Protocollen voor implementatie van een Published: September 16, 2013 doi: 10.3791/50762

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Zachary Z. Sun*¹, Clarmyra A. Hayes*², Jonghyeon Shin³, Filippo Caschera⁴, Richard M. Murray², Vincent Noireaux⁴

¹Department of Biology, California Institute of Technology, ²Department of Bioengineering, California Institute of Technology, ³Synthetic Biology Center, Department of Bioengineering, Massachusetts Institute of Technology, ⁴School of Physics and Astronomy, University of Minnesota

* These authors contributed equally

Summary

Deze vijfdaagse protocol beschrijft alle stappen, apparatuur en aanvullende software voor het maken en uitvoeren van een efficiënte endogene Escherichia coli op basis TX-TL-cel-vrije expressie systeem vanaf nul. Met reagentia, het protocol duurt 8 uur of minder voor het inrichten van een reactie, verzamelen en verwerken van gegevens.

Abstract

Ideaal celvrije expressiesystemen kan theoretisch emuleren een in vivo cellulaire omgeving in een gecontroleerde in vitro platform. ¹ Dit is nuttig om eiwitten en genetische circuits op een gecontroleerde wijze en voor het verschaffen van een omgeving voor prototyping synthetische biologie. ^2,3 Om dit laatste doel te bereiken, cel-vrije expressie systemen die behouden endogene Escherichia coli transcriptie-translatie mechanismen zijn in staat om een betere weerspiegeling van in vivo cellulaire dynamiek dan op basis van T7 RNA polymerase transcriptie. We beschrijven de voorbereiding en uitvoering van een efficiënt endogene E. coli gebaseerde transcriptie-translatie (TX-TL)-cel-vrije expressie systeem dat equivalente hoeveelheden eiwit als T7-gebaseerde systemen kunnen produceren tegen een 98% kostenreductie soortgelijke commerciële systemen. ^4,5 De bereiding van buffers en ruwe cel extract zijn beschreven, evenals de uitvoering van eendrie buis TX-TL reactie. Het gehele protocol duurt vijf dagen voor te bereiden en levert genoeg materiaal voor maximaal 3000 enkele reacties in een voorbereiding. Eenmaal opgesteld, elke reactie is onder de 8 uur van installatie tot het verzamelen en analyseren van gegevens. Mechanismen van regulering en transcriptie exogeen E. coli, zoals lac / tet onderdrukkers en T7 RNA polymerase kan worden aangevuld. ⁶ Endogene eigenschappen, zoals mRNA en DNA afbraaksnelheden, kan worden aangepast. ⁷ De TX-TL celvrij expressiesysteem is aangetoond voor zware schaal circuit assemblage, het verkennen van biologische verschijnselen, en de expressie van eiwitten onder zowel T7-en endogene promotors. ^6,8 Begeleidende wiskundige modellen zijn beschikbaar. ^9,10 Het resulterende systeem heeft unieke toepassingen in de synthetische biologie als een prototyping omgeving, of "TX- TL biomoleculaire breadboard. "

Introduction

Celvrije expressie technologie begon in de jaren 1950 als puur translationeel, het vorderen der jaren later aan gekoppelde transcriptie-translatie mechanismen omvatten het gebruik van T7 bacteriofaag DNA. ^11,12 Sindsdien hebben talrijke inspanningen werden geleverd om de creatie van ruwe cel-extract (of E optimaliseren . coli S30 extract). ^13,14 Deze optimalisaties omvatten het verlengen van celvrije eiwitsynthese door ATP regeneratie of stam wijzigingen, en het verminderen van het protocol tijd en kosten. ^15-17 Alternative-cel vrije expressie systemen bestaan ​​die gebruik bereide componenten in plaats van ruwe celextract voor expressie. ⁵ Beide ruw celextract en reconstitutie methoden ontwikkeld voor commercieel gebruik.

Met de komst van de synthetische biologie, is er een verhoogde behoefte aan een goed gekarakteriseerd platform te testen en uit te drukken gemanipuleerde biologische modules en circuits. ^18,19 Dit platform moetveelzijdig, goed gekarakteriseerde, eenvoudig te manipuleren, en gericht op de gebruiker geleverde componenten. Ondanks dat een halve eeuw geleden ontwikkeld celvrije systemen op basis van E. coli intrinsiek deel deze eisen, omdat ze een vereenvoudigde weergave van in vitro cellulaire processen waarbij de complexiteit van de groei en metabolisme. Daarnaast zijn alle van de fundamentele kennis van in-vivo werk op E. coli toepassing gemakkelijk E. coli celvrije systemen.

Hoewel cel vrije expressie systemen toepassingen kunnen hebben in de synthetische biologie, om het doel van de meeste cel-vrije meningsuiting systemen op heden heeft de maximalisatie van eiwitten en metabolieten opbrengst geweest. Dit wordt bereikt door gebruik bacteriofaag T7 transcriptie van sequenties aangedreven door T7 promoters. ²⁰ Hoewel expressie efficiënte en robuuste Deze systemen dienen een gespecialiseerde doel. Celregulering methoden zijn beperkt, moet doelwit DNA templates zijnreengineered naar T7 promotors omvatten, en bepaalde sequenties zoals ribosomale complexen kan niet worden getranscribeerd en gemonteerd. ^21,22 Bestaande celvrije expressie systemen in staat zijn om hoge opbrengsten te behouden met behoud van endogene regulerende mechanismen, een veelzijdigheid die nodig is voor de synthetische biologie.

We hebben een endogene E. ontwikkeld coli celvrij expressiesysteem dat de efficiëntie van eiwitexpressie blijkt uit eerdere systemen behouden maar voegt extra veelzijdigheid doordat expressie en regulering gebaseerd op zowel endogene en exogene (T7 of andere) mechanismen. De hier beschreven protocol is gebaseerd op mijn Kigawa et al.. (2004) en Liu et al.. (2005), maar heeft belangrijke wijzigingen. Het maakt gebruik van Mg-en K-glutamaat op Mg-en K-acetaat voor een hogere efficiëntie, verwijdert 2-mercapto-ethanol, en lyseert cellen met behulp van een kraal-beater. ^17,23,24 Bead-beating wordt verkozen boven homogenisering,-druk-gebaseerde methoden, of sonicatie vanwege de lagere kosten en vergelijkbare opbrengsten aan concurrerende systemen. is ²³ 3-fosfoglycerinezuur (3-PGA) gebruikt als energiebron zoals het werd gevonden om superieure eiwitopbrengsten geven in vergelijking met creatine fosfaat en fosfoenolpyruvaat. ^4,25 Ons systeem kan produceren tot 0,75 mg / ml reporter eiwit met behulp van een-sigma70 gebaseerde promotor met lambda-faag exploitanten of een-T7 gedreven promotor, vergelijkbaar met de opbrengst van andere commerciële systemen. ^4,6 Vijf dagen zijn verplicht om alle benodigde reagentia (figuur 1) te produceren. Bovendien biedt het een 98% kostenbesparing ten opzichte van vergelijkbare commerciële cel-vrije systemen - materiële kosten zijn $ 0,11 per 10 ul reactie, die stijgt tot $ 0,26 met inclusief arbeidsloon (figuur 2).

Protocol

1. Ruwe Cell Extract Voorbereiding

Het voorbereiden van ruwe cel extract over drie dagen zijn twee mensen om efficiënt uit te voeren. Het protocol functioneel bestaat uit drie delen: cultuur groei (stap 1.1 naar stap 1.11), cellyse (stap 1.12 tot stap 1.37), en pak verduidelijking (stap 1,38 naar stap 1.52). Het wordt aangeboden verdeeld in dagen voor het gemak. Ideaal extract 0,75 mg / ml deGFP uit plasmide pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 (Addgene # 40019), en heeft een ruw celextract concentratie van 27-30 mg / ml eiwit. ⁴ produceren echter , extract kenmerken variëren van partij tot partij. Het volgende recept levert genoeg voor ongeveer 3000 enkele reacties (6 ml ruwe cel extract). Als afbouw, is het aanbevolen om te gebruiken niet minder dan 1/6 van de waarden hier gegeven. Wegens tijdgebrek, opschaling wordt afgeraden.

Dag 1

1. Bereid bacteriecultuur media, cultuur plaat, en media supplementen zoals beschreven in Tabel 1. Zie Aanvullend materiaal 1 voor recepten.
2. . Strook BL21-stam Rosetta2 van -80 ° C op een 2xYT + P + Cm agar plaat en incubeer gedurende 15 uur bij 37 ° C of totdat kolonies gemakkelijk zichtbaar Opmerking: Chloramphenicol (Cm) wordt gebruikt voor het selecteren van een plasmide coderen zeldzame tRNA's in de BL21-Rosetta2 stam.

Dag 2

3. Bereid buffers en supplementen zoals beschreven in Tabel 2. Zie Aanvullend materiaal 1 voor recepten.
4. Bereiden en steriliseren materialen die nodig zijn voor dag 3, met inbegrip van: 6 x 4 L erlenmeyers met aluminiumfolie deksel (autoclaaf), 4 x 1 L steriele centrifuge flessen, trechter (autoclaaf), 100 g 0.1 mm glazen kralen (autoclaaf), 2 roer-bars (autoclaaf), 1 L en 500 ml maatcilinder (autoclaaf), 2 x 1 L bekers (autoclaaf), 3 ml spuit met 18 G naalden (steriel), 2-3 flhaver boeien, 2-3 10k MWCO dialyse cassettes (steriel), cuvetten.
5. Bereiden mini-cultuur 1. Voeg 4 ml 2xYT + P media en 4 pi Cm een ​​12 ml steriele cultuur buis en pre-warm tot 37 ° C gedurende 30 minuten.
6. Inoculeren mini-cultuur 1 met een kolonie van de 2xYT + P + Cm agar plaat. Incubeer bij 220 rpm, 37 ° C gedurende 8 uur.
7. 7 uur en 30 minuten later, bereiden mini-cultuur 2. Voeg 50 ml 2xYT media + P en 50 pl Cm een ​​steriele 250 ml Erlenmeyer en pre-warm tot 37 ° C gedurende 30 minuten.
8. Inoculeer mini-cultuur 2 100 pl mini-cultuur 1 en incubeer bij 220 rpm, 37 ° C gedurende 8 uur.

Dag 3

9. Weeg vier lege steriele 50 ml Falcon buizen en opnemen massa in tabel 3. Chill Falcon buizen op ijs, deze zullen vervolgens worden gebruikt in stap 1.18.
10. 7 uur en 30 minuten na stap 1.8, bereiden laatste bacteriecultuur media. Met behulp van een steriele 1 L maatcilinder, overdracht 660 ml 2xYT + P media into elk van zes 4 L Erlenmeyer kolven en pre-warm tot 37 ° C gedurende 30 minuten. Opmerking: 4 L of groter erlenmeyers worden aanbevolen voor een goede beluchting.
11. Voeg 6,6 ml van mini-cultuur 2 in elke 4 L erlenmeyer. Incubeer bij 220 rpm, 37 ° C totdat de cultuur een OD van 1,5-2,0 bij 600 nm (corresponderend met mid-log groeifase) bereikt. Controleer OD regelmatig met een 01:10 cultuur verwatering voor nauwkeurigheid Deze stap mag niet meer dan 3 uur duren - 3 uur 45 min;. Snelle groei en collectie tijdens mid-log-fase is van cruciaal belang voor extract kwaliteit.
12. Onmiddellijk na groei, dragen alle culturen gelijkmatig in vier 1 L centrifuge flessen en centrifugeer bij 5000 xg gedurende 12 min bij 4 ° C om bacteriële cellen te pelleteren.
13. Tijdens centrifugeren volledige S30A buffer voorbereiding door toevoeging van 4 ml 1 M DTT 2 L van eerder S30A. Mix en buffer te houden op ijs.
14. Bij centrifugeren klaar is, volledig te verwijderen supernatans van stap 1.12 door decanting en blotting de centrifuge flessen op een steriele papieren handdoek.
15. Voeg 200 ml S30A buffer bij 4 ° C voor elk van de vier centrifuge flessen en schud de flessen krachtig tot pellet volledig opgelost zonder resterende klonten. Centrifugeer de vier flessen bij 5000 g gedurende 12 min bij 4 ° C.
16. Volledig te verwijderen supernatant uit de vorige stap door decanteren en deppen de centrifuge flessen op een steriele papieren handdoek.
17. Herhaal stap 1.15 en 1.16.
18. Voeg 40 ml S30A buffer bij 4 ° C aan elke centrifugefles. . Breng elke pellet en S30A combinatie in een gekoeld Falcon buis van 1,9) Opmerking: Deze stap is om de pellets te zetten in een kleinere container.
19. Centrifugeer de Falcon buizen bij 2000 g gedurende 8 minuten bij 4 ° C. Verwijder de bovenstaande vloeistof door decanteren.
20. Opnieuw centrifuge Falcon buizen bij 2000 g gedurende 2 min bij 4 ° C. Volledig te verwijderen resterende supernatant met een pipet. Blijf op ijs.
21. Weeg de fonze Falcon buizen met pellet en opnemen massa in tabel 3. Bereken pellet massa S30A buffer benodigde volume en massa kralen nodig gebaseerd op de specifieke formules in Tabel 3.
22. Correct laden en kralen slaan van de pellet is cruciaal voor het maken kwaliteit extract, en is de meest uitdagende stap. Het wordt aanbevolen om de video te bekijken voordat u probeert. Falen om luchtbellen te voorkomen en te distribueren kralen gelijkmatig zal resulteren in inefficiënte extract.
23. Voeg de hoeveelheid S30A buffer berekend in Tabel 3 aan elke Falcon buis, vortex tot homogeen en terug naar ijs.
24. Terwijl de andere Falcon buizen op ijs, voeg kralen tussenpozen aan een Falcon buis in drie monsters, elk met 1/3 van de totale korrels. Na toevoeging van elke portie van kralen, vortex gedurende 30 seconden. Plaats Falcon buis op ijs tussen vortex stappen en na de laatste vortex. Na het laatste deel wordt toegevoegd, zorgenkralen zijn gelijkmatig verdeeld. Een dikke pasta worden gevormd.
25. Bereid een 5 ml (volume) pipet door het afsnijden van het einde met een steriel scheermesje een 3-4 mm opening te creëren. Dial pipet 2 ml Opmerking: Verschillende sets pipet en tips geven verschillende hoeveelheden zuigkracht die onvoldoende te trekken en loslaten dikke streep-cel-oplossing kan zijn, een 1 ml pipet met terminale verwijderd kunnen worden gebruikt in plaats..
26. Breng 20 bead-beating buizen op ijs.
27. Controleer hoge viscositeit van cel-kraal oplossing met behulp van gemodificeerde pipet. Het moet viskeuze het punt nauwelijks verlaten de pipetpunt wordt uitgeworpen worden. Als te stroperig, past pipet volgens stap 1.25. Indien niet viskeus genoeg kunnen kralen worden toegevoegd in stappen van (pellet massa * 0,05), maximaal massa (pelletmassa * 5.1). Na elke toevoeging van kralen, vortex gedurende 30 seconden en terugkeren naar ijs. Zie Figuur 3a voor een demonstratie van de viscositeit.
28. Verwijder kraal-cel-oplossing van Falcon buis met behulp van gemodificeerde pipet, en over in een steriele-kraal verslaan buis, te vullen driekwart vol met kraal-cel-oplossing. Spin extreem kort (1sec) op een teller mini-centrifuge om luchtbellen te verwijderen zonder herverdeling van kralen. Zie de figuren 3b-d voor stilstaande beelden van de kraal-beating pompslang.
29. Finish toevoegen kraal-celoplossing een holle meniscus te vormen.
30. Voeg een zeer kleine druppel kraal-cell oplossing op de binnenkant van een kraal verslaan dopje, let daarbij goed op de buiten rand van de dop niet belemmeren, anders, de kraal verslaan buis niet dicht sufficientl y. Tik op de dop op een vlakke ondergrond en controleer of er geen luchtbellen aan de onderkant van de kap.
31. Cap de-kraal verslaan buis met de kraal verslaan dop van de vorige stap. Hand aan assistent voor kraal pak slaag. Als dit juist gebeurt, moet de dop goed gesloten, geen luchtbellen should zichtbaar en weinig (of geen) bead-cell oplossing moet overlopen. Opnieuw het laadproces als luchtbellen zichtbaar zijn of de dop niet volledig dicht.
32. Vortex Falcon buis van stap 1.24 met de resterende kraal-cel-oplossing voor een gelijkmatige verdeling van de kralen zorgen. Herhaal de stappen 1,28-1,31 totdat Falcon buis leeg is; dan 1,24 herhaal de stappen tot 1,31 voor elke extra Falcon buis.
33. Gedragscode stappen 1,33-1,38 tegelijk. Heb assistent take gevuld-bead verslaan buizen van 1,31 en leg ze op ijs. Zodra twee ingevulde kraal verslaan buizen zijn verzameld en zijn op ijs al minstens een minuut, beginnen kraal pak slaag.
34. Klop een buis gedurende 30 seconden bij 46 tpm. Plaats ondersteboven op ijs gedurende 30 seconden terwijl het verslaan van de andere buis.
35. Herhaal de vorige stap, zodanig dat elk gevuld-kraal verslaan buis is beter voor 1 min totaal.
36. Herhaal de stappen 1,33-1,35 tot 8 gevuld kraal-beating buizen (of het maximumbedrag van de centrifuge kan houden) have is verwerkt. Vervolgens bouwen filter apparaat vanaf 15 ml Falcon (figuur 3e). Voeg een nieuwe kraal verslaan cap, platte deel naar boven, naar de bodem van een 15 ml Falcon. Verwijder vervolgens de dop van de bewerkte kraal verslaan buis en druk op micro-chromatografie kolom stevig op het einde van bewerkte kraal verslaan buis tot volledig afgesloten. Breek elutie einde van micro-chromatografie kolom en plaats micro-chromatografie kolom, elutie eindigen naar beneden in lege kraal-kralen buis. Plaats dit complex in 15 ml Falcon. Herhaal dit voor alle 8 ingevulde kraal verslaan buizen; blijf op ijs toen compleet.
37. Centrifuge 8 filter inrichtingen, Falcon buis afgetopte bij 6000 g gedurende 5 min bij 4 ° C tot pellet extract en scheiden van kralen.
38. Controleer elke kraal-beating buis levensvatbaar extract geproduceerd. Goed verslaan extract zal niet troebel zijn, en de pellet zal twee verschillende lagen. Gooi alle troebel buizen, en breng het supernatant van niet-troebele buizen into individuele 1.75 ml micro-centrifuge buizen, waarbij zo weinig pellet mogelijk. Houd op ijs totdat alle kralen slaan buizen zijn verwerkt. Zie figuur 3f vergelijken van een correct vs verkeerd verwerkt kraal-beating buis.
39. Centrifuge micro-centrifugebuisjes voorgaande stap bij 12.000 g gedurende 10 min bij 4 ° C.
40. Transfer-pellet gratis supernatans in lege kraal-kloppend buizen met behulp van een pipet, het consolideren van 500 ul in een nieuwe kraal slaan buis.
41. Incubeer vorige stap, met kralen slaan caps verwijderd, bij 220 rpm, 37 ° C gedurende 80 minuten. Deze stap verteert resterende nucleïnezuren middels endogene exonucleasen vrijkomt bij de hiel-beading proces en kan gebeuren wanneer de kraal slaan buis in een weefselkweek buis.
42. Bereid dialyse materialen. Compleet S30B buffer voorbereiding door toevoeging van 2 ml 1 M DTT tot 2 L van eerder bereide S30B. Meng en voeg 900 ml in elk van twee sterile 1 L bekers. Voeg steriele magneetroerder in elk bekerglas; houden bij 4 ° C.
43. Na stap 1.41, moeten extract troebel uitzien. Consolideren extract in 1,5 ml porties van 1,75 ml micro-centrifugebuizen en centrifugeer bij 12.000 g gedurende 10 min bij 4 ° C.
44. Met behulp van een pipet, consolidatie-pellet gratis supernatans in 15 ml Falcon buizen op ijs, en meng goed door de aftopping van de buis en omkeren. Bespaar 10 ul van supernatant op ijs voor stap 1.47.
45. Bepaal totale hoeveelheid extract, hydrateren en het noodzakelijke aantal 10K MWCO dialyse cassettes door onderdompeling in S30B gedurende 2 minuten, uitgaande van 2,5 ml extract per cassette.
46. Laad cassettes met 2,5 ml van het extract. Elke beker kan tot 2 cassettes, dialyseren, roeren, bij 4 ° C gedurende 3 uur Opmerking: gedeeltelijke belading van cassettes is aanvaardbaar.. Dialyseren verhoogt de eiwitproductie opbrengst.
47. Tijdens de vorige stap, karakteriseren extract eiwitconcentratie met een Bradford assay, gebruik extract opgeslagen in stap 1.44. Zie Aanvullend materiaal 2 voor details.
48. Na de dialyse is voltooid, extract aliquot 1,5 ml in 1,75 ml micro-centrifugebuisjes. Centrifugeer bij 12.000 g gedurende 10 min bij 4 ° C. Een pellet wordt op de bodem van de buis.
49. Consolideren heldere bovenstaande vloeistof uit de vorige stap door pipetteren in een 15 ml Falcon buis op ijs. Meng door omkeren 5-10x.
50. Op basis van de concentratie bepaald door Bradford in stap 1.47, bepalen hoeveelheid extract om aliquot in individuele 1,75 ml buisjes. Elk individu buis moet een volume met 810-900 mg totaal eiwit. Extract moeten een totale concentratie eiwit hoger dan 27 mg / ml zijn. Deze stap vereist hulp doelmatig voeren. Opmerking: Aliquot extract dan 30 mg / ml in 30 pi aliquots en schaal indien de concentratie hoger is, bijvoorbeeld hoeveelheid extract bij 28 mg / ml met 30 ui en hoeveelheid extract bij 32mg / ml met 28,1 pi.
51. Aliquot extract volgende stap 1.50, zorg om luchtbellen te voorkomen. Flash-bevriezen extract in vloeibare stikstof. Opmerking: Hoeveelheden met bellen kan worden verwijderd door centrifugeren bij 10.000 g gedurende 30 seconden bij 4 ° C.
52. Verwijder buizen uit vloeibare stikstof met behulp van een zeef en onmiddellijke opslag bij -80 ° C. Veiligheid: Draag beschermende brillen, de doppen van extract buizen kunnen loskomen als gevolg van het temperatuurverschil tussen vloeibare stikstof en kamertemperatuur.

2. Amino Acid Solution Voorbereiding

Amino Acid oplossing moet worden voorbereid in bulk. Het volgende recept maakt gebruik van een volledige set van RTS Amino Acid Sampler, leveren genoeg voor circa 11.000 enkele reacties. Als afbouw, is het raadzaam om niet minder dan een halve kit gebruiken. Elk aminozuur in de voorraad wordt toegevoerd 1,5 ml, 168 mM, behalve leucine op 140 mM. De uiteindelijke samenstelling van de aminozuuroplossing is:leucine, 5 mM, andere aminozuren, 6 mM. Dit is 4x werkende concentratie.

1. Verwijderen 20 aminozuren van -20 ° C en ontdooien bij kamertemperatuur. Eenmaal ontdooid, vortex tot aminozuren ontbinden incuberen bij 37 ° C indien noodzakelijk. Na aminozuren opgelost, zet alle aminozuren op ijs behalve Asn, Phe, en Cys, die worden gehouden op kamertemperatuur. Cys mogelijk niet volledig oplossen.
2. Op ijs, voeg 12 ml steriel water om een ​​steriele 50 ml Falcon buis.
3. Voeg 1,5 ml van elk aminozuur in de volgende volgorde, zorg ervoor dat de Falcon buis geschud na elke toevoeging en aan de oplossing op het ijs te houden: Ala, Arg, Asn, Asp, Gin, Glu, Gly, Zijn, Ile, Lys, ontmoet, Phe, Pro, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr, Leu, Cys. Cys kan worden toegevoegd als een suspensie. Na toevoeging vortex tot oplossing betrekkelijk helder, incuberen bij 37 ° C indien noodzakelijk. Cys mogelijk niet volledig oplossen.
4. Aliquot Amino Acid Solution in 50 buizen bij26 pi elk op ijs. Aliquot de rest bij 500 ul per buis op ijs. De 26 pi aliquots worden gebruikt voor de kalibratie extract, terwijl de 500 ul aliquots worden gebruikt voor het bereiden buffer. Tijdens aliquoteren, vortex de hoofdstam regelmatig om ongelijke suspensie voorkomen.
5. Flash bevriezen monsters in vloeibare stikstof en bewaar bij -80 ° C. Veiligheid: Draag een veiligheidsbril, de doppen van extract buizen kunnen loskomen als gevolg van het temperatuurverschil tussen vloeibare stikstof en kamertemperatuur.
6. Optioneel: Voer een activiteit assay van de nieuw-gemaakte Amino Acid Solution tegen een eerder gemaakte Amino Acid Solutions.

3. Energy Solution Voorbereiding

Energy Solution wordt zowel gebruikt voor het kalibreren van ruwe cel-extract en voor het creëren van buffer, en moeten bereid in bulk. Het volgende recept levert genoeg ongeveer 10.000 enkele reacties. Als de afbouw, het is recommended te gebruiken niet minder dan 1/24 van de waarden hier gegeven. Zoals de Energy Solution is een belangrijke monetaire kosten, kunnen beginnende gebruikers zich willen voorbereiden op 1/24 schaal. De uiteindelijke samenstelling van Energy Solution is: HEPES pH 8 700 mm, ATP 21 mm, 21 mm GTP, CTP 12,6 mM, UTP 12,6 mM, tRNA 2,8 mg / ml, CoA 3,64 mM, NAD 4,62 mM, cAMP 10,5 mm, folinezuur 0,95 mM, 14 mM spermidine, 3-PGA 420 mM. Dit is 14x werkende concentratie. Indien gewenst, kan elke afzonderlijke in tabel 4 worden opgeslagen bij -80 ° C voor later gebruik.

1. Verwijder alle chemicaliën in tabel 4 van -80 ° C, -20 ° C of 4 ° C tot kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
2. Bereid voorraad oplossingen zoals beschreven in Tabel 4. Zie Aanvullend materiaal 1 voor recepten. Plaats alle oplossingen op het ijs na de bereiding.
3. In een 15 ml Falcon buis, achtereenvolgens in deze volgorde, en zorg ervoor dat de Falcon buis geschud na elke toevoeging en de oplossingen o houdenn ijs: 3,6 ml 2 M HEPES, 144 pi water, 1,39 ml nucleotide mix, 576 ul 50 mg / ml tRNA, 576 ul 65 mM CoA, 276 ul 175 mM NAD, 170 pi 650 mM cAMP, 288 ul 33,9 mM Folinezuur , 144 ul 1 M spermidine, en 3,09 ml 1,4 M 3-PGA.
4. Aliquot Energy Solution in 50 buizen bij 7 ul elk op ijs. Aliquot de rest bij 150 ul per buis op ijs. De 7 pi aliquots worden gebruikt voor de kalibratie extract, terwijl de 150 ul aliquots worden gebruikt voor het bereiden buffer. Tijdens aliquoteren, vortex de hoofdstam vaak.
5. Flash bevriezen monsters in vloeibare stikstof en bewaar bij -80 ° C. Veiligheid: Draag een veiligheidsbril, de doppen van extract buizen kunnen loskomen als gevolg van het temperatuurverschil tussen vloeibare stikstof en kamertemperatuur.
6. Optioneel: Voer een activiteit assay van nieuw gemaakte Energy Solution tegen een eerder gemaakte Energy Solutions.

4. Buffer Voorbereiding

Buffer Voorbereiding vereist de voltooiing van Crude Cell Extract Voorbereiding, Amino Acid Solution Voorbereiding en Energy Solution Voorbereiding. Elke buffer is uniek voor een partij van ruwe cel extract. Mg-glutamaat, K-glutamaat, en DTT (in die volgorde) zijn geoptimaliseerd in dit gedeelte om reacties te produceren met een maximale niveaus van expressie. Het volgende protocol maakt gebruik van een vooraf geschreven sjabloon, TXTL_e (sjabloon) _calibration_JoVE.xlsx (Aanvullend materiaal 3), vooraf bereide ruwe celextract kalibreren en buffer te bereiden. Men kan echter ook worden gekalibreerd ruw celextract en buffer bereiden, zonder de sjabloon door optimalisatie Mg-glutamaat, K-glutamaat en DTT handmatig instellen buffer zodanig dat samen met extract is 75% van het totale reactievolume. Als handmatig kalibreren, kan de definitieve reactie-omstandigheden worden gevonden in stap 5.

1. Voltooi de "algemene gegevens" vorm.
2. Dooi op ijs 100 mM Mg-glutamaat (4 ° C), 3 M K-glutamaat (4 ° C), 6mM Amino Acid oplossing (26 pl, -80 ° C), Energy Solution (7 pi, -80 ° C), 100 mM DTT (-20 ° C), positieve controle DNA (-20 ° C), 40% PEG- . 8000 (4 ° C), ruwe cel extract (-80 ° C) en water (4 ° C) Opmerking: Gebruik 1 nM werkconcentratie pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 (Addgene plasmide 40019) voor de positieve controle (excitatie 485 nm, emissie 525 nm), of een andere referentie die een hoge intensiteit van het signaal produceert. ⁴
3. Bereid zeven 10.5 pi reacties, het testen van een reeks van 4-10 mM extra Mg-glutamaat, door aliquoting set hoeveelheden voorraad Mg-glutamaat in individuele micro-centrifuge buizen. Opmerking: Hoewel 10,5 ul reacties in eerste instantie worden voorbereid, de laatste reactie is 10 pi.
4. Bereid master mix waar aangegeven in de mal onder "Mg-glutamaat kalibratie" een extra 80 mM K-glutamaat. Blijf op ijs en vortex na de toevoeging van elk item. Opmerking: De waarden hier en in de template gegeven zijnnaast de hoeveelheden Mg-glutamaat, K-glutamaat en DTT aanwezig in de S30B buffer gebruikt om ruw celextract maken.
5. Voeg master mix aan monsters die Mg-glutamaat en reacties voor te bereiden. Zie stappen 5,10-5,13 voor gedetailleerde instructies.
6. Run reactie bij 29 ° C, hetzij in een broedstoof of een plaat lezer.
7. . Bepaal optimale Mg-glutamaatconcentratie eind-expressie niveau en de maximale snelheid van proteïne-expressie (Figuur 4a) Opmerking: looptijden variëren, afhankelijk van experiment, maar duren meestal tot 8 uur.
8. Herhaal stap 4,2-4,7 K-glutamaat onder "K-glutamaat kalibratie" instelling Mg-glutamaat met die in stap 4.7.
9. Herhaal stap 4,2-4,7 voor DTT onder "DTT kalibratie" instelling Mg-glutamaat met die in stap 4.7 en K-glutamaat met die in stap 4.8. Opmerking: we hebben gevonden dat toegevoegde DTT heeft geen significante invloed end- expressieniveaus.
10. Gebruikwaarden in kalibratie onder "Buffer samenstelling" de samenstelling van de buffer te bereiden bepalen. Op basis van de hoeveelheid ruwe cel extract dat wordt gevormd, wordt een master mix recept geproduceerd voor een vast bedrag van de buffers.
11. Ontdooien porties zoals vermeld in master mix recept op ijs. Eenmaal ontdooid, bereiden master mix, houden op ijs en vortexen na de toevoeging van elk item.
12. Aliquot door bedrag vermeld onder "Buffer samenstelling." Flash-vries bufferbuizen in vloeibare stikstof. Terwijl aliquoteren, vortex de belangrijkste voorraad regelmatig.
13. Verwijder buizen uit vloeibare stikstof met behulp van een zeef en onmiddellijke opslag bij -80 ° C. Veiligheid: Draag beschermende brillen, de doppen van extract buizen kunnen loskomen als gevolg van het temperatuurverschil tussen vloeibare stikstof en kamertemperatuur.

5. Experimentele Uitvoering van een TX-TL Reactie

Uiteindelijke reactie-omstandigheden zijn: 8,9-9,9 mg / ml protein (uit ruw extract), 4,5 mM 10,5 mM Mg-glutamaat, 40-160 mM K-glutamaat, 0,33-3,33 mM DTT, 1,5 mM elk aminozuur behalve leucine, 1,25 mM leucine, 50 mM HEPES, 1,5 mM ATP en GTP, 0,9 mM CTP en UTP, 0,2 mg / ml tRNA, 0,26 mM CoA, 0,33 mM NAD, 0,75 mM cAMP, 0,068 mM folinezuur, 1 mM spermidine, 30 mM 3-PGA, 2% PEG-8000. Simpele TX -TL reactie heeft 3 delen (buizen): ruw celextract, buffer, en DNA. De verhouding is: 75% buffer en extract, 25% DNA reacties kunnen variëren in volume, en we gebruiken 10 pl volgens afspraak reactie volume te minimaliseren en maken die in een 384-wells plaat.. Grotere volumes nodig agitatie voor een goede zuurstofvoorziening. Het volgende protocol maakt gebruik van een vooraf geschreven sjabloon, TXTL_JoVE.xlsx (Aanvullend materiaal 4), een 10 ul reactie uit te voeren. Artikelen in paars geven de gebruiker ingevoerde waarden, en items in het blauw geven extra reagentia toe te voegen aan de reactie. Echter, men kan ook een reactie wit uit te voerenhout de template door volgende reactie voorwaarden hierboven beschreven.

1. Voltooi de "algemene gegevens" vorm.
2. Onder "Master Mix Voorbereiding," plaatst het uittreksel procentuele waarde van stap 4.1 in de paarse doos.
3. Ontwerp uw experiment in silico met behulp van de "Master Mix Voorbereiding" (rijen 10-17) en "DNA Voorbereiding" (rijen 19-50) secties. In het algemeen kan constanten in de sectie "Master Mix Voorbereiding 'worden gezet, terwijl de variabelen in de sectie" DNA Voorbereiding "kan worden gezet. Minimaliseer monsters per experiment om monster verdamping en experimentele starttijd vertekening te voorkomen. Zie figuur 6 voor een voorbeeld setup.
4. Onder "Master Mix Voorbereiding," reagentia zoals inductoren of eiwitten, die zal gaan in alle monsters bij een constante concentratie toe te voegen. Te beginnen met rij 14, vul het blauw gearceerde gebieden, het houden van een reagens aan elke regel. Eenheden zijn relatieve verhoudingen.
5. Onder "DNA Voorbereiding," toe te voegen DNA dat monster speci zal zijnic. Monster ID # 1 en # 2 corresponderen met positieve en negatieve controles, respectievelijk. Monsteridentificaties # 3 en hoger kunnen door de gebruiker aanpasbaar voor DNA-, voorraad-concentratie in ng / ul, lengte in basenparen, gewenste uiteindelijke concentratie in nM, en herhalingen (van 10 pi reacties). De hoeveelheid voorraad DNA om de gewenste uiteindelijke concentratie bereikt wordt automatisch berekend. . Het totaal in de rijsommen 10,5 * n, waarbij n het aantal herhalingen Opmerking: Hoewel de uiteindelijke reactievolume is 10 pl, de berekeningen veronderstellen een totaal volume van 10,5 gl per reactie te verantwoorden volume verloren tijdens pipetteren.
6. Onder "DNA Voorbereiding," reagentia of extra DNA dat monster specifiek blauwe kolommen zullen voegen. De DNA-concentratie in nM worden berekend onder "DNA Preparation", terwijl sample reagentia vereisen handmatige berekening op basis van een totaal reactievolume van 10,5 * n. De ingevoerde hoeveelheden worden afgetrokken van het watervolume van dezelfde rij.
7. Verwijder benodigde number buizen buffer, ruw celextract, en positieve controles onder "Tubes ontdooid," van -20 ° C of -80 ° C en ontdooien op ijs.
8. Bereid DNA-monsters. Voor elk monster ID, ​​monster uit de aangegeven DNA, water en door de gebruiker geleverde zaken per hoofdstuk "DNA Voorbereiding" in een micro-centrifugebuis, bij kamertemperatuur. Let op: om te proeven te voorkomen, onlangs gekalibreerd pipetten en low-stok pipet tips en micro-centrifuge buizen worden aanbevolen.
9. Wanneer buizen uit stap 5.7 worden ontdooid, de voorbereiding van de master mix bestaande uit buffer, extract, en eventuele globale gebruiker geleverde artikelen op basis van de oranje-grijze vakjes, houden op ijs en vortexen na de toevoeging van elk item. Opmerking: Extract is uiterst viskeus. Hoeveelheden met luchtbellen worden verwijderd door centrifugeren bij 10.000 g gedurende 30 seconden bij 4 ° C.
10. Voeg de hoeveelheid master mix aangegeven in de oranje cellen onder "DNA Voorbereiding" (kolom O) aan elk DNA-monster, en laten kamertemperatuurtuur. Behandel dit als de reactie starttijd.
11. Vortex elk monster, en centrifugeer bij 10.000 xg gedurende 30 seconden bij kamertemperatuur achtergebleven monster te verlagen en bellen verminderen.
12. Als het uitvoeren van de reactie in de micro-centrifuge buizen, incubeer direct bij 29 ° C. . Anders, pipet 10 ul van het monster in een 384-wells plaat Let op: Reacties in hoeveelheden van meer dan 10 ul kan agitatie voor zuurstoftoevoer nodig.
13. Centrifuge plaat bij 4000 xg gedurende 30 seconden bij kamertemperatuur eventueel resterende monster naar beneden te brengen en om luchtbellen te verminderen. Seal plaat daarna om verdamping te voorkomen.
14. Run reactie bij 29 ° C. Opmerking: Runtimes Afhankelijk experiment, maar duren meestal tot 8 uur.

Representative Results

We hebben een vijfdaagse protocol gepresenteerd voor de bereiding van een endogene Escherichia coli op basis TX-TL-cel-vrije expressie systeem. Een monster tijdlijn voor het creëren van de reagentia - ruwe cel-extract en buffer - is te vinden in figuur 1. Eens gemaakt, kan deze worden opgeslagen bij -80 ° C gedurende maximaal een jaar. Na reagentia zijn gemaakt, kunt experimentele opstelling en de uitvoering worden gedaan in minder dan 8 uur.

Daarnaast hebben we geoptimaliseerd expressieomstandigheden van de TX-TL celvrij expressiesysteem. Andere gebruiker geleverde toevoegingen, zoals buffers of DNA oplossingen wordt gekalibreerd toxiciteit vooraf. Bijvoorbeeld, verschillende verwerkingsmethoden van plasmiden leiden tot verschillende expressie door zoutgehalte. We testten ook het effect van Tris-Cl elutiebuffer bij reactie-efficiëntie (Figuur 5).

Een voorbeeld van ruw celextract kalibratie verwijzing stap 4,1-4,9, weergegevenin figuur 4a. In het algemeen onze experimenten blijkt dat het ruwe celextract is het meest gevoelig voor Mg-glutamaat, gevolgd door K-glutamaat. De celvrije expressiesysteem tonen, construeerden wij en getest tegenkoppellus basis van tet repressie. ²⁶ (figuur 6). In de cel-vrije expressie systeem, hetzelfde circuit run met en zonder ATC toont een 7-voudig eindpunt expressie verandering van deGFP reporter na acht uur van meningsuiting. Hoewel dit experiment geen wereldwijde inductoren of repressors vereisen, indien nodig zij onder "Master Mix Voorbereiding." Kan worden toegevoegd

Figuur 1. Tijdlijn voor ruwe cel extract, aminozuur oplossing, en energie oplossing voorbereiding. Een vijfdaagse Timelin e voor een typische uitvoering van het protocol is hierboven gegeven, geoptimaliseerd voor overnachting incubatie en overdag werken stappen.

Figuur 2. Kosten en expressie analyse van concurrerende ruwe cel extracten. a) Verdeling van de kosten van arbeid en materialen van de TX-TL-cel-vrije expressie systeem. Gebaseerd op de kosten van reagentia als van december 2012, en de arbeidskosten van $ 14 per uur. B) Vergelijking van de TX-TL-cel-vrije expressie systeem kosten versus andere commerciële systemen. De kosten worden uitgesplitst per pi, hoewel reactie volumes per kit. C) Vergelijking van de TX-TL-cel-vrije expressie systeem rendement versus andere commerciële systemen kan variëren. Eiwitexpressie het rendement bepaald door de fabrikant normen./ 50762fig2large.jpg "target =" _blank "> Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.

Figuur 3. Laden en verwerking van een kraal-beating buis. a) Demonstratie van de juiste viscositeit van cel-kraal oplossing. Cel-kraal oplossing zal een viscositeit afhankelijk van vele factoren, inclusief het bedrag van S30A buffer toegevoegd, de hoeveelheid kralen toegevoegd, en tijd besteed aan ijs te hebben. B) Laden van-kraal verslaan buis voor snel tafelblad centrifugeren. Het centrifugeren verwijdert belletjes opgedaan tijdens het laden. C) Bubbles oppervlakte komt na tafelblad centrifugeren. De grootte van de belletjes zal variëren, ze kunnen worden geknald of verwijderd met behulp van een pipet tip d) Volledig ingevuld kraal verslaan buis voor het afdekken.. Een meniscus wordt gevormd in de kraal slaan tube, en de dop heeft genoeg te dekken en veroorzaken kleine hoeveelheden niet te vol raakt. e) Correct geladen filterapparaat. Deze kunnen worden hergebruikt. F) Vergelijking kunnen tegen verkeerd bewerkte kraal slaan buis. De buis aan de linkerkant is een goed ritme tube - het heeft een klein en goed afgebakend toplaag, en zeer heldere bovenstaande. De buis rechts niet optimaal zijn, gebaseerd op de grotere, wazige tweede laag en de wazige supernatant. Buizen die suboptimaal zijn moeten extra bewerking ondergaan.

Figuur 4. Eigenschappen van ruw extract preparaten. a) Typische kalibratie percelen voor ruwe cel extract. Ruw extract wordt gekalibreerd voor extra Mg-glutamaat, K-glutamaat, en DTT niveau, in die volgorde. Getoond wordt eindpunt fluorescence na 8 uur, en maximale percentage van eiwitproductie op basis van een 12 minuten voortschrijdend gemiddelde. Op basis van deze percelen een acceptabel bereik aanvullende Mg-glutamaat 4 mM K-glutamaat 60-80 mM DTT en 0-3 mM. Merk op dat elke ruwe extract moet onafhankelijk voor deze drie variabelen worden gekalibreerd. B) Variatie van extract preparaten. Endpoint fluorescentie van twee ruwe extracten voorbereid op verschillende data wordt getoond; fout bars zijn 1 standaarddeviatie van drie onafhankelijke runs op verschillende dagen. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Figuur 5. Effecten van DNA-oplossing op de expressie-efficiëntie. a) Vergelijking van twee verschillende zuiveringwerkwijzen voor de verwerking plasmiden. 1 nM van pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 wordt bereid met behulp van slechts een Qiaprep Spin Miniprep Kit (Zuivering methode 1) of nabewerkt met een QiaQuick PCR zuivering kit (Zuivering methode 2). Getoond wordt eindpunt fluorescentie na 8 uur, en maximale snelheid van eiwitproductie op basis van een 12 minuten gemiddelde. Error bars zijn 1 standaarddeviatie van vier onafhankelijke runs op verschillende dagen. B) Effect van elutiebuffer (Tris-Cl). Verschillende concentraties van Tris-Cl worden vergeleken in een celvrije expressie reactie gebaseerd op de expressie van 1 nM pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500. Concentraties gelden eindconcentraties Tris-Cl in de reactie; elutiebuffer gebruikte 10 mM Tris-Cl. Error bars zijn 1 standaarddeviatie van drie onafhankelijke runs op verschillende dagen. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Figuur 6. Sample TX-TL run van een negatieve feedback loop. a) Steekproef setup van een cel-vrije uitvoering reactie. Tests "op" vs "uit" staat van de negatieve feedback loop, met positieve en negatieve controles. B) Plasmidemap van negatieve terugkoppeling. C) Representatieve resultaten. Gegevens weerspiegelt experiment in a) en b), met negatieve controle afgetrokken van signaal. Genetische circuit getoond in insert. Error bars zijn 1 standaarddeviatie van drie onafhankelijke runs op verschillende dagen. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Naam	Concentratie	Bedrag	Sterilisatie	Notes
Chlooramfenicol (Cm)	34 mg / ml in ethanol	1 ml	Filter steriliseren (0,22 pm)	Kunnen worden gemaakt in grotere hoeveelheden opgeslagen bij -20 ° C voor later gebruik.
2xYT + P + Cm agar plaat	31 g / L 2xYT, 40 mM dibasisch kaliumfosfaat, 22 mM kaliumfosfaat monobasisch, 34 ug / ml chlooramfenicol	1 plaat	Autoclaaf
2xYT + P media	31 g / L 2xYT, 40 mM dibasisch kaliumfosfaat, 22 mM kaliumfosfaat monobasisch	4 L	Autoclaaf

Tabel 1. Reagentia voor dag 1 van Ruwe Cell Extract protocol.

Naam	Concentratie	Bedrag	Sterilisatie	Notes
Tris base	2 M	250 ml	Filter steriliseren (0,22 pm) of autoclaaf	Kan worden bewaard bij kamertemperatuur.
DTT	1 M	6 ml	Filter steriliseren (0,22 pm)	Kunnen worden in grotere hoeveelheden en opgeslagen bij -20 ° C voor later gebruik.
S30A buffer	14 mM Mg-glutamaat, 60 mM K-glutamaat, 50 mM Tris, pH 7,7	2 L	Autoclaaf	PH 7,7 te bereiken, titreer met azijnzuur. Voeg DTT tot 2 mM uiteindelijke concentratie vlak voor gebruik. Bewaren bij 4 ° C.
S30B buffer	14 mM Mg-glutamaat, 60 mM K-glutamaat, ~ 5 mM Tris, pH 8,2	2 L	Autoclaaf	Tot pH 8,2 te bereiken, titreer met 2MTris. Voeg DTT tot 1 mM uiteindelijke concentratie vlak voor gebruik. Bewaren bij 4 ° C.

Tabel 2. Reagentia voor dag 2 van ruwe Cell Extract protocol.

	Valk
	1	2	3	4
Lege 50 ml Falcon (g)
50 ml Falcon met pellet (g)
Pellet massa (50 ml Falcon met pellet - lege 50 ml Falcon) (G)
S30A buffer volume toe te voegen (pellet massa * 0,9) (ml)
Totale massa van kralen te voegen (pellet massa * 5.0) (G)

Tabel 3. S30A buffer en kraal massa rekenmachine, voor dag 3 van ruwe Cell Extract protocol.

Naam	Concentratie	Bedrag	Sterilisatie	Notes
HEPES	2 M, pH 8	4 ml	Geen	Tot pH 8 te bereiken, titreren met KOH.
Nucleotide Mix	156 mM ATP en GTP, 94 mM CTP en UTP, pH 7,5	1.5 ml	Geen	Op pH 7,5 te bereiken, titreren met KOH.
tRNA	50 mg / ml	600 ul	Geen
CoA	65 mM	600 ul	Geen
NAD	175 mM, pH 7,5-8	300 pi	Geen	Om pH 7.5-8 bereiken, titreer met Tris op 2 M.
cAMP	650 mM, pH 8	200 gl	Geen	Tot pH 8 te bereiken, titreer met Tris op 2 M.
Folinezuur	33,9 mM	300 pi	Geen	Hoewel slechts 300 pi nodig, aanvullende recept is 1.15 ml.
Spermidine	1 M	150 gl	Geen	Bewaar bij 4 ° C, warmte tot 37 ° C te smelten.
3-PGA	1.4 M, pH 7,5	3.2 ml	Geen	Op pH 7,5 te bereiken, titreer met Tris op 2 M.

Tabel 4. Reagentia te bereiden op Energy Solution protocol.

Aanvullend materiaal 1. Recepten voor items.

Chlooramfenicol, 34 mg / ml: Bereid 0,51 g chlooramfenicol en voeg 15 ml ethanol. Filter steriliseer (0,22 uM), monster 1 ml buizen, bewaar bij -20 ° C voor later gebruik.

2xYT + P + Cm agar plaat: Bereid 1,24 g 2xYT, 1,6 ml kalium dibasisch oplossing @ 1 M, 0,88 ml kalium monobase oplossing @ 1 M, 0,6 g agar en water tot 40 ml. Autoclaaf. Laat afkoelen tot 50 ° C en voeg 40 ul Cm. Aliquot 25 ml in een 100 x 15 mm petrischaal en laat afkoelen voor een uur.

2xYT + P media: Bereid 124 g 2xYT, 160 ml kalium dibasisch oplossing @ 1 M, 88 ml kalium monobase oplossing @ 1 M, en water tot 4 L. Aliquot uit in 2 x 1,88 L en 0,24 L. autoclaaf.

Tris-base, 2 M: Bereid 60.57 g Tris-base en water tot 250 ml. Steriliseren, bewaren bij kamertemperatuur voor later gebruik.

DTT, 1 M: Bereid 2,31 g DTT en water tot 15 ml. Filter steriliseer (0,22 uM), monster 1 ml buizen, bewaar bij -20 ° C voor later gebruik.

S30A buffer: Bereid 10,88 g Mg-glutamaat en 24,39 g K-glutamaat, 50 ml 2 M Tris van azijnzuur (pH 7,7) en water 2 L. Autoclaaf, bewaren bij 4 ° C, voeg 4 ml 1 M DTT vóór gebruik.

S30B buffer: Bereid 10,88 g Mg-glutamaat en 24,39 g K-glutamaat, 2 M Tris (pH 8,2) en water 2 L. Autoclaaf, bewaren bij 4 ° C, voeg 2 ml 1 M DTT vóór gebruik.

HEPES: Bereid 1,91 g HEPES (MW 238,21), KOH (pH 8) en water 4 ml.

tRNA: Bereid 30 mg van tRNA en water tot 600 pi.

CoA: Bereid 30 mg CoA (MW 767,53) en water tot 600 pi.

NAD: Voeg 34.83 mg NAD (MW 663,43), 2 M Tris (pH 7,5-8), en water tot 300 ul. (Voeg 27 ul van 2 M Tris om de oplossing tot pH 7,5-8 brengen).

cAMP: Voeg 42.80 mg cAMP (MW 329,22), 2 M Tris (pH 8), en water tot 200 ul. (Voeg 73 ul van 2 M Tris om de oplossing tot pH 8 te brengen).

Folinezuur (33,9 mm): Tot 20 mg vast folinezuur calciumzout (MW 511,5), voeg 1,15 ml water.

Spermidine: Bereid 23.55 ul spermidine (MW 145,25) en water tot 150 pi. Bereid bij kamertemperatuur na een korte smelten bij 37 ° C.
3-PGA: Voeg 1,03 g 3-PGA (MW 230,02), 2 M Tris (pH 7,5), en water tot 3,2 ml. (Voeg 1,73 ml 2 M Tris om de oplossing op pH 7,5 te brengen).

Nucleotide Mix: Voeg 145 mg ATP dikaliumzout dihydraat (MW 619,4), 133 mg van GTP dinatriumzout (MW 567,14), 79,4 mg CTP dinatriumzoutdihydraat (MW 563,16), 82,6 mg UTP trinatriumzout dihydraat (MW 586,12) , KOH 15% verdunning (tot pH 7,5) en 1,5 ml water. (Voeg 353 ul van KOH 15% verdunning om de oplossing op pH 7,5 te brengen).

Aanvullend materiaal 2. Bradford assay.

1. Verwijder Bradford middel uit 4 ° C en ingesteld op kamertemperatuur.
2. Bereid 50 gl BSA standaard 1 mg / ml en bij 0,1 mg / ml.
3. Bereid 40 pi 20x verdunning van het extract van stap 1.47.
4. Voeg 800 ul water tot 7 cuvetten.
5. Bereid standaard cuvetten van 0 mg / ml, 1 mg / ml (10 ul 0,1 mg / ml BSA), 2 mg / ml (20 ul 0,1 mg / ml BSA), 4 mg / ml (4 pl 1 mg / ml BSA) , 6 mg / ml (6 ui 1 mg / ml BSA).
6. Bereid experimentele cuvetten van 2 pl monster en 4 ui monster.
7. Voeg 200 ul van Bradford agent steeds cuvet en meng goed by pipetteren. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende ten minste 10 minuten.
8. Produceren standaard curve bij OD 595 nm met behulp van cuvetten uit stap 6.5. Standaardcurve afwijzen indien r ² <0.95.
9. Bepaal extract concentratie bij OD 595 nm met behulp van cuvetten uit stap 6.6.

Aanvullend materiaal 3. Buffer kalibratie spreadsheet.

Zie TXTL_e (template) _calibration_JoVE.xlsx .

Aanvullend materiaal 4. Celvrije meningsuiting lopen spreadsheet.

Zie TXTL _JoVE.xlsx .

Discussion

De endogene Escherichia coli op basis TX-TL-cel-vrije expressie systeem hier beschreven is een makkelijk-to-run drie buis reactie die minder dan acht uur kan nemen van het opzetten van de verzameling van gegevens. Het proces waarbij alle reagentia vereist vijf dagen tijd totaal (met aanzienlijke arbeid eisen slechts een dag), maar levert ruw extract 3000 reacties en buffer-making reagentia 10.000 reacties (figuur 1). Bovendien, ruw extract en buffer-making reagentia zijn stabiel gedurende tenminste 1 jaar bij -80 ° C, waardoor meervoudig gebruik van een preparaat. ⁴ Op $ 0,11 per 10 ul reactie ($ 0,26 inclusief arbeid), de kosten zijn 98% lager dan bij vergelijkbare commerciële systemen (figuur 2).

Er zijn een aantal onopgeloste beperkingen, echter het systeem. Het einde efficiëntie van elke ruwe celextract voorbereiding kan variëren op basis van de gebruiker vaardigheid en op milieu-omstandigheden, hoewel typical opbrengst variatie is tussen 5-10% (figuur 4b). Hierdoor partij tot partij variabiliteit in zowel eindpunt expressie en expressie dynamiek te verwachten. Deze variaties zullen waarschijnlijk blijven totdat extract volledig is gekarakteriseerd of totdat extract creatie volledig geautomatiseerd. Als het celvrije expressiesysteem wordt gebruikt om gevoelige kwantitatieve experimenten, is het raadzaam om alle experimenten uitgevoerd met dezelfde partij ruw celextract. De opbrengst van een enkele ruwe celextract partij, ongeveer 3000 reacties, zou voldoende moeten zijn voor typische experimentele cursussen. Hoewel we vermoeden variatie kan worden verwijderd door schaalvergroting en automatiseren van de procedure, zou deze pogingen aanzienlijke investering bron te betrekken.

Bovendien, hoewel eindpunt expressie niveaus zijn redelijk eenvoudig te bepalen, moet meer werk worden gedaan in het begrijpen dynamiek inherent aan de cel-vrij systeem. Het is bekend dat beide middelen competition en resource beperking kan invloed hebben op de expressie dynamiek. Zo kan beperkt endogene sigma 70 resulteren in een verzadigende regime verhoogde DNA-matrijs vervaardigen van een expressieprofiel analoog aan die van nucleotide of aminozuur uitputting. ^9,27 echter dynamiek niet volledig te worden verstaan ​​het systeem gebruiken. Voor pure stijgingen van de opbrengst, kan optimalisatie worden gedaan door machine-learning benaderingen. ²⁸ Vragen van de concurrentie hulpbronnen en beperking kan worden aangepakt door wiskundige modellen geverifieerd met behulp van experimentele gegevens.

De hier gepresenteerde protocol is geoptimaliseerd voor een BL21-Rosetta2 stam, maar generalizable andere E. coli-stammen. Wijzigingen in BL21-Rosetta2, zoals het verwijderen van het gen dat codeert lon protease en de toevoeging van genen die coderen voor zeldzame tRNA, zorgen voor maximale eiwitproductie. We hebben het protocol geprobeerd met twee andere extract stammen - alleen BL21 en BL21 een trxA knockout-eend hebben 50% minder eiwit opbrengst. Onze hypothese is dat de rendementen op dezelfde afnemen bij het gebruik van andere stammen. Andere veranderingen in parameters, zoals het wisselen 2xYT groeimedium voor LB en andere rijke bouillon, hebben geresulteerd in verminderde eiwitrendement.

Cel-vrije expressie systemen met gebruik van zowel endogene en exogene transcriptie-translatie machines en mechanismen regelgeving hebben brede toepassingen in zowel eiwitten en metabolieten expressie en in de synthetische biologie. ^3,29 In plaats van beperkt te zijn tot-T7 gereguleerd circuits, kan men voor ogen produceren van complexe biomoleculen in een door de gebruiker regelbare instelling met een mix van inheemse E. coli promotors en exogeen geleverd transcriptie en regelmechanismen. Zonder beperkingen van celdeling en metabolisme, kan variabiliteit in synthetische circuits zoals de repressilator of metabole gemanipuleerde lichaam zoals het produceren van artemisinine worden verminderd of beter begrepen. ^30,31 Wij have gebruikt deze voordelen uit te voeren genetische schakelaars, alsmede sigmafactor vastlegging begrijpen ^9,32 Deze technologie kan ook de ruggengraat van "minimal" of "kunstmatige" cellen -. klein, goed gekarakteriseerd en zelfvoorzienend belichaamde eenheden van extract. ^33,34

Uiteindelijk verwachten we onmiddellijk gebruik van deze endogene cel vrije expressie systeem als een prototyping omgeving voor synthetische biologie. Bijnaam "TX-TL biomoleculaire breadboard," het celvrije expressiesysteem verschaft een controleerbare omgeving waar synthetische circuits die bestemd is voor in vivo expressie kunnen golf prototyping ondergaan - cycli van proeven op basis plasmide lineair of chemisch gesynthetiseerd DNA, gevolgd van analyse en snelle modificatie. Prototyping rondes kunnen worden geholpen door voorspellende wiskundige modellen die momenteel worden ontwikkeld. Door het verwijderen van klonen en in vivo manipulatie voor niet-finale circuits, verwachten we engiengineering cyclustijden te verlagen tot 1-3 dagen in plaats van de huidige weken standaard.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2xYT	MP biomedicals	3012-032
3-PGA	Sigma-Aldrich	P8877
ATP	Sigma-Aldrich	A8937
Bacto-agar	BD Diagnostics	214010
Bead-beating tubes (polypropylene microvials)	BioSpec	522S
Beads, 0.1mm dia.	BioSpec	11079101
BL21 Rosetta 2 E. coli strain	Novagen	71402
Bradford BSA Protein Assay Kit	Bio-rad	500-0201
cAMP	Sigma-Aldrich	A9501
Chloramphenicol	Sigma-Aldrich	C1919
CoA	Sigma-Aldrich	C4282
CTP	USB	14121
Cuvettes, 1.5ml	Fisher	14-955-127
DTT	Sigma-Aldrich	D0632
Folinic acid	Sigma-Aldrich	F7878
GTP	USB	16800
HEPES	Sigma-Aldrich	H6147
K-glutamate	Sigma-Aldrich	G1149
Mg-glutamate	Sigma-Aldrich	49605
Micro Bio-Spin Chromatography Columns	Bio-Rad	732-6204
NAD	Sigma-Aldrich	N6522
Nunc 384-well optical bottom plates	Thermo-Scientific	142761
Nunc sealing tape	Thermo-Scientific	232701
PEG-8000	Promega	V3011
Potassium phosphate dibasic solution	Sigma-Aldrich	P8584
Potassium phosphate monobasic solution	Sigma-Aldrich	P8709
RTS Amino Acid Sampler	5 Prime	2401530
Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 10k MWCO (Kit)	Thermo-Scientific	66382
Spermidine	Sigma-Aldrich	85558
Tris base	Fischer	BP1521
tRNA (from E. coli)	Roche Applied Science	MRE600
UTP	USB	23160
1L Centrifuge Bottle	Beckman-Coulter	A98813	This is specific for Avanti J-series; obtain equivalent size for centrifuge in use.
4L Erlenmeyer Flask	Kimble Chase	26500-4000
Avanti J-26XP Centrifuge	Beckman-Coulter	393127	Or 1L-capable centrifuge equivalent.
Forma 480 Orbital Shaker	Thermo Scientific	480	Or chest-size 6x4L shaker equivalent.
JLA-8.1000 Rotor	Beckman-Coulter	363688	Or 1L-capable, 5000 x g rotor equivalent for centrifuge.
Mini-Beadbeater-1	BioSpec	3110BX
Supplemental Material 1. Recipes for Items. Chloramphenicol, 34 mg/ml: Prepare 0.51 g chloramphenicol and add ethanol to 15 ml. Filter sterilize (0.22 μM), aliquot to 1 ml tubes, store at -20 °C for later use. 2xYT+P+Cm agar plate: Prepare 1.24 g 2xYT, 1.6 ml potassium phosphate dibasic solution @ 1 M, 0.88 ml potassium phosphate monobasic solution @ 1 M, 0.6 g agar, and water to 40 ml. Autoclave. Let cool to 50 °C and add 40 μl Cm. Aliquot 25 ml into a 100x15 mm petri dish, and let cool for an hour. 2xYT+P media: Prepare 124 g 2xYT, 160 ml potassium phosphate dibasic solution @1 M, 88 ml potassium phosphate monobasic solution @ 1 M, and water to 4 L. Aliquot out into 2x1.88 L and 0.24 L. Autoclave. Tris base, 2 M: Prepare 60.57 g Tris base and water to 250 ml. Sterilize, store at RT for later use. DTT, 1 M: Prepare 2.31 g DTT and water to 15 ml. Filter sterilize (0.22 μM), aliquot to 1 ml tubes, store at -20 °C for later use. S30A buffer: Prepare 10.88 g Mg-glutamate and 24.39 g K-glutamate, 50 ml Tris at 2M, acetic acid (to pH 7.7), and water to 2 L. Autoclave, store at 4 °C, add 4 ml 1 M DTT before use. S30B buffer: Prepare 10.88 g Mg-glutamate and 24.39 g K-glutamate, Tris at 2 M (to pH 8.2), and water to 2 L. Autoclave, store at 4 °C, add 2 ml 1 M DTT before use. HEPES: Prepare 1.91 g HEPES (MW 238.21), KOH (to pH 8), and water to 4 ml. tRNA: Prepare 30 mg of tRNA and water to 600 μl. CoA: Prepare 30 mg of CoA (MW 767.53) and water to 600 μl. NAD: Add 34.83 mg of NAD (MW 663.43), Tris at 2 M (to pH 7.5-8), and water to 300 μl. (Add 27 μl of Tris at 2 M to bring the solution to pH 7.5-8). cAMP: Add 42.80 mg of cAMP (MW 329.22), Tris at 2 M (to pH 8), and water to 200 μl. (Add 73 μl of Tris at 2 M to bring the solution to pH 8). Folinic Acid (33.9 mM): To 20 mg of solid folinic acid calcium salt (MW 511.5), add 1.15 ml water. Spermidine: Prepare 23.55 μl of spermidine (MW 145.25) and water to 150 μl. Prepare at room temperature after melting briefly at 37 °C. 3-PGA: Add 1.03 g of 3-PGA (MW 230.02), Tris at 2 M (to pH 7.5), and water to 3.2 ml. (Add 1.73 ml of Tris at 2 M to bring the solution to pH 7.5). Nucleotide Mix: Add 145 mg of ATP dipotassium salt dihydrate (MW 619.4), 133 mg of GTP disodium salt (MW 567.14), 79.4 mg of CTP disodium salt dihydrate (MW 563.16), 82.6 mg of UTP trisodium salt dihydrate (MW 586.12), KOH at 15% dilution (to pH 7.5), and water to 1.5 ml. (Add 353 μl of KOH at 15% dilution to bring the solution to pH 7.5). Supplemental Material 2. Bradford Assay. Remove Bradford agent from 4 °C and set at room temperature. Prepare 50 μl BSA Standard at 1 mg/ml and at 0.1 mg/ml. Prepare 40 μl 20x dilution of extract from step 1.47. Add 800 μl water to 7 cuvettes. Prepare standard cuvettes for 0 mg/ml, 1 mg/ml (10 μl 0.1 mg/ml BSA), 2 mg/ml (20 μl 0.1 mg/ml BSA), 4 mg/ml (4 μl 1 mg/ml BSA), 6 mg/ml (6 μl 1 mg/ml BSA). Prepare experimental cuvettes for 2 μl of sample and 4 μl of sample. Add 200 μl of Bradford agent to each cuvette and mix well by pipetting. Incubate at room temperature for at least 10 min. Produce standard curve at OD 595nm using cuvettes from step 6.5. Reject standard curve if r2 < 0.95. Determine extract concentration at OD 595nm using cuvettes froms tep 6.6. Supplemental Material 3. Buffer calibration spreadsheet. See TXTL_e(template)_calibration_JoVE.xlsx. Supplemental Material 4. Cell-free expression run spreadsheet. See TXTL _JoVE.xlsx.