Summary
Zebrafish sono stati uno strumento prezioso per molte aree di ricerca. Qui mostriamo un metodo per provocare una risposta visiva e calcolare una acuità visiva funzionale nel zebrafish adulto.
Abstract
Zebrafish sono un modello collaudato per la ricerca di visione, tuttavia molti dei metodi precedenti generalmente focalizzati su larve o dimostrato una semplice risposta. Più di recente comportamento visivo adulto in zebrafish è diventato di interesse, ma i metodi per misurare risposte specifiche sono nuova venuta. Per colmare questa lacuna, abbiamo deciso di sviluppare una metodologia per utilizzare ripetutamente e con precisione la risposta optocinetico (okr) per misurare l'acuità visiva in zebrafish adulto. Qui mostriamo che l'acuità visiva del zebrafish adulto può essere misurata, inclusi sia i acuità visiva binoculare e monoculare. Poiché il pesce non è danneggiato durante la procedura, l'acuità visiva può essere misurato e confrontato su brevi o lunghi periodi di tempo. Le misure di acuità visiva qui descritte possono anche essere fatto in fretta per consentire un elevato throughput e per le procedure visivi supplementari se lo desideri. Questo tipo di analisi è favorevole a studi di intervento droga o ricerche di progressione della malattia.
Introduction
Zebrafish (Danio rerio) sono un buon modello per studiare la fisiologia visiva a causa della somiglianza della loro retina ad altri vertebrati, il loro ciclo di vita breve, e la disponibilità di mutanti geneticamente modificati 1,2. Il riflesso optocinetico / risposta / nistagmo (okr) è una combinazione di esercizio regolare e rapidi movimenti oculari saccadi. Per oltre 60 anni i clinici hanno dimostrato che la OKR può essere utilizzato per misurare oggettivamente acuità visiva in pazienti ed è particolarmente utile per determinare infantili capacità visive 3-5. Il primo uso documentato di okr in animali stava usando piccioni nel 1950 6. Più di recente, il okr è diventato uno strumento prezioso per valutare la funzione visiva in zebrafish larvale ed è spesso usato per schermare per mutanti genetici che hanno una compromissione 1,2 visiva. Mentre il OKR è stato ampiamente utilizzato per determinare la funzione visiva in zebrafish larvale ma solo recentemente è stato dimostrato in zebra adultopescare 7-10. Un recente articolo di Tappeiner et al. Utilizza un sistema di optomotor disponibile in commercio tradizionalmente usato per i topi, OptoMotry, per dimostrare che l'acuità visiva di zebrafish adulto rimane abbastanza costante, ~ 0.59 cicli per grado (CPD), anche attraverso diverse velocità angolari 7 .
Sebbene il OKR ha dimostrato di essere molto utile in studi zebrafish larvali, altri metodi per comportamento visivo sono stati utilizzati in zebrafish adulti con vari gradi di successo. Il saggio di risposta di fuga dimostrato che albino e rubino zebrafish, entrambi mutanti pigmentazione, hanno ridotto risposte visive in condizioni di luce intensa 11,12. Questa stessa analisi di risposta di fuga è successo anche individuato cecità notturna d mutanti, anche se a 2 anni di 13 anni. Tuttavia, il saggio risposta escape non è senza difetti. E 'difficile attribuire a una funzione visiva esatta ed è solo un approximatio lordon di cambiamenti visivi - il che significa che ci vuole un grande cambiamento prima che venga identificato il cambiamento.
Un altro metodo che è stato sviluppato per identificare zebrafish adulto con disabilità visive è la risposta optomotor (OMR) 11. In questo saggio, pesce è messo in una vasca circolare con una colonna opaca al centro. Strisce bianche e nere ruotano attorno al serbatoio e il pesce ha il compito di nuotare nella direzione del moto striscia. Come la risposta di fuga, l'OMR si concentra sulle capacità visuomotori di zebrafish adulto. Si è tuttavia usato con successo per identificare pesce con problemi di vista, come i mutanti lrp2/bugeye 14. I lrp2/bugeye buftalmo espositive zebrafish, elevata pressione intraoculare, diminuiti OMR, e progressiva degenerazione retinica 14,15.
Molti studi hanno utilizzato le funzionalità visuomotori di zebrafish adulto, che sono spesso soggettivi e non possono essere quantitatively analizzato. Utilizzando il okr, si può studiare l'acuità visiva dei pesci adulti più obiettiva. Abbiamo costruito il nostro dispositivo okr, sul modello di quello inizialmente usato per gli studi larvali 1. In questo studio dimostriamo che la okr può essere usata per calcolare sia monoculare e binoculare acuità visiva in zebrafish.
Protocol
Tutti zootecnia e gli esperimenti devono essere autorizzati e condotte in conformità con le linee guida definite dal Comitato Istituzionale cura degli animali ed uso del rispettivo ente o di altri requisiti di legge.
1. Cura Zebrafish
- Mantenere zebrafish in condizioni standard a 28,5 ° C in un ciclo di 10 ore buio-luce 14 hr 16.
- Tenere zebrafish adulto ad una densità deposito di circa 3 pesce / L.
2. Risposta Optokinetic (okr)
- Costruisci il dispositivo di registrazione okr personalizzata con un diametro di 14,5 centimetri tamburo rotante, un microscopio stereo con impostazioni di intensità della luce regolabile (300-8,000 lux) e un computer (Figura 1a).
- Attaccare una fotocamera al microscopio che fornirà un live feed su un monitor adiacente e consentire l'acquisizione e la registrazione di immagini.
- Controllare il tamburo rotante utilizzando un microcontrollore collegato a un computer che accommoData di varie selezioni di velocità e direzione.
- Anestetizzare il pesce in 0,016% tricaine per 2-3 minuti e poi mettere il pesce su una piccola piattaforma con gli occhi e le branchie sospesi sopra il bordo.
- Posizionare un sottile spugna / asciugamano sopra il corpo del pesce e il pin 2-3 pezzi di schiuma, sagomati per ospitare il pesce, sopra il pesce per tenerlo immobilizzato. Limitando il movimento della coda del pesce è risultato essere un aspetto cruciale per l'immobilizzazione senza causare lesioni ai pesci, e fu meglio realizzato utilizzando un pezzo di schiuma. (Figura 1b)
- Posizionare il pesce in una vasca piena d'acqua cilindrico, che si inserisce all'interno del tamburo rotante del dispositivo di registrazione OKR. Utilizzare magneti sulla piattaforma per posizionare il pesce montante, con gli occhi circa 7,3 cm dal bordo del tamburo. I pesci dovrebbero rilanciare dall'anestesia in pochi minuti - la respirazione normale riprenderà e movimenti oculari casuali deve essere rispettato.
- Mettere un bassorilievoe grata di 0,07 cicli per grado (CPD) nel tamburo rotante e coinvolgere i comandi del computer per iniziare a rotazione e di acquisizione video (una velocità di 12 giri al minuto è stato utilizzato per questo lavoro, ma una velocità di 8-16 rpm dovrebbero dare risultati simili).
- Dopo un primo okr è suscitato dalla base reticolo, mettere in pausa la rotazione brevemente, e sostituire la grata di una griglia più piccola (più alta frequenza spaziale).
- Ripetere questo processo fino a quando un okr non può più essere suscitato. Ripetere il test con la grata più piccola che ha provocato un OKR seguendo un approccio scala modificata e quindi ripetere utilizzando la grata che non è riuscito a provocare una risposta di verifica delle perdite del OKR. Questo processo può essere ripetuto per verificare una vera risposta al più piccolo reticolo rilevabile se il reticolo finale differente rispetto alla prima estinzione.
- Ottenere misure di acuità monoculare mettendo una plastica occlusore nero sopra le strisce adiacenti all'occhio opposto. Ripetere la procedura di cui sopra (punti 2.6-2.7).
- Ottenere l'acutezza dell'occhio opposto riposizionando il occluder e ripetendo di nuovo la procedura 2,6-2,7.
- Nota la distanza di ogni occhio è dalle strisce durante la procedura di test utilizzando la striscia di misurazione di riferimento sotto il serbatoio pesce in modo che le misure di acuità accurate possono essere calcolate nei seguenti passi.
3. Calcolo acuità visiva
- Ottenere l'acuità visiva calcolando la CPD:
dove a è la distanza dal centro della lente alla grata, e h è la lunghezza di un ciclo del reticolo più piccola alla quale OKR stato osservato (figura 1c). - Per le misure di acuità visiva combinati, la media viene utilizzato un valore sia dal occhio destro e sinistro.
dove a è la distanza dal centro della lente alla grata, e h è la lunghezza di un ciclo del reticolo più piccola alla quale OKR stato osservato (figura 1c). Representative Results
Okr funzionalità del dispositivo
Il dispositivo OKR come spiegato sopra e mostrato in Figura 1 funziona con una manutenzione minima. Come osservato nella fase 2.3, immobilizzando la coda è fondamentale per mantenere il pesce trattenuto durante la registrazione. Sufficientemente immobilizzato, i pesci possono essere tenuti nel dispositivo okr per periodi di tempo prolungati. Di conseguenza, occorre prestare attenzione durante le fasi iniziali di immobilizzazione, in modo che più dati possono essere raccolti per ogni singolo pesce.
Misure di acuità visiva
Il binocolo okr è facilmente raggiunta in normale pesci adulti. Seguendo la procedura di cui sopra si possono trovare acuità visiva per zebrafish di molte età (Figura 2). La migliore acuità spaziale binoculare abbiamo registrato era 0,74 CPD. Come osservato in Figura 2, l'acuità binoculare generalmente aumenta con l'età (n = 46, p = 0,002 ANOVA utilizzando SPSS v14), ma si livelladopo circa 12 mesi di età. Quando abbiamo confrontato l'acuità visiva misurata in 5 mesi wild type pesce pari età lrp2/bugeye pesce, abbiamo scoperto che il pesce lrp2/bugeye ha ridotto significativamente l'acuità (p <0,001; wild-type: 0.49 ± 0.05 CPD; n = 8; lrp2/bugeye: 0.35 ± 0.06, n = 10; T-test di Student utilizzando Excel).
Occludendo l'occhio destro l'acuità visiva per l'occhio sinistro può essere determinato e viceversa. Rispetto alla acutezza binoculare, sommatoria binocolo si osserva in modo simile alla visione umana 17 (Figura 3). L'acuità binoculare era generalmente il 5-10% in più rispetto sia a destra (OD) oa sinistra (OS) acutezza misurati in maniera indipendente. Per alcuni singoli pesci la differenza era un miglioramento del 25%.
Figura 1. Reco okrrding. A) Il dispositivo okr è costituito da un diametro di 14,5 centimetri tamburo e microscopio con le impostazioni di intensità di luce regolabile (300-8,000 lux) rotante. Una telecamera fornisce un feed in tempo reale su un monitor adiacente. Il tamburo rotante ha diverse impostazioni di velocità in entrambe le direzioni in senso orario e antiorario e grate di frequenze spaziali intercambiabili sono inserito e rimosso come necessario. B) I pesci sono garantiti e posta al centro del tamburo rotante. C) Cicli per grado (CPD) è calcolato utilizzando CPD = 
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Figura 2. L'acuità visiva cambia con l'età. Il grafico mostra acuità visiva indipendenti di misura 5 - 15 mesi di età. L'acuità visiva aumenta in generale per tutto il primo anno di sviluppo e poi code fuori un po 'a 15 mesi di età (p = 0.002 ANOVA utilizzando SPSS v14). Ogni punto può sia rappresentare uno o più pesci. L'acuità visiva è misurata in cicli / grado (CPD). (N = 46 in totale, 8 a 5 mesi, 4 a 6 mesi, 7 a 8 mesi, 6 a 9 mesi, 11 a 10 mesi; 2 a 11 mesi, 2 a 12 mesi e 6 a 15 mesi). Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .
Figura 3. Binoculare acuità visiva effetto sommatoria. Il binocolo (OU) acuità visiva è generalmente superiore rispetto a destra (OD) oa sinistra (OS) acutezza dell'occhio. In questo particolare gruppo i acutezza OS erano significativamente più bassi. (* P = 0,006, N = 8)jove.com/files/ftp_upload/50832/50832fig3highres.jpg "target =" _blank "> Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.
Discussion
In occasione i pesci possono sfuggire nel serbatoio dell'acqua. E 'fondamentale per immobilizzare la coda. Inoltre, l'uso di un sottile spugna / asciugamano sopra il corpo del pesce è stato trovato anche per essere prezioso per mantenere i pesci sospesi per periodi di tempo prolungati. Siamo riusciti a mantenere i pesci immobilizzati per più di 30 minuti utilizzando questa procedura senza danneggiare il pesce. Questo lasso di tempo è più che sufficiente per fare il binocolo e due acuità monoculare.
La presentazione del reticolo può essere fatto come descritto qui e altrove utilizzando un tamburo rotante fisicamente o presentando un display digitale 18-22. Entrambi i tipi hanno vantaggi e svantaggi specifici. Abbiamo scelto di utilizzare la rotazione fisica, sia per ragioni di costo e le specifiche tecniche. Escludendo il computer e apparecchiature di imaging, il dispositivo okr qui descritto può essere costruito per circa $ 150.
Il okr è un mezzo obiettivo di determinare vismanuale acutezza in zebrafish adulto. Mentre diversi altri saggi visuomotori per la visione sono stati utilizzati in precedenti esperimenti e anche dell'elettroretinogramma è stato fatto con successo negli occhi di zebrafish adulto, anche se non è stato fortemente utilizzato, il okr zebrafish adulto apre le porte a molte nuove condizioni sperimentali 22. Questo studio ha dimostrato l'utilità della OKR a misurare la variazione di acuità visiva nel tempo, identificando differenza visiva acuità in modelli di malattia oculare, e nel determinare monoculare acuità visiva.
È interessante notare che, adulto visione zebrafish rispetto alla visione umana (20/20) è di circa 20/1, 000 (0.60 quando CPD è convertito a -0,3 logMAR). Anche se questo può sembrare poveri, gli occhi zebrafish sono molto adatti per il suo ambiente. Nonostante il compito visivo di guardare attraverso 6,5 centimetri di acqua, pochi millimetri di policarbonato, e un altro centimetro d'aria, il pesce eseguire abbastanza bene! Abbiamo scoperto che l'acuità zebrafish adulto è about 70% di quello che sarebbe prevedibile data la loro spaziatura dei fotorecettori. 23 Contrasto che, con le prestazioni umane ottimali ~ 20/12, che è circa il 80% del predetto 20/10, e la tecnica okr per misurare la capacità visiva in zebrafish adulto è impressionante 24 , 25.
La tecnica di misura occhio acuità visiva indipendenti consentirebbe di studi in cui un occhio poteva essere trattata e l'altro utilizzato come controllo. Inoltre, il pesce con lo sviluppo degli occhi asimmetrico come il lrp2/bugeye o pesce che si sviluppano cataratta potrebbero essere monitorati con maggiore precisione. Va notato che la cura deve essere presa per misurare con precisione la distanza tra gli occhi e le strisce e per occludere l'intero campo visivo. Questa tecnica dovrebbe aprire la porta a misure più accurate e specifiche della funzione visiva zebrafish.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Finanziamenti erogati dalla Western University of Health Sciences College of Optometry a DJC. Un ringraziamento speciale a Irisa Tam per la progettazione grafica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Super Low Light Black White Video Security Camera | Super Circuits | PC164CEX-2 | Any low light camera may be used |
| Arduino Duemilanove microcontroller | Adafruit Industries | The Arduino Uno is also compatible with the speed control software. | |
| Tricaine Methanesulfonate | VWR | 101107-950 |
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