Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

In vitro Coculture Assay at vurdere Patogen induceret Neutrophil Trans-epitel Migration

Published: January 6, 2014 doi: 10.3791/50823
Automatic Translation
1,2,3, 1,3, 3, 1,3
1Department of Pediatrics, Harvard Medical School, 2Department of Pediatric Gastroenterology, MGH for Children, 3Mucosal Immunology and Biology Research Center, Massachusetts General Hospital

Summary

Neutrofil trans-epitelmigration som reaktion på slimhindebakteriel infektion bidrager til epitelskader og kliniske sygdomme. En in vitro-model er blevet udviklet, der kombinerer patogen, humane neutrofiler og polariserede menneskelige epitelcellelag dyrket på transwellfiltre for at lette undersøgelser mod optrævling af de molekylære mekanismer, der orkestrerer dette fænomen.

Abstract

Slimhindeoverflader tjener som beskyttende barrierer mod patogene organismer. Medfødte immunrespons aktiveres ved sensing patogen, der fører til infiltration af væv med migrerende inflammatoriske celler, primært neutrofiler. Denne proces har potentiale til at være ødelæggende for væv, hvis overdreven eller holdt i en uløst tilstand.  Cocultured in vitro modeller kan bruges til at studere de unikke molekylære mekanismer, der er involveret i patogen induceret neutrofil trans-epitel migration. Denne type model giver alsidighed i eksperimentelt design med mulighed for kontrolleret manipulation af patogenet, epitelbarrieren eller neutrofil. Patogen infektion af den apikale overflade af polariserede epitelmonolag, der dyrkes på gennemtrængelige transwellfiltre, anstifter fysiologisk relevant basolateral til apikale trans-epitelmigration af neutrofiler, der påføres basolateraloverfladen. Den in vitro-model, der er beskrevet heri, viser de mange trin, der er nødvendige for at demonstrere neutrofil migration på tværs af et polariseret lungeepitelemonolag, der er inficeret med patogen P. aeruginosa (PAO1). Såning og dyrkning af gennemtrængelige transwells med humane afledte lungeepitele celler er beskrevet sammen med isolering af neutrofiler fra fuldblod og dyrkning af PAO1 og nonpathogenic K12 E. coli (MC1000).  Emigrationsprocessen og den kvantitative analyse af migrerede neutrofiler, der er blevet mobiliseret som reaktion på patogen infektion, er vist med repræsentative data, herunder positive og negative kontroller. Dette in vitro-modelsystem kan manipuleres og påføres andre slimhindeoverflader. Inflammatoriske reaktioner, der involverer overdreven neutrofil infiltration, kan være ødelæggende for værtsvæv og kan forekomme i mangel af patogene infektioner. En bedre forståelse af de molekylære mekanismer, der fremmer neutrofil trans-epitelmigration gennem eksperimentel manipulation af det in vitro-cokultur assay-system, der er beskrevet heri, har et betydeligt potentiale til at identificere nye terapeutiske mål for en række mukosale infektiøse såvel som inflammatoriske sygdomme.

Introduction

Slimhindeoverflader tjener som fysiske og immunologiske barrierer, der giver beskyttelse mod eksterne trusler, der er udbredt i miljøet1,2. Denne beskyttende epitelbarriere kan kompromitteres, når patogene organismer invaderer2. I tilfælde af et bakterielt patogen anstifter dette møde ofte en inflammatorisk proces ved at aktivere det medfødte immunsystem og udløse en hurtig mobilisering af førstehjælpere granulocytter kendt som neutrofiler2-4. Kemotaktiske midler, der letter neutrofil rekruttering, produceres delvis af slimhindeepitelecellerne, der søger at befri værten for det ulovlige patogen2-4. Overdreven eller uløst neutrofil infiltration af slimhindeepitelets overflade kan forårsage betydelig patologi1,5. Dette er en konsekvens af uspecifikke vævsskader forårsaget af antibakterielt neutrofilarsenal5-7. I sådanne tilfælde overskygges neutrofilers bakterielle clearancekapacitet af ødelæggelse af værtsvæv under en smitsom fornærmelse.  Forstyrrelse af den beskyttende epitelbarrierefunktion kan føre til øget eksponering af underliggende væv for mikroorganismer og/eller toksiner, hvilket yderligere forværrer sygdomspatologien8,9. Disse konsekvenser kan observeres i flere organsystemer, herunder lungerne og fordøjelseskanalen1,5. Desuden er ikke-infektiøse inflammatoriske tilstande som alvorlige anfald af astma, kronisk obstruktiv lungesygdom (KOL), akut respiratorisk nødsyndrom (ARDS) og inflammatorisk tarmsygdom (IBD) præget af det patologiske brud på slimhinde epitelbarrieren ved en overdreven neutrofil reaktion4,5,10-12.

Den komplekse proces med neutrofil rekruttering efter slimhindeinfektion involverer flere opdelte trin1,5,13,14. For det første skal neutrofiler afvige fra cirkulation via en række celle-til-celle-interaktioner, der letter trans-endotelmigration1,13. Neutrofiler navigerer derefter i eksisterende interstitiel plads, der indeholder ekstracellulær matrix1,14. For at nå lumen af den inficerede slimhinde skal neutrofiler derefter migrere over epitelbarrieren1,4,5. Dette indviklede multistep fænomen undersøges ofte samlet ved hjælp af in vivo dyremodeller af infektion15. Sådanne modeller er nyttige til at fastslå nødvendigheden af specifikke faktorer, såsom kemokiner, vedhæftningsmolekyler eller signalveje, der deltager i den samlede proces, men er stort set utilstrækkelige til at løse molekylære bidrag, der er kritiske for hvert særskilt opdelt trin16. Cocultured in vitro-systemer, der modellerer trans-endothelial, trans-matrix eller trans-epitelmigration af neutrofiler, har været særlig nyttige i denne henseende1.14,16,17.

Der er udviklet et robust cokulturanalysesystem med henblik på dechifrering af mekanismer, der er ansvarlige for neutrofil trans-epitelmigration som reaktion på patogen infektion18-22. Denne model indebærer at inficere den apikale overflade af polariserede menneskelige epitelcellelag med et bakterielt patogen efterfulgt af anvendelse af frisk isolerede menneskelige neutrofiler på basolateraloverfladen18-22. Neutrofiler migrerer over epitelbarrieren som reaktion på epitelbaserede kemotaktiske produkter, der udskilles efter patogen infektion18,21-23. Dette modelsystem er blevet anvendt ved hjælp af tarm- og lungeepitele kulturer, der er udsat for passende vævsspecifikke bakterielle patogener, og har afsløret nye molekylære mekanismer, der sandsynligvis er vigtige for den neutrofile rekrutteringsproces under slimhindeinfektion3,8,19,24-28. Styrken af denne in vitro coculture model er, at en reduktionistisk tilgang gør det muligt for investigator at eksperimentelt manipulere patogenet, epitelbarrieren og / eller neutrofil i et velkontrolleret, meget reproducerbart, ret billigt system. Indsigt indsamlet fra denne tilgang kan effektivt udnyttes til at gennemføre fokuseret analyse af opdelte begivenheder under neutrofil rekruttering ved hjælp af in vivo infektion modeller22,29,30.

Denne artikel viser de mange trin, der er nødvendige for en vellykket etablering af denne reproducerbare model for at udforske patogeninduceret neutrofil trans-epitelmigration. Lunge epitelbarrierer inficeret med patogenet Pseudomonas aeruginosa er omtalt i denne artikel; andre vævs epithelia og patogener kan dog erstattes med mindre ændringer. Såning og dyrkning af polariserede lunge epitelcellelag på omvendt kollagen belagt gennemtrængelig transwell filtre er beskrevet heri, som er væksten af patogene P. aeruginosa og isolering af neutrofiler fra fuldblod. Hvordan disse komponenter kombineres for at observere patogeninduceret neutrofil trans-epitelmigration præsenteres sammen med passende positive og negative kontroller for at etablere en reproducerbar analyse. Alsidigheden af denne tilgang til at undersøge forskellige aspekter af patogen induceret neutrofil trans-epitel migration diskuteres med henvisning til specifikke undersøgelser i litteraturen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Trin (1-3) skal udføres i et sterilt miljø under en laminar flow hætte.

1. Kollagen Coating Transwells

  1. Lav en 30 μg/ml kollagenopløsning. 3 mg/ml kollagenbestand 1:100 fortyndes i 60% ethanol, der er passeret gennem en 0,2 μm filterenhed.
  2. Hvirvelfortyndet 30 μg/ml opløsning. Bemærk: Det er ikke nødvendigt at hvirvle 3 mg/ml kollagenbestandsopløsningen, da denne opløsning er ret tyktflydende, og der kan indføres luftbobler, hvilket potentielt reducerer nøjagtigheden ved pipettering.
  3. Fjern 0,33 cm2 vækstområde transwells med en porestørrelse på 3 μm fra udvendig emballage og læg 24-brøndspladen, der indeholder 12 transwells på hovedet inde i emhætten.
  4. Løft bundpladen af og læg den til side. Bemærk: Transwells vil nu være på hovedet hvile på toppen af låget af 24-brønds plade
  5. Tænd Bunsen brænder. Flamme hæmostat for sterilitet og lad afkøle.
  6. Med steril hæmostat overføres transwells til en 150 mm x 25 mm petriskål, og hold dem i omvendt position. Bemærk: Sørg for at bevare steriliteten af den tomme 24-brønds plade plus låg, der skal bruges til at huse transwells, når de er blevet seedet med epitelceller.
  7. 70 μl af 30 μg/ml kollagenopløsningen afpipetteres på filtermembranen for hver omvendt transwell. Bemærk: Overfladespændingen skal holde denne opløsningsvolumen på plads, da der ikke er vægge omkring filtermembranen, når du får adgang til overfladen af undersiden. Pas på, at kollagenopløsningen ikke drypper ned ad siden af transwellen og undgår at flytte transwells under belægningsproceduren.
  8. Lad låget af petriskålen være slukket i mindst 4 timer for at tillade ethanolopløsning at fordampe. For at opretholde sterilitet under denne proces skal hætteventilatoren og det ultraviolette lys være tændt.
  9. Når transwells er tørret, kan de bruges straks eller opbevares ved stuetemperatur i op til en uge, forudsat at Petri paraboldækslet er på plads, og steriliteten opretholdes.

2. Passage Kolbe af epitelceller til såning Transwells

(Denne protokol beskriver specifikt håndteringen af lungeepitelecellelinjen H292 til generering af epitelbarrierer dyrket på transwells. Andre epitelcellelinjer kan bruges med mindre ændringer.)

  1. Forbered kulturmediet ved at tilsætte 10% varmeinaktiveret føtalt kvægserum (HI-FBS) og 1x Penicillin/Streptomycin til RPMI 1640.
  2. Varme medier, trypsin-EDTA (T-EDTA) og D-PBS i 37 ºC vandbad.
  3. T-75 kolben, der indeholder celler fra inkubatoren, fjernes, og sammenløbet vurderes visuelt med omvendt mikroskop. Bemærk: Når der anvendes H292-celler, skal kolberne være tæt på eller helt sammenflydende.
  4. Aspirat medier fra kolbe. Reducer den tid, cellerne er tørre, ved at have næste opløsning i hætten med hætte løsnet.
  5. Der tilsættes 5 ml D-PBS til T-75 kolben og hvirvles. Undgå at skabe bobler. Fjern PBS ved aspiration.
  6. Der tilsættes 3 ml T-EDTA til T-75 kolben og hvirvles for at dække bunden.
  7. Det meste af T-EDTA fjernes, så der efterlades ca. 0,3 ml i T-75 kolbe.
  8. Den lille resterende mængde T-EDTA fordeles over cellernes overflade og placeres i en befugtet inkubator under normale dyrkningsforhold (37 ºC, 5% CO2).
  9. Efter en periode fjernes kolben fra inkubatoren. Bemærk: Cellerne skal let løsne sig fra kolbens overflade ved forsigtigt at trykke på kolben på siden. Celler skal nu afrundes og flydes, når de visualiseres under mikroskopet. Den gennemsnitlige tid dette vil tage for H292 celler er 5-10 min.
  10. Der tilsættes 10 ml dyrkningsmedie til kolben for at neutralisere T-EDTA og opbruge cellerne. Celleopløsningen skal tegnes i pipettespidsen og skubbes ud på overfladen af kolber, der indeholder celler, ca. fem gange for at genbruge alle celler.
  11. Resuspended celler overføres til et 15 ml rør til såning af transwells. Bemærk: Koncentrationen af resuspended H292-celler, der fremstilles på denne måde, skal ligge mellem ca. 1 x 106-1,8 x 106 celler/ml.

3. Såning kollagen belagt transwells med epitelceller

  1. Der tilsættes 70 μl genbrugt celleopløsning fra 15 ml røret til hver omvendt kollagenbelagt transwell. Bemærk: H292 celleopløsninger med et koncentrationsområde mellem 1 x 106-1,8 x 106 celler/ml giver ca. 70.000-120.000 celler/transwell.
  2. Celleaffjedringen blandes med forsigtigt at vende røret med jævne mellemrum for at forhindre celler i at slå sig ned i bunden af 15 ml røret, mens de sår transwells. Bemærk: Du må ikke hvirvle celler og være forsigtig med, at pipette spids ikke kommer i direkte kontakt med kollagen belagt membran filter.
  3. Når alle inverterede transwells er blevet seedet med epitelceller, skal petriskåldækslet udskiftes og placeres omhyggeligt i vævskulturinkubatoren, befugtet, 37 ºC, 5% CO2. Pas på at undgå at forstyrre den celleaffjedring, der er blevet tilføjet til den kollagenbelagte filtermembran.
  4. Vedligehold inverterede transwells i vævskulturens inkubator, befugtet, 37 ºC, 5% CO2 natten over. Bemærk: Boblen af væskeholdige celler skal forblive forbundet med transwellens gennemtrængelige filtermembran under hele nattens inkubation. Hvis filtermembranen bliver tør på grund af fordampning af væske, eller fordi væsken drypper ned ad siden af transwells, vokser epitellagene muligvis ikke korrekt.
  5. Den følgende dag tilsættes 1 ml medie i den originale sterile 24-brønds plade og vende hver omvendt transwell ved hjælp af en steriliseret hæmostat i hver brønd, der indeholder 1 ml medier.
  6. Der tilsættes 0,2 ml medier til det øverste kammer i hver transwell, og der returneres til vævskulturens inkubator, befugtet, 37   ºC, 5% CO2.
  7. H292 inverterede transwells kan bruges fra 8 dage op til 1 måned efter såning. Bemærk: Vi foreslår, at du venter mindst 8 dage efter såning af transwells for at sikre, at epitelmonometrene er fuldt dannede og udviser en funktionel barriere. Man kan teste H292 epitelbarrieren ved at afgøre, om monolaget er i stand til at begrænse trans-epitelfluxen af proteinheste radiseperoxidase (HRP) efter tilføjelse til basolateraloverfladen18.

4. Forberedelse af bakterier til infektion af epitellag på transwells

  1. En dag før eksperimentet, udtrække en koloni af P. aeruginosa PAO1 fra en Pseudomonas Isolation Agar plade og en koloni af K12 E. coli MC1000 fra en Luria-Bertani (LB) Agar plade og sted i separate rør, der indeholder 3 ml LB bouillon. ADVARSEL: P. aeruginosa er et menneskeligt patogen, standard BSL2 sikkerhedsforanstaltninger bør vedtages ved håndtering af denne organisme.
  2. Ryst natten over ved 225 omdrejninger i et 37 ºC miljø.
  3. Næste dag fjernes 1 ml fra de tætte bakteriekulturer og placeres i 1,5 ml Eppendorf-rør.
  4. Spin i mikrofuge ved 15.800 x g i 5 min og fjern derefter supernatant.
  5. Forbered Hanks' balancerede saltopløsning med calcium og magnesium (HBSS+) på forhånd. Der tilsættes 23,8 g HEPES- og 97,5 g HBSS+-pulver til 9,5 L destilleret vand. Der tilsættes små mængder på 10 M NaOH til opløsning, mens pH overvåges, indtil en stabil pH-kel på 7,4 er nået. Bring volumen op til 10 L og opbevar ved 4 ºC.
  6. Genbrugt hver bakteriel pellet med 1 ml HBSS +. Vortex for at være sikker på en jævn bakteriel suspension er opnået.
  7. Spin igen ved 15.800 x g i 5 min og fjern supernatant.
  8. PaO1-pelletpen blev genbrugt med 0,6 ml HBSS+ og MC1000 pellet med 0,5 ml HBSS+. Vortex de bakterielle suspensioner.
  9. Fortynd PAO1 og MC1000 genbrugte pellets yderligere 1:100 i HBSS+. For eksempel tilsættes 50 μl af den 0,6 ml PAO1 resuspended pellet til 5 ml HBSS+. Bemærk: Ved hjælp af optiske tæthedsmålinger (OD) til bestemmelse af dyrkningstæthed samt standardfortyndingsformningsenhed (CFU) fortyndingsmetode giver PAO1- og MC1000-opløsninger, der er fremstillet på denne måde, konsekvent mellem 3 x 107-6 x 107 CFU/ml. Tætheden af en bakteriekultur er positivt korreleret med OD-målingen af kulturen ved 600 nm, og denne korrelation kan bruges til at estimere bakteriecellekoncentrationen. For at bekræfte bakteriecellekoncentrationen kan kulturen fortyndes til en meget lav anslået koncentration og besudlet på en agarplade, så man kunne forvente, at mellem 30-200 bakterieceller ville være til stede på pladen. Cellerne spredes over pladen og inkuberes natten over ved 37 ºC, således at hver celle danner en individuel koloni af celler, der er store nok til at være synlige, og kolonier kan derefter tælles.

5. Isolation af neutrofiler fra fuldblod

  1. Syrecitratafxtroseopløsning (ACD) anvendes som antikoagulerende middel og fremstilles ved tilsætning af 6,9 g citronsyre, 12,5 g natriumcitrat og 10 g dextrose til 500 ml destilleret vand. Når alle komponenter er opløst, steriliseres ACD-opløsningen ved at passere gennem en 0,2 μm filterenhed. Acd-opløsningen opbevares ved 4 ºC.
  2. Før der trækkes blod, tilsættes 5 ml ACD til 50 ml sprøjte og fastgøres 21 x 3/4 G sommerfuglnål med 12 i slange.
  3. Påfør årepresse, tør venen med alkohol, og indsæt nål. Bemærk: Enhver forskningsprotokol, der involverer mennesker, skal godkendes af et institutionelt bedømmelsesudvalg, og der skal gives skriftligt informeret samtykke fra hver bloddonor. For eksempel blev eksperimenter udført ved hjælp af denne protokol godkendt af Massachusetts General Hospital Institutional Review Board og tildelt protokol #1999-P-007782.
  4. Træk langsomt 45 ml blod, der sikrer, at blodet blandes med ACD én gang i sprøjten.
  5. Når der er udtaget 45 ml (50 ml samlet volumen), skal årepressen løsnes, før nålen tages ud. Tryk straks på sår med steril gaze, når nålen fjernes.
  6. Overfør langsomt blod ned ad siden af et 50 ml rør over ca. 5-10 sek.
  7. Spin i centrifuge ved 1.000 x g med bremsen deaktiveret i 20 minutter ved stuetemperatur. Bemærk: Et yderligere trin, der involverer fortynding af fuldblod i PBS- og omhyggelig overlejring af fortyndet blod på Ficoll-Paque før centrifugering, kan anvendes til at opnå en lidt højere grad af neutrofil renhed ved mere effektivt at adskille buffy coat fra granulocytterne8. Udelade dette skridt tjener til at spare tid uden drastisk at påvirke udbytte eller renhed med henblik på denne analyse, og dermed går vi ind for ikke at medtage blod overlay på Ficoll-Paque skridt.
  8. Mens blodet drejer rundt, tilsættes der meget langsomt 1 g gelatine i 50 ml opvarmet Hanks' balancerede saltopløsning uden calcium og magnesium (HBSS(-)) for at forberede 2% gelatineopløsning. Opbevar opløsningen ved 37 ºC.
  9. Indsug og kassér plasma fra 50 ml blodrøret ved hjælp af en glaspipettespids, der er blevet behandlet med Sigmacote.
  10. Fortsæt med at aspirere meget omhyggeligt for at fjerne buffy frakken, som indeholder hvide blodlegemer, herunder lymfocytter.
  11. Da buffy pels langsomt fjernes, den hvidlige gule overskyet materiale over den røde blodlegeme (RBC) lag vil forsvinde. Stop aspiration, når buffy pels er fjernet, og RBC lag kan tydeligt visualiseres, når du ser fra over røret.
  12. Prøv ikke at forstyrre RBC lag som granulocytter, for det meste neutrofiler, er nær overfladen af RBC lag, men er ikke synlige.
  13. Til et volumen på 15 ml RBC lag tilsættes 30 ml varm 2% gelatineopløsning (2x volumen af RBC-laget).
  14. Inverter røret forsigtigt for at blande, idet man sørger for at minimere dannelsen af bobler.
  15. Inkuber ved 37   ºC i 25 min. Bemærk: RBC'er skal aggregere og afregne til bunden. Som et alternativ til gelatine kan der anvendes store molekylære vægtafxtrans til sediment RBC8.
  16. Efter inkubation overføres toplagslys rødlig opløsning, der indeholder granulocytter, til et nyt 50 ml rør med pipette, idet du skal passe på ikke at forstyrre det afregnede mørke RBC-lag under overførslen. Når det er adskilt, skal du kassere mørkt RBC-lag.
  17. Spin overført lys rødlig opløsning, der indeholder granulocytter og nogle RBC'er i centrifuge ved 1.000 x g med bremse aktiveret i 10 minutter ved stuetemperatur for at pelletceller.
  18. Hæld eller aspirere supernatant omhyggeligt, som den rødlige celle pellet, der vil danne efter centrifugation er generelt løs.
  19. Rbc lysis buffer fremstilles på forhånd, og der opbevares 4 ºC ved tilsætning af 8,29 g ammoniumchlorid (NH4Cl), 1 g natriumbicarbonat (NaHCO3) og 0,038 g EDTA til 1 L destilleret vand i et bægerglas. Der skal gemmes RBC lysis-buffer ved 4 ºC.
  20. Resuspend og bryde op rødlig celle pellet med en lille mængde af kolde RBC lysis buffer. Når cellepillen er i opløsning, fyldes røret til 50 ml med RBC lysis buffer. Bemærk: På dette tidspunkt og fremadrettet skal cellerne holdes på is eller ved 4 ºC.
  21. Spin i centrifuge ved 300 x g i 10 min ved 4   ºC og hæld derefter supernatanten af eller aspirat. Bemærk: Supernatanten vil være noget rødlig indeholdende lysede RBC'er. Pellet skal være gullig hvid på dette punkt. Hvis der forbliver betydelige RBC'er i pellet som angivet med en rødlig pellet, kan trin 5.20-5.21 gentages. Der forbliver betydelige RBC'er i cellepillen, hvis den rødlige pellet fra trin 5.20 ikke er brudt tilstrækkeligt op.
  22. Opsuspen og bryde op hvidlig pellet med et lille volumen af HBSS (-) og derefter fylde røret til 50 ml med HBSS (-). Bemærk: HBSS(-) og ikke HBSS+ bør anvendes til at genbruge den hvidlige cellepille. HBSS(-) mangler calcium og magnesium.
  23. Spin igen i centrifuge ved 300 x g i 10 min ved 4   ºC.
  24. Supernatant hældes af, og pelletpenussususesus til et slutvolumen på 1 ml HBSS(-).
  25. Der tilsættes 5 μl af 1 ml celleophæng til 250 μl HBSS(-) i et 1,5 ml Eppendorf-rør og blandes forsigtigt op og ned med pipette.
  26. Der tilsættes 25 μl fortyndet celleaffjedring til 25 μl 0,4% Trypan blå.
  27. Der tilsættes 12 μl blanding til hver side af et standard hæmocytometer.
  28. Tæl antallet af levende celler, der har udelukket Trypan blå farvestof og er til stede i den midterste firkant på begge sider af hæmometeret.
  29. For at beregne cellekoncentrationen skal du gange gennemsnittet af de 2 kvadrater med 100 (fortyndingsfaktor) og derefter gange med 104 for at give antallet af celler/ml.
  30. Den endelige koncentration justeres til 5 x 107 celler/ml. Hvis den er større end 5 x 107 celler/ml, justeres ved at tilføje HBSS(-). Hvis mindre, pellet cellerne og genbruges til passende volumen.
  31. Hold cellerne på is, indtil de er klar til migrationsanalyse. Bemærk: Disse celler repræsenterer granulocytpopulationen af hvide blodlegemer. Størstedelen af de granulocytter isoleret fra fuldblod er neutrofiler. Celler holdes på is suspenderet i HBSS (-) indtil ud over migration assay for at opretholde celler i en hvilende tilstand.

6. Forberedelse af epitelcellelag til migrationsanalyse

(Dissetrin behøver ikke at blive udført inden for en steril hætte.)

  1. Fjern fra inkubator 24-brønd plade støtte epitel lag, der er blevet dyrket på undersiden af transwell filter membraner i mindst otte dage.
  2. Tag fat i kanten af hver transwell med en hæmostat, løft ud af 24-brøndspladen og vend transwellen over en affaldsspand for at kassere kulturmedier fra transwellens indre kammer. Dyp hver transwell i et vaskebæger, der indeholder HBSS+ for at fylde transwellens indre kammer med HBSS+. Kassér væske fra inderkammeret i en affaldsspand.
  3. Gentag trin 6.2 for en anden vask i HBSS+. Efter to vaske skal transwells placeres i en ny 24-brønds plade, der indeholder 1 ml HBSS+ i hver brønd. Bemærk: Alle vaske skal udføres med HBSS+, der opvarmes til 37 ºC.
  4. Overhold det øverste kammer i hver transwell for at vurdere epitelcellelags integritet. Bemærk: HBSS+ må ikke lække ind i og fylde transwellens øverste kammer, når det placeres i brønden på en 24-brønds plade, der indeholder 1 ml HBSS+.
  5. Efter nøje observation af hver transwell tilsættes 0,2 ml HBSS+ i øverste kammer.
  6. Placer i inkubator ved 37   ºC, 5% CO2 i et befugtet kammer i 30-60 minutter for at ekvilibrere epitelcellelag.

7. Neutrofil Trans-epitel Migration Assay

  1. Fjern fra inkubator 24-brønds plade af vaskede transwells ekvilibrerende i HBSS+.
  2. Tag fat i hver transwell med en hæmostat og kassér væske i toppen godt ind i en affaldsspand.
  3. Placer hver transwell på hovedet i en 150 mm x 25 mm petriskål.
  4. Til seks af de omvendte Transwells tilsættes 25 μl HBSS+. Til tre af de omvendte transwells inficeres med 25 μl P. aeruginosa (PAO1) fortyndet i HBSS+, tilberedt som beskrevet i trin 4. Til de sidste tre inverterede transwells skal der inficeres med 25 μl E. coli K12 (MC1000) fortyndet i HBSS+, tilberedt som beskrevet i trin 4. Dette er ca. 0,8 x 106-1,5 x 106 CFU/epitellag for hver bakterieart, da koncentrationen af bakterieopløsningerne i trin 4 er ca. 3 x 107-6 x 107 CFU/ml.
  5. Inkuber ved 37   ºC, 5% CO2 i et befugtet kammer i 60 min.
  6. FMLP fremstilles som en positiv kontrol for neutrofil migration ved at tilsætte 5 μl 10 mM fMLP-bestand til 5 ml HBSS+, hvilket giver en 10 μM opløsning.
  7. Vask transwells ved at gribe med en hæmostat og vende tilbage over i en 24-godt vaskeplade, der indeholder 1 ml HBSS + i de nederste kamre. Der tilsættes 0,2 ml HBSS+ til de øverste kamre.
  8. Tag fat i transwell med en hæmostat og fjern fra den første vaskeplade. Før transwells anbringes i en anden 24-brønds vaskeplade, der indeholder 1 ml HBSS+, kasseres væske fra øverste kammer i en affaldsspand. Der tilsættes 0,2 ml HBSS+ til det øverste kammer.
  9. Gentag trin 7.8 en gang mere for i alt 3 vasker. Bemærk: Alle transwells bør udsættes for samme håndterings- og vaskeregime, uanset om de er inficeret med bakterier eller ej, for at sikre, at alle transwells, der analyseres, er blevet manipuleret på samme måde. En 60 min infektion med enten PAO1 eller MC1000 reducerer ikke levedygtigheden eller ændrer barriereegenskaberne for H292 monolayer som vurderet ved en laktat dehydrogenase baseret toksikologi assay og HRP flux assay, henholdsvis18,22.
  10. Forbered 24-brønds trækplade ved at tilsætte 1 ml HBSS+ i 12 brønde på 24-brøndspladen. Bemærk: Denne plade kan tilberedes på forhånd.
  11. Efter den tredje vask kasseres væske fra de øverste kamre af transwells i en affaldsspand ved hjælp af en hæmostat, og tre af de uinficerede transwells anbringes i tre brønde på den 24-brønds migrationsplade, der indeholder 1 ml HBSS+, hvilket repræsenterer den negative kontrol.
  12. 10 μl af en 10 μM opløsning fMLP til hver af tre brønde på 24-brønds migrationspladen, der indeholder 1 ml HBSS+ (100 nM).
  13. Placer tre af de uinficerede transwells i tre brønde af 24-brønds migrationspladen, der indeholder 100 nM fMLP, hvilket repræsenterer en positiv kontrol for isolerede neutrofilers evne til at migrere.
  14. Tre transwells, der er inficeret med PAO1, og tre transwells, der er inficeret med MC1000, anbringes i tre brønde hver af den 24-brønds migrationsplade, der indeholder 1 ml HBSS+. Der tilsættes 0,1 ml HBSS+ til det øverste kammer i hver transwell.
  15. Ud over de 0,1 ml HBSS+ i hver transwell tilsættes forsigtigt 20 μl af neutrofilaffedringen (5 x 107 celler/ml), der er tilberedt som beskrevet i trin 5. Bemærk: Dette repræsenterer ca. 1 x 106 neutrofiler/transwell.
  16. Inkuber ved 37 ºC, 5% CO2 i et befugtet kammer i 2 timer for at tillade trans-epitelmigration af neutrofiler.
  17. Forbered en standardkurve til bestemmelse af antallet af neutrofiler, der er migreret efter 2 timer. Neutrofilsuspensionen (5 x 10 7 celler/ml) tilsættes 40 μl af neutrofilsuspensionen (5 x10 7 celler/ml) til 2 ml HBSS(+) og der udføres serielle 2 gange yderligere fortyndinger for i alt 10 standarder fra ca. 2.000 celler/ml til 1 x 106 celler/ml. Der medtag 1 ml HBSS(+) for tom.
  18. Efter 2 timers migration skal du løfte transwells ved at gribe med en hæmostat og trykke forsigtigt mod indersiden af 24-brønds migrationspladen. Kassér transwells.
  19. Vurder migrationen af neutrofiler groft i brøndene ved at se brønde på 24-brønds migrationspladen under et omvendt mikroskop ved hjælp af 10X-målet (se figur 1 for billeder af migrerede neutrofiler i hver tilstand).
  20. Der tilsættes 50 μl på 10% triton X-100 til hver brønd, der bruges i 24-brønds migreringspladen, hver standard og den tomme.
  21. Drej 24-brønds migrationspladen, standarderne og blank ved lav hastighed i 20 minutter ved 4   ºC.
  22. Forbered 1 M citrat buffer på forhånd. Der tilsættes 52,5 g citronsyre og 73,5 g natriumcitrat til 400 ml destilleret vand i et bægerglas. Bring pH til 4,2. Der tilsættes destilleret vand til slutopløsning på 500 ml. Opbevar opløsning ved 4 ºC.
  23. Forbered ABTS substratopløsning frisk den dag. Der tilsættes 3 ABTS-tabletter (10 mg hver) og 5 ml 1 M citratbuffer til 45 ml destilleret vand. Lad tabletterne opløses fuldstændigt i opløsning. Tilsætning af 50 μl hydrogenperoxid på 50 μl tilbageholdes, indtil der er behov for ABTS-substratopløsningen (se trin 7.27).
  24. Der tilsættes 50 μl citratbuffer til hver brønd, der anvendes i 24-brønds migreringspladen, hver standard og den tomme.
  25. 100 μl af hver prøve overføres godt i to eksemplarer til en 96-brøndsplade. Bemærk: Det er meget vigtigt at blande indholdet grundigt i hver prøve godt, før du går over til 96-brøndspladen. Opløsningen pipetters op og ned mindst fem gange før overførsel.
  26. 100 μl af hver standard overføres og emnerne til 96-brøndspladen efter blanding (blindprøve i to eksemplarer).
  27. Der tilsættes 50 μl 30% hydrogenperoxid til ABTS-opløsningen og hvirvelstrømmen.
  28. Der tilsættes 100 μl ABTS-substratopløsning til hver prøve på 96-brøndspladen.
  29. Lad pladen udvikle sig i 5-10 minutter i mørke. Bemærk: En grøn farve skal udvikle sig i visse brønde, der korrelerer med antallet af neutrofiler, der er til stede i hver brønd.
  30. Læs ved bølgelængde på 405 nm ved hjælp af en mikropladelæser.
  31. Antallet af neutrofiler, der er migreret over epitellaget ved hjælp af de standarder, hvor der er en lineær positiv korrelation mellem de kendte antal neutrofiler, der er fremstillet som standarder, og mængden af peroxidaseaktivitet målt ved optisk massefylde ved 405 nm (Se figur 2 og 3 for repræsentative data). Bemærk: Denne metode til neutrofil kvantificering drager fordel af den store mængde peroxidaseaktivitet, der udvises af neutrofiler på grund af myeloperoxidaseudtryk. Alternative metoder til at kvantificere neutrofiler kan overvejes, såsom metoder, der involverer prælabeling af neutrofiler med radioaktivitet eller fluorescensforbindelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Flere undersøgelser har vist, at patogeninficerede epitellag letter neutrofil trans-epitelmigration3,8,19,24-28,31,32. Dette sker via en patogenspecifik induktion af en epitelcelleafledt neutrofil kemotaktisk gradient3,23. For eksempel forårsager patogen P. aeruginosa, der interagerer med lungeepitelecellernes apikale overflade, et betydeligt antal neutrofiler til at migrere over epitellaget18,22,25,26,33,34. Dette klinisk relevante analysesystem kan manipuleres på mange måder for at afsløre nøglepatogen og værtsmolekylære bidragydere, når det kombineres med passende kontroller.

Neutrofiler føjet til polariserede epitelcellelag, der ikke er blevet præinficeret, migrerer ikke over i betydelige tal. Anvendelse af en kemo-tiltrækkende gradient på tværs af et upåvirket epitellag vil imidlertid drive et betydeligt antal neutrofiler over. Det er vigtigt at medtage både disse negative og positive kontroller inden for hver analyse, når man undersøger neutrofil migration på tværs af patogeninficerede epitellag. Den negative kontrol fastslår baggrundsantallet af neutrofiler, der krydser epitellaget uden signal. Dette tal skal være meget lavt, når dyrkede epitelceller har etableret en funktionel barriere. Høj baggrundsmigration komplicerer fortolkningen af resultater opnået med patogeninficeret epitel. Den positive kontrol indebærer anvendelse af en gradient af et neutrofilt kemo-tiltrækningsmiddel som fMLP på tværs af epitellaget og tjener til at bekræfte, at de isolerede neutrofiler er funktionelle. I tilfælde af, at epitellag forbehandles med visse reagenser for at vurdere deres indvirkning på patogeninduceret transepitele migration, tjener fMLP-gradienten desuden til at kontrollere for eventuelle virkninger, som reagenset måtte have på neutrofilernes evne til at navigere i epitellaget uanset patogenmedierede virkninger. En yderligere kontrol, der ofte anvendes inden for dette analysesystem, indebærer infektion af epitellag med ikke-patogene bakterier parallelt med patogen. Denne kontrol kan udnyttes til at skelne mellem relevante epitelresponser efter interaktion med bakterier samt hjælpe med at identificere patogene faktorer, der er nødvendige for at stimulere neutrofil trans-epitelmigration.

Neutrofil trans-epitelmigration kan vurderes både kvalitativt og kvantitativt. Ved afslutningen af 2 timers inkubation efter tilsætning af neutrofiler til basolateraloverfladen fjernes transwells, og neutrofiler, der er migreret fuldt ud over epitellaget til det apikale kammer, kan ses i bunden af 24-brønds migrationspladen. Et repræsentativt billede af hver betingelse vises i Figur 1, visualiseret ved hjælp af et omvendt lysmikroskop. Meget få neutrofiler blev observeret for at migrere over et ikke-inficeret epitellag uden en påtvunget kemotaktisk gradient (HBSS+) og repræsenterer baggrundsniveauer i analysen (Figur 1A). I modsætning hertil var der en overflod af transmigrerede neutrofiler tydelig, når der blev angivet en fMLP-gradient (figur 1B). Infektion i epitelet med nonpathogenic E. coli MC1000 resulterede i få synlige transmigrerede neutrofiler, mens mange transmigrerede neutrofiler var observerbare, når epitellag blev inficeret med lungepatogen P. aeruginosa (PAO1) (Figur 1C og 1D).

De neutrofiler, der er migreret i eksperimentet, kvantificeres ved at måle deres myeloperoxidaseaktivitet. En standardkurve anvendes til at muliggøre et skøn over antallet af transmigrerede neutrofiler. Antallet af neutrofiler korrelerer positivt med mængden af peroxidaseaktivitet målt efter lysis af neutrofiler med værdier, der udviser et lineært forhold i det interval af neutrofile tal, der er valgt til standardkurven (2 x 103-1 x 106 celler/ml) (figur 2). Et betydeligt antal neutrofiler migrerer på tværs af epitellag som reaktion på en forudsat fMLP-gradient eller som reaktion på et epitellag inficeret med PAO1 (figur 3). Antallet af neutrofiler, der migrerer i mangel af stimuli (HBSS+) eller efter apiktisk epitelinfektion med nonpathogenic E. coli MC1000, ligger under detektionsgrænsen for analysen (figur 3). Data i figur 3 repræsenterer det gennemsnitlige antal transmigrerede neutrofiler med fejllinjer, der repræsenterer standardafvigelsen for tre uafhængige brønde/tilstand. Kvantitative data, der er afbildet i figur 3 , stemmer overens med repræsentative brøndbilleder , der vises i figur 1.

Figure 1
Figur 1. Billede af neutrofiler efter trans-epitelmigration. Billeder blev set med et omvendt lysmikroskop ved 10X forstørrelse af bundbrønden (apikalt kammer) af 24-brønds migrationspladen efter 2 timers inkubationstid med neutrofiler føjet til toppen godt (basolateralkammer). (A) Negativ kontrol HBSS+. (B) Positiv kontrol pålagt fMLP kemotaktisk gradient. (C) Epitelcellelag inficeret med ikke-patiske E. coli K12 (MC1000). D) Epitelcellelag inficeret med patogen P. aeruginosa (PAO1). Klik her for at se større billede.

Figure 2
Figur 2. Neutrofiler ved en udgangskoncentration på 1 x 106 blev udsat for ni 2-dobbelte fortyndinger. Efter lysis blev mængden af peroxidaseaktivitet bestemt, og antallet af neutrofiler blev graferet på x-aksen med peroxidaseaktivitet på y-aksen. Den afbildede ligning kan bruges til at bestemme antallet af neutrofiler, der er til stede i hver brønd efter transmigration baseret på mængden af peroxidaseaktivitet målt i hver brønd. Klik her for at se større billede.

Figure 3
Figur 3. Kvantificering af transmigrerede neutrofiler. Antallet af transmigrerede neutrofiler kvantificeres ved relativ myeloperoxidaseaktivitet til en lineær standardkurve af kendte antal neutrofiler. Der blev observeret et betydeligt antal transmigrerede neutrofiler efter epitelcelleinfektion med patogen P. aeruginosa (PAO1) eller etablering af en apikale basolaterale gradient af neutrofil kemo-tiltrækkende fMLP. Der blev observeret et ikke målbart antal transmigrerede neutrofiler efter epitelcelleinfektion med nonpathogenic E. coli K12 (MC1000) behandling eller negativ kontrolbuffer (HBSS+). Klik her for at se større billede.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Neutrofil migration på tværs af slimhinde epiteloverflader er et almindeligt træk i sygdomspatologi efter infektion med bakterielle patogener3. Den metode, der er beskrevet heri, tilbyder en hurtig, ligetil tilgang til eksperimentelt at isolere denne diskrete begivenhed ved hjælp af en menneskelig celle afledt in vitro coculture assay system, der modellerer et træk ved den inflammatoriske proces udløst af bakterielle infektioner. Dette system blev oprindeligt udviklet ved hjælp af polariserede tarmepitele celler inficeret med enteriske patogener, herunder Salmonella typhimurium, Shigella flexneri, og forskellige patogene E. coli8,19,24,27,28. Hver af disse patogene organismer er i stand til at drive neutrofiler på tværs af polariserede tarm epitelmonomerer dyrket på inverterede kollagenbelagte gennemtrængelige transwellfiltre. Dette forsøgssystem er blevet tilpasset med modifikationer for at udforske lungeepitele barrierer og patogen induceret neutrofil trans-epitelmigration18,26. Flere luftveje epitelcellelinjer bortset fra H292 er blevet brugt til disse undersøgelser, herunder almindeligt citerede A549, BEAS-2B og Calu-3 lunge epitelcellelinjer22,26. P. aeruginosa anstifter betændelse i lungerne og forårsager betydelig skade, der karakteriserer sygdomme som akut lungebetændelse og cystisk fibrose35,36. Som beskrevet fremkalder lungepatogenet P. aeruginosa let neutrofil trans-epitelmigration ved infektion af lungeepitele celler, et bemærkelsesværdigt træk ved den inflammatoriske proces observeret i lungebetændelse og cystisk fibrose. Desuden er flere yderligere stammer af P. aeruginosa, herunder kliniske isolater fra cystisk fibrose patienter blevet valideret som inducere i denne analyse25. Streptococcus pneumoniae og Klebsiella pneumoniae, Gram-positive og Gram-negative bakterielle patogener, henholdsvis, er almindeligt forbundet med lungebetændelse og har vist sig at være i stand til at fremkalde neutrofil trans-epitel migration ved hjælp af in vitro coculture model26,32. Således tilbyder dette modelsystem en robust in vitro-tilgang ved hjælp af humane afledte celler til at udforske inflammatoriske processer iværksat af slimhindepatogener.

Standardvævskulturbaserede modeller, der ofte bruges til at udforske interaktioner mellem værtspatogener, anvender generelt epitelceller , der dyrkes på flade plastoverflader16. In vitro coculture assay tilbyder en større grad af kompleksitet, der giver alsidighed i eksperimentelt design16,37,38. Polariserede epitelceller dyrket på undersiden af gennemtrængelige transwell filtre skaber en apical rum, der vender mod bunden kammeret, når de placeres i en 24-brønd plade og en basolateral rum, der vender indersiden toppen godt af transwell14,17. Denne diskrete opdeling og retningsbestemte orientering gør det muligt at analysere fysiologisk basolateral til apiktisk migration af neutrofiler som reaktion på påtvungne eller epitelcellegenererede kemotaktiske gradienter14,17,23. In vitro-cokultursystemet gør det muligt at undersøge specifikke molekylære mekanismer, der kan henføres til trans-epitelmigration, hvilket kan være vanskeligt at løse i det komplekse miljø af en in vivo-model for lungeinfektion1,15. Ethvert fund vedrørende identificering af nøglefaktorer, der er involveret i neutrofil trans-epitelmigration ved hjælp af in vitro-cokulturmodellen , kan efterfølgende valideres for relevans ved hjælp af in vivo-modeller med akut lungebetændelse15,22.

In vitro coculture assay kan manipuleres på mange måder at studere en række fænomener. Undersøgelser med fokus på bakterielle gener, der bidrager til neutrofil rekruttering, kan udføres ved at analysere tilgængelige mutantbiblioteker for specifikke patogener af interesse25,39,40. Gener, der afsløres ved en sådan analyse, kan repræsentere nye virulensfaktorer og potentielle terapeutiske mål for antiinfektiøse stoffer. Den neutrofile kan også repræsentere fokus for analyse. For eksempel anvender neutrofiler flere celleoverflade vedhæftningsmolekyler for at lette trans-epitelmigration5,14,34,41,42. Nøglecelle-til-celle-interaktioner kan variere afhængigt af kemo-tiltrækkende drivende migration og det væv, som neutrofilerne interagerer med34. Neutrofiler kan forbehandles med hæmmere, antistoffer eller antagonister, inden de vurderer patogeninduceret trans-epitelmigration for at identificere overflademolekyler eller signalveje, der er kritiske for denne proces22,34. Epitelceller spiller en afgørende rolle under infektion og betændelse ved at fornemme signaler og kommunikere med immunceller gennem opløselige mæglere43. Signalveje, polariseret sekretion af kemo-tiltrækningsmidler og epiteloverflade vedhæftningsmolekyler, der interagerer med enten bakterier eller neutrofiler, der påvirker patogeninduceret neutrofil trans-epitelmigration, kan alle undersøges ved hjælp af in vitro-cokulturanalysen. Anvendelsen af denne coculture model afslørede betydningen af en tidligere ikke-fortærsket lipid eicosanoid kemo-tiltrækkende kendt som hepoxilin A33,18,21. Hepoxilin A3 produceres af både lunge- og tarmepitele celler som reaktion på infektion med specifikke patogener og er ansvarlig for at drive neutrofiler over det polariserede epitelmonolag fra basolateralen til den inficerede apikale side3. Således in vitro coculture assay fungerer som en robust sonderende værktøj med potentiale til at identificere kritiske mekanismer, der mægle vært-patogen interaktioner og orkestrere inflammation. Desuden har dette modelsystem potentiale til at blive tilpasset som en høj gennemstrømning screening tilgang til at vurdere effektiviteten af selektive anti-infektiøse eller anti-inflammatoriske behandlingsstoffer.

I opsummering giver vi en detaljeret trin-for-trin-protokol til undersøgelse af migration af neutrofiler på tværs af et monolag af patogeninficerede lungeepitele cellelag dyrket på gennemtrængelige transwellfiltre. Teknikker, der er beskrevet heri, kan ændres for at studere neutrofil migration på tværs af andre slimhindeoverflader, hvor neutrofiler infiltrerer i sygdomstilstande som mave-tarmkanalen eller genitourinære tarmkanalen. Desuden er indsigter opnået ved hjælp af in vitro-cokulturanalysesystemet sandsynligvis relevante for en lang række inflammatoriske sygdomme, der ikke drives af specifikke infektiøse stoffer. Inflammatoriske sygdomme i slimhindeoverfladerne, der indeholder neutrofiler, der krydser den beskyttende epitelbarriere til en patologisk grad, omfatter KOL, ARDS, astma og IBD5,10-12. En dybere forståelse af de molekylære mekanismer, der styrer neutrofil trans-epitel migration vil sandsynligvis informere terapeutiske strategier rettet mod at lindre destruktive inflammatoriske processer i forbindelse med disse fælles lidelser, hvilket giver nye muligheder for at forbedre menneskers sundhed.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet økonomisk af NIH (1 R01 AI095338-01A1).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NCl-H292 cells ATCC CRL-1848
RPMI-1640 medium ATCC 30-2001
Pseudomonas aeruginosa PAO1 ATCC #47085
Escherichia coli MC1000 ATCC #39531
D-PBS (1x) liquid Invitrogen 14190-144 without calcium and magnesium
Heat Inactivated Fetal bovine serum Invitrogen 10082-147 10% added to culture medium
Penicillin-Streptomycin Invitrogen 15140-122 100x: 10,000 units of penicillin and 10,000 µg of streptomycin per ml.
Trypsin-EDTA (0.05%) Invitrogen 25300-062 50 ml aliquots are stored frozen at -20 ºC.  Aliquot in use can be stored at 4 ºC short-term.  
Hank's Balanced Salt Solution - HBSS(-) Invitrogen 14175-079 Sterile, without calcium and magnesium
Trypan Blue Solution Invitrogen 15250-061. Stock = 0.4%
Collagen, Rat Tail Invitrogen A10483-01 Can also be isolated in the laboratory directly from the tails of rats using standard protocols
Citric acid Sigma-Aldrich C1909-500G Component of 1 M citrate buffer and acid citrate dextrose (ACD) solution
Sodium Citrate Sigma-Aldrich S4641-500G Component of 1 M citrate buffer
Dextrose anhydrous Sigma-Aldrich D8066-250G Component of acid citrate dextrose (ACD) solution
Ammonium Chloride Sigma-Aldrich 213330-500G Component of red blood cell (RBC) lysis buffer
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S6014-500G Component of red blood cell (RBC) lysis buffer
EDTA Sigma-Aldrich ED-100G Component of red blood cell (RBC) lysis buffer
HBSS(+) powder Sigma-Aldrich H1387-10L Key component of HBSS+
HEPES Sigma-Aldrich H3375-500G Component of HBSS+
Sigmacote Sigma-Aldrich SL2-25ML Follow vendor instructions to coat glass pipette tips
Triton X-100 Sigma-Aldrich T-9284
2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt (ABTS) Sigma-Aldrich A9941-50TAB Key component of ABTS substrate solution
30% Hydrogen Peroxide Solution Sigma-Aldrich H1009-100ML Component of ABTS substrate solution
N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP or fMLF) Sigma-Aldrich F-3506 A Stock solution of 10 mM in DMSO should be prepared and aliquots stored at -20 ºC.
Gelatin Type B Fisher Scientific M-12026
Pseudomonas isolation agar  Fisher Scientific DF0927-17-1 Follow manufacturer’s instructions to make PIA plates
Ficoll-Paque PLUS  Fisher Scientific 45-001-749 Optional, can improve neutrophil purity
24-well migration plate Corning Incorporated #3524
24-well wash plate Falcon 35-1147 Can be reused if soaked in 70% ethanol and washed thoroughly prior to reuse
96-well plate Fisher Scientific #12565501
Transwell Permeable Supports  Corning Incorporated #3415 Polycarbonate; Diameter: 6.5 mm; Growth area: 0.33 cm2; Dish style: 24-well plate; Pore size: 3.0 µm
Petri dish Falcon 35-1013 Each Petri dish holds 24 inverted 0.33 cm2 Transwells.  
500 ml 0.2 μm filter / flask Fisher Scientific 09-740-25A To sterilize acid citrate dextrose (ACD) solution
5-3/4 in glass Pasteur pipette Fisher Scientific 13-678-20A Coat tips with Sigmacote prior to use
Hemostat Fisher Scientific 13-812-14 Curved, Serrated
Invertoskop Inverted Microscope Zeiss #342222
Versa-Max Microplate Reader Molecular Devices #432789

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Burns, A. R., Smith, C. W., Walker, D. C. Unique structural features that influence neutrophil emigration into the lung. Physiol. Rev. 83, 309-336 (2003).
  2. Hurley, B. P., McCormick, B. A. Intestinal epithelial defense systems protect against bacterial threats. Curr. Gastroenterol. Rep. 6, 355-361 (2004).
  3. McCormick, B. A. Bacterial-induced hepoxilin A3 secretion as a pro-inflammatory mediator. FEBS J. 274, 3513-3518 (2007).
  4. Mumy, K. L., McCormick, B. A. The role of neutrophils in the event of intestinal inflammation. Curr. Opin. Pharmacol. 9, 697-701 (2009).
  5. Chin, A. C., Parkos, C. A. Pathobiology of neutrophil transepithelial migration: implications in mediating epithelial injury. Annu. Rev. Pathol. 2, 111-143 (2007).
  6. Segel, G. B., Halterman, M. W., Lichtman, M. A. The paradox of the neutrophil's role in tissue injury. J. Leukoc. Biol. 89, 359-372 (2011).
  7. Weiss, S. J. Tissue destruction by neutrophils. N. Engl. J. Med. 320, 365-376 (1989).
  8. Hurley, B. P., Thorpe, C. M., Acheson, D. W. Shiga toxin translocation across intestinal epithelial cells is enhanced by neutrophil transmigration. Infect. Immun. 69, 6148-6155 (2001).
  9. Kohler, H., et al. Salmonella enterica serovar Typhimurium regulates intercellular junction proteins and facilitates transepithelial neutrophil and bacterial passage. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 293, 178-187 (2007).
  10. Gane, J., Stockley, R. Mechanisms of neutrophil transmigration across the vascular endothelium in COPD. Thorax. 67, 553-561 (2012).
  11. Grommes, J., Soehnlein, O. Contribution of neutrophils to acute lung injury. Mol. Med. 17, 293-307 (2011).
  12. Nakagome, K., Matsushita, S., Nagata, M. Neutrophilic inflammation in severe asthma. Int. Arch. Allergy Immunol.. 158 Suppl 1, 96-102 (2012).
  13. Choi, E. Y., Santoso, S., Chavakis, T. Mechanisms of neutrophil transendothelial migration. Front. Biosci. 14, 1596-1605 (2009).
  14. Louis, N. A., Campbell, E., Colgan, S. P. Model systems to investigate neutrophil adhesion and chemotaxis. Methods Mol. Biol. 412, 257-270 (2007).
  15. Craig, A., Mai, J., Cai, S., Jeyaseelan, S. Neutrophil recruitment to the lungs during bacterial pneumonia. Infect. Immun. 77, 568-575 (2009).
  16. Hurley, B. P., McCormick, B. A. Translating tissue culture results into animal models: the case of Salmonella typhimurium. Trends Microbiol. 11, 562-569 (2003).
  17. Lee, W. Y., Chin, A. C., Voss, S., Parkos, C. A. In vitro neutrophil transepithelial migration. Methods Mol. Biol. 341, 205-215 (2006).
  18. Hurley, B. P., Siccardi, D., Mrsny, R. J., McCormick, B. A. Polymorphonuclear cell transmigration induced by Pseudomonas aeruginosa requires the eicosanoid hepoxilin A3. J. Immunol. 173, 5712-5720 (2004).
  19. McCormick, B. A., Colgan, S. P., Delp-Archer, C., Miller, S. I., Madara, J. L. Salmonella typhimurium attachment to human intestinal epithelial monolayers: transcellular signalling to subepithelial neutrophils. J. Cell Biol. 123, 895-907 (1993).
  20. McCormick, B. A., et al. Surface attachment of Salmonella typhimurium to intestinal epithelia imprints the subepithelial matrix with gradients chemotactic for neutrophils. J. Cell Biol. 131, 1599-1608 (1995).
  21. Mrsny, R. J., et al. Identification of hepoxilin A3 in inflammatory events: a required role in neutrophil migration across intestinal epithelia. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 7421-7426 (2004).
  22. Tamang, D. L., et al. Hepoxilin A(3) facilitates neutrophilic breach of lipoxygenase-expressing airway epithelial barriers. J. Immunol. 189, 4960-4969 (2012).
  23. McCormick, B. A., Parkos, C. A., Colgan, S. P., Carnes, D. K., Madara, J. L. Apical secretion of a pathogen-elicited epithelial chemoattractant activity in response to surface colonization of intestinal epithelia by Salmonella typhimurium. J. Immunol. 160, 455-466 (1998).
  24. Boll, E. J., et al. Enteroaggregative Escherichia coli promotes transepithelial migration of neutrophils through a conserved 12-lipoxygenase pathway. Cell Microbiol. 14, 120-132 (2012).
  25. Hurley, B. P., et al. The two-component sensor response regulator RoxS/RoxR plays a role in Pseudomonas aeruginosa interactions with airway epithelial cells. Microbes Infect. 12, 190-198 (2010).
  26. Hurley, B. P., Williams, N. L., McCormick, B. A. Involvement of phospholipase A2 in Pseudomonas aeruginosa-mediated PMN transepithelial migration. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 290, L703-L709 (2006).
  27. McCormick, B. A., Siber, A. M., Maurelli, A. T. Requirement of the Shigella flexneri virulence plasmid in the ability to induce trafficking of neutrophils across polarized monolayers of the intestinal epithelium. Infect. Immun. 66, 4237-4243 (1998).
  28. Savkovic, S. D., Koutsouris, A., Hecht, G. Attachment of a noninvasive enteric pathogen, enteropathogenic Escherichia coli, to cultured human intestinal epithelial monolayers induces transmigration of neutrophils. Infect. Immun. 64, 4480-4487 (1996).
  29. Agbor, T. A., Demma, Z. C., Mumy, K. L., Bien, J. D., McCormick, B. A. The ERM protein, ezrin, regulates neutrophil transmigration by modulating the apical localization of MRP2 in response to the SipA effector protein during Salmonella typhimurium infection. Cell Microbiol. 13, 2007-2021 (2011).
  30. Pazos, M., et al. Multidrug resistance-associated transporter 2 regulates mucosal inflammation by facilitating the synthesis of hepoxilin A3. J. Immunol. 181, 8044-8052 (2008).
  31. Agace, W. W., Patarroyo, M., Svensson, M., Carlemalm, E., Svanborg, C. Escherichia coli induces transuroepithelial neutrophil migration by an intercellular adhesion molecule-1-dependent mechanism. Infect. Immun. 63, 4054-4062 (1995).
  32. Bhowmick, R., et al. Systemic Disease during Streptococcus pneumoniae Acute Lung Infection Requires 12-Lipoxygenase-Dependent Inflammation. J. Immunol. , (2013).
  33. Hurley, B. P., Pirzai, W., Mumy, K. L., Gronert, K., McCormick, B. A. Selective eicosanoid-generating capacity of cytoplasmic phospholipase A2 in Pseudomonas aeruginosa-infected epithelial cells. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 300, 286-294 (2011).
  34. Hurley, B. P., Sin, A., McCormick, B. A. Adhesion molecules involved in hepoxilin A3-mediated neutrophil transepithelial migration. Clin. Exp. Immunol. 151, 297-305 (2008).
  35. Frank, D. W. Research Topic on Pseudomonas aeruginosa, Biology, Genetics, and Host-Pathogen Interactions. Front. Microbiol. 3, 20 (2012).
  36. Lyczak, J. B., Cannon, C. L., Pier, G. B. Lung infections associated with cystic fibrosis. Clin. Microbiol. Rev. 15, 194-222 (2002).
  37. Bucior, I., Mostov, K., Engel, J. N. Pseudomonas aeruginosa-mediated damage requires distinct receptors at the apical and basolateral surfaces of the polarized epithelium. Infect. Immun. 78, 939-953 (2010).
  38. Kierbel, A., et al. Pseudomonas aeruginosa exploits a PIP3-dependent pathway to transform apical into basolateral membrane. J. Cell Biol. 177, 21-27 (2007).
  39. Lee, C. A., et al. A secreted Salmonella protein induces a proinflammatory response in epithelial cells, which promotes neutrophil migration. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 12283-12288 (2000).
  40. Zurawski, D. V., Mumy, K. L., Faherty, C. S., McCormick, B. A., Maurelli, A. T. Shigella flexneri type III secretion system effectors OspB and OspF target the nucleus to downregulate the host inflammatory response via interactions with retinoblastoma protein. Mol. Microbiol. 71, 350-368 (2009).
  41. Brazil, J. C., et al. Neutrophil migration across intestinal epithelium: evidence for a role of CD44 in regulating detachment of migrating cells from the luminal surface. J. Immunol. 185, 7026-7036 (2010).
  42. Lawrence, D. W., et al. Antiadhesive role of apical decay-accelerating factor (CD55) in human neutrophil transmigration across mucosal epithelia. J. Exp. Med. 198, 999-1010 (2003).
  43. Hodges, K., Hecht, G. Interspecies communication in the gut, from bacterial delivery to host-cell response. J. Physiol. 590, 433-440 (2012).

Tags

Infektion Problem 83 Cellulær biologi Epitel Neutrophils Pseudomonas aeruginosa Respiratory Tract Diseases Neutrophils epitelbarrierer patogener transmigration
<em>In vitro</em> Coculture Assay at vurdere Patogen induceret Neutrophil Trans-epitel Migration
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kusek, M. E., Pazos, M. A., Pirzai,… More

Kusek, M. E., Pazos, M. A., Pirzai, W., Hurley, B. P. In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration. J. Vis. Exp. (83), e50823, doi:10.3791/50823 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter