Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Introduksjon Kokulturanalyse for å vurdere patogenindusert nøytrofil transepiteriemigrasjon

Published: January 6, 2014 doi: 10.3791/50823
Automatic Translation
1,2,3, 1,3, 3, 1,3
1Department of Pediatrics, Harvard Medical School, 2Department of Pediatric Gastroenterology, MGH for Children, 3Mucosal Immunology and Biology Research Center, Massachusetts General Hospital

Summary

Neutrophil trans-epitelial migrasjon som svar på mucosal bakteriell infeksjon bidrar til epitelskade og klinisk sykdom. En in vitro-modell er utviklet som kombinerer patogene, menneskelige nøytrofiler og polariserte menneskelige epitelcellelag dyrket på transwellfiltre for å lette undersøkelser mot å avdekke molekylære mekanismer som orkestrerer dette fenomenet.

Abstract

Mucosal overflater tjener som beskyttende barrierer mot patogene organismer. Medfødte immunresponser aktiveres ved sensing patogen som fører til infiltrasjon av vev med migrerende inflammatoriske celler, primært nøytrofiler. Denne prosessen har potensial til å være ødeleggende for vev hvis overdreven eller holdt i uløst tilstand.  Kokulturerte in vitro-modeller kan brukes til å studere de unike molekylære mekanismene som er involvert i patogenindusert nøytrofil transepitelmigrasjon. Denne typen modell gir allsidighet i eksperimentell design med mulighet for kontrollert manipulering av patogenet, epitelbarrieren eller nøytrofil. Patogen infeksjon av den apikale overflaten av polariserte epitelmonolayers dyrket på gjennomtrengelige transwellfiltre instigates fysiologisk relevant basolateral til apikal trans-epitelial migrasjon av nøytrofiler påført den basolaterale overflaten.  In vitro-modellen som er beskrevet her, demonstrerer de mange trinnene som er nødvendige for å demonstrere nøytrofil migrasjon over en polarisert lungeepitelmonolayer som har blitt smittet med patogen P. aeruginosa (PAO1). Såing og dyrking av gjennomtrengelige transwells med humane avledede lungeepitelceller er beskrevet, sammen med isolering av nøytrofiler fra hele menneskelig blod og dyrking av PAO1 og ikke-patogen K12 E. coli (MC1000).  Utvandringsprosessen og kvantitativ analyse av vellykkede migrerte nøytrofiler som har blitt mobilisert som respons på patogen infeksjon, vises med representative data, inkludert positive og negative kontroller. Dette in vitro-modellsystemet kan manipuleres og påføres andre slimhinneoverflater. Inflammatoriske responser som involverer overdreven nøytrofil infiltrasjon kan være ødeleggende for å være vert for vev og kan oppstå i fravær av patogene infeksjoner. En bedre forståelse av molekylære mekanismer som fremmer nøytrofil trans-epitelial migrasjon gjennom eksperimentell manipulering av in vitro coculture analysesystemet beskrevet heri har betydelig potensial til å identifisere nye terapeutiske mål for en rekke mucosal smittsomme så vel som inflammatoriske sykdommer.

Introduction

Mucosal overflater tjener som fysiske og immunologiske barrierer som gir beskyttelse mot eksterne trusler gjennomgripende i miljøet1,2. Denne beskyttende epitelbarrieren kan kompromitteres når patogene organismer invaderer2. Når det gjelder et bakteriell patogen, initierer dette møtet ofte en inflammatorisk prosess ved å aktivere det medfødte immunforsvaret og utløse en rask mobilisering av første respondergranulocytter kjent som nøytrofiler2-4. Chemotaktiske midler som letter nøytrofilrekruttering, produseres delvis av mucosal epitelceller som søker å kvitte seg med verten for det fornærmende patogenet2-4. Overdreven eller uløst nøytrofil infiltrasjon av mucosal epiteloverflaten kan forårsake betydelig patologi1,5. Dette er en konsekvens av ikke-spesifikk vevsskade forårsaket av det antibakterielle nøytrofilarsenalet5-7. I slike tilfeller er bakteriell clearance kapasitet av nøytrofiler overskygget av ødeleggelse av vertsvev under en smittsom fornærmelse.  Forstyrrelse av den beskyttende epitelbarrierefunksjonen kan føre til økt eksponering av underliggende vev for mikroorganismer og / eller giftstoffer, ytterligere forverrende sykdomspatologi8,9. Disse konsekvensene kan observeres i flere organsystemer, inkludert lunge- og fordøyelseskanalen1,5. Videre er ikke-smittsomme inflammatoriske tilstander som alvorlige utbrudd av astma, kronisk obstruktiv lungesykdom (KOLS), akutt respiratorisk nødsyndrom (ARDS) og inflammatorisk tarmsykdom (IBD) preget av det patologiske bruddet på mucosal epitelbarrieren ved en overdreven nøytrofil respons4,5,10-12.

Den komplekse prosessen med nøytrofilrekruttering etter slimhinneinfeksjon innebærer flere inndelte trinn1,5,13,14. For det første må nøytrofiler avvike fra sirkulasjon via en rekke celle-til-celle interaksjoner som letter trans-endotelial migrasjon1,13. Nøytrofiler navigerer deretter i eksisterende mellomliggende mellomrom som inneholder ekstracellulær matrise1,14. For å nå lumen til den infiserte slimhinnen, må nøytrofiler migrere over epitelbarrieren1,4,5. Dette intrikate multistepfenomenet undersøkes ofte samlet ved hjelp av in vivo dyremodeller av infeksjon15. Slike modeller er nyttige for å fastslå nødvendigheten av spesifikke faktorer, for eksempel kjemokiner, vedheftsmolekyler eller signalveier som deltar i den samlede prosessen, men som i stor grad er utilstrekkelige for å løse molekylære bidrag som er kritiske for hvert distinkte inndelt trinn16. Kokulturerte in vitro-systemer som modellerer trans-endotelial, transmatrise eller transeptelial migrasjon av nøytrofiler har vært spesielt nyttig i denne forbindelse1,14,16,17.

Et robust kokulturanalysesystem er utviklet med det formål å dechiffrere mekanismer som er ansvarlige for nøytrofil transepiteriemigrasjon som svar på patogen infeksjon18-22. Denne modellen innebærer å infisere den apikale overflaten av polariserte menneskelige epitelcellelag med et bakteriell patogen etterfulgt av påføring av nyisolerte menneskelige nøytrofiler til den basolaterale overflaten18-22. Nøytrofiler migrerer over epitelbarrieren som svar på epitel-avledede chemotaktiske produkter utskilt etter patogen infeksjon18,21-23. Dette modellsystemet har blitt brukt ved hjelp av tarm- og lungeepitelkulturer utsatt for passende vevsspesifikke bakterielle patogener og har avduket nye molekylære mekanismer som sannsynligvis er viktige for nøytrofilrekrutteringsprosessen under slimhinneinfeksjon3,8,19,24-28. Styrken til denne in vitro-kokulturmodellen er at en reduksjonistisk tilnærming gjør det mulig for undersøkeren å eksperimentelt manipulere patogenet, epitelbarrieren og / eller nøytrofil i et godt kontrollert, svært reproduserbart, ganske billig system. Innsikt samlet fra denne tilnærmingen kan effektivt utnyttes til å gjennomføre fokusert analyse av inndelte hendelser under nøytrofilrekruttering ved hjelp av in vivo-infeksjonsmodeller 22,29,30.

Denne artikkelen demonstrerer de mange trinnene som er nødvendige for vellykket etablering av denne reproduserbare modellen for å utforske patogenindusert nøytrofil trans-epitelial migrasjon. Lunge epitelial barrierer smittet med patogenet Pseudomonas aeruginosa er omtalt i denne artikkelen; Imidlertid kan andre vevsepilesi og patogener erstattes med mindre modifikasjoner. Såing og dyrking av polariserte lungeepitelecellelag på inverterte kollagenbelagte gjennomtrengelige transwellfiltre er detaljert heri, og det samme er veksten av patogen P. aeruginosa og isolering av nøytrofiler fra hele blodet. Hvordan disse komponentene kombineres for å observere patogenindusert nøytrofil transeptelial migrasjon presenteres sammen med passende positive og negative kontroller for å etablere en reproduserbar analyse. Allsidigheten av denne tilnærmingen for å undersøke ulike aspekter av patogenindusert nøytrofil trans-epitelial migrasjon diskuteres med referanse til spesifikke studier i litteraturen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Trinn (1-3) skal utføres i et sterilt miljø under en laminær strømningshette.

1. Kollagenbelegg Transwells

  1. Lag en 30 μg/ml kollagenoppløsning. Fortynn kollagenbestanden på 3 mg/ml 1:100 i 60 % etanol som har gått gjennom en filterenhet på 0,2 μm.
  2. Virvel fortynnet 30 μg/ml oppløsning. Merk: Det er ikke nødvendig å virvelere 3 mg/ml kollagenbestandsoppløsningen, da denne løsningen er ganske viskøs og luftbobler kan innføres, noe som potensielt kan redusere nøyaktigheten ved pipettering.
  3. Fjern 0,33 cm2 vekstområdetranswells med en porestørrelse på 3 μm fra utvendig emballasje og plasser 24-brønnsplaten som inneholder 12 transwells opp ned inne i hetten.
  4. Løft av bunnplaten og legg den til side. Merk: Transwells vil nå være opp ned hvilende på toppen av lokket på 24-brønnsplaten
  5. Slå på Bunsen brenner. Flammehemostat for sterilitet og la avkjøles.
  6. Med steril hemostat, overfør transwells til en 150 mm x 25 mm Petri-tallerken, og hold dem i omvendt stilling. Merk: Sørg for å opprettholde steriliteten til den tomme 24-brønnsplaten pluss lokket som skal brukes til å huse transwells når de er sådd med epitelceller.
  7. Pipette 70 μl av den 30 μg/ml kollagenoppløsningen på filtermembranen til hver invertert transwell. Merk: Overflatespenningen bør holde dette oppløsningsvolumet på plass, da det ikke er noen vegger rundt filtermembranen når du får tilgang til overflaten på undersiden. Pass på at kollagenoppløsningen ikke drypper ned på siden av transwell og unngår bevegelige transwells under beleggprosedyren.
  8. La lokket på Petri-parabolen stå av i minst 4 timer for å la etanoloppløsningen fordampe. For å opprettholde steriliteten under denne prosessen, hold hetteviften og ultrafiolett lys på.
  9. Etter at transwells har tørket, kan de brukes umiddelbart eller lagres ved romtemperatur i opptil en uke, forutsatt at Petri-paraboldekselet er på plass og steriliteten opprettholdes.

2. Passasjeflaske med epitelceller for såing transwells

(Denne protokollen beskriver spesifikt håndteringen av lungeepitelcellelinjen H292 for generering av epitelbarrierer dyrket på transwells. Andre epitelceller kan brukes med små modifikasjoner.)

  1. Forbered kulturmediet ved å legge til 10% varmeinaktivert foster Bovine Serum (HI-FBS) og 1x Penicillin / Streptomycin til RPMI 1640.
  2. Varme medier, trypsin-EDTA (T-EDTA) og D-PBS i 37 ºC vannbad.
  3. Fjern T-75 kolbe som inneholder celler fra inkubatoren og vurder samløp visuelt med invertert mikroskop. Merk: Når du bruker H292-celler, bør kolber være nær eller helt sammenfølende.
  4. Aspirerte medier fra kolbe. Reduser tiden cellene er tørre ved å ha neste løsning i hetten med hetten løsnet.
  5. Tilsett 5 ml D-PBS til T-75 kolbe og virvel. Unngå å lage bobler. Fjern PBS ved aspirasjon.
  6. Tilsett 3 ml T-EDTA i T-75 kolbe og virvle for å dekke bunnen.
  7. Fjern det meste av T-EDTA, og la det være ca. 0,3 ml i T-75 kolbe.
  8. Fordel det lille gjenværende volumet av T-EDTA over overflaten av cellene og plasser i en fuktet inkubator under standard kulturforhold (37 ºC, 5% CO2).
  9. Etter en periode, fjern kolben fra inkubatoren. Merk: Celler skal lett løsne fra overflaten av kolben ved å banke forsiktig på kolben på siden. Celler skal nå avrundes og flyte når de visualiseres under mikroskopet. Gjennomsnittlig tid dette vil ta for H292 celler er 5-10 min.
  10. Tilsett 10 ml kulturmedier i kolbe for å nøytralisere T-EDTA og resuspendceller. Trekk opp celleløsningen i pipettespissen og løs ut på overflaten av kolben som inneholder celler omtrent fem ganger for å resuspendere alle celler.
  11. Overfør resuspended celler til et 15 ml rør for såing transwells. Merk: Konsentrasjonen av resuspenderte H292-celler fremstilt på denne måten bør variere mellom ca. 1 x 106-1,8 x 106 celler/ml.

3. Seeding Kollagen belagt transwells med epitelceller

  1. Tilsett 70 μl resuspended celleoppløsning fra 15 ml rør til hver invertert kollagenbelagt transwell. Merk: H292 celleløsninger med et konsentrasjonsområde mellom 1 x 106-1,8 x 106 celler/ml vil gi ca. 70 000-120 000 celler/transwell.
  2. Bland cellefjæringen ved å invertere røret forsiktig med jevne mellomrom for å forhindre at celler setter seg til bunnen av 15 ml-røret mens du sår transwells. Merk: Ikke virvelceller og vær forsiktig med at pipettespissen ikke kommer i direkte kontakt med kollagenbelagt membranfilter.
  3. Når alle inverterte transwells har blitt sådd med epitelceller, erstatt Petri parabolen deksel og legg forsiktig i vevskulturinkubatoren, fuktet, 37 ºC, 5% CO2. Pass på at du ikke forstyrrer cellefjæringen som er tilsatt kollagenbelagt filtermembran.
  4. Oppretthold inverterte transwells i vevskulturinkubatoren, fuktet, 37 ºC, 5% CO2 over natten. Merk: Væskeboblen som inneholder celler, skal forbli forbundet med den gjennomtrengelige filtermembranen til transwell gjennom hele natten inkubasjon. Hvis filtermembranen blir tørr på grunn av fordampning av væske eller fordi væsken drypper ned på siden av transwells, kan det hende at epitellagene ikke vokser riktig.
  5. Neste dag, tilsett 1 ml medier i den opprinnelige sterile 24-brønnsplaten og vend hver invertert transwell ved hjelp av en sterilisert hemostat i hver brønn som inneholder 1 ml medier.
  6. Tilsett 0,2 ml medier i det øverste kammeret i hver transwell og gå tilbake til vevskulturinkubator, fuktet, 37   ºC, 5% CO2.
  7. H292 inverterte transwells kan brukes fra 8 dager opp til 1 måned etter sådd. Merk: Vi foreslår at du venter minst 8 dager etter sådd av transwells for å sikre at epitel monolayers har fullt dannet og viser en funksjonell barriere. Man kan teste H292 epitelbarrieren ved å avgjøre om monolayer er i stand til å begrense trans-epitelial flux av proteinhest reddik peroxidase (HRP) etter tillegg til basolateral overflate18.

4. Fremstilling av bakterier for infeksjon av epitellag på transwells

  1. En dag før eksperimentet, trekk ut en koloni av P. aeruginosa PAO1 fra en Pseudomonas Isolation Agar plate og en koloni av K12 E. coli MC1000 fra en Luria-Bertani (LB) Agar plate og plasser i separate rør som inneholder 3 ml LB kjøttkraft. FORSIKTIG: P. aeruginosa er et menneskelig patogen, standard BSL2 sikkerhetstiltak bør vedtas ved håndtering av denne organismen.
  2. Rist over natten ved 225 o/min i et miljø på 37 ºC.
  3. Neste dag, fjern 1 ml fra de tette bakteriekulturene og legg i 1,5 ml Eppendorf-rør.
  4. Spinn i mikrofunksjon ved 15 800 x g i 5 minutter, og fjern deretter supernatanten.
  5. Forbered Hanks' balanserte saltløsning med kalsium og magnesium (HBSS+) på forhånd. Tilsett 23,8 g HEPES og 97,5 g HBSS+ pulver til 9,5 L destillert vann. Tilsett små mengder 10 M NaOH til løsningen, mens du overvåker pH til en stabil pH på 7,4 er nådd. Ta med volum opp til 10 L og oppbevar ved 4 ºC.
  6. Resuspend hver bakteriell pellet med 1 ml HBSS +. Virvel for å være sikker på at en jevn bakteriell suspensjon oppnås.
  7. Spinn igjen på 15,800 x g i 5 min og fjern supernatant.
  8. Resuspend PAO1 pellet med 0,6 ml HBSS+ og MC1000 pellets med 0,5 ml HBSS+. Virvel bakterielle suspensjoner.
  9. Fortynn PAO1- og MC1000-resuspenderte pellets ytterligere 1:100 i HBSS+. Tilsett for eksempel 50 μl av den 0,6 ml PAO1 resuspenderte pellet til 5 ml HBSS+. Merk: Ved hjelp av optisk tetthet (OD) målinger for å bestemme kulturtetthet samt standard kolonidannende enhet (CFU) fortynningsbelegg metodikk, PAO1 og MC1000 løsninger utarbeidet på denne måten konsekvent utbytte mellom 3 x 107-6 x 107 CFU / ml. Tettheten av en bakteriekultur er positivt korrelert med OD-målingen av kulturen ved 600 nm, og denne korrelasjonen kan brukes til å estimere bakteriell cellekonsentrasjon. For å bekrefte bakteriell cellekonsentrasjon kan kulturen fortynnes til en svært lav estimert konsentrasjon og belagt på en agarplate slik at man forventer at mellom 30-200 bakterieceller er til stede på platen. Cellene er spredt over platen og inkubert over natten ved 37 ºC slik at hver celle danner en individuell koloni av celler som er store nok til å være synlige og kolonier kan deretter telles.

5. Isolering av nøytrofiler fra fullblods

  1. Acid citrate dextrose løsning (ACD) brukes som en antikoagulant og fremstilles ved å tilsette 6,9 g sitronsyre, 12,5 g natriumsitrat og 10 g dekstrose til 500 ml destillert vann. Når alle komponentene er oppløst, steriliseres ACD-oppløsningen ved å passere gjennom en 0,2 μm filterenhet. Oppbevar ACD-oppløsning ved 4 ºC.
  2. Før du tegner blod, tilsett 5 ml ACD til 50 ml sprøyte og fest 21 x 3/4 G sommerfuglnål med 12 i slangen.
  3. Påfør tourniquet, tørk venen med alkohol, og sett inn nålen. Merk: Enhver forskningsprotokoll som involverer mennesker må godkjennes av et institusjonelt kontrollutvalg, og skriftlig informert samtykke må gis fra hver blodgiver. Eksperimenter utført ved hjelp av denne protokollen ble for eksempel godkjent av Massachusetts General Hospital Institutional Review Board og tildelt protokoll #1999-P-007782.
  4. Trekk sakte 45 ml blod og sørg for at blodet blandes med ACD en gang i sprøyten.
  5. Når 45 ml er trukket (50 ml totalt volum), løsne turniquet før du fjerner nålen. Påfør straks trykk for å såre med steril gasbind når nålen er fjernet.
  6. Overfør blod sakte nedover siden av et 50 ml rør over ca. 5-10 sek.
  7. Spinn i sentrifuge ved 1000 x g med bremsen deaktivert i 20 minutter ved romtemperatur. Merk: Et ekstra trinn som involverer fortynning av fullblod i PBS- og forsiktig overlegg av fortynnet blod på Ficoll-Paque før sentrifugering kan brukes for å oppnå et litt høyere nivå av nøytrofil renhet ved mer effektivt å skille den buffy kappen fra granulocyttene8. Å utelate dette trinnet tjener til å spare tid uten å drastisk påvirke utbytte eller renhet med henblikk på denne analysen, og dermed favoriserer vi ikke å inkludere blodoverlegget på Ficoll-Paque-trinnet.
  8. Mens blodet spinner, tilsett veldig sakte 1 g gelatin i 50 ml oppvarmet Hanks ' Balansert saltoppløsning uten kalsium og magnesium (HBSS (-)) for å forberede 2% gelatinoppløsning. Oppbevar oppløsningen ved 37 ºC.
  9. Aspirer og kast plasma fra 50 ml blodrøret ved hjelp av en glasspipettespiss som har blitt behandlet med Sigmacote.
  10. Fortsett å aspirere veldig nøye for å fjerne den buffy kappen, som inneholder hvite blodlegemer, inkludert lymfocytter.
  11. Når den buffy kappen sakte fjernes, vil det hvite gule overskyet materiale over det røde blodlegemelaget (RBC) forsvinne. Avslutt aspirasjon når buffy frakk er fjernet og RBC-laget kan tydelig visualiseres når du ser ovenfra røret.
  12. Prøv å ikke forstyrre RBC-laget som granulocytter, for det meste nøytrofiler, er nær overflaten av RBC-laget, men er ikke synlige.
  13. Til et volum på 15 ml RBC-lag, tilsett 30 ml varm 2% gelatinoppløsning (2x volum av RBC-laget).
  14. Inverter røret forsiktig for å blande, og pass på å minimere dannelsen av bobler.
  15. Inkuber ved 37   ºC i 25 min. Merk: RBCer skal aggregere og bosette seg til bunnen. Som et alternativ til gelatin kan stor molekylvektdextrans brukes til sediment RBCs8.
  16. Etter inkubasjon, overfør topplag lys rødaktig løsning som inneholder granulocytter til et nytt 50 ml rør med pipette, vær forsiktig så du ikke forstyrrer det avgjorte mørke RBC-laget under overføring. Kast det mørke RBC-laget når det er separert.
  17. Spinn overført lys rødaktig løsning som inneholder granulocytter og noen RBCer i sentrifuge ved 1000 x g med brems aktivert i 10 minutter ved romtemperatur for å pellet celler.
  18. Hell av eller aspirer supernatanten forsiktig, da den rødlige cellepelletsen som vil danne seg etter sentrifugering generelt er løs.
  19. Forbered RBC lysis buffer på forhånd og lagre ved 4 ºC ved å tilsette 8,29 g ammoniumklorid (NH4Cl), 1 g natriumbikarbonat (NaHCO3) og 0,038 g EDTA til 1 L destillert vann i et beger. Oppbevar RBC lysisbuffer ved 4 ºC.
  20. Resuspend og bryte opp rødaktig cellepellet med et lite volum kald RBC lysis buffer. Når cellepellet er i løsning, fyll røret til 50 ml med RBC lysisbuffer. Merk: På dette tidspunktet og fremover, hold cellene på is eller ved 4 ºC.
  21. Spinn i sentrifuge ved 300 x g i 10 min ved 4   ºC og hell deretter av eller aspirer supernatanten. Merk: Supernatanten vil være noe rødaktig med lysede RBCer. Pelletsen skal være gulaktig hvit på dette tidspunktet. Hvis betydelige RBCer forblir i pelletsen som angitt av en rødaktig pellets, kan trinn 5.20-5.21 gjentas. Betydelige RBCer forblir i cellepellet hvis den rødlige pellet fra trinn 5.20 ikke er brutt opp tilstrekkelig.
  22. Resuspend og bryte opp hvitaktig pellet med et lite volum HBSS (-) og fyll deretter røret til 50 ml med HBSS (-). Merk: HBSS(-) og ikke HBSS+ skal brukes til å resuspendere den hvite cellepelleten. HBSS(-) mangler kalsium og magnesium.
  23. Spinn igjen i sentrifuge ved 300 x g i 10 min ved 4   ºC.
  24. Hell av supernatant og resuspend pellet til et sluttvolum på 1 ml HBSS(-).
  25. Tilsett 5 μl av 1 ml celleoppheng til 250 μl HBSS(-) i et 1,5 ml Eppendorf-rør og bland forsiktig opp og ned med pipette.
  26. Tilsett 25 μl fortynnet celleoppheng til 25 μl 0,4% Trypan blå.
  27. Tilsett 12 μl blanding på hver side av et standard hemocytometer.
  28. Tell antall levende celler som har utelukket Trypan blå fargestoff og er til stede i den midterste firkanten på begge sider av hemocytometeret.
  29. For å beregne cellekonsentrasjonen multipliserer du gjennomsnittet av de 2 rutene med 100 (fortynningsfaktor) og multipliserer deretter med 104 for å gi antall celler/ml.
  30. Juster den endelige konsentrasjonen til 5 x 107 celler/ml. Hvis du er større enn 5 x 107 celler/ml, justerer du ved å legge til HBSS(-). Hvis mindre, pellet cellene og resuspend til riktig volum.
  31. Hold celler på is til de er klare for migrasjonsanalyse. Merk: Disse cellene representerer granulocyttpopulasjonen av hvite blodlegemer. Flertallet av granulocyttene isolert fra hele menneskelig blod er nøytrofiler. Celler holdes på is suspendert i HBSS (-) til tillegg til migrasjonsanalysen for å opprettholde celler i passiv tilstand.

6. Utarbeidelse av epitelcellelag for migrasjonsanalyse

(Disse trinnene trenger ikke utføres i en steril hette.)

  1. Fjern fra inkubator 24-brønns plate som støtter epitellag som har blitt dyrket på undersiden av transwellfiltermembraner i minst åtte dager.
  2. Ta tak i kanten av hver transwell med en hemostat, løft ut av 24-brønnsplaten og inverter transwell over en for å kaste kulturmedier fra transwellens indre kammer. Dypp hver transwell i et vaskebeger som inneholder HBSS+ for å fylle transwellens indre kammer med HBSS+. Kast væske fra det indre kammeret i en.
  3. Gjenta trinn 6.2 for en ny vask i HBSS+. Etter to vasker, plasser transwells i en ny 24-brønns plate som inneholder 1 ml HBSS + i hver brønn. Merk: Alle vasker skal utføres med HBSS+ som er oppvarmet til 37 ºC.
  4. Vær oppmerksom på det øverste kammeret i hver transwell for å vurdere epitelcellelagintegritet. Merk: HBSS+ skal ikke lekke inn i og fylle transwellens øverste kammer når det plasseres i brønnen på en 24-brønnsplate som inneholder 1 ml HBSS+.
  5. Etter nøye å ha observert hver transwell, tilsett 0,2 ml HBSS + i toppkammeret.
  6. Plasser i inkubator ved 37   ºC, 5% CO2 i et fuktet kammer i 30-60 min for å likevekte epitelcellelag.

7. Neutrophil trans-epitelial migrasjon assay

  1. Fjern fra inkubator 24-brønns plate av vasket transwells likevekt i HBSS+.
  2. Ta tak i hver transwell med en hemostat og kast væske i toppen godt inn i en.
  3. Legg hver transwell opp ned i en Petri-tallerken på 150 mm x 25 mm.
  4. Til seks av de inverterte Transwells, tilsett 25 μl HBSS+. Til tre av de inverterte transwells, infisere med 25 μl P. aeruginosa (PAO1) fortynnet i HBSS + tilberedt som beskrevet i trinn 4. Til de tre siste inverterte transwells smitter du med 25 μl E. coli K12 (MC1000) fortynnet i HBSS+ tilberedt som beskrevet i trinn 4. Dette er ca. 0,8 x 106-1,5 x 106 CFUer/epitellag for hver bakterieart siden konsentrasjonen av bakterielle løsninger tilberedt i trinn 4 er ca. 3 x 107-6 x 107 CFU/ml.
  5. Inkuber ved 37   ºC, 5% CO2 i et fuktet kammer i 60 min.
  6. Forbered fMLP som en positiv kontroll for nøytrofil migrasjon ved å legge til 5 μl 10 mM fMLP-lager til 5 ml HBSS + som gir en 10 μM løsning.
  7. Vask transwells ved å gripe med en hemostat og snu tilbake til en 24-brønns vaskeplate som inneholder 1 ml HBSS + i bunnkamrene. Tilsett 0,2 ml HBSS+ i de øverste kamrene.
  8. Grip transwell med en hemostat og fjern fra den første vaskeplaten. Før du plasserer transwells i en annen 24-brønns vaskeplate som inneholder 1 ml HBSS+, kast væske fra toppkammeret i en. Tilsett 0,2 ml HBSS+ i det øverste kammeret.
  9. Gjenta trinn 7.8 en gang til for totalt 3 vasker. Merk: Alle transwells bør utsettes for samme håndterings- og vaskeregime, enten de har blitt smittet med bakterier eller ikke, for å sikre at alle transwells som blir analysert har blitt manipulert på samme måte. En 60 min infeksjon med enten PAO1 eller MC1000 reduserer ikke levedyktighet eller endrer barriereegenskapene til H292 monolayer som vurdert av en laktat dehydrogenase basert toksikologianalyse og HRP flux analyse, henholdsvis18,22.
  10. Forbered 24-brønns trekkplate ved å tilsette 1 ml HBSS+ i 12 brønner på 24-brønnsplaten. Merk: Denne platen kan tilberedes på forhånd.
  11. Etter den tredje vasken, kast væske fra de øverste kamrene av transwells i en ved hjelp av en hemostat og plasser tre av de uinfiserte transwells i tre brønner av 24-brønns migrasjonsplaten som inneholder 1 ml HBSS +, som representerer den negative kontrollen.
  12. Pipette 10 μl av en 10 μM løsning av fMLP i hver av tre brønner i 24-brønns migrasjonsplaten som inneholder 1 ml HBSS+ (100 nM).
  13. Plasser tre av de uinfiserte transwells i tre brønner av 24-brønns migrasjonsplaten som inneholder 100 nM fMLP, som representerer en positiv kontroll for evnen til isolerte nøytrofiler til å migrere.
  14. Plasser tre transwells infisert med PAO1 og tre transwells infisert med MC1000 i tre brønner hver av 24-brønns migrasjonsplaten som inneholder 1 ml HBSS +. Tilsett 0,1 ml HBSS+ i det øverste kammeret i hver transwell.
  15. På toppen av 0,1 ml HBSS+ i hver transwell tilsetter du forsiktig 20 μl nøytrofil suspensjon (5 x 107 celler/ml) tilberedt som beskrevet i trinn 5. Merk: Dette representerer omtrent 1 x 106 nøytrofiler/transwell.
  16. Inkuber ved 37 ºC, 5% CO 2 i et fuktetkammer i 2 timer for å tillate trans-epitelial migrasjon av nøytrofiler.
  17. Forbered en standardkurve for å bestemme antall nøytrofiler som har migrert etter 2 timer. Tilsett 40 μl nøytrofil suspensjon (5 x 107 celler/ml) i 2 ml HBSS (+) og overfør 1 ml til 1 ml HBSS (+) og utfør serielle 2 ganger fortynning åtte ekstra ganger for totalt 10 standarder fra ca. 2000 celler/ml til 1 x 106 celler/ml. Inkluder 1 ml HBSS(+) for blank.
  18. Etter 2 timers migrasjon, løft transwells ved å gripe med en hemostat og trykk forsiktig mot innerveggene på 24-brønns migrasjonsplaten. Kast transwells.
  19. Vurder migrering av nøytrofiler grovt i brønnene ved å se brønner på 24-brønns migrasjonsplaten under et invertert mikroskop ved hjelp av 10X-målet (se figur 1 for bilder av migrerte nøytrofiler i hver tilstand).
  20. Tilsett 50 μl 10% triton X-100 til hver brønn som brukes i 24-brønns migrasjonsplaten, hver standard og den tomme.
  21. Roter 24-brønns migrasjonsplaten, standardene og blank ved lav hastighet i 20 minutter ved 4   ºC.
  22. Klargjør 1 M sitratbuffer på forhånd. Tilsett 52,5 g sitronsyre og 73,5 g natriumsitrat til 400 ml destillert vann i et beger. Bring pH til 4.2. Tilsett destillert vann til sluttløsning på 500 ml. Oppbevar oppløsning ved 4 ºC.
  23. Forbered ABTS substratløsning frisk den dagen. Tilsett 3 ABTS tabletter (10 mg hver) og 5 ml 1 M sitratbuffer til 45 ml destillert vann. La tablettene oppløses helt i oppløsning. Hold tilbake tilsetning av 50 μl 30% hydrogenperoksid til ABTS-substratløsningen er nødvendig (se trinn 7.27).
  24. Tilsett 50 μl sitratbuffer i hver brønn som brukes i 24-brønns migrasjonsplaten, hver standard og den tomme.
  25. Overfør 100 μl av hver prøvebrønn i duplikat til en 96-brønnsplate. Merk: Det er svært viktig å blande innholdet grundig i hver prøvebrønn før du går over til 96-brønnsplaten. Pipette løsningen opp og ned minst fem ganger før overføring.
  26. Overfør 100 μl av hver standard og blank til 96-brønnsplaten etter blanding (blank i duplikat).
  27. Tilsett 50 μl 30% hydrogenperoksid til ABTS-løsningen og virvelen.
  28. Tilsett 100 μl ABTS-substratløsning i hver prøve på 96-brønnsplaten.
  29. La platen utvikle seg i 5-10 min i mørket. Merk: En grønn farge skal utvikle seg i visse brønner, korrelere med antall nøytrofiler som er tilstede i hver brønn.
  30. Les ved bølgelengde på 405 nm ved hjelp av en mikroplateleser.
  31. Beregn antall nøytrofiler som har migrert over epitellaget ved hjelp av standardene der det finnes en lineær positiv korrelasjon mellom det kjente antallet nøytrofiler utarbeidet som standarder og mengden peroksidaseaktivitet målt ved optisk tetthet ved 405 nm (Se figur 2 og 3 for representative data). Merk: Denne metoden for nøytrofil kvantifisering utnytter den store mengden peroksidaseaktivitet utstilt av nøytrofiler på grunn av myeloperoxidaseuttrykk. Alternative tilnærminger for å kvantifisere nøytrofiler kan vurderes, for eksempel metoder som involverer prelabeling nøytrofiler med radioaktivitet eller fluorescensforbindelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Flere studier har vist at patogeninfiserte epitellag letter nøytrofil trans-epitelial migrasjon3,8,19,24-28,31,32. Dette skjer via en patogenspesifikk induksjon av en epitelcelle-avledet nøytrofil kjemoaktisk gradient3,23. For eksempel fører patogen P. aeruginosa som samhandler med den apikale overflaten av lungeepiteleceller til at et betydelig antall nøytrofiler migrerer over epitellaget18,22,25,26,33,34. Dette klinisk relevante analysesystemet kan manipuleres på mange måter for å avdekke nøkkelpatogen og være vert for molekylære bidragsytere når det er parret med passende kontroller.

Nøytrofiler lagt til polariserte epitelcellelag som ikke har blitt preinfected, klarer ikke å migrere over i merkbare tall. Imidlertid vil påføring av en kjemo-tiltrekkende gradient over et uinfert epitellag drive betydelig antall nøytrofiler over. Det er viktig å inkludere henholdsvis disse negative og positive kontrollene i hver analyse når man undersøker nøytrofil migrasjon på tvers av patogeninfiserte epitellag. Den negative kontrollen etablerer bakgrunnsnummeret til nøytrofiler som krysser epitellaget i fravær av signal. Dette tallet bør være svært lavt når dyrkede epitelceller har etablert en funksjonell barriere. Høy bakgrunnsmigrasjon kompliserer tolkning av resultater oppnådd med patogeninfisert epitel. Den positive kontrollen innebærer å bruke en gradient av et nøytrofil kjemo-tiltrekkende middel som fMLP over epitellaget og tjener til å bekrefte at de isolerte nøytrofiler er funksjonelle. Videre, i tilfelle at epitellag er forbehandlet med visse reagenser for å vurdere deres innvirkning på patogenindusert trans-epitelial migrasjon, tjener fMLP-gradienten til å kontrollere for eventuelle effekter reagenset kan ha på nøytrofilers evne til å navigere i epitellaget uavhengig av patogenmediede effekter. En ekstra kontroll som ofte brukes i dette analysesystemet innebærer infeksjon av epitellag med ikke-apatogeniske bakterier parallelt med patogen. Denne kontrollen kan utnyttes til å skille relevante epitelresponser etter interaksjon med bakterier, samt bistå med identifisering av patogene faktorer som er nødvendige for å stimulere nøytrofil transepetelial migrasjon.

Neutrophil trans-epitelial migrasjon kan vurderes både kvalitativt og kvantitativt. Ved ferdigstillelse av 2 timers inkubasjon etter tilsetning av nøytrofiler til basolateraloverflaten, blir transwells fjernet og nøytrofiler som har migrert helt over epitellaget til det apikale kammeret, kan ses i bunnbrønnen til den 24-brønns migrasjonsplaten. Et representativt bilde av hver betingelse vises i figur 1, visualisert ved hjelp av et invertert lysmikroskop. Svært få nøytrofiler ble observert for å migrere over et uinfert epitellag uten en pålagt kjemosaktisk gradient (HBSS+) og representere bakgrunnsnivåer i analysen (Figur 1A). Derimot var en overflod av transmigrerte nøytrofiler tydelig når en fMLP-gradient er gitt (Figur 1B). Infeksjon av epitelet med ikke-patogen E. coli MC1000 resulterte i få synlige transmigrerte nøytrofiler, mens mange transmigrerte nøytrofiler var observerbare når epitellag ble smittet med lungepatogeniske P. aeruginosa (PAO1) (figur 1C og 1D).

Nøytrofiler som har migrert i eksperimentet kvantifiseres ved å måle deres myeloperoxidaseaktivitet. En standardkurve brukes for å muliggjøre en estimering av antall transmigrerte nøytrofiler. Antall nøytrofiler korrelerer positivt med mengden peroksidaseaktivitet målt etter lysis av nøytrofiler med verdier som viser et lineært forhold i området med nøytrofile tall valgt for standardkurven (2 x 103-1 x 106 celler/ml) (Figur 2). Et betydelig antall nøytrofiler migrerer over epitellag som svar på en gitt fMLP-gradient eller som svar på et epitellag infisert med PAO1 (figur 3). Antallet nøytrofiler som migrerer i fravær av stimuli (HBSS+) eller etter apikal epitelinfeksjon med ikke-patogent E. coli MC1000 er under deteksjonsgrensen for analysen (Figur 3). Data presentert i figur 3 representerer gjennomsnittlig antall transmigrerte nøytrofiler med feilfelt som representerer standardavvik for tre uavhengige brønner/tilstand. Kvantitative data som er avbildet i figur 3, samsvarer med representative brønnbilder som vises i figur 1.

Figure 1
Figur 1. Bilde av nøytrofiler etter transepiteriemigrasjon. Bilder ble sett med et invertert lysmikroskop ved 10X forstørrelse av bunnbrønnen (apical chamber) av 24-brønns migrasjonsplaten etter 2 timers inkubasjonsperiode med nøytrofiler lagt til toppbrønnen (basolateralt kammer). (A) Negativ kontroll HBSS+. (B) Positiv kontroll pålagt fMLP kjemoaktisk gradient. (C) Epiteliale cellelag infisert med ikke-patogen E. coli K12 (MC1000). (D) Epiteliale cellelag infisert med patogen P. aeruginosa (PAO1). Klikk her for å vise større bilde.

Figure 2
Figur 2. Nøytrofiler i en startkonsentrasjon på 1 x 106 ble utsatt for ni 2 ganger fortynning. Etter lysis ble mengden peroksidaseaktivitet bestemt og antall nøytrofiler ble grafert på x-aksen med peroksidaseaktivitet på y-aksen. Ligningen som er avbildet kan brukes til å bestemme antall nøytrofiler som er tilstede i hver brønn etter transmigrasjon basert på mengden peroksidaseaktivitet målt i hver brønn. Klikk her for å vise større bilde.

Figure 3
Figur 3. Kvantifisering av transmigrerte nøytrofiler. Antall transmigrerte nøytrofiler kvantifiseres av relativ myeloperoxidaseaktivitet til en lineær standardkurve av kjente antall nøytrofiler. Et betydelig antall transmigrerte nøytrofiler ble observert etter epitelcelleinfeksjon med patogen P. aeruginosa (PAO1) eller etablering av en apikal til basolateral gradient av nøytrofil kjemo-tiltrekkende fMLP. Uoppdagelig antall transmigrerte nøytrofiler ble observert etter epitelcelleinfeksjon med ikke-patogent E. coli K12 (MC1000) behandling eller bare negativ kontrollbuffer (HBSS+). Klikk her for å vise større bilde.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Nøytrofil migrasjon over slimhinne epiteloverflater er et vanlig trekk ved sykdomspatologi etter infeksjon med bakterielle patogener3. Metodikken som er beskrevet her, tilbyr en rask, grei tilnærming for å eksperimentelt isolere denne diskrete hendelsen ved hjelp av en menneskelig celle avledet i vitro kokulturanalysesystem som modellerer en funksjon av den inflammatoriske prosessen utløst av bakterielle infeksjoner. Dette systemet ble opprinnelig utviklet ved hjelp av polariserte intestinale epitelceller infisert med enteriske patogener, inkludert Salmonella typhimurium, Shigella flexneri, og ulike patogene E. coli8,19,24,27,28. Hver av disse patogene organismene er i stand til å drive nøytrofiler over polariserte intestinale epitelmonolayer dyrket på inverterte kollagenbelagte gjennomtrengelige transwellfiltre. Dette eksperimentelle systemet har blitt tilpasset med modifikasjoner for å utforske lunge epitelial barrierer og patogen indusert nøytrofil trans-epitelial migrasjon18,26. Flere epitelcellelinjer for luftveier bortsett fra H292 har blitt brukt til disse studiene, inkludert ofte sitert A549, BEAS-2B og Calu-3 lunge epitelcellelinjer22,26. P. aeruginosa instigates betennelse i lungene forårsaker betydelig skade karakteriserende sykdommer som akutt lungebetennelse og cystisk fibrose35,36. Som beskrevet induserer lungepatogenet P. aeruginosa lett nøytrofil transepiteriemigrasjon ved infeksjon av lungeepitelceller, et bemerkelsesverdig trekk ved den inflammatoriske prosessen observert i lungebetennelse og cystisk fibrose. Videre har flere ekstra stammer av P. aeruginosa inkludert kliniske isolasjoner fra cystiske fibrosepasienter blitt validert som indusere i denne analysen25. Streptococcus pneumoniae og Klebsiella pneumoniae, Gram-positive og Gram-negative bakterielle patogener, henholdsvis, er ofte forbundet med lungebetennelse og har vist seg å være i stand til å indusere nøytrofil transepiteriemigrasjon ved hjelp av in vitro-kokulturmodellen 26,32. Dermed tilbyr dette modellsystemet en robust in vitro-tilnærming ved hjelp av menneskelige avledede celler for å utforske inflammatoriske prosesser som er initiert av slimhinnepatogener.

Standard vevskulturbaserte modeller som ofte brukes til å utforske vertspatogeninteraksjoner, bruker vanligvis epitelceller dyrket på flate plastoverflater16. In vitro coculture-analysen gir en større grad av kompleksitet som gir allsidighet i eksperimentell design16,37,38. Polariserte epitelceller dyrket på undersiden av gjennomtrengelige transwellfiltre skaper et apikalt rom som vender mot bunnkammeret når de plasseres i en 24-brønns plate og et basolateralt rom som vender mot innsiden av toppen av transwell14,17. Denne diskrete oppdelingen og retningsretningen gjør det mulig å analysere fysiologiske basolaterale til apikale migrasjon av nøytrofiler som svar på pålagte eller epitelformede cellegenererte kjemoaktiske gradienter14,17,23. In vitro-kokultursystemet gjør det mulig å undersøke spesifikke molekylære mekanismer som kan tilskrives transepitelmigrasjon, noe som kan være vanskelig å løse i det komplekse miljøet til en in vivo-modell av lungeinfeksjon1,15. Ethvert funn angående identifisering av nøkkelfaktorer involvert i nøytrofil trans-epitelial migrasjon ved hjelp av in vitro-kokulturmodellen kan deretter valideres for relevans ved hjelp av in vivo-modeller av akutt lungebetennelse15,22.

In vitro-kokulturanalysen kan manipuleres på mange måter for å studere en rekke fenomener. Studier fokusert på bakterielle gener som bidrar til nøytrofilrekruttering kan utføres ved å analyse av tilgjengelige mutantbiblioteker for spesifikke patogener av interesse25,39,40. Gener avslørt fra slik analyse kan representere nye virulensfaktorer og potensielle terapeutiske mål for antiinfektive midler. Nøytrofil kan også representere analysefokuset. For eksempel bruker nøytrofiler flere celleoverflateadhesjonsmolekyler for å lette trans-epitelmigrasjon5,14,34,41,42. Viktige celle-til-celle interaksjoner kan variere avhengig av kjemo-tiltrekkende drivende migrasjon og vevet som nøytrofiler samhandler34. Nøytrofiler kan forbehandles med inhibitorer, antistoffer eller antagonister før de vurderer patogenindusert transepiteriemigrasjon for å identifisere overflatemolekyler eller signalveier som er kritiske for denne prosessen22,34. Epitelceller tjener en kritisk rolle under infeksjon og betennelse ved å føle signaler og kommunisere med immunceller gjennom løselige mediatorer43. Signalveier, polarisert sekresjon av kjemo-tiltrekkende midler og epitelial overflateadhesjonsmolekyler som samhandler med enten bakterier eller nøytrofiler som påvirker patogenindusert nøytrofil transepiteriemigrasjon, kan alle undersøkes ved hjelp av in vitro-kokulturanalysen. Anvendelsen av denne kokulturmodellen avslørte viktigheten av en tidligere ikke verdsatt lipid eicosanoid kjemo-tiltrekkende kjent som hepoxilin A33,18,21. Hepoxilin A3 produseres av både lunge- og tarmepitelceller som svar på infeksjon med spesifikke patogener og er ansvarlig for å kjøre nøytrofiler over den polariserte epitelmonolayeren fra basolateral til den infiserte apikale siden3. Dermed fungerer in vitro-kokulturanalysen som et robust utforskende verktøy med potensial til å identifisere kritiske mekanismer som formidler vertspatogeninteraksjoner og orkestrerer betennelse. Videre har dette modellsystemet potensial til å bli tilpasset som en høy gjennomstrømning screening tilnærming for å vurdere effektiviteten av selektive antiinfektive eller antiinflammatoriske terapeutiske midler.

I oppsummering gir vi en detaljert trinnvis protokoll for å undersøke migrering av nøytrofiler over en monolayer av patogeninfiserte lungeepitelcellelag dyrket på gjennomtrengelige transwellfiltre. Teknikker beskrevet heri kan modifiseres for å studere nøytrofil migrasjon over andre mucosale overflater der nøytrofiler infiltrerer i sykdomstilstander som mage-tarmkanalen eller genitourinary tract. I tillegg er innsikt oppnådd ved hjelp av in vitro coculture analysesystem sannsynligvis relevant for et bredt spekter av inflammatoriske sykdommer som ikke er drevet av spesifikke smittsomme stoffer. Inflammatoriske sykdommer i slimhinnen overflater som har nøytrofiler som krysser den beskyttende epitelbarrieren til en patologisk grad inkluderer KOLS, ARDS, astma og IBD5,10-12. En dypere forståelse av de molekylære mekanismene som styrer nøytrofil trans-epitelial migrasjon vil sannsynligvis informere terapeutiske strategier rettet mot å lindre destruktive inflammatoriske prosesser forbundet med disse vanlige plagene, og gi nye veier for å forbedre menneskers helse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de ikke har konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet økonomisk av NIH (1 R01 AI095338-01A1).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NCl-H292 cells ATCC CRL-1848
RPMI-1640 medium ATCC 30-2001
Pseudomonas aeruginosa PAO1 ATCC #47085
Escherichia coli MC1000 ATCC #39531
D-PBS (1x) liquid Invitrogen 14190-144 without calcium and magnesium
Heat Inactivated Fetal bovine serum Invitrogen 10082-147 10% added to culture medium
Penicillin-Streptomycin Invitrogen 15140-122 100x: 10,000 units of penicillin and 10,000 µg of streptomycin per ml.
Trypsin-EDTA (0.05%) Invitrogen 25300-062 50 ml aliquots are stored frozen at -20 ºC.  Aliquot in use can be stored at 4 ºC short-term.  
Hank's Balanced Salt Solution - HBSS(-) Invitrogen 14175-079 Sterile, without calcium and magnesium
Trypan Blue Solution Invitrogen 15250-061. Stock = 0.4%
Collagen, Rat Tail Invitrogen A10483-01 Can also be isolated in the laboratory directly from the tails of rats using standard protocols
Citric acid Sigma-Aldrich C1909-500G Component of 1 M citrate buffer and acid citrate dextrose (ACD) solution
Sodium Citrate Sigma-Aldrich S4641-500G Component of 1 M citrate buffer
Dextrose anhydrous Sigma-Aldrich D8066-250G Component of acid citrate dextrose (ACD) solution
Ammonium Chloride Sigma-Aldrich 213330-500G Component of red blood cell (RBC) lysis buffer
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S6014-500G Component of red blood cell (RBC) lysis buffer
EDTA Sigma-Aldrich ED-100G Component of red blood cell (RBC) lysis buffer
HBSS(+) powder Sigma-Aldrich H1387-10L Key component of HBSS+
HEPES Sigma-Aldrich H3375-500G Component of HBSS+
Sigmacote Sigma-Aldrich SL2-25ML Follow vendor instructions to coat glass pipette tips
Triton X-100 Sigma-Aldrich T-9284
2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt (ABTS) Sigma-Aldrich A9941-50TAB Key component of ABTS substrate solution
30% Hydrogen Peroxide Solution Sigma-Aldrich H1009-100ML Component of ABTS substrate solution
N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP or fMLF) Sigma-Aldrich F-3506 A Stock solution of 10 mM in DMSO should be prepared and aliquots stored at -20 ºC.
Gelatin Type B Fisher Scientific M-12026
Pseudomonas isolation agar  Fisher Scientific DF0927-17-1 Follow manufacturer’s instructions to make PIA plates
Ficoll-Paque PLUS  Fisher Scientific 45-001-749 Optional, can improve neutrophil purity
24-well migration plate Corning Incorporated #3524
24-well wash plate Falcon 35-1147 Can be reused if soaked in 70% ethanol and washed thoroughly prior to reuse
96-well plate Fisher Scientific #12565501
Transwell Permeable Supports  Corning Incorporated #3415 Polycarbonate; Diameter: 6.5 mm; Growth area: 0.33 cm2; Dish style: 24-well plate; Pore size: 3.0 µm
Petri dish Falcon 35-1013 Each Petri dish holds 24 inverted 0.33 cm2 Transwells.  
500 ml 0.2 μm filter / flask Fisher Scientific 09-740-25A To sterilize acid citrate dextrose (ACD) solution
5-3/4 in glass Pasteur pipette Fisher Scientific 13-678-20A Coat tips with Sigmacote prior to use
Hemostat Fisher Scientific 13-812-14 Curved, Serrated
Invertoskop Inverted Microscope Zeiss #342222
Versa-Max Microplate Reader Molecular Devices #432789

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Burns, A. R., Smith, C. W., Walker, D. C. Unique structural features that influence neutrophil emigration into the lung. Physiol. Rev. 83, 309-336 (2003).
  2. Hurley, B. P., McCormick, B. A. Intestinal epithelial defense systems protect against bacterial threats. Curr. Gastroenterol. Rep. 6, 355-361 (2004).
  3. McCormick, B. A. Bacterial-induced hepoxilin A3 secretion as a pro-inflammatory mediator. FEBS J. 274, 3513-3518 (2007).
  4. Mumy, K. L., McCormick, B. A. The role of neutrophils in the event of intestinal inflammation. Curr. Opin. Pharmacol. 9, 697-701 (2009).
  5. Chin, A. C., Parkos, C. A. Pathobiology of neutrophil transepithelial migration: implications in mediating epithelial injury. Annu. Rev. Pathol. 2, 111-143 (2007).
  6. Segel, G. B., Halterman, M. W., Lichtman, M. A. The paradox of the neutrophil's role in tissue injury. J. Leukoc. Biol. 89, 359-372 (2011).
  7. Weiss, S. J. Tissue destruction by neutrophils. N. Engl. J. Med. 320, 365-376 (1989).
  8. Hurley, B. P., Thorpe, C. M., Acheson, D. W. Shiga toxin translocation across intestinal epithelial cells is enhanced by neutrophil transmigration. Infect. Immun. 69, 6148-6155 (2001).
  9. Kohler, H., et al. Salmonella enterica serovar Typhimurium regulates intercellular junction proteins and facilitates transepithelial neutrophil and bacterial passage. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 293, 178-187 (2007).
  10. Gane, J., Stockley, R. Mechanisms of neutrophil transmigration across the vascular endothelium in COPD. Thorax. 67, 553-561 (2012).
  11. Grommes, J., Soehnlein, O. Contribution of neutrophils to acute lung injury. Mol. Med. 17, 293-307 (2011).
  12. Nakagome, K., Matsushita, S., Nagata, M. Neutrophilic inflammation in severe asthma. Int. Arch. Allergy Immunol.. 158 Suppl 1, 96-102 (2012).
  13. Choi, E. Y., Santoso, S., Chavakis, T. Mechanisms of neutrophil transendothelial migration. Front. Biosci. 14, 1596-1605 (2009).
  14. Louis, N. A., Campbell, E., Colgan, S. P. Model systems to investigate neutrophil adhesion and chemotaxis. Methods Mol. Biol. 412, 257-270 (2007).
  15. Craig, A., Mai, J., Cai, S., Jeyaseelan, S. Neutrophil recruitment to the lungs during bacterial pneumonia. Infect. Immun. 77, 568-575 (2009).
  16. Hurley, B. P., McCormick, B. A. Translating tissue culture results into animal models: the case of Salmonella typhimurium. Trends Microbiol. 11, 562-569 (2003).
  17. Lee, W. Y., Chin, A. C., Voss, S., Parkos, C. A. In vitro neutrophil transepithelial migration. Methods Mol. Biol. 341, 205-215 (2006).
  18. Hurley, B. P., Siccardi, D., Mrsny, R. J., McCormick, B. A. Polymorphonuclear cell transmigration induced by Pseudomonas aeruginosa requires the eicosanoid hepoxilin A3. J. Immunol. 173, 5712-5720 (2004).
  19. McCormick, B. A., Colgan, S. P., Delp-Archer, C., Miller, S. I., Madara, J. L. Salmonella typhimurium attachment to human intestinal epithelial monolayers: transcellular signalling to subepithelial neutrophils. J. Cell Biol. 123, 895-907 (1993).
  20. McCormick, B. A., et al. Surface attachment of Salmonella typhimurium to intestinal epithelia imprints the subepithelial matrix with gradients chemotactic for neutrophils. J. Cell Biol. 131, 1599-1608 (1995).
  21. Mrsny, R. J., et al. Identification of hepoxilin A3 in inflammatory events: a required role in neutrophil migration across intestinal epithelia. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 7421-7426 (2004).
  22. Tamang, D. L., et al. Hepoxilin A(3) facilitates neutrophilic breach of lipoxygenase-expressing airway epithelial barriers. J. Immunol. 189, 4960-4969 (2012).
  23. McCormick, B. A., Parkos, C. A., Colgan, S. P., Carnes, D. K., Madara, J. L. Apical secretion of a pathogen-elicited epithelial chemoattractant activity in response to surface colonization of intestinal epithelia by Salmonella typhimurium. J. Immunol. 160, 455-466 (1998).
  24. Boll, E. J., et al. Enteroaggregative Escherichia coli promotes transepithelial migration of neutrophils through a conserved 12-lipoxygenase pathway. Cell Microbiol. 14, 120-132 (2012).
  25. Hurley, B. P., et al. The two-component sensor response regulator RoxS/RoxR plays a role in Pseudomonas aeruginosa interactions with airway epithelial cells. Microbes Infect. 12, 190-198 (2010).
  26. Hurley, B. P., Williams, N. L., McCormick, B. A. Involvement of phospholipase A2 in Pseudomonas aeruginosa-mediated PMN transepithelial migration. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 290, L703-L709 (2006).
  27. McCormick, B. A., Siber, A. M., Maurelli, A. T. Requirement of the Shigella flexneri virulence plasmid in the ability to induce trafficking of neutrophils across polarized monolayers of the intestinal epithelium. Infect. Immun. 66, 4237-4243 (1998).
  28. Savkovic, S. D., Koutsouris, A., Hecht, G. Attachment of a noninvasive enteric pathogen, enteropathogenic Escherichia coli, to cultured human intestinal epithelial monolayers induces transmigration of neutrophils. Infect. Immun. 64, 4480-4487 (1996).
  29. Agbor, T. A., Demma, Z. C., Mumy, K. L., Bien, J. D., McCormick, B. A. The ERM protein, ezrin, regulates neutrophil transmigration by modulating the apical localization of MRP2 in response to the SipA effector protein during Salmonella typhimurium infection. Cell Microbiol. 13, 2007-2021 (2011).
  30. Pazos, M., et al. Multidrug resistance-associated transporter 2 regulates mucosal inflammation by facilitating the synthesis of hepoxilin A3. J. Immunol. 181, 8044-8052 (2008).
  31. Agace, W. W., Patarroyo, M., Svensson, M., Carlemalm, E., Svanborg, C. Escherichia coli induces transuroepithelial neutrophil migration by an intercellular adhesion molecule-1-dependent mechanism. Infect. Immun. 63, 4054-4062 (1995).
  32. Bhowmick, R., et al. Systemic Disease during Streptococcus pneumoniae Acute Lung Infection Requires 12-Lipoxygenase-Dependent Inflammation. J. Immunol. , (2013).
  33. Hurley, B. P., Pirzai, W., Mumy, K. L., Gronert, K., McCormick, B. A. Selective eicosanoid-generating capacity of cytoplasmic phospholipase A2 in Pseudomonas aeruginosa-infected epithelial cells. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 300, 286-294 (2011).
  34. Hurley, B. P., Sin, A., McCormick, B. A. Adhesion molecules involved in hepoxilin A3-mediated neutrophil transepithelial migration. Clin. Exp. Immunol. 151, 297-305 (2008).
  35. Frank, D. W. Research Topic on Pseudomonas aeruginosa, Biology, Genetics, and Host-Pathogen Interactions. Front. Microbiol. 3, 20 (2012).
  36. Lyczak, J. B., Cannon, C. L., Pier, G. B. Lung infections associated with cystic fibrosis. Clin. Microbiol. Rev. 15, 194-222 (2002).
  37. Bucior, I., Mostov, K., Engel, J. N. Pseudomonas aeruginosa-mediated damage requires distinct receptors at the apical and basolateral surfaces of the polarized epithelium. Infect. Immun. 78, 939-953 (2010).
  38. Kierbel, A., et al. Pseudomonas aeruginosa exploits a PIP3-dependent pathway to transform apical into basolateral membrane. J. Cell Biol. 177, 21-27 (2007).
  39. Lee, C. A., et al. A secreted Salmonella protein induces a proinflammatory response in epithelial cells, which promotes neutrophil migration. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 12283-12288 (2000).
  40. Zurawski, D. V., Mumy, K. L., Faherty, C. S., McCormick, B. A., Maurelli, A. T. Shigella flexneri type III secretion system effectors OspB and OspF target the nucleus to downregulate the host inflammatory response via interactions with retinoblastoma protein. Mol. Microbiol. 71, 350-368 (2009).
  41. Brazil, J. C., et al. Neutrophil migration across intestinal epithelium: evidence for a role of CD44 in regulating detachment of migrating cells from the luminal surface. J. Immunol. 185, 7026-7036 (2010).
  42. Lawrence, D. W., et al. Antiadhesive role of apical decay-accelerating factor (CD55) in human neutrophil transmigration across mucosal epithelia. J. Exp. Med. 198, 999-1010 (2003).
  43. Hodges, K., Hecht, G. Interspecies communication in the gut, from bacterial delivery to host-cell response. J. Physiol. 590, 433-440 (2012).

Tags

Infeksjon Utgave 83 Cellulær biologi Epitel Nøytrofiler Pseudomonas aeruginosa Luftveissykdommer Nøytrofiler epitelbarrierer patogener transmigrasjon
<em>Introduksjon</em> Kokulturanalyse for å vurdere patogenindusert nøytrofil transepiteriemigrasjon
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kusek, M. E., Pazos, M. A., Pirzai,… More

Kusek, M. E., Pazos, M. A., Pirzai, W., Hurley, B. P. In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration. J. Vis. Exp. (83), e50823, doi:10.3791/50823 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter