Summary
Il materiale qui descrive un metodo sviluppato per preservare la struttura tridimensionale della cromatina delle cellule germinali testicolari. Questo è stato definito il metodo di scorrimento tridimensionale (3D). Questo metodo migliora la sensibilità per il rilevamento di strutture subnucleari ed è applicabile per l'immunofluorescenza, il DNA e la fluorescenza dell'RNA nell'ibridazione in situ (FISH).
Abstract
Durante la differenziazione testicolare delle cellule germinali, la struttura della cromatina nucleare cambia dinamicamente. Di seguito viene descritto un metodo progettato per preservare la disposizione tridimensionale della cromatina delle cellule germinali testicolari presenti nei topi; questo metodo è stato definito come il metodo di scorrimento tridimensionale (3D). In questo metodo, i tubuli testicolari vengono trattati direttamente con una fase di permeabilizzazione che rimuove il materiale citoplasmatico, seguito da una fase di fissazione che fissa i materiali nucleari. I tubuli vengono quindi dissociati, la sospensione cellulare è citospun e le cellule aderiscono alle diapositive. Questo metodo migliora la sensibilità verso il rilevamento di strutture subnucleari ed è applicabile per l'immunofluorescenza, il DNA e la fluorescenza dell'RNA nell'ibridazione in situ (FISH) e la combinazione di questi metodi di rilevamento. Come esempio di una possibile applicazione del metodo di scorrimento 3D, viene mostrato un COT-1 RNA FISH per rilevare gli RNA nascenti. Il metodo di scorrimento 3D faciliterà l'esame dettagliato delle relazioni spaziali tra la struttura della cromatina, il DNA e l'RNA durante la differenziazione delle cellule germinali testicolari.
Introduction
Nei teste, le cellule germinali si differenziano dalla spermatogonia diploide attraverso la meiosi in spermatozoi maturi e aploidi. Durante questo processo, la struttura della cromatina nucleare delle cellule germinali viene continuamente e dinamicamente rimodellata. Le crepa superficiali sono comunemente utilizzate per l'esame citologico delle singole cellule spermatogeniche. Un metodo prevalente di diffusione superficiale utilizza un trattamento ipotonico con cui le singole cellule spermatogeniche vengono diffuse e appiattite1. Queste condizioni sono ottimali per l'analisi dettagliata dei cromosomi meiotici. Le caratteristiche cromosomiche come lo stato sinaptico e i focolai di ricombinazione sono facilmente osservabili usando questo metodo. Tuttavia, il trattamento ipotonico interrompe l'architettura della cromatina subnucleare, quindi questa tecnica non è adatta per l'analisi strutturale dei nuclei. Di conseguenza, è stato progettato un metodo migliorato per preservare la struttura tridimensionale della cromatina delle cellule germinali testicolari. Questo metodo è stato definito metodo di scorrimento tridimensionale (3D) (Figura 1). Il metodo di scorrimento 3D ha permesso il rilevamento della nascente localizzazione dell'RNA nei nuclei perché inizialmente è stato ottimizzato per esaminare l'espressione genica e gli stati di cromatina durante la differenziazione delle cellule germinali testicolari mediante ibridazione della fluorescenza dell'RNA in situ (FISH)2,3. Questo metodo 3D è applicabile anche alla combinazione di immunofluorescenza, DNA e RNA FISH. Inoltre, questo metodo ha aiutato nella scoperta della cromatina sessuale postmeiotica (PMSC), un compartimento silenzioso dei cromosomi sessuali trovato negli spermatidi postmeiotici2.
Il metodo di scorrimento 3D è stato originariamente ottimizzato attraverso la combinazione di due fasi essenziali di preparazione dello scivolo comunemente utilizzate per la colorazione nucleare: la fase di fissazione progettata per fissare i materiali nucleari e la fase di permeabilizzazione destinata a rimuovere i materiali citoplasmatici al fine di migliorare l'accessibilità dei reagenti di colorazione, come anticorpi e sonde FISH. Come descritto in precedenza inun'altra pubblicazione 3, è stato determinato che la fase di permeabilizzazione deve precedere la fase di fissazione al fine di ottenere risultati ottimali con basso background citoplasmatico. In questo metodo di scorrimento 3D, la fase di permeabilizzazione e la successiva fase di fissazione vengono eseguite direttamente su tubuli seminiferi e sono seguite dalla dissociazione meccanica delle cellule germinali con forcep prima della citospinning su diapositive. Un metodo alternativo per RNA FISH di cellule spermatogeniche è stato sviluppato in un altro laboratorio4. In questo metodo, coerentemente con il metodo 3D, la fase di permeabilizzazione deve precedere la fase di fissazione per ottenere risultati ottimali di RNA FISH.
Il seguente protocollo descrive il metodo di scorrimento 3D e fornisce un esempio di una possibile applicazione, Cot-1 RNA FISH per il rilevamento di RNA nascenti nucleari. Il DNA Cot-1 è costituito da elementi ripetitivi nel genoma. Qui, una sonda del DNA Cot-1 è ibridata ad un introne e a un UTR delle trascrizioni nascenti, rilevando così le regioni trascrittili attive nel nucleo5,6. Le diapositive 3D sono versatili e possono essere applicate a una combinazione di tecniche di immunofluorescenza, DNA e RNA FISH al fine di ottenere un esame dettagliato delle relazioni spaziali tra l'architettura della cromatina.
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Protocol
1.3D preparazione delle diapositive
- Preparare i seguenti reagenti:
- Tampone CSK: NaCl da 100 mM, saccarosio da 300 mM, tubi da 10 mM, 3 mM MgCl2. Regolare il pH a 6,8 con 1 M NaOH. Conservare il buffer CSK a 4 °C.
- Tampone CSK con 0,5% Tritone X-100: Aggiungere 200 μl di Tritone X-100 a 40 ml di tampone CSK. Mescolare la soluzione utilizzando l'agitatore magnetico fino a quando Triton X-100 non viene completamente sciolto. Conservare il buffer CSK con 0,5% Tritone X-100 a 4 °C.
- 4% Paraformaldeide (PFA)–PBS, pH 7.4: Sciogliere 4 g di PFA in circa 70-80 ml di acqua. Per accelerare il processo di dissoluzione, aggiungere circa 20 μl di 4 N NaOH e mantenere la soluzione in un bagno d'acqua a 60 °C fino a quando la PFA non si è completamente sciolta e la soluzione è trasparente. Questo processo richiede circa 1 ora. Dopo che la PFA si è completamente sciolta, aggiungere 10 ml di 10x PBS. Regolare il volume finale a 100 ml con acqua e raffreddare la soluzione a temperatura ambiente (25 °C). Utilizzare una soluzione preparata al momento per ogni nuovo esperimento.
Nota: ottenere l'autorizzazione istituzionale per tutto il lavoro sugli animali e aderire alle linee guida pertinenti per la cura degli animali.
- Eutanasia dei topi maschi. Usando forcep e forbici, asporta il testicolo dal mouse. Posizionare il testicolo in PBS (o RPMI 1640). Dopo la rimozione del testicolo, eseguire rapidamente i seguenti passaggi 1.3-1.4 al fine di prevenire la degradazione dell'RNA.
- Rompono il testicolo su una piccola piastra di Petri e tolgono la tunica albuginea. Dipanare i tubuli seminiferi in PBS sul ghiaccio usando le forcep.
- Utilizzando le forcep, trasferire diversi tubuli (diversi pezzi di tubuli di circa 5-10 mm di lunghezza) in un pozzo di un piatto da 4 pozzetti contenente 500 ml di tampone CSK + 0,5% Tritone X-100 sul ghiaccio e incubare per 6 minuti. La sovraesposizione al buffer CSK può causare l'interruzione delle celle.
- Utilizzando le forcep, trasferire tutti i tubuli in un unico pozzo di un piatto da 4 pozzetti contenente il 4% di soluzione PFA-PBS. Questo passaggio può essere preformato senza stereomicroscopio, ma opzionalmente può essere utilizzato. Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. Inizia contemporaneamente a preparare 12 camere di citospino durante i periodi di incubazione.
- Utilizzando le forcep, trasferire tutti i tubuli in un pozzo di un piatto da 4 pozzetti contenente PBS. Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Sul retro di uno scivolo di vetro, trasferire tutti i tubuli in 30 μl di PBS (la parte superiore dello scivolo deve essere evitata a causa della carica cationica). Usando le punte di due forcep, strappare i tubuli a pezzi. Tritare i tubuli in direzione orizzontale ritagliando i tubuli tra le punte di due forcep e tirando le forcep orizzontalmente. Continuare con questo passaggio per circa 10-20 secondi.
- Mescolare la sospensione tubazione utilizzando una pipetta P20.
- Trasferire la sospensione su un tubo di microcentrifugo, diluire con PBS a circa 1,3 ml. Applicare 100 μl di sospensione su ciascuna delle 12 camere di citospino (1,2 ml totali). In questo passaggio, la concentrazione di cellule non ha bisogno di essere determinata.
- Citospin i campioni a 2.000 giri/min per 10 minuti a temperatura ambiente. Dopo la citospinizzazione, scivoli asciutti sul banco di laboratorio per alcuni minuti a temperatura ambiente. Dopo che le diapositive sono state autorizzate ad asciugarsi completamente per alcuni minuti, passare al passaggio successivo.
- Utilizzando un barattolo coplin contenente PBS, lavare gli scivoli per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Trasferire le diapositive in un barattolo di Coplin contenente il 70% di etanolo e attendere almeno 2 minuti prima dell'inizio dell'RNA FISH. Le diapositive sono stabili per alcune settimane con 70% di etanolo a 4 °C. Per la conservazione a lungo termine, disidratare le diapositive utilizzando il trattamento seriale con 80% e 100% di etanolo in barattoli Coplin per 2 minuti ciascuno e asciugare all'aria completamente disidratare le diapositive. Conservare a -80 °C in una slide box.
2. Preparazione della sonda del DNA Cot-1 mediante priming casuale
- Preparare i seguenti reagenti:
- Buffer di ibridazione: Mescolare i componenti in corso per preparare 900 ml di scorta stabilizzatrice di ibridazione; questa soluzione verrà utilizzata per rifornire le sonde. Questa scorta stabilizzatrice di ibridazione consente l'aggiunta del 10% del volume della soluzione inibitore della RNasi (Ribonucleoside Vanadyl Complex) prima dell'ibridazione.
Prima dell'ibridazione, aggiungere 1/10 vol di 200 mM ribonucleoside Vanadyl Complex o acqua alla scorta stabilizzatrice di ibridazione per abbinare la concentrazione finale. A -20 °C, questa miscela è stabile per più di un anno.componente Importo (μl) Concentrazione finale Formamide 500 50% (v/v) 50% di Dextran 200 10% (con) 20x SSC 100 2x 1% BSA 100 0.1% - 20x SSC: Sciogliere 88,2 g di citrato di sodio e 175,3 g di NaCl in circa 800 ml di acqua. Regolare il pH a 7.0 utilizzando alcune gocce di 1 M HCl. Aggiungere acqua per regolare il volume finale a 1 L. Sterilizzare mediante autoclave. Dopo la preparazione, 20x SSC possono essere conservati a temperatura ambiente.
- 50% (w/v) Dextran: Mescolare l'acqua e aggiungere lentamente 50 g di solfato di dextran. Continuare a mescolare durante la notte a temperatura ambiente. Aggiungere acqua per regolare il volume finale a 100 ml. Conservare a temperatura ambiente.
- Buffer di ibridazione: Mescolare i componenti in corso per preparare 900 ml di scorta stabilizzatrice di ibridazione; questa soluzione verrà utilizzata per rifornire le sonde. Questa scorta stabilizzatrice di ibridazione consente l'aggiunta del 10% del volume della soluzione inibitore della RNasi (Ribonucleoside Vanadyl Complex) prima dell'ibridazione.
- Aggiungere i seguenti componenti elencati di seguito a un tubo PCR. Utilizzando una macchina PCR, mescolare e incubare la soluzione per 5 minuti a 95 °C.
componente Quantità per reazione (μl) finale DNA Cot-1: 1 mg/ml 1 1 μg Primer random 9mer (dal kit) 10 Acqua 27 - Centrifugare brevemente e posizionare sul ghiaccio.
- Aggiungere i componenti seguenti. Mescolare e incubare per 30 min a 37 °C utilizzando una macchina PCR. (Per i dettagli del kit utilizzato si veda la tabella dei reagenti e delle attrezzature).
componente Quantità per reazione (μl) Concentrazione finale Miscela preparata a partire dal passaggio 2.2 38 Tampone nucleotidico 5x (dal kit) 9.2 Cy3-dUTP (1 mM) 0.8 16 μM Klenow (dal kit) 2 - Aggiungere 2 μl di tampone di arresto (dal kit) per interrompere la reazione.
- Purificare la reazione interrotta utilizzando colonne di microspin.
- Aggiungere 50 μg (5 μl) di DNA dello sperma di aringa (50 volte superiore al DNA del modello Cot-1) alla frazione purificata.
- Misurare il volume totale utilizzando una pipetta. Aggiungere 0,7x volume di etanolo al 100% e volume 0,1x di acetato di sodio 3 M (pH 5.2), mescolare bene e centrifugare per 15 minuti alla velocità massima (17.000 x g) utilizzando un microcentrifugo a 4 °C.
- Rimuovere il liquido e aggiungere 200 μl di etanolo al 70%, mescolare bene e centrifugare per 5 minuti alla velocità massima a 4 °C.
- Rimuovere il liquido in eccesso. Asciugare il precipitato per 10-30 minuti a temperatura ambiente.
- Sciogliere il pellet in 20 μl di scorta stabilizzatrice di ibridazione. Poiché il pellet è spesso difficile da sciogliere, pipettare ripetutamente. Come opzione alternativa, un miscelatore a vortice può anche essere utilizzato per sciogliere in modo efficiente il pellet. Le sonde possono essere mantenute a -20 °C fino all'uso.
3. Cot-1 RNA FISH
- Aggiungere i componenti elencati di seguito a un tubo PCR. Utilizzando una macchina PCR, incubare per 10 min a 80 °C, seguito da una fase di preannealizzazione di circa 10-30 min a 42 °C. Conservare a 42 °C fino all'ibridazione. Ribonucleoside Vanadyl Complex è facoltativo; può essere sostituito con acqua.
componente Quantità per reazione (μl) finale Sonda A DNA Cot-1 (50 ng/μl) 2 100 ng Complesso Di Vanadyl Ribonucleoside (200 mM) 2 20 mM Buffer di ibridazione aggiunto a 20 - Vetrini disidratati in un barattolo di Coplin contenente 80% di etanolo per 2 min, seguiti da un barattolo di Coplin contenente 100% di etanolo per 2 min. Scivoli asciutti completamente sulla panchina del laboratorio a temperatura ambiente.
- Preriscaldare in anticipo una camera a punta (riempita con 2-3 cm di acqua) in un incubatore a 42 °C. Posizionare la diapositiva sulla camera della casella di punta. Centrifugare brevemente le sonde preannealate e la pipetta direttamente sugli scivoli disidratati. Evitare di fare bolle. Coprire delicatamente lo scivolo con un foglietto di copertura.
- Ibridare per 6 ore fino a durante la notte (14-15 ore) a 42 °C.
- Preparare soluzioni di lavaggio in vasetti Coplin (due vasetti con 2x SSC e 50% formamide, e due vasetti con 2x SSC). Preriscaldare a 42 °C per 30 minuti in un bagno d'acqua.
