Summary
ここでの材料は精巣生殖細胞の三次元クロマチン構造を維持するために開発された方法を記述する。これは三次元(3D)スライド法と呼ばれます。この方法は、亜核組織の検出感度を向上させ、免疫蛍光、DNA、および蛍光をその 中で の蛍光(FISH)に適用可能です。
Abstract
精巣胚芽細胞分化の間、核クロマチンの構造は動的に変化する。以下は、マウスに見られる精巣生殖細胞の三次元クロマチン配置を維持するために設計された方法を説明します;この方法は三次元(3D)スライド法と呼ばれる。この方法では、精巣細管は細胞質材料を除去する透過性のステップで直接処理され、続いて核物質を固定する固定ステップが続く。次いで、尿細管を解合し、細胞懸濁液を細胞紡ぎ、細胞はスライドに付着させる。この方法は、亜核組織の検出に対する感度を向上させ、免疫蛍光、DNA、および蛍光をその 中で の蛍光、DNA、およびRNA蛍光(FISH)およびこれらの検出方法の組み合わせに適用可能である。3Dスライド法の応用例として、Cot-1 RNA FISHが新生RNAを検出することが示されています。3Dスライド法は、精巣胚芽細胞分化中のクロマチン構造、DNA、RNA間の空間的関係の詳細な検討を容易にする。
Introduction
精巣では、生殖細胞は、二数葉化精子腫から、成熟したハプロイド精子に対するマイオシスを介して分化する。この過程において、胚芽細胞の核クロマチン構造は、連続的かつ動的に再モデル化される。表面の広がりは、個々の精子細胞の細胞学的検査に一般的に使用される。表面広がりの一般的な方法は、個々の精子細胞が広がり、平坦化される低調薬治療を採用する1.これらの条件は、精密染色体の詳細な分析に最適です。シナプス状態や再結合病巣などの染色体特徴は、この方法を用いて容易に観察される。しかし、低張治療は亜核クロマチンアーキテクチャを破壊し、したがってこの技術は核の構造解析には適さない。その結果、精巣生殖細胞の三次元クロマチン構造を維持するように改良された方法が設計されている。この方法は、3次元(3D)スライド法と呼ばれる(図1)。3Dスライド法は、その現場でのRNA蛍光による精巣胚芽細胞分化中の遺伝子発現およびクロマチン状態を調べるために最初に最適化されたため、核内の新生RNA局在化の検出を可能にした(FISH)2,3。この3D法は、免疫蛍光、DNA、RNA FISHの組み合わせにも適用可能です。さらに、この方法は、ポストメオティック性クロマチン(PMSC)の発見に役立ち、ポストメオティック精子2に見られる性染色体の無声コンパートメントである。
3Dスライド法は、核染色に一般的に使用されるスライド調製の2つの重要なステップの組み合わせによって、もともと最適化されました:核物質を固定するために設計された固定ステップと、抗体やFISHプローブなどの染色試薬の入手可能性を向上させるために細胞質材料を除去することを意図した透過性ステップ。他の刊行3で既に説明したように、低細胞質バックグラウンドで最適な結果を得るためには、パーメアビレーションステップが固定工程の前になければならないことが決定された。この3Dスライド法では、透過化ステップとその後の固定ステップを半細管上で直接行い、続いて細胞回転前に細胞を鉗子で生殖細胞を滑らかに回転させます。精子細胞のRNA FISHの代替方法が別の実験室4で開発された。この方法では、3D法と一致し、RNA FISHの最適な結果を得るためにパーメアビライゼーションステップが固定工程の前になければなりません。
以下のプロトコルは、3Dスライド法について説明し、核新生RNAの検出に可能な応用例であるCot-1 RNA FISHを提供する。Cot-1 DNAは、ゲノム中の反復的な要素から構成されています。ここで、Cot-1 DNAプローブは、新生転写物のイントロンとUTRにハイブリダイズされ、核5,6内の転写活性領域を検出する。3Dスライドは汎用性が高く、クロマチンアーキテクチャ間の空間的関係の詳細な検査を得るために、免疫蛍光、DNAおよびRNA FISH技術の組み合わせに適用することができます。
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Protocol
1.3D スライドの準備
- 以下の試薬を準備します。
- CSKバッファ:100 mM NaCl、300 mMスクロース、10 mMパイプ、3 mM MgCl2.1 M NaOH で pH を 6.8 に調整します。CSKバッファーは4°Cで保管してください。
- 0.5%トリトンX-100のCSKバッファ:200 μlのトリトンX-100から40 mlのCSKバッファを加えます。トリトンX-100が完全に溶解するまで、磁気撹拌機を使用して溶液を混合します。CSKバッファーを0.5%トリトンX-100で4°Cで保管してください。
- 4% パラホルムアルデヒド (PFA)-PBS、 pH 7.4: 約 70-80 ml の水に PFA の 4 g を溶解します。溶解プロセスを迅速化するために、約20 μlの4 N NaOHを加え、PFAが完全に溶解して溶液が透明になるまで、水浴中の溶液を60°Cに保ちます。このプロセスは約1時間かかります。PFAが完全に溶解した後、10x PBSの10mlを加えます。水で最終体積を100mlに調整し、溶液を室温(25°C)に冷却します。新しい実験ごとに、新たに準備したソリューションを使用します。
注:すべての動物の仕事のための制度的許可を得て、関連する動物のケアガイドラインに従ってください。
- 雄マウスを安楽死させる。鉗子とはさみを使用して、マウスから精巣を切除する。テストをPBS(またはRPMI 1640)に入れる。精巣を除去した後、RNAの分解を防ぐために、以下のステップ1.3-1.4を迅速に実施する。
- 小さなペトリ皿の精巣を破裂させ、 チュニカアルブギネアを取り除く.鉗子を使用して氷の上のPBSで半日本の細管を解き明かす。
- 鉗子を使用して、500 mlのCSKバッファー+0.5%トリトンX-100を含む4ウェル皿の1つの井戸に、いくつかの管状(長さ約5〜10mmの細管)を1つの井戸に移し、6分間インキュベートする。CSKバッファーへの過度の露出は、細胞の破壊につながる可能性があります。
- 鉗子を使用して、4%PFA-PBS溶液を含む4ウェル皿の1つの井戸にすべての細管を移す。このステップは、実体顕微鏡なしで前形をすることができるが、任意で使用することができる。室温で10分間インキュベートします。同時にインキュベーション期間中に12個の細胞スピンチャンバーの準備を開始する。
- 鉗子を使用して、すべての細管をPBSを含む4ウェル皿の1つの井戸に移します。室温で5分間インキュベートします。
- ガラススライドの裏側で、すべての管を30 μlのPBSに移します(カチオン電荷のため、スライドの上部は避けてください)。2つの鉗子の先端を使用して、細管を粉々に引き裂く。2つの鉗子の先端の間で管を切り取り、鉗子を水平に引っ張ることによって、管を水平方向に刻みます。この手順を約 10 ~ 20 秒間続けます。
- P20ピペットを用いてピペットで懸濁液を混ぜます。
- 懸濁液をマイクロ遠心チューブに移し、PBSで約1.3mlに希釈します。12個のサイトスピンチャンバ(合計1.2 ml)のそれぞれに100 μlの懸濁液を塗布します。この工程では、細胞の濃度を決定する必要はありません。
- 細胞回転は、室温で10分間2,000rpmでサンプルを回転させます。サイトスピニング後、実験室のベンチで室温で数分間スライドします。スライドが数分完全に乾燥した後、次のステップに進みます。
- PBSを含むコプリン瓶を使用して、室温で5分間スライドを洗浄します。
- 70%エタノールを含むコプリン瓶にスライドを移し、RNA FISHの開始前に少なくとも2分待ちます。スライドは、4°Cで70%エタノール中の数週間安定である。 長期保存の場合、コプリン瓶に80%と100%エタノールを使用して2分間連続処理を施し、スライドを完全に脱水乾燥します。スライドボックスに-80°Cで保管してください。
2. ランダムプライミングによるコト-1 DNAプローブ調製
- 以下の試薬を準備します。
- ハイブリダイゼーションバッファ:ハイブリダイゼーションバッファストックの900 mlを準備するために進行コンポーネントを混合します。このソリューションは、プローブのストックに使用されます。このハイブリダイゼーションバッファーストックは、ハイブリダイゼーションの前にRNase阻害剤溶液(リボヌクレオシドバナジル錯体)の10%の体積の添加を可能にします。
ハイブリダイゼーションの前に、200 mM リボヌクレオシド バナジルコンプレックスまたは水の 1/10 vol を最終濃度に合わせてハイブリダイゼーション バッファー ストックに加えます。-20°Cでは、この混合物は1年以上安定している。コンポーネント 量(μl) 最終濃度 ホルムアミド 500 50% (v/v) デキストラン 50% 200 10% (w/v) 20x SSC 100 2x 1% BSA 100 0.1% - 20x SSC:クエン酸ナトリウム88.2g、NaCl175.3gを約800mlの水に溶かします。1 M HCl の数滴を使用して pH を 7.0 に調整し、水を加え、オートクレーブ処理で最終ボリュームを 1 L. 滅菌に調整します。調製後、20倍のSSCを室温で保存することができます。
- 50%(w/v)デキストラン:水をかき混ぜ、ゆっくりと50gのデキストラン硫酸塩を加えます。室温で一晩かき混ぜ続けます。水を加えると、最終容積を100mlに調整します。室温で保管してください。
- ハイブリダイゼーションバッファ:ハイブリダイゼーションバッファストックの900 mlを準備するために進行コンポーネントを混合します。このソリューションは、プローブのストックに使用されます。このハイブリダイゼーションバッファーストックは、ハイブリダイゼーションの前にRNase阻害剤溶液(リボヌクレオシドバナジル錯体)の10%の体積の添加を可能にします。
- 以下の成分を PCR チューブに追加します。PCR機を使用して、95°Cで5分間混合してインキュベートします。
コンポーネント 反応あたりの量 (μl) 最終的な コト-1 DNA:1 mg/ml 1 1 μg ランダム9マープライマー(キットから) 10 水 27 - 遠心分離機は簡単に氷の上に置きます。
- 次のコンポーネントを追加します。PCR機を使用して37°Cで30分間混合し、インキュベートします。(使用したキットの詳細については、試薬および装置の表を参照してください。
コンポーネント 反応あたりの量 (μl) 最終濃度 ステップ2.2から調製された混合物 38 5xヌクレオチドバッファー(キットから) 9.2 サイ3-dUTP (1 mM) 0.8 16 μM クレノウ (キットより) 2 - 2 μlのストップバッファー(キットから)を加えると、反応を中止します。
- マイクロスピンカラムを使用して停止した反応を精製します。
- 精製された分率に50μg(5μl)のニシン精子DNA(鋳型Cot-1 DNAの50倍の過剰量)を加えます。
- ピペットを使用して総体積を測定します。0.7倍のエタノール量100%、酢酸ナトリウム3M(pH 5.2)の0.1倍の体積を加え、よく混ぜ、遠心分離機を最大速度(17,000 x g)で4°Cのマイクロ遠心分離機を使用して15分間加えます。
- 液体を取り出し、200μlの70%エタノールを加え、4°Cで最高速度で5分間よく混ぜます。
- 余分な液体を取り除きます。沈殿物を室温で10〜30分間乾燥させます。
- 20 μlのハイブリダイゼーションバッファーストックにペレットを溶かします。ペレットは溶解しにくいことが多いため、ピペットを繰り返し使用する。代替オプションとして、ボルテックスミキサーを使用してペレットを効率的に溶解することもできます。プローブは使用するまで-20°Cに保つことができます。
3. コト-1 RNAフィッシュ
- 以下のコンポーネントを PCR チューブに追加します。PCR機を用いて、80°Cで10分間インキュベートし、続いて42°Cで約10〜30分間の前焼成工程を行う。 ハイブリダイゼーションが行なくなるまで42°Cに保ちます。リボヌクレオシドバナジル複合体は任意です。それは水と交換することができます。
コンポーネント 反応あたりの量 (μl) 最終的な コト-1 DNAプローブ(50 ng/μl) 2 100 ng リボヌクレオシド・ヴァナジル・コンプレックス (200 mM) 2 20mM ハイブリダイゼーションバッファ 20 に追加 - 80%エタノールを含むコプリン瓶で2分間脱水スライドし、続いて100%エタノールを含むコプリン瓶を2分間脱水する。室温の実験室のベンチの乾燥スライドは完全に。
- 42°Cインキュベーターにチップボックスチャンバー(2〜3cmの水で満たされた)を予熱します。先端箱の部屋の上にスライドを置きます。プレアンネプローブとピペットを脱水スライドに直接遠心分離します。泡を作らないようにしてください。スライドをカバースリップでそっと覆います。
- 42°Cで6時間から一晩(14〜15時間)ハイブリダイズする。
- コプリンの瓶(2x SSCと50%のフォルミドを備えた2つの瓶、2倍のSSCを備えた2つの瓶)で洗浄液を準備します。42°Cで水浴で30分間予熱します。
- かみそりの刃を使用して、スライドの端からカバースリップを取り外します。サンプルを引っ掻かないようにします。2x SSCと50%ホルムアミドを含むコプリン瓶にスライドを45°Cで5分間洗浄します。 この手順を 1 回繰り返します。
- 2x SSCを含むコプリン瓶にスライドを5分間45°Cで洗います。 この手順を 1 回繰り返します。
- スライドに20μlのDAPI取り付けメディアを追加し、カバースリップでカバーします。カバーガラスを軽く押して、余分な取り付けメディアを取り外します。洗浄ティッシュと余分な土台媒体をブロット。スライドは顕微鏡評価の準備ができています。
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Representative Results
3D スライドの代表的な結果を図 2に示します。この実験では、コト1RNA FISHを、抗CBX1およびγH2AX抗体を用いた免疫染色と共に新生転写を検出するために行った。RNA FISHと免疫染色を組み合わせるために、免疫染色を最初に行い、続いて3に記載されるRNA FISHを行った。CBX1は、XY体(または性体)と呼ばれるメイオシスにおける中心血球ヘテロクロマチンおよびサイレントセックス染色体に局部するヘテロクロマチンタンパク質である。γH2AXはヒストン変異体H2AXのリン酸化形態であり、XY体上に局地化する。この写真では、Cot-1信号は、ユークロマティック領域に蓄積しますが、心間血球ヘテロクロマチンとXY体から除外されています。
表面広がり調製中、低張性溶液による処理は核を膨らみ、核下構造を物理的に拡張する。この一般的な方法は、単一のzプレーン1ですべてのメオティック染色体をキャプチャするのに最も適しています。低張治療後の3Dスライド法と表面広がりの違いを明らかにするために、各実験のパキテイン精子細胞の代表的な写真が、蛍光顕微鏡を用いて同じ倍率を用いて示されている(図2A 及び 2B)。低張液で処理された表面スプレッドでは、三次元クロマチン構造が破壊され、すべてのメオティック染色体軸を単一のZ平面内で捕捉することができます。しかし、3Dスライド調製は、クロマチン構造を維持します。
図 1.3Dスライド法の概略図。3Dスライド法は、3次元クロマチン構造を保持することができる。スライドの立体的性質により、複数のzセクションを含むデータ取得は、核をカバーする必要があります。
図 2.3Dスライド法と表面の比較は、同じ倍率で低調処理後に広がります。(A)3Dスライドを用いて、Cot-1 RNA FISH(cy3)および抗CBX1(fitc)およびγH2AX(cy5)抗体による免疫染色が行われる。単一のzセクションを有するパキテネ精子細胞が示されている。(B)表面広がりを用いて、抗SCP3およびγH2AX抗体による免疫染色が行われる。パキテイン精子細胞が示されている。円: XY ボディ。バー:10 μm。
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Discussion
3Dスライドの準備では、パーメアビライゼーションステップは固定ステップの前に行います。これらのステップは、半細管上で直接行われ、それによって、3次元クロマチン構造を維持する。RNA/DNA FISHのクロマチン構造を保存するための代替オプションは、パーメアビライゼーションステップと固定ステップを同時に行うことである。この代替技術は、有袋類生殖細胞およびマウスの着床前胚7,8において行われている。しかし、固定工程がパーメアビライズステップに先行する場合、高い細胞質背景を生じさせる可能性がある。したがって、RNAおよびDNA FISHのスライド最適化の重要な決定要因は、透過性の順序と固定ステップに依存します。パーメアビライズステップの持続時間は、スライド調製の最適化のための重要な要素でもあります。この方法では、6 分が一般的な条件です。ただし、使用する材料のバリエーションに応じて調整できます。
3次元クロマチン構造の保存は、表面スプレッドスライドから明確に分離する3Dスライドの特徴です。この利点は、染色体拡散製剤の場合とは大きく異なる。3Dスライド法では、3次元クロマチン構造を保持しますが、核全体を包含するために複数のZセクションを使用してデータを取得する必要があります。1 つの z セクションは、核のすべてのシグナルをキャプチャできません。したがって、複数の z セクションの必要性は、この方法の大きな制限です。単一のz断面で核を取り込むには、表面の広がりが有利です。したがって、3D法と表面広がり製剤は、明らかな利点を有し、明知および精子形成の研究のために相互に互いの特徴を補償する。
3Dスライド法は、精巣内で見つかったすべての細胞タイプに適用することができます, 精子,円形精子,セルトリ細胞を含む.この方法は、Meiotic性染色体不活性化の発症時における性染色体のクロマチン圧縮を調べ、PMSC10に対するエピジェネティック修飾を調べることにも適用されている。将来の応用の観点から、この方法は他の組織または細胞に適用され得る。その場合は、パーメアビライゼーション手順を固定手順の前にすることをお勧めします。あるいは、パーメアビライズ工程と固定工程を同時に行うことができる。
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Disclosures
著者は開示するものは何もない。
Acknowledgments
私がリー研究所にいたとき、このプロジェクトを監督してくれたジニー・T・リーと、原稿を編集してくれたタイラー・ブローリングに感謝します。この作品は、ダイムズ財団のマーチからバジル・オコナースタータースカラー賞とNIHグラントGM098605によって支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cot-1 DNA | Invitrogen | 18440-016 | |
| Stratagene Prime-It Fluor Fluorescence Labeling Kit | Agilent | 300380 | |
| Herring sperm DNA Solution | Invitrogen | 15634-017 | |
| Ethanol. 200 proof (absolute) | Pharmco-aaper | 111000200 | |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | |
| Formamide deionized | American Bioanalytical | AB00600-00500 | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma-Aldrich | C8532 | |
| Bovine serum albumin | Lifeblood Medical | 77110-100 | |
| Dextran sulfate sodium salt from Leuconostoc spp. | Sigma-Aldrich | D6001 | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | A10491-01 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| PIPES | Sigma-Aldrich | P6757 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M0250 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 76240 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H1200 | |
| Ribonucleoside-vanadyl complex | New England Biolabs | S1402S | |
| Illustra MicroSpin G-50 Columns | GE Healthcare | 27-5330-01 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Forceps | VWR | 300-050 | |
| Microcentrifuge tubes | Bioexpress | C-3262-1 | |
| Cytospin 3 | Shandon | ||
| Coplin Jar | Fisher | 08-815 | |
| Superfrost /Plus Microscope Slides | Fisher | 12-550-15 | |
| 4-well dish | Fisher | 12-566-301 | |
| Cover glass | Fisher | 12-544-G | |
| Air incubator | Revolutionary Science | RS-IF-203 |
References
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