Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

In vitro Coculture Assay om pathogene geïnduceerde neutrofiele trans-epitheliale migratie te beoordelen

Published: January 6, 2014 doi: 10.3791/50823
Automatic Translation
1,2,3, 1,3, 3, 1,3
1Department of Pediatrics, Harvard Medical School, 2Department of Pediatric Gastroenterology, MGH for Children, 3Mucosal Immunology and Biology Research Center, Massachusetts General Hospital

Summary

Neutrofiele trans-epitheliale migratie als reactie op mucosale bacteriële infectie draagt bij aan epitheelletsel en klinische ziekte. Er is een in vitro model ontwikkeld dat pathogene, menselijke neutrofielen en gepolariseerde menselijke epitheelcellagen combineert die op transwellfilters zijn gekweekt om onderzoeken naar het ontrafelen van de moleculaire mechanismen die dit fenomeen orkestreren te vergemakkelijken.

Abstract

Mucosale oppervlakken dienen als beschermende barrières tegen pathogene organismen. Aangeboren immuunreacties worden geactiveerd bij het detecteren van pathogenen die leiden tot de infiltratie van weefsels met migrerende ontstekingscellen, voornamelijk neutrofielen. Dit proces heeft het potentieel om destructief te zijn voor weefsels als het overmatig is of in een onopgeloste toestand wordt gehouden.  Gecocultureerde in vitro modellen kunnen worden gebruikt om de unieke moleculaire mechanismen te bestuderen die betrokken zijn bij pathogene geïnduceerde neutrofiele trans-epitheliale migratie. Dit type model biedt veelzijdigheid in experimenteel ontwerp met de mogelijkheid voor gecontroleerde manipulatie van de ziekteverwekker, epitheelbarrière of neutrofiel. Pathogene infectie van het apicale oppervlak van gepolariseerde epitheliale monolagen gekweekt op permeabele transwellfilters veroorzaakt fysiologisch relevante basolaterale tot apicale transepitheelmigratie van neutrofielen die op het basolaterale oppervlak worden toegepast. Het hierin beschreven in vitro model toont de vele stappen aan die nodig zijn om neutrofiele migratie aan te tonen over een gepolariseerde longepitheelmonolayer die is geïnfecteerd met pathogene P. aeruginosa (PAO1). Zaaien en cultiveren van doorlatende transwells met menselijke afgeleide longepitheelcellen wordt beschreven, samen met isolatie van neutrofielen uit volledig menselijk bloed en cultivering van PAO1 en nietpathogene K12 E. coli (MC1000).  Het emigratieproces en de kwantitatieve analyse van met succes gemigreerde neutrofielen die zijn gemobiliseerd als reactie op pathogene infectie, worden aangetoond met representatieve gegevens, waaronder positieve en negatieve controles. Dit in vitro modelsysteem kan worden gemanipuleerd en toegepast op andere mucosale oppervlakken. Ontstekingsreacties waarbij overmatige neutrofiele infiltratie betrokken is, kunnen destructief zijn voor gastheerweefsels en kunnen optreden bij afwezigheid van pathogene infecties. Een beter begrip van de moleculaire mechanismen die neutrofiele transepitheelmigratie bevorderen door experimentele manipulatie van het in vitro coculture assay-systeem dat hierin wordt beschreven, heeft een aanzienlijk potentieel om nieuwe therapeutische doelen te identificeren voor een reeks mucosale infectieuze en inflammatoire ziekten.

Introduction

Mucosale oppervlakken dienen als fysieke en immunologische barrières die bescherming bieden tegen externe bedreigingen die alomtegenwoordig zijn in het milieu1,2. Deze beschermende epitheelbarrière kan worden aangetast wanneer pathogene organismen binnendringen2. In het geval van een bacteriële ziekteverwekker veroorzaakt deze ontmoeting vaak een ontstekingsproces door het aangeboren immuunsysteem te activeren en een snelle mobilisatie van eerstehulpgranulocyten bekend als neutrofielen2-4te activeren . Chemotactische middelen die neutrofiele rekrutering vergemakkelijken, worden gedeeltelijk geproduceerd door de mucosale epitheelcellen die de gastheer van de beledigende ziekteverwekker2-4willen bevrijden. Overmatige of onopgeloste neutrofiele infiltratie van het mucosale epitheeloppervlak kan significante pathologie veroorzaken1,5. Dit is een gevolg van niet-specifieke weefselschade veroorzaakt door het antibacteriële neutrofielenarsenaal5-7. In dergelijke gevallen wordt de bacteriële klaringscapaciteit van neutrofielen overschaduwd door vernietiging van gastheerweefsel tijdens een infectieuze belediging.  Verstoring van de beschermende epitheliale barrièrefunctie kan leiden tot een verhoogde blootstelling van onderliggend weefsel aan micro-organismen en/of toxines, waardoor de ziektepathologie verder wordt verergerd8,9. Deze gevolgen kunnen worden waargenomen in meerdere orgaansystemen, waaronder de longen en het spijsverteringskanaal1,5. Bovendien worden niet-infectieuze ontstekingsaandoeningen zoals ernstige aanvallen van astma, chronische obstructieve longziekte (COPD), acuut respiratoir distress syndroom (ARDS) en inflammatoire darmziekte (IBD) gekenmerkt door de pathologische breuk van de mucosale epitheelbarrière door een overmatige neutrofiele respons4,5,10-12.

Het complexe proces van neutrofiele rekrutering na mucosale infectie omvat verschillende gecompartimenteerde stappen1,5,13,14. Ten eerste moeten neutrofielen uit de circulatie vertrekken via een reeks cel-naar-celinteracties die trans-endotheelmigratie vergemakkelijken1,13. Neutrofielen navigeren vervolgens door bestaande interstitiële ruimte met extracellulaire matrix1,14. Om het lumen van het geïnfecteerde slijmvlies te bereiken, moeten neutrofielen vervolgens migreren over de epitheelbarrière1,4,5. Dit ingewikkelde multistep-fenomeen wordt vaak in geaggregeerde zin onderzocht met behulp van in vivo diermodellen van infectie15. Dergelijke modellen zijn nuttig om de noodzaak vast te stellen van specifieke factoren, zoals chemokinen, adhesiemoleculen of signaleringsroutes die deelnemen aan het algehele proces, maar zijn grotendeels ontoereikend voor het oplossen van moleculaire bijdragen die van cruciaal belang zijn voor elke afzonderlijke gecompartimenteerde stap16. Coculturele in vitro systemen die trans-endotheel-, transmatrix- of transepitheelmigratie van neutrofielen modelleren, zijn in dit opzicht bijzonder nuttig geweest1,14,16,17.

Er is een robuust coculture-assaysysteem ontwikkeld voor het ontcijferen van mechanismen die verantwoordelijk zijn voor neutrofiele transepitheelmigratie als reactie op pathogene infectie18-22. Dit model omvat het infecteren van het apicale oppervlak van gepolariseerde menselijke epitheelcellagen met een bacteriële ziekteverwekker gevolgd door toepassing van vers geïsoleerde menselijke neutrofielen op het basolaterale oppervlak18-22. Neutrofielen migreren over de epitheelbarrière als reactie op epitheliale chemotactische producten die zijn uitgescheiden na pathogene infectie18,21-23. Dit modelsysteem is gebruikt met behulp van intestinale en longepitheelculturen die zijn blootgesteld aan geschikte weefselspecifieke bacteriële pathogenen en heeft nieuwe moleculaire mechanismen onthuld die waarschijnlijk belangrijk zijn voor het wervingsproces van neutrofielen tijdens mucosale infectie3,8,19,24-28. De kracht van dit in vitro coculture model is dat een reductionistische benadering de onderzoeker in staat stelt om de ziekteverwekker, epitheelbarrière en/of neutrofiel experimenteel te manipuleren in een goed gecontroleerd, zeer reproduceerbaar, vrij goedkoop systeem. Inzicht verkregen uit deze aanpak kan effectief worden gebruikt om gerichte analyse uit te voeren van gecompartimenteerde gebeurtenissen tijdens neutrofiele rekrutering met behulp van in vivo infectiemodellen22,29,30.

Dit artikel demonstreert de meerdere stappen die nodig zijn voor de succesvolle vaststelling van dit reproduceerbare model om pathogene geïnduceerde neutrofiele trans-epitheelmigratie te onderzoeken. Longepitheelbarrières geïnfecteerd met de ziekteverwekker Pseudomonas aeruginosa komen in dit artikel voor; andere weefselepithlia en pathogenen kunnen echter worden vervangen door kleine wijzigingen. Zaaien en cultiveren van gepolariseerde longepitheelcellagen op omgekeerde collageen gecoate permeabele transwellfilters wordt hierin beschreven, net als de groei van pathogene P. aeruginosa en de isolatie van neutrofielen uit volbloed. Hoe deze componenten worden gecombineerd om door pathogenen geïnduceerde neutrofiele transepitheelmigratie te observeren, wordt gepresenteerd, samen met passende positieve en negatieve controles om een reproduceerbare test vast te stellen. De veelzijdigheid van deze benadering om verschillende aspecten van pathogene geïnduceerde neutrofiele transepitheelmigratie te onderzoeken, wordt besproken met betrekking tot specifieke studies in de literatuur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Stappen (1-3) moeten worden uitgevoerd in een steriele omgeving onder een laminaire stromingskap.

1. Collageen coating transwells

  1. Maak een collageenoplossing van 30 μg/ml. Verdun 3 mg/ml collageenbouillon 1:100 in 60% ethanol die door een filtereenheid van 0,2 μm is gegaan.
  2. Vortex verdunde oplossing van 30 μg/ml. Opmerking: Het is niet nodig om de 3 mg/ml collageenbouillonoplossing te vortexen, omdat deze oplossing vrij stroperig is en luchtbellen kunnen worden geïntroduceerd, waardoor de nauwkeurigheid bij pipetten mogelijk afneemt.
  3. Verwijder 0,33 cm2 groeigebiedtranswells met een poriegrootte van 3 μm van de buitenverpakking en plaats de 24-putplaat met 12 transwells ondersteboven in de kap.
  4. Til de bodemplaat op en plaats opzij. Opmerking: Transwells zal nu ondersteboven rusten bovenop het deksel van de 24-put plaat
  5. Zet bunsenbrander aan. Vlamhemostase voor steriliteit en laat afkoelen.
  6. Breng met steriele hemostase transwells over naar een Petrischaal van 150 mm x 25 mm, zodat ze in de omgekeerde positie blijven. Opmerking: Zorg ervoor dat u de steriliteit van de lege 24-put plaat plus deksel behoudt om transwells te huisvesten zodra ze zijn gezaaid met epitheelcellen.
  7. Pipet 70 μl van de collageenoplossing van 30 μg/ml op het filtermembraan van elke omgekeerde transwell. Opmerking: Oppervlaktespanning moet dit volume oplossing op zijn plaats houden, omdat er geen wanden rond het filtermembraan zijn bij het openen van het oppervlak van de onderkant. Zorg ervoor dat de collageenoplossing niet langs de zijkant van de transwell druppelt en vermijd bewegende transwells tijdens de coatingprocedure.
  8. Laat het deksel van de Petrischaal minimaal 4 uur staan om ethanoloplossing te laten verdampen. Om de steriliteit tijdens dit proces te behouden, houdt u de ventilator van de kap en het ultraviolette licht aan.
  9. Nadat de transwells zijn opgedroogd, kunnen ze onmiddellijk worden gebruikt of tot een week bij kamertemperatuur worden bewaard, op voorwaarde dat de petrischaalafdekking op zijn plaats is en de steriliteit behouden blijft.

2. Passagekolf van epitheelcellen voor het zaaien van transwells

(Dit protocol beschrijft specifiek de behandeling van de longepitheelcellijn H292 voor het genereren van epitheelbarrières die op transwells worden gekweekt. Andere epitheliale cellijnen kunnen worden gebruikt met kleine aanpassingen.)

  1. Bereid het kweekmedium voor door 10% warmtegeïnactiveerd Foetale Runderserum (HI-FBS) en 1x Penicilline/Streptomycine toe te voegen aan RPMI 1640.
  2. Warme media, trypsine-EDTA (T-EDTA) en D-PBS in 37 ºC waterbad.
  3. Verwijder de T-75 kolf met cellen uit de incubator en beoordeel de samenvloeiing visueel met een omgekeerde microscoop. Opmerking: Bij gebruik van H292-cellen moeten kolven dicht bij of volledig samenvloeien.
  4. Aspireer media uit kolf. Verminder de tijd dat cellen droog zijn door de volgende oplossing in de kap met losgemaakte dop te hebben.
  5. Voeg 5 ml D-PBS toe aan de T-75 kolf en wervel. Vermijd het maken van bubbels. Verwijder PBS door aspiratie.
  6. Voeg 3 ml T-EDTA toe aan de T-75 kolf en wervel om de bodem te bedekken.
  7. Verwijder het grootste deel van de T-EDTA en laat ongeveer 0,3 ml in de T-75 kolf.
  8. Verdeel het kleine resterende volume T-EDTA over het oppervlak van de cellen en plaats het in een bevochtigde incubator onder standaard kweekomstandigheden (37 ºC, 5% CO2).
  9. Verwijder na een bepaalde tijd de kolf uit de incubator. Opmerking: Cellen moeten gemakkelijk loskomen van het oppervlak van de kolf door zachtjes op de kolf op de zijkant te tikken. Cellen moeten nu worden afgerond en zwevend wanneer ze onder de microscoop worden gevisualiseerd. De gemiddelde tijd die dit kost voor H292-cellen is 5-10 minuten.
  10. Voeg 10 ml kweekmedia toe aan de kolf om T-EDTA en resuspend cellen te neutraliseren. Trek de celoplossing in pipetpunt en werp ongeveer vijf keer uit op het oppervlak van de kolf met cellen om alle cellen opnieuw te suspenden.
  11. Breng geresuspendeerde cellen over in een buis van 15 ml voor het zaaien van transwells. Opmerking: De concentratie van op deze wijze bereide geresuspendeerde H292-cellen moet variëren tussen ongeveer 1 x 106-1,8 x 106 cellen/ml.

3. Zaaien collageen gecoate transwells met epitheelcellen

  1. Voeg 70 μl geresuspendeerde celoplossing uit de buis van 15 ml toe aan elke omgekeerde collageen gecoate transwell. Opmerking: H292-celoplossingen met een concentratiebereik tussen 1 x 106-1,8 x 106 cellen/ml leveren ongeveer 70.000-120.000 cellen/transwell op.
  2. Meng de celsuspensie door de buis regelmatig voorzichtig om te keren om te voorkomen dat cellen zich op de bodem van de buis van 15 ml nestelen terwijl ze de transwells zaaien. Opmerking: Draai cellen niet om en wees voorzichtig dat pipetpunt niet in direct contact komt met met collageen bedekt membraanfilter.
  3. Zodra alle omgekeerde transwells zijn gezaaid met epitheelcellen, vervang petrischaaldeksel en plaats voorzichtig in de weefselkweekincubator, bevochtigd, 37 ºC, 5% CO2. Zorg ervoor dat u de celsuspensie die aan het met collageen bedekte filtermembraan is toegevoegd, niet verstoort.
  4. Behoud omgekeerde transwells in de weefselkweek incubator, bevochtigd, 37 ºC, 5% CO2 's nachts. Opmerking: De vloeistofbel die cellen bevat, moet gedurende de nacht incubatie geassocieerd blijven met het doorlatende filtermembraan van de transwell. Als het filtermembraan droog wordt door verdamping van vloeistof of omdat de vloeistof langs de zijkant van de transwells druppelt, kunnen de epitheellagen niet goed groeien.
  5. Voeg de volgende dag 1 ml media toe aan de originele steriele 24-well plaat en draai elke omgekeerde transwell met behulp van een gesteriliseerde hemostase in elke put met 1 ml media.
  6. Voeg 0,2 ml media toe aan de bovenste kamer van elke transwell en keer terug naar weefselkweek incubator, bevochtigd, 37   ºC, 5% CO2.
  7. H292 omgekeerde transwells kunnen worden gebruikt vanaf 8 dagen tot 1 maand na het zaaien. Opmerking: We raden aan om minimaal 8 dagen na het zaaien van transwells te wachten om ervoor te zorgen dat de epitheliale monolagen zich volledig hebben gevormd en een functionele barrière vertonen. Men kan de H292-epitheelbarrière testen door te bepalen of de monolaag in staat is om de trans-epitheelstroom van het eiwit paardenradijsperoxidase (HRP) te beperken na toevoeging aan het basolaterale oppervlak18.

4. Voorbereiding van bacteriën voor infectie van epitheliale lagen op transwells

  1. Haal een dag voor het experiment één kolonie P. aeruginosa PAO1 uit een Pseudomonas Isolation Agar-plaat en één kolonie K12 E. coli MC1000 uit een Luria-Bertani (LB) Agar-plaat en plaats deze in afzonderlijke buizen met 3 ml LB-bouillon. LET OP: P. aeruginosa is een menselijke ziekteverwekker, bij de behandeling van dit organisme moeten standaard BSL2-veiligheidsmaatregelen worden genomen.
  2. Schud 's nachts bij 225 tpm in een omgeving van 37 ºC.
  3. Verwijder de volgende dag 1 ml uit de dichte bacterieculturen en plaats deze in 1,5 ml Eppendorf-tubes.
  4. Draai 5 minuten in microfuge op 15.800 x g en verwijder vervolgens supernatant.
  5. Bereid hanks' balanced salt solution met calcium en magnesium (HBSS+) van tevoren. Voeg 23,8 g HEPES en 97,5 g HBSS+ poeder toe aan 9,5 L gedestilleerd water. Voeg kleine hoeveelheden van 10 M NaOH toe aan de oplossing, terwijl de pH wordt gecontroleerd totdat een stabiele pH van 7,4 is bereikt. Breng het volume op tot 10 L en bewaar op 4 ºC.
  6. Resuspend elke bacteriële pellet met 1 ml HBSS+. Vortex om er zeker van te zijn dat een gelijkmatige bacteriële suspensie wordt bereikt.
  7. Draai opnieuw op 15.800 x g gedurende 5 minuten en verwijder supernatant.
  8. Resuspend de PAO1 pellet met 0,6 ml HBSS+ en de MC1000 pellet met 0,5 ml HBSS+. Vortex de bacteriële suspensus.
  9. Verdun de PAO1 en MC1000 resuspended pellets 1:100 verder in HBSS+. Voeg bijvoorbeeld 50 μl van de 0,6 ml PAO1 geresuspendeerde pellet toe aan 5 ml HBSS+. Opmerking: Met behulp van optische dichtheidsmetingen (OD) om de kweekdichtheid te bepalen, evenals de standaardkolonievormende eenheid (CFU) verdunningsplatingsmethodologie, leveren PAO1- en MC1000-oplossingen die op deze manier zijn bereid consequent tussen 3 x 107-6 x10 7 KVE/ml op. De dichtheid van een bacteriecultuur is positief gecorreleerd met de OD-meting van de cultuur bij 600 nm en deze correlatie kan worden gebruikt om de concentratie van bacteriële cellen te schatten. Om de concentratie van bacteriële cellen te bevestigen, kan de cultuur worden verdund tot een zeer lage geschatte concentratie en op een agarplaat worden geplateerd, zodat men zou verwachten dat er tussen de 30-200 bacteriële cellen op de plaat aanwezig zouden zijn. De cellen worden verspreid over de plaat en 's nachts geïncubeerd bij 37 ºC, zodat elke cel een individuele kolonie cellen vormt die groot genoeg is om zichtbaar te zijn en kolonies vervolgens kunnen worden geteld.

5. Isolatie van neutrofielen uit volbloed

  1. Zure citraat dextrose oplossing (ACD) wordt gebruikt als een antistollingsmiddel en bereid door toevoeging van 6,9 g citroenzuur, 12,5 g natriumcitraat en 10 g dextrose aan 500 ml gedestilleerd water. Zodra alle componenten zijn opgelost, wordt de ACD-oplossing gesteriliseerd door een filtereenheid van 0,2 μm te passeren. Bewaar acd-oplossing bij 4 ºC.
  2. Voeg voorafgaand aan het afnemen van bloed 5 ml ACD toe aan de spuit van 50 ml en bevestig 21 x 3/4 G vlindernaald met 12 in slang.
  3. Breng tourniquet aan, veeg de ader af met alcohol en steek de naald in. Opmerking: Elk onderzoeksprotocol met betrekking tot menselijke proefpersonen moet worden goedgekeurd door een institutionele beoordelingscommissie en schriftelijke geïnformeerde toestemming moet worden gegeven van elke bloeddonor. Experimenten uitgevoerd met behulp van dit protocol werden bijvoorbeeld goedgekeurd door de Massachusetts General Hospital Institutional Review Board en toegewezen protocol #1999-P-007782.
  4. Neem langzaam 45 ml bloed af, zodat het bloed eenmaal in de spuit met ACD wordt vermengd.
  5. Wanneer 45 ml is getrokken (50 ml totaal volume), maak dan het tourniquet los voordat u de naald verwijdert. Oefen onmiddellijk druk uit op de wond met steriel gaas wanneer de naald wordt verwijderd.
  6. Breng het bloed langzaam over langs de zijkant van een buis van 50 ml gedurende ongeveer 5-10 sec.
  7. Draai in de centrifuge op 1.000 x g met de rem 20 minuten gedeactiveerd bij kamertemperatuur. Opmerking: Een extra stap met verdunning van volbloed in PBS- en zorgvuldige overlay van verdund bloed op Ficoll-Paque voorafgaand aan centrifugeren kan worden gebruikt om een iets hoger niveau van neutrofiele zuiverheid te bereiken door de buffy coat efficiënter te scheiden van de granulocyten8. Het weglaten van deze stap dient om tijd te besparen zonder de opbrengst of zuiverheid drastisch te beïnvloeden voor deze test, en daarom geven we er de voorkeur aan om de bloedoverlay niet op ficoll-Paque-stap op te slaan.
  8. Terwijl het bloed draait, voeg je heel langzaam 1 g gelatine toe aan 50 ml verwarmde Hanks' Balanced Salt Solution zonder calcium en magnesium (HBSS(-)) om 2% gelatineoplossing te bereiden. Houd de oplossing op 37 ºC.
  9. Aspireer en gooi plasma weg uit de buis van 50 ml bloed met behulp van een glazen pipettip die is behandeld met Sigmacote.
  10. Blijf zeer voorzichtig aspireren om de buffy coat te verwijderen, die witte bloedcellen bevat, waaronder lymfocyten.
  11. Als de buffy coat langzaam wordt verwijderd, zal het witgele troebele materiaal boven de rode bloedcellaag (RBC) verdwijnen. Stop de aspiratie zodra buffy coat is verwijderd en RBC-laag kan duidelijk worden gevisualiseerd bij het bekijken van boven de buis.
  12. Probeer de RBC-laag niet te verstoren, omdat granulocyten, meestal neutrofielen, zich in de buurt van het oppervlak van de RBC-laag bevinden, maar niet zichtbaar zijn.
  13. Voeg aan een volume van 15 ml RBC-laag 30 ml warme 2% gelatineoplossing (2x volume van de RBC-laag) toe.
  14. Keer de buis voorzichtig om om te mengen en zorg ervoor dat de vorming van bubbels wordt geminimaliseerd.
  15. Incubeer   gedurende 25 minuten bij 37 ºC. Opmerking: RBC's moeten aggregeren en tot de bodem bezinken. Als alternatief voor gelatine kan dextrans met een groot molecuulgewicht worden gebruikt voor sediment-RBC's8.
  16. Breng na incubatie de lichte roodachtige oplossing van de bovenste laag die granulocyten bevat over in een nieuwe tube van 50 ml met pipet, waarbij u erop moet letten dat de vaste donkere RBC-laag tijdens de overdracht niet wordt verstoord. Eenmaal gescheiden, gooi donkere RBC-laag weg.
  17. Spin overgebracht licht roodachtige oplossing met granulocyten en sommige RBCs in centrifuge op 1.000 x g met rem geactiveerd voor 10 minuten bij kamertemperatuur om pelletcellen.
  18. Giet het supernatant voorzichtig af of aspireer het, omdat de roodachtige celkorrel die zich na centrifugeren zal vormen over het algemeen los zit.
  19. Bereid de RBC-lysisbuffer van tevoren voor en bewaar bij 4 ºC door 8,29 g ammoniumchloride (NH4Cl), 1 g natriumbicarbonaat (NaHCO3)en 0,038 g EDTA toe te voegen aan 1 L gedestilleerd water in een bekerglas. Bewaar de RBC-lysisbuffer bij 4 ºC.
  20. Resuspend en breek roodachtige celkorrel met een klein volume koude RBC-lysisbuffer. Zodra de celkorrel in oplossing is, vult u de buis tot 50 ml met RBC-lysisbuffer. Opmerking: Houd de cellen op dit punt en in de toekomst op ijs of op 4 ºC.
  21. Draai in centrifuge op 300 x g gedurende 10 minuten bij 4   ºC en giet het supernatant af of aspireer het. Opmerking: De supernatant zal enigszins roodachtig zijn en lysed RBCs bevatten. De pellet moet op dit punt geelachtig wit zijn. Als er significante RBC's in de pellet achterblijven, zoals aangegeven door een roodachtige pellet, kan stap 5.20-5.21 worden herhaald. Significante RBC's blijven in de celpellet als de roodachtige pellet uit stap 5.20 niet voldoende wordt afgebroken.
  22. Resuspend en breek witachtige pellet met een klein volume HBSS(-) en vul de buis tot 50 ml met HBSS(-). Opmerking: HBSS(-) en niet HBSS+ moeten worden gebruikt om de witachtige celkorrel te resuspenden. HBSS(-) heeft een tekort aan calcium en magnesium.
  23. Draai opnieuw in centrifuge op 300 x g gedurende 10 min bij 4   ºC.
  24. Giet het supernatant af en resuspend de pellet tot een eindvolume van 1 ml HBSS(-).
  25. Voeg 5 μl van de 1 ml celsuspensie toe aan 250 μl HBSS(-) in een Eppendorf-buis van 1,5 ml en meng voorzichtig op en neer met een pipet.
  26. Voeg 25 μl verdunde celsuspensie toe aan 25 μl 0,4% Trypan blauw.
  27. Voeg 12 μl mengsel toe aan elke kant van een standaard hemocytometer.
  28. Tel het aantal levende cellen dat de Trypan blauwe kleurstof heeft uitgesloten en aanwezig zijn in het middelste vierkant van beide zijden van de hemocytometer.
  29. Om de celconcentratie te berekenen, vermenigvuldigt u het gemiddelde van de 2 kwadraten met 100 (verdunningsfactor) en vermenigvuldigt u zich vervolgens met10 4 om het aantal cellen/ml te geven.
  30. Stel de eindconcentratie in op 5 x 107 cellen/ml. Indien groter dan 5 x 107 cellen/ml, moet u deze aanpassen door HBSS(-) toe te voegen. Als dat minder is, pellet de cellen en resuspend naar het juiste volume.
  31. Houd cellen op ijs tot ze klaar zijn voor migratietest. Opmerking: Deze cellen vertegenwoordigen de granulocytpopulatie van witte bloedcellen. De meerderheid van de granulocyten geïsoleerd uit volledig menselijk bloed zijn neutrofielen. Cellen worden op ijs gesuspendeerd in HBSS(-) gehouden tot aanvulling op de migratietest om cellen in een rustgevende toestand te houden.

6. Voorbereiding van epitheliale cellagen voor migratietest

(Deze stappen hoeven niet te worden uitgevoerd in een steriele kap.)

  1. Verwijder uit incubator 24-put plaat ondersteunende epitheellagen die zijn gekweekt aan de onderkant van transwell filter membranen voor ten minste acht dagen.
  2. Pak de rand van elke transwell vast met een hemostase, til uit de 24-put plaat en keer de transwell om over een afvalemmer om cultuurmedia uit de binnenkamer van de transwell te gooien. Dompel elke transwell in een wasbeker met HBSS+ om de binnenkamer van de transwell te vullen met HBSS+. Gooi vloeistof uit de binnenkamer in een afvalemmer.
  3. Herhaal stap 6.2 voor een tweede wasbeurt in HBSS+. Plaats na twee wasbeurten transwells in een nieuwe 24-well plaat met 1 ml HBSS+ in elke put. Opmerking: Alle wasbeurten moeten worden uitgevoerd met HBSS+ dat is opgewarmd tot 37 ºC.
  4. Observeer de bovenste kamer van elke transwell om de integriteit van de epitheelcellaag te beoordelen. Opmerking: HBSS+ mag niet in de bovenste kamer van de transwell lekken en vullen wanneer deze in de put van een 24-putplaat met 1 ml HBSS+ wordt geplaatst.
  5. Voeg na zorgvuldige observatie van elke transwell 0,2 ml HBSS+ toe aan de bovenste kamer.
  6. Plaats in incubator bij 37   ºC, 5% CO2 in een bevochtigde kamer gedurende 30-60 minuten om epitheelcellagen te equilibreren.

7. Neutrofiele trans-epitheliale migratietest

  1. Haal uit incubator 24-well plaat van gewassen transwells equilibreren in HBSS +.
  2. Pak elke transwell met een hemostase vast en gooi vloeistof er bovenop tot ver in een afvalemmer.
  3. Plaats elke transwell ondersteboven in een Petrischaal van 150 mm x 25 mm.
  4. Voeg aan zes van de omgekeerde Transwells 25 μl HBSS+ toe. Infecteer aan drie van de omgekeerde transwells met 25 μl P. aeruginosa (PAO1) verdund in HBSS+ bereid zoals beschreven in stap 4. Infecteer tot de laatste drie omgekeerde transwells met 25 μl E. coli K12 (MC1000) verdund in HBSS+ bereid zoals beschreven in stap 4. Dit is ongeveer 0,8 x 106-1,5 x 106 CFUs/epitheellaag voor elke bacteriesoort, aangezien de concentratie van de bacteriële oplossingen bereid in stap 4 ongeveer 3 x 107-6 x 107 KVE/ml is.
  5. Incubeer bij 37   ºC, 5% CO2 in een bevochtigde kamer gedurende 60 min.
  6. Bereid fMLP voor als een positieve controle op neutrofiele migratie door 5 μl 10 mM fMLP-voorraad toe te voegen aan 5 ml HBSS+ met een oplossing van 10 μM.
  7. Was transwells door te grijpen met een hemostase en terug te draaien in een 24-well wasplaat die 1 ml HBSS + in de onderste kamers bevat. Voeg 0,2 ml HBSS+ toe aan de bovenste kamers.
  8. Pak transwell vast met een hemostase en verwijder van de eerste wasplaat. Voordat u transwells in een tweede 24-well wasplaat met 1 ml HBSS+ plaatst, gooit u vloeistof uit de bovenste kamer in een afvalemmer. Voeg 0,2 ml HBSS+ toe aan de bovenkamer.
  9. Herhaal stap 7.8 nog één keer voor in totaal 3 wasbeurten. Opmerking: Alle transwells moeten worden onderworpen aan hetzelfde behandelings- en wasregime, ongeacht of ze al dan niet met bacteriën zijn geïnfecteerd, om ervoor te zorgen dat alle transwells die worden onderzocht op dezelfde manier zijn gemanipuleerd. Een infectie van 60 minuten met PAO1 of MC1000 vermindert de levensvatbaarheid niet en verandert de barrière-eigenschappen van de H292-monolaag niet, zoals beoordeeld door een toxicologische test op basis van lactaatdehydrogenase en de HRP-fluxtest, respectievelijk18,22.
  10. Bereid 24-well migratieplaat door 1 ml HBSS+ toe te voegen aan 12 putten van de 24-well plaat. Opmerking: Deze plaat kan van tevoren worden voorbereid.
  11. Gooi na de derde wasbeurt vloeistof uit de bovenste kamers van transwells in een afvalemmer met behulp van een hemostase en plaats drie van de niet-geïnfecteerde transwells in drie putten van de 24-put migratieplaat met 1 ml HBSS +, wat de negatieve controle vertegenwoordigt.
  12. Pipet 10 μl van een 10 μM oplossing van fMLP in elk van de drie putten van de 24-put migratieplaat met 1 ml HBSS+ (100 nM).
  13. Plaats drie van de niet-geïnfecteerde transwells in drie putten van de 24-put migratieplaat met 100 nM fMLP, wat een positieve controle is voor het vermogen van geïsoleerde neutrofielen om te migreren.
  14. Plaats drie met PAO1 geïnfecteerde transwells en drie met MC1000 geïnfecteerde transwells in drie putten van respectievelijk de 24-put migratieplaat met 1 ml HBSS+. Voeg 0,1 ml HBSS+ toe aan de bovenste kamer van elke transwell.
  15. Voeg bovenop de 0,1 ml HBSS+ in elke transwell voorzichtig 20 μl neutrofiele suspensie (5 x 107 cellen/ml) toe, bereid zoals beschreven in stap 5. Opmerking: Dit vertegenwoordigt ongeveer 1 x 106 neutrofielen/transwell.
  16. Incubeer bij 37 ºC, 5% CO2 in een bevochtigde kamer gedurende 2 uur om trans-epitheliale migratie van neutrofielen mogelijk te maken.
  17. Bereid een standaardcurve voor voor het bepalen van het aantal neutrofielen dat na 2 uur is gemigreerd. Voeg 40 μl neutrofielensuspensie (5 x 107 cellen/ml) toe aan 2 ml HBSS(+) en breng 1 ml over in 1 ml HBSS(+) en voer 8 keer seriële 2-voudige verdunningen uit voor in totaal 10 standaarden, variërend van ongeveer 2.000 cel/ml tot 1 x 106 cellen/ml. Voeg 1 ml HBSS(+) toe voor blanco.
  18. Til na 2 uur migratie de transwells op door met een hemostase te grijpen en tik zachtjes tegen de binnenwanden van de 24-put migratieplaat. Gooi transwells weg.
  19. Beoordeel de migratie van neutrofielen grof in de putten door putten van de 24-putmigratieplaat onder een omgekeerde microscoop te bekijken met behulp van de 10X-doelstelling (zie figuur 1 voor afbeeldingen van gemigreerde neutrofielen in elke toestand).
  20. Voeg 50 μl 10% triton X-100 toe aan elke put die wordt gebruikt in de 24-put migratieplaat, elke standaard en de blanco.
  21. Draai de 24-put migratieplaat, standaarden en blanco bij lage snelheid gedurende 20 minuten bij 4   ºC.
  22. Bereid vooraf een 1 M citraatbuffer voor. Voeg 52,5 g citroenzuur en 73,5 g natriumcitraat toe aan 400 ml gedestilleerd water in een bekerglas. Breng de pH op 4,2. Voeg gedestilleerd water toe voor de uiteindelijke oplossing van 500 ml. Bewaar de oplossing bij 4 ºC.
  23. Bereid abts substraatoplossing vers die dag. Voeg 3 ABTS tabletten (elk 10 mg) en 5 ml 1 M citraatbuffer toe aan 45 ml gedestilleerd water. Laat tabletten volledig oplossen in de oplossing. Onthoud toevoeging van 50 μl 30% waterstofperoxide totdat de ABTS-substraatoplossing nodig is (zie stap 7.27).
  24. Voeg 50 μl citraatbuffer toe aan elke put die wordt gebruikt in de 24-put migratieplaat, elke standaard en de blanco.
  25. Breng 100 μl van elk monster goed in tweevoud over op een plaat met 96 putten. Opmerking: Het is erg belangrijk om de inhoud in elk monster goed te mengen voordat u naar de 96-put plaat gaat. Pipetteer de oplossing minstens vijf keer op en neer voordat u de oplossing overzet.
  26. Breng 100 μl van elke norm en de blanco na het mengen (blanco in tweevoud) over op de 96-well plaat.
  27. Voeg 50 μl 30% waterstofperoxide toe aan de ABTS-oplossing en vortex.
  28. Voeg 100 μl ABTS-substraatoplossing toe aan elk monster op de 96-putplaat.
  29. Laat de plaat zich 5-10 minuten ontwikkelen in het donker. Opmerking: Een groene kleur moet zich ontwikkelen in bepaalde putten, correlerend met het aantal neutrofielen in elke put.
  30. Lees op golflengte van 405 nm met behulp van een microplate reader.
  31. Bereken het aantal neutrofielen dat over de epitheellaag is gemigreerd met behulp van de normen waarbij een lineaire positieve correlatie bestaat tussen het bekende aantal neutrofielen dat als norm is opgesteld en de hoeveelheid peroxidaseactiviteit gemeten door optische dichtheid bij 405 nm (zie figuren 2 en 3 voor representatieve gegevens). Opmerking: Deze methode van neutrofiele kwantificering maakt gebruik van de grote hoeveelheid peroxidaseactiviteit die neutrofielen vertonen als gevolg van myeloperoxidase-expressie. Alternatieve benaderingen voor het kwantificeren van neutrofielen kunnen worden overwogen, zoals methoden waarbij neutrofielen met radioactiviteit of fluorescentieverbindingen vooraf worden gelabeld.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Verschillende studies hebben aangetoond dat met ziekteverwekkers geïnfecteerde epitheellagen neutrofiele transepitheelmigratie vergemakkelijken3,8,19,24-28,31,32. Dit gebeurt via een pathogene-specifieke inductie van een epitheelcel-afgeleide neutrofiele chemotactische gradiënt3,23. Bijvoorbeeld, pathogene P. aeruginosa interactie met het apicale oppervlak van longepitheelcellen zorgt ervoor dat een aanzienlijk aantal neutrofielen migreren over de epitheellaag18,22,25,26,33,34. Dit klinisch relevante testsysteem kan op tal van manieren worden gemanipuleerd om belangrijke pathogenen te onthullen en moleculaire bijdragers te hosten in combinatie met de juiste controles.

Neutrofielen die zijn toegevoegd aan gepolariseerde epitheelcellagen die niet zijn geïnfecteerd, migreren niet in aanzienlijke aantallen. Het aanbrengen van een chemo-attractant gradiënt over een niet-geïnfecteerde epitheellaag zal echter aanzienlijke aantallen neutrofielen overdrijven. Het is belangrijk om zowel deze negatieve als positieve controles respectievelijk in elke test op te nemen bij het onderzoeken van neutrofiele migratie over pathogene geïnfecteerde epitheellagen. De negatieve controle bepaalt het achtergrondaantal neutrofielen dat de epitheellaag kruist bij afwezigheid van signaal. Dit aantal moet zeer laag zijn wanneer gekweekte epitheelcellen een functionele barrière hebben vastgesteld. Migratie met een hoge achtergrond bemoeilijkt de interpretatie van resultaten die zijn bereikt met met ziekteverwekkers geïnfecteerd epitheel. De positieve controle omvat het aanbrengen van een gradiënt van een neutrofiele chemo-attractant zoals fMLP over de epitheellaag en dient om te bevestigen dat de geïsoleerde neutrofielen functioneel zijn. Verder dient de fMLP-gradiënt, in het geval dat epitheellagen worden voorbehandeld met bepaalde reagentia om hun effecten op door pathogenen geïnduceerde trans-epitheelmigratie te beoordelen, om te bepalen welke effecten het reagens kan hebben op het vermogen van neutrofielen om door de epitheellaag te navigeren, ongeacht de door pathogenen gemedieerde effecten. Een extra controle die vaak binnen dit assaysysteem wordt gebruikt, omvat infectie van epitheellagen met nietpathogene bacteriën parallel met pathogenen. Deze controle kan worden benut om relevante epitheelreacties na interactie met bacteriën te onderscheiden en te helpen bij de identificatie van pathogene factoren die nodig zijn om neutrofiele transepitheelmigratie te stimuleren.

Neutrofiele trans-epitheliale migratie kan zowel kwalitatief als kwantitatief worden beoordeeld. Na voltooiing van de incubatie van 2 uur na toevoeging van neutrofielen aan het basolaterale oppervlak, worden transwells verwijderd en kunnen neutrofielen die volledig over de epitheellaag naar de apicale kamer zijn gemigreerd, worden bekeken in de onderste put van de 24-put migratieplaat. Een representatief beeld van elke voorwaarde wordt weergegeven in figuur 1,gevisualiseerd met behulp van een omgekeerde lichtmicroscoop. Er werden zeer weinig neutrofielen waargenomen die migreerden over een niet-geïnfecteerde epitheellaag zonder een opgelegde chemotactische gradiënt (HBSS+) en achtergrondniveaus in de test vertegenwoordigden (Figuur 1A). Daarentegen was een overvloed aan getransmigreerde neutrofielen zichtbaar wanneer een fMLP-gradiënt wordt verstrekt (figuur 1B). Infectie van het epitheel met nietpathogene E. coli MC1000 resulteerde in weinig zichtbare getransmigreerde neutrofielen, terwijl veel getransmigreerde neutrofielen waarneembaar waren wanneer epitheellagen werden geïnfecteerd met de longpathogene P. aeruginosa (PAO1) (figuren 1C en 1D).

De neutrofielen die in het experiment zijn gemigreerd, worden gekwantificeerd door hun myeloperoxidase-activiteit te meten. Een standaardcurve wordt gebruikt om een schatting van het aantal getransmigreerde neutrofielen mogelijk te maken. Het aantal neutrofielen correleert positief met de hoeveelheid peroxidaseactiviteit gemeten na lysis van neutrofielen met waarden die een lineaire relatie vertonen in het bereik van neutrofielenaantallen die zijn geselecteerd voor de standaardcurve (2 x 103-1 x 106 cellen/ml) (figuur 2). Een aanzienlijk aantal neutrofielen migreert over epitheellagen als reactie op een verstrekte fMLP-gradiënt of als reactie op een epitheellaag die is geïnfecteerd met PAO1 (figuur 3). Het aantal neutrofielen dat migreert bij afwezigheid van stimuli (HBSS+) of na apicale epitheelinfectie met nietpathogene E. coli MC1000 ligt onder de detectiegrens voor de test (figuur 3). De gegevens in figuur 3 geven het gemiddelde aantal getransmigreerde neutrofielen weer met foutbalken die de standaardafwijking van drie onafhankelijke putten / conditie vertegenwoordigen. Kwantitatieve gegevens in figuur 3 komen overeen met representatieve putafbeeldingen die in figuur 1worden weergegeven .

Figure 1
Figuur 1. Afbeelding van neutrofielen na trans-epitheliale migratie. Beelden werden bekeken met een omgekeerde lichtmicroscoop bij 10X vergroting van de onderste put (apicale kamer) van de 24-put migratieplaat na de incubatieperiode van 2 uur met neutrofielen toegevoegd aan de bovenste put (basolaterale kamer). (A) Negatieve controle HBSS+. (B) Positieve controle opgelegd fMLP chemotactische gradiënt. (C) Epitheliale cellagen geïnfecteerd met nietpathogene E. coli K12 (MC1000). (D) Epitheliale cellagen geïnfecteerd met pathogene P. aeruginosa (PAO1). Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.

Figure 2
Figuur 2. Neutrofielen bij een beginconcentratie van 1 x 106 werden onderworpen aan negen 2-voudige verdunningen. Na lysis werd de hoeveelheid peroxidaseactiviteit bepaald en werd het aantal neutrofielen op de x-as met peroxidaseactiviteit op de y-as in kaart gebracht. De afgebeelde vergelijking kan worden gebruikt om het aantal neutrofielen in elke put na transmigratie te bepalen op basis van de hoeveelheid peroxidaseactiviteit gemeten in elke put. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.

Figure 3
Figuur 3. Kwantificering van getransmigreerde neutrofielen. Het aantal getransmigreerde neutrofielen wordt gekwantificeerd door relatieve myeloperoxidaseactiviteit tot een lineaire standaardcurve van bekende aantallen neutrofielen. Aanzienlijke aantallen getransmigreerde neutrofielen werden waargenomen na epitheelcelinfectie met pathogene P. aeruginosa (PAO1) of de vaststelling van een apicale tot basolaterale gradiënt van neutrofiele chemo-attractant fMLP. Niet-detecteerbare aantallen getransmigreerde neutrofielen werden waargenomen na epitheliale celinfectie met niet-pathogene behandeling met E. coli K12 (MC1000) of alleen negatieve controlebuffer (HBSS+). Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Neutrofiele migratie over mucosale epitheeloppervlakken is een veel voorkomend kenmerk in ziektepathologie na infectie met bacteriële pathogenen3. De hierin beschreven methodologie biedt een snelle, eenvoudige aanpak om deze discrete gebeurtenis experimenteel te isoleren met behulp van een in vitro coculture assay-systeem dat een kenmerk modelleert van het ontstekingsproces dat wordt veroorzaakt door bacteriële infecties. Dit systeem werd oorspronkelijk ontwikkeld met behulp van gepolariseerde intestinale epitheelcellen geïnfecteerd met enterische pathogenen, waaronder Salmonella typhimurium, Shigella flexneri, en verschillende pathogene E. coli8,19,24,27,28. Elk van deze pathogene organismen is in staat om neutrofielen over gepolariseerde intestinale epitheliale monolagen te drijven die worden gekweekt op omgekeerde collageen gecoate permeabele transwellfilters. Dit experimentele systeem is aangepast met modificaties om longepitheelbarrières en pathogene geïnduceerde neutrofiele transepitheelmigratie te onderzoeken18,26. Verschillende luchtwegepitheelcellijnen behalve H292 zijn gebruikt voor deze studies, waaronder vaak geciteerde A549, BEAS-2B en Calu-3 longepitheelcellijnen22,26. P. aeruginosa veroorzaakt ontsteking in de longen die aanzienlijke schade veroorzaakt die ziekten zoals acute pneumonie en cystische fibrose kenmerkt35,36. Zoals beschreven, induceert de longpathogene P. aeruginosa gemakkelijk neutrofiele transepitheelmigratie bij infectie van longepitheelcellen, een opmerkelijk kenmerk van het ontstekingsproces waargenomen bij longontsteking en cystische fibrose. Bovendien zijn verschillende aanvullende stammen van P. aeruginosa, waaronder klinische isolaten van cystische fibrosepatiënten, gevalideerd als inductoren in deze test25. Streptococcus pneumoniae en Klebsiella pneumoniae, Gram-positieve en Gram-negatieve bacteriële pathogenen worden gewoonlijk geassocieerd met pneumonie en het is aangetoond dat ze neutrofiele transepitheelmigratie kunnen induceren met behulp van het in vitro coculture model26,32. Dit modelsysteem biedt dus een robuuste in vitro benadering met behulp van menselijke afgeleide cellen om ontstekingsprocessen te verkennen die zijn geïnitieerd door mucosale pathogenen.

Standaard op weefselkweek gebaseerde modellen die vaak worden gebruikt om interacties met gastheerpathogenen te onderzoeken, maken over het algemeen gebruik van epitheelcellen die op vlakke plastic oppervlakken worden gekweekt16. De in vitro coculture assay biedt een grotere mate van complexiteit en biedt veelzijdigheid in experimenteel ontwerp16,37,38. Gepolariseerde epitheelcellen die aan de onderkant van doorlatende transwellfilters worden gekweekt, creëren een apicaal compartiment dat naar de onderste kamer kijkt wanneer het in een 24-putplaat wordt geplaatst en een basolateraal compartiment dat uitkijkt op de binnenste bovenput van de transwell14,17. Deze discrete compartimentering en richtingsoriëntatie maakt de analyse van fysiologisch basolaterale naar apicale migratie van neutrofielen mogelijk als reactie op opgelegde of epitheliale celgegenereerde chemotactische gradiënten14,17,23. Het in vitro coculturesysteem maakt het mogelijk om specifieke moleculaire mechanismen te onderzoeken die kunnen worden toegeschreven aan transepitheelmigratie, die moeilijk op te lossen kan zijn in het complexe milieu van een in vivo model van longinfectie1,15. Elke bevinding met betrekking tot de identificatie van belangrijke factoren die betrokken zijn bij neutrofiele trans-epitheliale migratie met behulp van het in vitro coculturemodel kan vervolgens worden gevalideerd voor relevantie met behulp van in vivo modellen van acute pneumonie15,22.

De in vitro coculture test kan op tal van manieren gemanipuleerd worden om een reeks fenomenen te bestuderen. Studies gericht op bacteriële genen die bijdragen aan de rekrutering van neutrofielen kunnen worden uitgevoerd door beschikbare mutantenbibliotheken te onderzoeken op specifieke pathogenen van belang25,39,40. Genen die uit een dergelijke analyse worden onthuld, kunnen nieuwe virulentiefactoren en potentiële therapeutische doelen voor anti-infectieuze middelen vertegenwoordigen. De neutrofiel kan ook de focus van de analyse vertegenwoordigen. Neutrofielen gebruiken bijvoorbeeld verschillende celoppervlakadhesiemoleculen om transepitheelmigratie te vergemakkelijken5,14,34,41,42. Belangrijke cel-cel interacties kunnen variëren afhankelijk van de chemo-attractant drijvende migratie en het weefsel waarmee de neutrofielen interageren34. Neutrofielen kunnen worden voorbehandeld met remmers, antilichamen of antagonisten voordat pathogene geïnduceerde trans-epitheelmigratie wordt beoordeeld om oppervlaktemoleculen of signaleringsroutes te identificeren die van cruciaal belang zijn voor dit proces22,34. Epitheelcellen spelen een cruciale rol tijdens infectie en ontsteking door signalen te detecteren en te communiceren met immuuncellen via oplosbare mediatoren43. Signaleringsroutes, gepolariseerde afscheiding van chemo-attractanten en epitheliale oppervlakteadhesiemoleculen die interageren met bacteriën of neutrofielen die de door ziekteverwekkers geïnduceerde neutrofiele transepitheelmigratie beïnvloeden, kunnen allemaal worden onderzocht met behulp van de in vitro coculture-test. Toepassing van dit coculture model onthulde het belang van een voorheen niet gewaardeerd lipide eicosanoïde chemo-attractant bekend als hepoxiline A33,18,21. Hepoxiline A3 wordt geproduceerd door zowel long- als intestinale epitheelcellen als reactie op infectie met specifieke pathogenen en is verantwoordelijk voor het drijven van neutrofielen over de gepolariseerde epitheliale monolaag van het basolaterale naar de geïnfecteerde apicale kant3. De in vitro coculture assay dient dus als een robuust verkennend instrument met het potentieel om kritische mechanismen te identificeren die gastheer-pathogene interacties bemiddelen en ontstekingen orkestreren. Verder heeft dit modelsysteem het potentieel om te worden aangepast als een screeningsbenadering met hoge doorvoer om de effectiviteit van selectieve anti-infectieuze of ontstekingsremmende therapieën te beoordelen.

Samenvattend bieden we een gedetailleerd stapsgewijs protocol voor het onderzoeken van de migratie van neutrofielen over een monolaag van met ziekteverwekkers geïnfecteerde longepitheelcellagen die groeien op doorlatende transwellfilters. Technieken die hierin worden beschreven, kunnen worden aangepast om neutrofiele migratie over andere mucosale oppervlakken te bestuderen waar neutrofielen infiltreren in ziektetoestanden zoals het maagdarmkanaal of het urogenitale kanaal. Bovendien zijn inzichten verkregen met behulp van het in vitro coculture assay-systeem waarschijnlijk relevant voor een breed scala aan ontstekingsziekten die niet worden aangedreven door specifieke infectieuze agentia. Ontstekingsziekten van de slijmvliesoppervlakken met neutrofielen die de beschermende epitheelbarrière in een pathologische graad overschrijden, zijn COPD, ARDS, astma en IBD5,10-12. Een dieper begrip van de moleculaire mechanismen die de transepithele migratie van neutrofielen regelen, zal waarschijnlijk therapeutische strategieën informeren die gericht zijn op het verlichten van destructieve ontstekingsprocessen die verband houden met deze veelvoorkomende kwalen, en nieuwe wegen bieden om de menselijke gezondheid te verbeteren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Acknowledgments

Dit werk werd financieel ondersteund door NIH (1 R01 AI095338-01A1).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NCl-H292 cells ATCC CRL-1848
RPMI-1640 medium ATCC 30-2001
Pseudomonas aeruginosa PAO1 ATCC #47085
Escherichia coli MC1000 ATCC #39531
D-PBS (1x) liquid Invitrogen 14190-144 without calcium and magnesium
Heat Inactivated Fetal bovine serum Invitrogen 10082-147 10% added to culture medium
Penicillin-Streptomycin Invitrogen 15140-122 100x: 10,000 units of penicillin and 10,000 µg of streptomycin per ml.
Trypsin-EDTA (0.05%) Invitrogen 25300-062 50 ml aliquots are stored frozen at -20 ºC.  Aliquot in use can be stored at 4 ºC short-term.  
Hank's Balanced Salt Solution - HBSS(-) Invitrogen 14175-079 Sterile, without calcium and magnesium
Trypan Blue Solution Invitrogen 15250-061. Stock = 0.4%
Collagen, Rat Tail Invitrogen A10483-01 Can also be isolated in the laboratory directly from the tails of rats using standard protocols
Citric acid Sigma-Aldrich C1909-500G Component of 1 M citrate buffer and acid citrate dextrose (ACD) solution
Sodium Citrate Sigma-Aldrich S4641-500G Component of 1 M citrate buffer
Dextrose anhydrous Sigma-Aldrich D8066-250G Component of acid citrate dextrose (ACD) solution
Ammonium Chloride Sigma-Aldrich 213330-500G Component of red blood cell (RBC) lysis buffer
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S6014-500G Component of red blood cell (RBC) lysis buffer
EDTA Sigma-Aldrich ED-100G Component of red blood cell (RBC) lysis buffer
HBSS(+) powder Sigma-Aldrich H1387-10L Key component of HBSS+
HEPES Sigma-Aldrich H3375-500G Component of HBSS+
Sigmacote Sigma-Aldrich SL2-25ML Follow vendor instructions to coat glass pipette tips
Triton X-100 Sigma-Aldrich T-9284
2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt (ABTS) Sigma-Aldrich A9941-50TAB Key component of ABTS substrate solution
30% Hydrogen Peroxide Solution Sigma-Aldrich H1009-100ML Component of ABTS substrate solution
N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP or fMLF) Sigma-Aldrich F-3506 A Stock solution of 10 mM in DMSO should be prepared and aliquots stored at -20 ºC.
Gelatin Type B Fisher Scientific M-12026
Pseudomonas isolation agar  Fisher Scientific DF0927-17-1 Follow manufacturer’s instructions to make PIA plates
Ficoll-Paque PLUS  Fisher Scientific 45-001-749 Optional, can improve neutrophil purity
24-well migration plate Corning Incorporated #3524
24-well wash plate Falcon 35-1147 Can be reused if soaked in 70% ethanol and washed thoroughly prior to reuse
96-well plate Fisher Scientific #12565501
Transwell Permeable Supports  Corning Incorporated #3415 Polycarbonate; Diameter: 6.5 mm; Growth area: 0.33 cm2; Dish style: 24-well plate; Pore size: 3.0 µm
Petri dish Falcon 35-1013 Each Petri dish holds 24 inverted 0.33 cm2 Transwells.  
500 ml 0.2 μm filter / flask Fisher Scientific 09-740-25A To sterilize acid citrate dextrose (ACD) solution
5-3/4 in glass Pasteur pipette Fisher Scientific 13-678-20A Coat tips with Sigmacote prior to use
Hemostat Fisher Scientific 13-812-14 Curved, Serrated
Invertoskop Inverted Microscope Zeiss #342222
Versa-Max Microplate Reader Molecular Devices #432789

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Burns, A. R., Smith, C. W., Walker, D. C. Unique structural features that influence neutrophil emigration into the lung. Physiol. Rev. 83, 309-336 (2003).
  2. Hurley, B. P., McCormick, B. A. Intestinal epithelial defense systems protect against bacterial threats. Curr. Gastroenterol. Rep. 6, 355-361 (2004).
  3. McCormick, B. A. Bacterial-induced hepoxilin A3 secretion as a pro-inflammatory mediator. FEBS J. 274, 3513-3518 (2007).
  4. Mumy, K. L., McCormick, B. A. The role of neutrophils in the event of intestinal inflammation. Curr. Opin. Pharmacol. 9, 697-701 (2009).
  5. Chin, A. C., Parkos, C. A. Pathobiology of neutrophil transepithelial migration: implications in mediating epithelial injury. Annu. Rev. Pathol. 2, 111-143 (2007).
  6. Segel, G. B., Halterman, M. W., Lichtman, M. A. The paradox of the neutrophil's role in tissue injury. J. Leukoc. Biol. 89, 359-372 (2011).
  7. Weiss, S. J. Tissue destruction by neutrophils. N. Engl. J. Med. 320, 365-376 (1989).
  8. Hurley, B. P., Thorpe, C. M., Acheson, D. W. Shiga toxin translocation across intestinal epithelial cells is enhanced by neutrophil transmigration. Infect. Immun. 69, 6148-6155 (2001).
  9. Kohler, H., et al. Salmonella enterica serovar Typhimurium regulates intercellular junction proteins and facilitates transepithelial neutrophil and bacterial passage. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 293, 178-187 (2007).
  10. Gane, J., Stockley, R. Mechanisms of neutrophil transmigration across the vascular endothelium in COPD. Thorax. 67, 553-561 (2012).
  11. Grommes, J., Soehnlein, O. Contribution of neutrophils to acute lung injury. Mol. Med. 17, 293-307 (2011).
  12. Nakagome, K., Matsushita, S., Nagata, M. Neutrophilic inflammation in severe asthma. Int. Arch. Allergy Immunol.. 158 Suppl 1, 96-102 (2012).
  13. Choi, E. Y., Santoso, S., Chavakis, T. Mechanisms of neutrophil transendothelial migration. Front. Biosci. 14, 1596-1605 (2009).
  14. Louis, N. A., Campbell, E., Colgan, S. P. Model systems to investigate neutrophil adhesion and chemotaxis. Methods Mol. Biol. 412, 257-270 (2007).
  15. Craig, A., Mai, J., Cai, S., Jeyaseelan, S. Neutrophil recruitment to the lungs during bacterial pneumonia. Infect. Immun. 77, 568-575 (2009).
  16. Hurley, B. P., McCormick, B. A. Translating tissue culture results into animal models: the case of Salmonella typhimurium. Trends Microbiol. 11, 562-569 (2003).
  17. Lee, W. Y., Chin, A. C., Voss, S., Parkos, C. A. In vitro neutrophil transepithelial migration. Methods Mol. Biol. 341, 205-215 (2006).
  18. Hurley, B. P., Siccardi, D., Mrsny, R. J., McCormick, B. A. Polymorphonuclear cell transmigration induced by Pseudomonas aeruginosa requires the eicosanoid hepoxilin A3. J. Immunol. 173, 5712-5720 (2004).
  19. McCormick, B. A., Colgan, S. P., Delp-Archer, C., Miller, S. I., Madara, J. L. Salmonella typhimurium attachment to human intestinal epithelial monolayers: transcellular signalling to subepithelial neutrophils. J. Cell Biol. 123, 895-907 (1993).
  20. McCormick, B. A., et al. Surface attachment of Salmonella typhimurium to intestinal epithelia imprints the subepithelial matrix with gradients chemotactic for neutrophils. J. Cell Biol. 131, 1599-1608 (1995).
  21. Mrsny, R. J., et al. Identification of hepoxilin A3 in inflammatory events: a required role in neutrophil migration across intestinal epithelia. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 7421-7426 (2004).
  22. Tamang, D. L., et al. Hepoxilin A(3) facilitates neutrophilic breach of lipoxygenase-expressing airway epithelial barriers. J. Immunol. 189, 4960-4969 (2012).
  23. McCormick, B. A., Parkos, C. A., Colgan, S. P., Carnes, D. K., Madara, J. L. Apical secretion of a pathogen-elicited epithelial chemoattractant activity in response to surface colonization of intestinal epithelia by Salmonella typhimurium. J. Immunol. 160, 455-466 (1998).
  24. Boll, E. J., et al. Enteroaggregative Escherichia coli promotes transepithelial migration of neutrophils through a conserved 12-lipoxygenase pathway. Cell Microbiol. 14, 120-132 (2012).
  25. Hurley, B. P., et al. The two-component sensor response regulator RoxS/RoxR plays a role in Pseudomonas aeruginosa interactions with airway epithelial cells. Microbes Infect. 12, 190-198 (2010).
  26. Hurley, B. P., Williams, N. L., McCormick, B. A. Involvement of phospholipase A2 in Pseudomonas aeruginosa-mediated PMN transepithelial migration. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 290, L703-L709 (2006).
  27. McCormick, B. A., Siber, A. M., Maurelli, A. T. Requirement of the Shigella flexneri virulence plasmid in the ability to induce trafficking of neutrophils across polarized monolayers of the intestinal epithelium. Infect. Immun. 66, 4237-4243 (1998).
  28. Savkovic, S. D., Koutsouris, A., Hecht, G. Attachment of a noninvasive enteric pathogen, enteropathogenic Escherichia coli, to cultured human intestinal epithelial monolayers induces transmigration of neutrophils. Infect. Immun. 64, 4480-4487 (1996).
  29. Agbor, T. A., Demma, Z. C., Mumy, K. L., Bien, J. D., McCormick, B. A. The ERM protein, ezrin, regulates neutrophil transmigration by modulating the apical localization of MRP2 in response to the SipA effector protein during Salmonella typhimurium infection. Cell Microbiol. 13, 2007-2021 (2011).
  30. Pazos, M., et al. Multidrug resistance-associated transporter 2 regulates mucosal inflammation by facilitating the synthesis of hepoxilin A3. J. Immunol. 181, 8044-8052 (2008).
  31. Agace, W. W., Patarroyo, M., Svensson, M., Carlemalm, E., Svanborg, C. Escherichia coli induces transuroepithelial neutrophil migration by an intercellular adhesion molecule-1-dependent mechanism. Infect. Immun. 63, 4054-4062 (1995).
  32. Bhowmick, R., et al. Systemic Disease during Streptococcus pneumoniae Acute Lung Infection Requires 12-Lipoxygenase-Dependent Inflammation. J. Immunol. , (2013).
  33. Hurley, B. P., Pirzai, W., Mumy, K. L., Gronert, K., McCormick, B. A. Selective eicosanoid-generating capacity of cytoplasmic phospholipase A2 in Pseudomonas aeruginosa-infected epithelial cells. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 300, 286-294 (2011).
  34. Hurley, B. P., Sin, A., McCormick, B. A. Adhesion molecules involved in hepoxilin A3-mediated neutrophil transepithelial migration. Clin. Exp. Immunol. 151, 297-305 (2008).
  35. Frank, D. W. Research Topic on Pseudomonas aeruginosa, Biology, Genetics, and Host-Pathogen Interactions. Front. Microbiol. 3, 20 (2012).
  36. Lyczak, J. B., Cannon, C. L., Pier, G. B. Lung infections associated with cystic fibrosis. Clin. Microbiol. Rev. 15, 194-222 (2002).
  37. Bucior, I., Mostov, K., Engel, J. N. Pseudomonas aeruginosa-mediated damage requires distinct receptors at the apical and basolateral surfaces of the polarized epithelium. Infect. Immun. 78, 939-953 (2010).
  38. Kierbel, A., et al. Pseudomonas aeruginosa exploits a PIP3-dependent pathway to transform apical into basolateral membrane. J. Cell Biol. 177, 21-27 (2007).
  39. Lee, C. A., et al. A secreted Salmonella protein induces a proinflammatory response in epithelial cells, which promotes neutrophil migration. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 12283-12288 (2000).
  40. Zurawski, D. V., Mumy, K. L., Faherty, C. S., McCormick, B. A., Maurelli, A. T. Shigella flexneri type III secretion system effectors OspB and OspF target the nucleus to downregulate the host inflammatory response via interactions with retinoblastoma protein. Mol. Microbiol. 71, 350-368 (2009).
  41. Brazil, J. C., et al. Neutrophil migration across intestinal epithelium: evidence for a role of CD44 in regulating detachment of migrating cells from the luminal surface. J. Immunol. 185, 7026-7036 (2010).
  42. Lawrence, D. W., et al. Antiadhesive role of apical decay-accelerating factor (CD55) in human neutrophil transmigration across mucosal epithelia. J. Exp. Med. 198, 999-1010 (2003).
  43. Hodges, K., Hecht, G. Interspecies communication in the gut, from bacterial delivery to host-cell response. J. Physiol. 590, 433-440 (2012).

Tags

Infectie Cellulaire Biologie Epitheel Neutrofielen Pseudomonas aeruginosa Luchtwegaandoeningen Neutrofielen epitheliale barrières pathogenen transmigratie
<em>In vitro</em> Coculture Assay om pathogene geïnduceerde neutrofiele trans-epitheliale migratie te beoordelen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kusek, M. E., Pazos, M. A., Pirzai,… More

Kusek, M. E., Pazos, M. A., Pirzai, W., Hurley, B. P. In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration. J. Vis. Exp. (83), e50823, doi:10.3791/50823 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter