätter pipetten vidrör tuben, sakta dra den längs axeln av röret och därmed utvidga det att närma in vivo längd, tryck sedan pipetten mot kammarens botten för att fästa slangen.
- Begin flödet av superfusionslösningen och låta den endoteliala röret för att vila i minst 20 minuter för att uppnå jämvikt och följer (se fig 3C). Använda en peristaltisk pump för att hålla konstant vätskeflöde (super) över endothelial röret. OBS: pinning pipetter kan tas bort när endothelial röret har anslutit sig till botten av flödet kammaren (~ 25 min) eller lämnas på plats för att säkerställa att endothelial röret inte lossnar.
5. Dye Lastning och Kalcium Imaging
- Att visualisera intracellulära kalciumsvar, ladda endotel rör med fluo-4:00 färgämne vid rumstemperatur (~ 24 ° C). Stoppa vätskeflödet i badet, och lägga fluo-4AM till kammaren i en slutlig koncentration av 10 pM. Vänta i 10 min för att tillåta färgen att tränga in i celler, då superfuse den endoteliala rör med färsk PSS under 20 min för att säkerställa extracellulär färgämne avlägsnas och att det intracellulära färgämnet helt har de-förestrade.
- Utför kalcium avbildning. För detta arbete, en upprätt mikroskop (se figur 2) som är utrustad med en roterande skiva konfokalt avbildningssystem användes vid omgivande rumstemperatur. Excite den fluorescerande kalcium färgämnet med en 491 nm laser och få bilder (vid 500-550 nm emission) med hjälp av en intensifierad digitalkamera.
Representative Results
Kalcium svar kan initieras i nyligen isolerade endothelial rör använder acetylkolin (ACh). I den här filmen, är en endotel rör lastad med 10 pM fluo-4:00 stimuleras med superfusion av 1 mikroM ACh (film 1). Klicka här för att se filmen . Färgämnet exciteras vid 491 nm och emission registreras 500-550 nm med användning av en intensifierad laddningskopplad anordning kamera. Bildstaplar förvärvas till 120 bilder / sek för en 25 sek period och kan därefter genomsnitt (t.ex. till 40 bilder / sek). Representativa fluorescens bilder över tiden visas i Figur 4.
Figur 1. Flödeskammare och pipetter som används vid isolering av endoteliala rör. A) flödet kammaren ihop med en 24 mm x 50 mm täckglas som bas. B) Exempel på en drog (till vänster) och en drog, bruten, polerad och vinklad (höger) kanyle pipett. Denna pipett används för att spola erytrocyter från lumen hos artären efter dissekering. Skala bar = 200 nm. C) Exempel på en drog (till vänster) och en drog, trasig och polerad (höger) rivning pipett. Den inre diametern hos denna pipett bestäms av den yttre diametern hos artären. D) Exempel på en drog (till vänster) och en drog, trasig och polerad (höger) sätter pipett skala bar = 200 nm.. Spetsen av denna pipett avrundas och helt förseglad för att säkra den endoteliala röret i flödeskammaren. Skala bar = 200 nm. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 2. Spinning skiva konfokalmikroskop för avbildning av Ca 2 +-signaler. A) Upprätt mikroskop som används för kalcium avbildning. B) (a) Confocal snurrande skivenhet med en (b) intensifierad CCD enhetens kamera. C) Immersion mål (a) 63x ( NA = 1) och (b) 20X (NA = 0,5) som används för att avbilda. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 3. Isolering av buken muskler och överlägsen epigastrisk artär. A (dvs. där fartyg ska ligeras). Skala bar = 1 cm. B) Isolerad magmuskel (ensidig) och SEA nålas i en dissektion kammare för microdissection. Röda pilen visar den första stora förgrenings platsen för SEA (dvs. den punkt där rengöring av kärlet stoppas). Skala bar = 1 cm. C) Isolerad endotelceller röret från en SEA. Differential interferens kontrast bild av ett endotel rör efter 1 timme inkubation vid rumstemperatur. Den endoteliala Röret superfuseras med superfusionsbuffert vid 3 ml / min. Skala bar = 50 nm. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 4. Kalcium fluorescens i en endotelceller rör. Representativa fluorescerande bilder av en endotel röret som svar på stimulering med 1 | iM acetylkolin. A) Fluorescens före stimulering. B) endothelial tube fluorescens vid tiden för acetylkolin administrering, t = 0 sek. C) endothelial tube fluorescens vid t = 5 sek. D) endotel rör fluorescens vid t = 10 sekunder. E) endothelial rör fluorescens vid t = 15 sekunder. F) endothelial rör fluorescens vid t = 20 sek. Skala barer = 40 um. Klicka här för att visa en större bild .
Discussion
Här beskriver vi isoleringen av endothelial rör från SEA och användningen av detta preparat för att visualisera Ca2 + signalering händelser inom sitt konstituerande EC. Detta förfarande var anpassad från en ursprungligen utvecklades för att isolera endothelial rör från arterioler i hamster kremastermuskeln 8. Använda mindre ändringar av de tekniker som presenteras här, har vi isolerat endothelial rör från en mängd olika kärlbäddar, inklusive: foder artärerna i hamster upprullningsdon muskler och kinden påse arterioler 10, mus överlägsen epigastrisk artär 6,7,9, mus mesenterial och cerebral artärer och lymfatiska mikrokärl (opublicerade observationer, referenser ingår för att isolera mesenteriala kärl 12 och cerebrala kärl 13). Isolera endothelial rör från nya kärlbäddar kan kräva ändringar i det ursprungliga protokollet. Om isolering inte lyckas, är det bäst att börja med att förändra uppslutningstider:Öka uppslutningstiden om endoteliala rören är svåra att isolera från glatta muskelceller och adventitia och reducera koktiden om den endoteliala röret inte förblir intakt. Om förändra uppslutningstider misslyckas, justering av koncentrationen av matsmältningsenzymer eller rötningstemperaturen bör prövas. Ett annat alternativ är att minska den inre diametern hos den triturering pipett, vilket ökar skjuvkraften vid avlägsnande av glatta muskelceller. En ökning av hastigheten för fluidum utskjutning kan också prövas för samma effekt men är mer benägna att skadas beredning. Det ska erkännas att det inte alltid är möjligt att isolera intakta endotelceller rör från fartyg där endotelceller inte är väl förbundna med varandra genom Junktional proteiner.
Dissociation av glatta muskelceller efter enzymatisk spjälkning inledningsvis utfördes med användning av en hand-stil pipett 8. Vi har förfinat pulverisering proceduren med en microsyrInge-systemet, vilket har möjlig konsekvent isolering av längre endothelial rör (upp till 3 mm) 6. Vid användning av detta system, är triturering pipetten återfylls med mineralolja för att åstadkomma en kontinuerlig vätskepelaren mellan kolven kontrollerande fluidrörelse och PSS innehållande kärlsegmentet. Den incompressibility av vätska tillsammans med den ständiga drivkraften i mikroskolv ger konstant skjuvning som fartyget tvingas genom pipettspetsen. Däremot handtekniker används ofta för dissocierande celler (t.ex. klämma gummikolven vid slutet av en Pasteur-pipett) involverar komprimering av luft, som introducerar variationer i drivtrycket och därigenom skjuvning utövas på pipettspetsen.
Det finns flera fördelar med att röret förberedelse för att studera endotelfunktion i mikrokärl. Den första är att isoleringsprocessen ger tydliga homogena interna cellulära populationer av EC och smidig muscle celler. Eftersom EC vara fysiskt ansluten som rör, de skiljer sig från enskilda glatta muskelceller, som behåller en "C"-konfiguration, om de förblir avslappnad under rivning. Således respektive celltyper lätt urskiljas, t.ex. när få prover för molekylära tekniker såsom realtids-PCR och immunohistokemi 10. Eftersom flera rör är isolerade från ett enda kärl (eller från bilaterala fartyg som gjort för SMB), kan molekylära data och funktionella uppgifter erhållas från samma fartyg i ett visst djur. Sålunda molekyluttryck kan korreleras med den funktionella beteende mikrovaskulära endotel. Vidare kan signaleringshändelser både intra-och intercellulära inneboende till mikrokärlendotel lösas oberoende från påverkan av hemodynamiska krafter (tryck, flöde), vasoaktiva ämnen transporteras i blodet (t.ex. hormoner), eller från omgivande glatta muskelceller (t.ex.60, via myoendothelial koppling 14-16), nerver 17, eller vävnads parenkymet 18.
Huvudsakligen eftersom endotelet är nyisolerade från utsedda mikrokärl, det finns ingen förändring av fenotyp som annars är associerad med odlingen EC 19-21. Till exempel, odlade EC förlorar muskarinreceptor uttryck och därmed ändra sina kalciumsignalerprofiler. Vidare kan elektrofysiologiska egenskaper hos EC förändring i kultur 22. Eftersom enskilda EC förblir kopplade genom funktionella gap junction-kanaler, den endothelial röret utgör en idealisk modell för att studera ledning av elektriska och Ca 2 +-signaler mellan celler 6,7. Det bör också vara medveten om att de dissocierade glatta muskelceller lätt studeras med patch-clamp teknik för kompletterande uppgifter som ligger till grund mikrovaskulära funktion 23.
En viktig begränsning av endothelial röret mOdel är instabiliteten av preparatet med ökande temperatur. Medan våra förberedelser från SMB har visat stabil och sund vid rumstemperatur (~ 24 ° C) och under flera timmar vid 32 ° C, morfologisk och funktionell försämring inträffar i mindre än en timme vid 37 ° C 9. En annan viktig begränsning av endothelial röret är förlusten av myoendothelial korsningar och deras inneboende signaleringsdomäner som är sammanbyggda till EG-funktion i den intakta kärlväggen 14-16. Det bör också vara medveten om att, medan längre rör möjliggör intercellulära signaler studeras över relativt stora avstånd 6, förberedelse av rör är komplicerat eftersom de får längre eftersom det blir svårare att helt ta avstånd omgivande glatta muskelceller och adventitia. Vi har funnit att rören är längre än 1-2 mm är också svårare att placera och säkra i flödet kammaren. Däremot, medan kortare rör (t.ex. <1 mm) ENAble Ca 2 + och elektriska signaler som skall studeras åtta, de är svåra att underhålla under superfusion i flödeskammaren. Slutligen, även med optimal isolering av rör bilateralt, finns det inte tillräckligt underlag för traditionell kvantifiering av proteinuttryck med hjälp av Western blot, men immunomärkning ger ett index på proteinuttryck och lokalisering. Trots dessa begränsningar utgör den endoteliala röret en ny beredning för att åstadkomma ny insikt i mekanismerna för mikrovaskulära endotelcell-funktion in vivo.
Disclosures
Inga.
Acknowledgments
Författarna tackar Dr Pooneh Bagher och Dr Erika Westcott för redaktionella kommentarer i utarbetandet av manuskriptet. Detta arbete stöddes av National Heart, Lung and Blood Institute of National Institutes of Health i tilldelningsnummer R37-HL041026 och R01-HL086483 till SSS-och F32-HL107050 till MJS. Detta innehåll är ensamt ansvarig för författare och inte nödvändigtvis representerar officiella ståndpunkter National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Chloride | Fisher | S642-212 | |
| Potassium Chloride | Sigma | P9541 | |
| Magnesium Sulfate | Sigma | M2643 | |
| Calcium Chloride | Sigma | C1016 | |
| Sodium Nitroprusside | Sigma | 431451 | |
| Bovine Serum Albumin | USB Products | 9048-46-8 | |
| Papain | Sigma | P-4762 | |
| Collagenase | Sigma | C-8051 | |
| Dithioerythritol | Sigma | D-8255 | |
| Boroscilicate Glass (Cannulation and Pinning Pipettes) | Warner Instruments | G150-4 | |
| Boroscilicate Glass (Trituration Pipettes) | World Precision Instruments | 4897 | |
| Nanoliter Injector Microsyringe | World Precision Instruments | B203MC4 | Updated to Nanoliter 2010 from Nanoliter 2000 |
| Micro4 Controller | World Precision Instruments | SYS-MICRO4 | |
| 12 mm x 75 mm Culture Tubes | Fisher | 14-961-26 | |
| 3-Axis Micromanipulator | Siskiyou Corp | DT3-100 | Holding and positioning the pinning pipettes |
| Flow Chamber | Warner Instruments | RC-27N | |
| 100-1,000 µl Pipette | Eppendorf | 3120000062 | For transferring digested vessel segment to the flow chamber |
| 1 ml Pipette Tips | Fisher | 02-707-405 | For transferring digested vessel segment to the flow chamber |
| Upright Microscope | Olympus | BX51W1 | The actual microscope is up to the user |
| Spinning Disc Confocal System | Yokogawa | CSU-X1 | Confocal imaging is optional |
| XR/TURBO EX Camera | Stanford Photonics | XR/TURBO EX | Ideal for our needs; may vary with user |
| Piper Control Software | Stanford Photonics | Imaging software for TURBO EX camera | |
| Stereo Microscrope | Leica | MZ8 | may vary with user |
| Sylgard | Dow Corning | 184 | |
| Microdissection Scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Dumont Forceps | Fine Science Tools | #5/45 | |
| Minutiens Insect Pins | Austerlitz | M size 0.15 mm | |
| GP Millipore Express PLUS Membrane | Millipore | SCGPT05RE | |
| Pipette Scoring Device | Austin Flameworks | Small Handheld Scoring Tool | austinflameworks.com |
| Compact Pet Trimmer | Wahl Clipper Corp. | Model 9966 | Clean well after each use to maintain life |
References
- Campbell, W. B., Gebremedhin, D., Pratt, P. F., Harder, D. R. Identification of epoxyeicosatrienoic acids as endothelium-derived hyperpolarizing factors. Circ. Res. 78, 415-423 (1996).
- Crutchley, D. J., Ryan, J. W., Ryan, U. S., Fisher, G. H. Bradykinin-induced release of prostacyclin and thromboxanes from bovine pulmonary artery endothelial cells. Studies with lower homologs and calcium antagonists. Biochim. Biophys. Acta. 751, 99-107 (1983).
- Kruse, H. J., Grunberg, B., Siess, W., Weber, P. C. Formation of biologically active autacoids is regulated by calcium influx in endothelial cells. Arterioscler. Thromb. 14, 1821-1828 (1994).
- Busse, R., et al.
- Ledoux, J., Bonev, A. D., Nelson, M. T. Ca2+-activated K+ channels in murine endothelial cells: block by intracellular calcium and magnesium. J. Gen. Physiol. 131, 125-135 (2008).
- Behringer, E. J., Socha, M. J., Polo-Parada, L., Segal, S. S. Electrical conduction along endothelial cell tubes from mouse feed arteries: confounding actions of glycyrrhetinic acid derivatives. Br. J. Pharmacol. 166, 774-787 (2012).
- Socha, M. J., Domeier, T. L., Behringer, E. J., Segal, S. S. Coordination of intercellular Ca2+ signaling in endothelial cell tubes of mouse resistance arteries. Microcirculation. 19, 757-770 (2012).
- Cohen, K. D., Jackson, W. F. Membrane hyperpolarization is not required for sustained muscarinic agonist-induced increases in intracellular Ca2+ in arteriolar endothelial cells. Microcirculation. 12, 169-182 (2005).
- Socha, M. J., Hakim, C. H., Jackson, W. F., Segal, S. S. Temperature effects on morphological integrity and Ca2+ signaling in freshly isolated murine feed artery endothelial cell tubes. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 301, 773-783 (2011).
- Hakim, C. H., Jackson, W. F., Segal, S. S. Connexin isoform expression in smooth muscle cells and endothelial cells of hamster cheek pouch arterioles and retractor feed arteries. Microcirculation. 15, 503-514 (1908).
- Behringer, E. J., Segal, S. S. Tuning electrical conduction along endothelial tubes of resistance arteries through Ca2+-activated K+ channels. Circ. Res. 110, 1311-1321 (2012).
- Bagher, P., et al. Low intravascular pressure activates endothelial cell TRPV4 channels, local Ca2+ events, and IKCa channels, reducing arteriolar tone. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 18174-18179 (2012).
- Faraci, F. M., et al. Cerebral vascular effects of angiotensin II: new insights from genetic models. J. Cereb. Blood Flow Metab. 26, 449-455 (2006).
- Emerson, G. G., Segal, S. S. Electrical coupling between endothelial cells and smooth muscle cells in hamster feed arteries: role in vasomotor control. Circ. Res. 87, 474-479 (2000).
- Ledoux, J., et al. Functional architecture of inositol 1,4,5-trisphosphate signaling in restricted spaces of myoendothelial projections. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 9627-9632 (2008).
- Tran, C. H., et al. Endothelial Ca2+ wavelets and the induction of myoendothelial feedback. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 302, 1226-1242 (2012).
- Nausch, L. W., et al. Sympathetic nerve stimulation induces local endothelial Ca2+ signals to oppose vasoconstriction of mouse mesenteric arteries. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 302, 594-602 (2012).
- Duza, T., Sarelius, I. H. Increase in endothelial cell Ca2+ in response to mouse cremaster muscle contraction. J Physiol. 555, 459-469 (2004).
- Colden-Stanfield, M., et al. Bradykinin-induced increases in cytosolic calcium and ionic currents in cultured bovine aortic endothelial cells. Circ. Res. 61, 632-640 (1987).
- Brunner, F., Kukovetz, W. R. Radioligand binding to muscarinic receptors of bovine aortic endothelial cells. Br. J. Pharmacol. 102, 373-380 (1991).
- Tracey, W. R., Peach, M. J. Differential muscarinic receptor mRNA expression by freshly isolated and cultured bovine aortic endothelial cells. Circ. Res. 70, 234-240 (1992).
- Adams, D. J., Hill, M. A. Potassium channels and membrane potential in the modulation of intracellular calcium in vascular endothelial cells. J. Cardiovasc. Electrophysiol. 15, 598-610 (2004).
- Jackson, W. F., Huebner, J. M., Rusch, N. J. Enzymatic isolation and characterization of single vascular smooth muscle cells from cremasteric arterioles. Microcirculation. 4, 35-50 (1997).
