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Neuroscience

Zebrafish의 시력의 정량적 측정과 Optokinetic 응답

Published: October 9, 2013 doi: 10.3791/50832
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 3, 3, 3
1College of Optometry, Western University of Health Sciences, 2Molecular Neurobiology Group, Western University of Health Sciences, 3Graduate College of Biomedical Sciences, Western University of Health Sciences

Summary

제브라 피쉬는 많은 연구 분야를위한 유용한 도구가되고있다. 여기서 우리는 시각적 인 반응을 유도하고 성인 제브라 피쉬의 기능 시력을 계산하는 방법을 보여줍니다.

Abstract

제브라 피쉬는 일반적으로 애벌레 물고기에 초점을 맞춘 또는 간단한 응답을 보여 이전 방법 그러나 많은 비전 연구를위한 입증 된 모델이다. 최근에 제브라 피쉬의 성인 시각적 동작이 관심이되고있다,하지만 특정 반응을 측정하는 방법은 앞으로의 새로운 기능입니다. 이러한 격차를 해결하기 위해, 우리는 반복하고 정확하게 성인 제브라 피쉬의 시력을 측정하기 위해 optokinetic 응답 (OKR)를 활용하는 방법을 개발하기 위해 밖으로 설정합니다. 여기에서 우리는 성인 제브라 피쉬의 시력은 양안 및 단안 예민 모두 포함하여 측정 할 수 있음을 보여준다. 물고기는 절차 중에 해쳐되지 않으므로 시력 시간이 짧거나 긴 기간에 걸쳐 측정되고 비교 될 수있다. 여기에 설명 된 시력 측정은 원하는 경우 신속 높은 처리량 및 추가 비주얼 절차를 허용도 행해질 수있다. 이러한 유형의 분석은 약물 개입 연구 또는 질병 진행의 조사에 공헌.

Introduction

제브라 피쉬 (다니오 rerio)는 인해 다른 척추 동물, 자신의 짧은 수명주기, 그리고 유전자 조작 돌연변이 1,2의 가용성에 대한 그들의 망막의 유사성에 시각 생리학을 연구하는 좋은 모델입니다. optokinetic 반사 / 응답 / 안진 (OKR)은 부드러운 추구하고 빠른 단속적 안구 운동의 조합이다. 60 년 이상 임상 OKR 객관적으로 환자의 시력을 측정하는 데 사용과 유아 시각적 기능 3-5 결정에 특히 유용 할 수 있다는 것을 증명하고있다. 동물의 OKR의 첫 번째 기록 사용은 1950 년 6 비둘기를 사용했다. 최근 OKR는 애벌레 제브라 피쉬의 시각 기능을 평가하고 종종 시각 장애 1,2가 유전자 돌연변이에 대한 화면으로 사용하기위한 중요한 도구가되고있다. OKR 폭넓게 유생 지브라 피쉬의 카메라 기능을 결정하기 위해 사용되었지만, 최근에는 성인 얼룩말 증명되었다7-10 물고기. Tappeiner의 최근 논문 등. 전통적으로 마우스에 사용되는 상용 optomotor 시스템을 사용, OptoMotry는 성인 제브라 피쉬의 시력도 다양한 각속도 7 걸쳐도 0.59 회 (CPD) ~ 매우 일정하게 유지되는 것을 입증하는 .

OKR이 애벌레 zebrafish의 연구에 매우 유용한 것으로 입증되었지만, 시각적 동작을위한 다른 방법은 성공의 학위를 변화와 제브라 피쉬 성인에 사용되었습니다. 탈출 응답 분석은 모두 색소 돌연변이, 밝은 조명 조건 (11, 12)에 시각적 인 반응을 감소, 그 흰둥이와 루비 제브라 피쉬를 보여 주었다. 이 같은 탈출 응답 분석은 성공적으로 13 세의 나이에 2 년에이기는하지만, 야맹증 D 돌연변이를 확인했습니다. 그러나, 이탈 반응 분석은 결함이없는 것은 아니다. 그것은 정확한 시각 기능에 돌리는 것은 어렵다에만 총 approximatio입니다시각적 인 변화의 N - 변화가 확인되기 전에 큰 변화를 의미합니다.

시각 장애가있는 성인 제브라 피쉬를 식별하기 위해 개발 된 또 다른 방법은 optomotor 응답 (OMR) 11입니다. 이 분석에서, 물고기는 중심에 불투명 한 열이있는 원형 탱크에 배치됩니다. 검은 색과 흰색 줄무늬 탱크 주위를 회​​전하고 물고기 스트라이프 운동의 방향으로 수영하는 임무를한다. 탈출 응답과 마찬가지로, OMR는 성인 제브라 피쉬의 시각 운동 기능에 초점을 맞추고 있습니다. 그것은 그러나 이러한 lrp2/bugeye 돌연변이 (14) 등의 시각 장애, 생선을 식별하는 데 성공적으로 사용되어왔다. lrp2/bugeye 제브라 피쉬 전시 buphthalmos, 안압 상승은 OMR을 감소하고, 진보적 인 망막 변성 (14, 15).

많은 연구들은 주관적 및 정량 할 수 없습니다 성인 제브라 피쉬의 시각 운동 기능을 사용하고 있습니다itatively 분석했다. OKR를 사용하여, 하나는 객관적으로 성인 물고기의 시력을 공부할 수 있습니다. 우리는 처음에 애벌레 연구 1에 사용되는 하나의 모델로 우리 자신의 OKR 장치를 구축했다. 본 연구에서 우리는 OKR가 단안 및 지브라 피쉬의 양안 시력 모두를 계산하는 데 사용될 수 있음을 보여준다.

Protocol

모든 동물의 사육 및 실험 승인 및 각 기관이나 기타 법적 요구 사항의 기관 애니멀 케어 및 사용위원회에 의해 명시된 지침에 따라 수행되어야한다.

1. 제브라 피쉬 케어

  1. 10 시간 어두운-14의 시간 빛 사이클 16에 28.5 ° C에서 표준 조건에서 제브라 피쉬를 유지한다.
  2. 약 3 물고기 / L의 탱크 밀도 성인 zebrafish의 유지

2. Optokinetic 응답 (OKR)

  1. 드럼을 회전 14.5 cm 직경, 조정 가능한 빛의 강도 설정 (300-8,000 럭스)와 스테레오 현미경과 컴퓨터 (그림 1A)를 사용하여 사용자 정의 OKR 기록 장치를 구축 할 수 있습니다.
    1. 인접한 모니터에 라이브 피드를 제공하고 이미지 캡처와 녹화를 위해 수 현미경에 카메라를 연결합니다.
    2. 숙소의 것이다 컴퓨터에 연결된 마이크로 컨트롤러를 사용하는 회전 드럼을 제어날짜 다양한 속도와 방향을 선택.
  2. 2 ~ 3 분 동안 0.016 %의 tricaine에서 물고기를 마취 한 다음 가장자리에 일시 중단 된 눈과 아가미 작은 플랫폼에서 물고기를 놓습니다.
  3. 물고기의 몸에 얇은 스폰지 / 수건을 배치하고 고정 유지하는 고기와 생선을 수용하기 위해 모양의 거품의 2 ~ 3 조각, 핀. 물고기의 꼬리의 움직임을 제한은 물고기에게 상해를주지 않고 고정화를위한 중요한 측면 것으로 판명되었고, 유용한 발포체의 평평한 조각을 사용하여 달성 하였다. (그림 1b)
  4. OKR 기록 장치의 회전 드럼 내부에 맞 원통형 물이 채워진 탱크에서 물고기를 놓습니다. 약 7.3 cm 드럼의 가장자리에서 눈으로 똑바로 물고기의 위치를​​ 플랫폼에 자석을 사용합니다. 물고기는 몇 분 이내에 마취에서 회복한다 - 정상적인 호흡이 다시 시작됩니다 무작위 안구의 움직임을 관찰해야한다.
  5. BAS를 배치전자 회전 드럼에 정도 (CPD) 당 0.07 사이클의 격자와 회전 및 비디오 캡처를 시작하기 위해 컴퓨터 제어 장치를 작동 (12 rpm의 속도는이 문서에 사용 된,하지만 8 ~ 16 회전의 속도는 비슷한 결과를 제공해야합니다).
  6. 초기 OKR는 격자 자료에 의해 유도되면, 간단하게 회전을 일시 중지하고, 작은 격자 (높은 공간 주파수)와 격자를 교체합니다.
  7. OKR이 더 이상 유발 할 수 없습니다 때까지이 과정을 반복합니다. 변성 계단 접근법 다음 OKR을 야기하고 OKR의 손실을 검증하는 반응을 유도하는 데 실패 격자를 이용한 반복 작은 격자로 재시험. 최종 격자가 제 멸종 사건에 대하여 변경된 경우이 프로세스는 최소 검출 격자에 진정한 응답을 확인하기 위해 반복 될 수있다.
  8. 반대 눈에 인접한 줄무늬에 검은 색 플라스틱의 occluder 배치하여 단안 시력 측정을 얻습니다. (2.6-2.7 단계) 위의 절차를 반복합니다.
  9. 의 occluder 위치를 변경하고 다시 단계 2.6-2.7를 반복하여 반대 눈의 시력을 얻을 수 있습니다.
  10. 각각의 눈은 정확한 시력 측정은 다음과 같이 계산 될 수 있도록 수조 아래 기준 측정 스트립을 사용하여 테스트 절차 중에 줄무늬에서 인 거리를 참고.

3. 시력 계산

  1. CPD를 계산하여 시력을 얻을 : 식 (1) 이 회절 격자에, 렌즈의 중심으로부터의 거리이고, H는 OKR는 (도 1C)를 관찰되는 작은 격자의 한주기의 길이이다.
  2. 결합 시력 측정의 평균 좌측 및 우측 눈 모두의 값이 사용된다.

Representative Results

OKR 장치 기능

위의 설명과 그림에 최소한의 유지 보수 1 기능을 같이 OKR 장치. 꼬리를 고정화 단계 2.3에서 언급 한 바와 같이 녹음하는 동안 억제 물고기를 유지하는 데 매우 중요합니다. 충분히 고정, 물고기를 장시간 OKR 장치에 보관하실 수 있습니다. 더 많은 데이터가 각각의 물고기를 수집 할 수 있도록 따라서, 치료는 초기 고정화 단계에서주의해야한다.

시력 측정

양안 OKR은 쉽게 정상 성인 물고기에 유도된다. 위의 절차에 따라 하나는 많은 나이의 제브라 피쉬 (그림 2)에 대한 시력을 찾을 수 있습니다. 우리가 기록 된 가장 양안 공간 시력은 0.74 CPD했다. 그림 2에서 언급 한 바와 같이, 양안 시력은 일반적으로 연령이 증가 (N = 46, P = SPSS의 V14을 사용하여 0.002 ANOVA), 만 레벨 해제나이 약 12​​ 개월 이후. 야생형, 우리는 나이 일치 lrp2/bugeye 물고기 5 개월 된 야생형 물고기에서 측정 된 시력을 비교했을 때, 우리는 lrp2/bugeye 물고기는 크게 시력 (p <0.001 감소 된 것을 발견했다 : 0.49 ± 0.05 CPD를, N = 8; lrp2/bugeye : 0.35 ± 0.06, N = 10, Excel을 사용하여 학생의 T-테스트).

오른쪽 눈을 폐색에 의해 왼쪽 눈의 시력은 그 반대의 경우도 마찬가지 결정 할 수 있습니다. 양안 시력과 비교했을 때, 양안 합계는 인간의 시각 (17) (그림 3)와 유사하게 관찰된다. 양안 시력은 일반적으로 권리 (OD) 또는 왼쪽 독립적으로 측정 (OS) 예민하거나 5 ~ 10 % 향상되었다. 일부 개별 물고기의 차이는 25 % 개선했다.

그림 1
그림 1. OKR의 RECO에 rding.) OKR 장치는 광도 조절 설정 (300-8,000 럭스)와 드럼과 현미경을 회전 14.5 cm 직경으로 구성되어 있습니다. 카메라는 인접한 모니터의 라이브 피드를 제공합니다. 도 (CPD) 당 필요에 따라 회전 드럼이 시계 방향과 반 시계 방향으로 교환 할 수있는 공간 주파수 격자 모두에서 다양한 속도 설정이 삽입 및 제거됩니다. B) 생선을 확보하고 회전 드럼의 중앙에 배치됩니다. C)주기가 계산된다 CPD =를 사용하여 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .

그림 2
그림 2. 시력은 나이로 변경합니다. 그래프는 5를 측정 독립적 인 시력을 보여줍니다 - 연령 15 개월입니다. 시력은 일반적으로 개발의 첫 해에 걸쳐 증가하고 만 15 개월 (P = SPSS의 V14을 사용하여 0.002 ANOVA)에 약간 끝납니다. 각 점은 1 또는 여러 물고기를 나타낼 수있다. 시력은 사이클 /도 (CPD)로 측정됩니다. (N = 총 46, 5 개월 8, 6 개월에 4, 8 개월 7, 9 개월에 6, 10 개월에 11; 11개월에서 2, 12 개월에 2, 15 개월 6). 여기를 클릭하십시오 더 큰 이미지를 볼 수 .

그림 3
그림 3. 양안 시력 합계 효과. 양안 (OU) 시력은 오른쪽 (OD) 또는 왼쪽 (OS) 눈 예민에 비해 일반적으로 더 높다. 이 특정 그룹의 OS 예민이 유의하게 낮았다. (* P = 0.006, N = 8)jove.com/files/ftp_upload/50832/50832fig3highres.jpg "대상 ="_blank "> 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

경우에 따라 물고기는 물 탱크에 빠져있다. 그것은 꼬리를 고정화하는 것이 중요합니다. 물고기의 몸에 얇은 스폰지 / 수건의 추가 사용은 장시간 동안 정지 물고기를 유지하는 데 매우 중요한 것으로 밝혀졌다. 우리는 물고기를 해치지 않고이 절차를 사용하여 30 분 동안 고정 된 물고기를 유지할 수 있었다. 이 시간은 양안 모두 단안 예민를 수행하기에 충분 이상입니다.

물리적으로 회전하는 드럼 또는 디지털 디스플레이를 제시하여 18-22를 사용하고 여기에 다른 곳에서 설명 된 격자의 프레젠테이션 역시 행해질 수있다. 두 가지 유형의 특정 장점과 단점이 있습니다. 우리는 모두 비용 이유 및 기술 사양에 대한 물리적 인 회전을 사용하기로 결정했습니다. 컴퓨터와 영상 장비를 제외하고, 여기에 설명 된 OKR 장치는 약 150 달러 구축 할 수 있습니다.

OKR는 힘을 결정하는 객관적인 방법이다성인 제브라 피쉬의 연간 시력. 비전에 대한 몇 가지 다른 시각 운동의 분석은 이전의 실험에서 사용 된 그것은 크게 활용되지 불구하고도 전위도 성공적으로 성인 zebrafish의 눈에서 수행되었지만, 성인 제브라 피쉬의 OKR 많은 새로운 실험 조건 (22)에 문을 엽니 다. 이 연구 결과는 안과 질환 모델에서 시력의 차이를 식별, 시간이 지남에 따라 시력의 변화를 측정의 OKR의 유틸리티를 시연하고, 단안 시력을 결정했다.

흥미롭게도, 성인 zebrafish의 비전은 인간의 시각 (20 / 19)에 비해 약 20 / 1, 000 (0.60 CPD는 -0.3 비해 logMAR로 변환 할 때)입니다. 이 가난한 보일 수 있지만, 제브라 피쉬의 눈은 아주 잘 그 환경에 적합합니다. 6.5 물 cm, 폴리 카보네이트 (polycarbonate)의 몇 밀리미터, 공기의 또 다른 센티미터를 통해보고의 시각적 작업에도 불구하고, 물고기는 아주 잘 수행! 우리는 성인 zebrafish의 시력은 ABO 것을 발견유타. 23 대조 자신의 광 수용체 간격 주어진 예측 될 것입니다 무슨의 70 %가 최적의 인간 성능을 ~ 12분의 20, 어느 쪽의 약 80 % 10분의 20 예측, 성인 zebrafish의 시각적 능력을 측정하기위한 OKR 기술이 인상적입니다 (24) 25.

독립적 눈 시력 측정 기술은 하나의 눈이 치료 될 수 있고, 다른 하나는 대조군으로 사용하는 연구를 허용한다. 또한 백내장을 개발 lrp2/bugeye 생선 비대칭 눈 개발 물고기보다 정확하게 모니터링 할 수 있습니다. 개호 정확하게 줄무늬로 눈으로부터의 거리를 측정하기 위해 비전의 전체 필드를 흡장주의 할 필요가 있음을 주목해야한다. 이 기술은 zebrafish의 시각 기능의보다 정확하고 구체적인 조치에 문을 열어야합니다.

Disclosures

저자가 공개하는 게 없다.

Acknowledgments

DJC로 검안의 건강 과학 대학의 웨스턴 대학에서 제공하는 자금 지원. 그래픽 디자인을위한 Irisa 탐 특별 감사.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Super Low Light Black White Video Security Camera Super Circuits PC164CEX-2 Any low light camera may be used
Arduino Duemilanove microcontroller Adafruit Industries The Arduino Uno is also compatible with the speed control software.
Tricaine Methanesulfonate VWR 101107-950

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References

  1. Brockerhoff, S. E., et al. A behavioral screen for isolating zebrafish mutants with visual system defects. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 10545-10549 (1995).
  2. Neuhauss, S. C., et al. Genetic disorders of vision revealed by a behavioral screen of 400 essential loci in zebrafish. J. Neurosci. 19, 8603-8615 (1999).
  3. Schumann, W. P. The objective determination of visual acuity on the basis of the optokinetic nystagmus. Am. J. Optom. Arch. Am. Acad. Optom. 29, 575-583 (1952).
  4. Gorman, J. J., Cogan, D. G., Gellis, S. S. An apparatus for grading the visual acuity of infants on the basis of opticokinetic nystagmus. Pediatrics. 19, 1088-1092 (1957).
  5. Fulton, A. B., Manning, K. A., Dobson, V. A behavioral method for efficient screening of visual acuity in young infants. II. Clinical application. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 17, 1151-1157 (1978).
  6. Huizinga, E., Van Der Meulen, P. Vestibular rotatory and optokinetic reactions in the pigeon. Ann. Otol. Rhinol. Laryngol. 60, 927-947 (1951).
  7. Tappeiner, C. Visual Acuity and Contrast Sensitivity of Adult Zebrafish. Front. Zool. 9, 10 (2012).
  8. Mueller, K. P., Schnaedelbach, O. D., Russig, H. D., Neuhauss, S. C. VisioTracker, an innovative automated approach to oculomotor analysis. J. Vis. Exp. (56), e3556 (2011).
  9. Zou, S. Q., et al. Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish. J. Vis. Exp. (36), e1742 (2010).
  10. Mueller, K. P., Neuhauss, S. C. Quantitative measurements of the optokinetic response in adult fish. J. Neurosci. Methods. 186, 29-34 (2010).
  11. Li, L., Dowling, J. E. A dominant form of inherited retinal degeneration caused by a non-photoreceptor cell-specific mutation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 11645-11650 (1997).
  12. Ren, J. Q., McCarthy, W. R., Zhang, H., Adolph, A. R., Li, L. Behavioral visual responses of wild-type and hypopigmented zebrafish. Vision Res. 42, 293-299 (2002).
  13. Maaswinkel, H., Mason, B., Li, L. ENU-induced late-onset night blindness associated with rod photoreceptor cell degeneration in zebrafish. Mech. Ageing Dev. 124, 1065-1071 (2003).
  14. Stujenske, J. M., Dowling, J. E., Emran, F. The bugeye mutant zebrafish exhibits visual deficits that arise with the onset of an enlarged eye phenotype. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 4200-4207 (2011).
  15. Veth, K. N. Mutations in zebrafish lrp2 result in adult-onset ocular pathogenesis that models myopia and other risk factors for glaucoma. PLoS Genet. 7, e1001310 (2011).
  16. Westerfield, M. THE ZEBRAFISH BOOK, A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 5th edn, University of Oregon Press. (2007).
  17. Cagenello, R., Arditi, A., Halpern, D. L. Binocular enhancement of visual acuity. J. Opt. Soc. Am. A Opt. Image Sci. Vis. 10, 1841-1848 (1993).
  18. Brockerhoff, S. E. Measuring the optokinetic response of zebrafish larvae. Nat. Protoc. 1, 2448-2451 (2006).
  19. Hodel, C., Neuhauss, S. C. Computer-based analysis of the optokinetic response in zebrafish larvae. CSH Protoc. 2008, pdb prot4961 (2008).
  20. Huber-Reggi, S. P., Mueller, K. P., Neuhauss, S. C. Analysis of optokinetic response in zebrafish by computer-based eye tracking. Methods Mol. Biol. 935, 139-160 (2013).
  21. Tappeiner, C. Visual acuity and contrast sensitivity of adult zebrafish. Front. Zool. 9, 10 (2012).
  22. Saszik, S., Bilotta, J. The effects of temperature on the dark-adapted spectral sensitivity function of the adult zebrafish. Vision Res. 39, 1051-1058 (1999).
  23. Haug, M. F., Biehlmaier, O., Mueller, K. P., Neuhauss, S. C. Visual acuity in larval zebrafish: behavior and histology. Front. Zool. 7, 8 (2010).
  24. Curcio, C. A., Sloan, K. R., Kalina, R. E., Hendrickson, A. E. Human photoreceptor topography. J. Comp. Neurol. 292, 497-523 (1990).
  25. Kalloniatis, M., Luu, C. Visual Acuity. , (1995).

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Cameron, D. J., Rassamdana, F., Tam, … More

Cameron, D. J., Rassamdana, F., Tam, P., Dang, K., Yanez, C., Ghaemmaghami, S., Dehkordi, M. I. The Optokinetic Response as a Quantitative Measure of Visual Acuity in Zebrafish. J. Vis. Exp. (80), e50832, doi:10.3791/50832 (2013).

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