- Utilizzare una lama per rimuovere lo slittamento del coperchio dal bordo dello scivolo. Evitare di graffiare i campioni. Lavare gli scivoli in un barattolo coplin contenente 2x SSC e 50% formamide per 5 min a 45 °C. Ripetere questo passaggio una volta.
- Lavare gli scivoli in un barattolo coplin contenente 2x SSC per 5 minuti a 45 °C. Ripetere questo passaggio una volta.
- Aggiungere 20 μl di supporti di montaggio DAPI alle diapositive e coprire con uno slittamento di copertura. Premere delicatamente il vetro di copertura per rimuovere i supporti di montaggio aggiuntivi. Blot supporti di montaggio extra con tessuto detergente. Le diapositive sono pronte per la valutazione della microscopia.
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Representative Results
Un risultato rappresentativo di una diapositiva 3D è mostrato nella figura 2. In questo esperimento, Cot-1 RNA FISH è stato eseguito per rilevare la trascrizione nascente insieme all'immunostaining usando anticorpi anti CBX1 e γH2AX. Per combinare RNA FISH e immunostaining, l'immunostaining è stato eseguito per primo, seguito da RNA FISH come descritto in3. La CBX1 è una proteina eterocromatina che si localizza in eterocromatina pericentromerica e cromosomi sessuali silenziosi in meiosi chiamata corpo XY (o corpo sessuale). γH2AX è una forma fosforilata della variante istono H2AX e si localizza sul corpo XY. In questa immagine, i segnali Cot-1 si accumulano sulle regioni eucromatiche, ma sono esclusi dall'eterocromatina pericentromerica e dal corpo XY.
Durante la preparazione della diffusione superficiale, il trattamento con soluzione ipotonica gonfia i nuclei e estende fisicamente le strutture subnucleari. Questo metodo prevalente per lo studio meiotico è più adatto per catturare tutti i cromosomi meiotici in un singolo piano z1. Per chiarire la differenza tra il metodo di scorrimento 3D e le superfici diffuse dopo il trattamento ipotonico, vengono mostrate immagini rappresentative di spermatociti pachytene di ogni esperimento utilizzando lo stesso ingrandimento utilizzando un microscopio epifluorescente(figure 2A e 2B). Nelle crepa superficiali trattate con soluzione ipotonica, la struttura tridimensionale della cromatina viene interrotta e tutti gli assi cromosomici meiotici possono essere catturati all'interno di un singolo piano z. La preparazione dello scivolo 3D, tuttavia, preserva la struttura intatta della cromatina.
Figura 1. Schema del metodo di diapositiva 3D. Il metodo di scorrimento 3D può preservare la struttura tridimensionale della cromatina. A causa della natura tridimensionale della diapositiva, è necessaria l'acquisizione dei dati con più sezioni z per coprire un nucleo.
Figura 2. Il confronto tra il metodo di scorrimento 3D e la superficie si diffonde dopo il trattamento ipotonico allo stesso ingrandimento. (A) Utilizzando lo scivolo 3D, vengono eseguiti cot-1 RNA FISH (cy3) e immunostaining con anticorpi anti CBX1 (fitc) e γH2AX (cy5). Viene mostrato uno spermatocita pachytene con una singola sezione z. (B) Utilizzando le superfici si diffonde, vengono eseguite immunosottendi con anticorpi anti SCP3 e γH2AX. Viene mostrato uno spermatocita pachytene. Cerchi: Corpo XY. Barre: 10 μm.
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Discussion
Nella preparazione della diapositiva 3D, la fase di permeabilizzazione precede la fase di fissazione. Questi passaggi vengono eseguiti direttamente su tubuli seminiferi, preservando così la struttura tridimensionale della cromatina. Un'opzione alternativa per preservare la struttura della cromatina per RNA / DNA FISH è eseguire contemporaneamente la fase di permeabilizzazione e la fase di fissazione. Questa tecnica alternativa è stata eseguita nelle cellule germinali marsupiali e negli embrioni di preimpianto deltopo 7,8. Tuttavia, se la fase di fissazione precede la fase di permeabilizzazione, può dare origine a un alto background citoplasmatico. Pertanto, il determinante critico dell'ottimizzazione dello scorrimento per RNA e DNA FISH dipende dall'ordine della permeabilizzazione e dalle fasi di fissazione. La durata della fase di permeabilizzazione è anche un fattore importante per l'ottimizzazione della preparazione delle diapositive. Sei minuti sono la condizione generale per questo metodo. Tuttavia, può essere regolato in base alla variazione dei materiali utilizzati.
La conservazione della struttura tridimensionale della cromatina è una caratteristica della diapositiva 3D che la separa distintamente dalle diapositive di diffusione della superficie. Questo vantaggio differisce notevolmente da quello della preparazione della diffusione cromosoma. Il metodo di scorrimento 3D preserva la struttura tridimensionale della cromatina, ma richiede l'acquisizione di dati con più sezioni z per includere un intero nucleo. Una singola sezione z non può catturare tutti i segnali di un nucleo. Pertanto, la necessità di più sezioni z è una limitazione importante a questo metodo. Per catturare un nucleo in una singola sezione z, le superfici si diffondono hanno un vantaggio. Pertanto, il metodo 3D e la preparazione della diffusione superficiale hanno vantaggi distinti e compensano reciprocamente le caratteristiche l'una dell'altra per lo studio della meiosi e della spermatogenesi.
Il metodo di scorrimento 3D può essere applicato a tutti i tipi di cellule presenti all'interno dei testicoli, tra cui spermatogonia, spermatidi rotondi e cellule sertoli. Questo metodo è stato anche applicato per esaminare la compattazione della cromatina dei cromosomi sessuali all'inizio dell'inattivazione cromosomica del sesso meiotico e per esaminare le modifiche epigenetiche su PMSC10. In termini di applicazioni future, questo metodo può essere applicato ad altri tessuti o cellule. In tal caso, si consiglia che la fase di permeabilizzazione preceda la fase di fissazione. In alternativa, la fase di permeabilizzazione e il passaggio di fissazione possono essere eseguiti contemporaneamente.
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Disclosures
L'autore non ha nulla da rivelare.
Acknowledgments
Ringrazio Jeannie T. Lee per la supervisione di questo progetto quando ero nel laboratorio di Lee e Tyler Broering per aver modificato il manoscritto. Questo lavoro è stato supportato dal Basil O'Connor Starter Scholar Award della March of Dimes Foundation e dal NIH Grant GM098605.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cot-1 DNA | Invitrogen | 18440-016 | |
| Stratagene Prime-It Fluor Fluorescence Labeling Kit | Agilent | 300380 | |
| Herring sperm DNA Solution | Invitrogen | 15634-017 | |
| Ethanol. 200 proof (absolute) | Pharmco-aaper | 111000200 | |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | |
| Formamide deionized | American Bioanalytical | AB00600-00500 | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma-Aldrich | C8532 | |
| Bovine serum albumin | Lifeblood Medical | 77110-100 | |
| Dextran sulfate sodium salt from Leuconostoc spp. | Sigma-Aldrich | D6001 | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | A10491-01 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| PIPES | Sigma-Aldrich | P6757 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M0250 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 76240 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H1200 | |
| Ribonucleoside-vanadyl complex | New England Biolabs | S1402S | |
| Illustra MicroSpin G-50 Columns | GE Healthcare | 27-5330-01 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Forceps | VWR | 300-050 | |
| Microcentrifuge tubes | Bioexpress | C-3262-1 | |
| Cytospin 3 | Shandon | ||
| Coplin Jar | Fisher | 08-815 | |
| Superfrost /Plus Microscope Slides | Fisher | 12-550-15 | |
| 4-well dish | Fisher | 12-566-301 | |
| Cover glass | Fisher | 12-544-G | |
| Air incubator | Revolutionary Science | RS-IF-203 |
References
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