Summary
Данио рерио были ценным инструментом для многих областях исследований. Здесь мы показываем, метод выпытать визуальный ответ и рассчитать функциональный остроту зрения в взрослых данио.
Abstract
Данио рерио являются проверенным модель для исследования зрения, однако многие из ранних методов, как правило, ориентированных на личинок рыб или продемонстрировали простой ответ. Совсем недавно взрослых визуальное поведение у рыбок данио стал интерес, но методы измерения конкретные ответы новичок приходит. Чтобы заполнить этот пробел, мы приступаем к разработке методологии неоднократно и точно использовать оптокинетическую ответ (ОКР) для измерения остроты зрения у взрослых рыбок данио. Здесь мы показываем, что острота зрения в взрослых данио могут быть измерены, в том числе обоих бинокулярного и монокулярных Acuities. Потому что рыба не пострадала во время процедуры, острота зрения может быть измерена и по сравнению на коротких или длительных периодов времени. Визуальные измерения остроты зрения, описанные здесь, также можно сделать быстро позволяет высокой пропускной и дополнительных визуальных процедур при желании. Этот тип анализа способствует лекарственного вмешательства исследований или исследований прогрессирования заболевания.
Introduction
Данио рерио (Danio рерио) являются хорошей моделью для изучения визуальный физиологию из-за сходства их сетчатки в других позвоночных, их короткого жизненного цикла, а также наличия генетически модифицированных мутантов 1,2. Оптокинетическим рефлекс / ответ / нистагм (ОКР) представляет собой сочетание гладкой преследования и быстрых саккаду движений глаз. За более чем 60 лет врачи показали, что ОКР может быть использован для объективного измерения остроты зрения у пациентов и особенно полезен для определения детской визуальные возможности 3-5. Первая запись об использовании ОКР в животных с помощью голубей в 1950 6. Совсем недавно, ОКР стал ценным инструментом для оценки зрительной функции в личиночной данио и часто используется для выявления генетических мутантов, имеющих визуального 1,2 обесценения. В то время как ОКР была широко используется для определения зрительной функции в личиночной данио, она только недавно была продемонстрирована во взрослой зебрырыбу 7-10. Согласно недавнему исследованию, Tappeiner др.. Использует имеющийся в продаже системы оптомоторных традиционно используемый для мышей, OptoMotry, чтобы продемонстрировать, что острота зрения взрослых данио остается достаточно постоянным, ~ 0,59 циклов в степени (CPD), даже в различных угловых скоростей 7 .
Хотя ОКР оказалась весьма полезной в личиночной данио исследований, другие методы для визуального поведения были использованы в данио взрослых с разной степенью успеха. Анализ побег ответ показали, что альбинос и рубиновый данио, как пигментация мутанты, сократили визуальные ответы в ярких условиях освещения 11,12. Этот же анализ побег ответ также успешно идентифицированы куриная слепота D мутантов, хотя 2 лет 13. Тем не менее, анализ побег ответ не без изъянов. Трудно приписать к точному зрительной функции и является только полная approximatioн визуальных изменений - то есть он принимает большое изменение до изменения идентифицируется.
Другой метод, который был разработан для выявления взрослых данио с нарушениями зрения является ответом оптомоторная (OMR) 11. В этом анализе рыбы помещают в резервуар круговой с непрозрачным колонке в центре. Черные и белые полосы поворачивать вокруг танка и рыба поручено купание в направлении движения полосы. Как ответ эвакуации, OMR фокусируется на visuomotor возможностей взрослых данио. Однако было успешно используется для идентификации рыбы с нарушениями зрения, таких как lrp2/bugeye мутантов 14. В lrp2/bugeye данио демонстрируют буфтальм, повышенное внутриглазное давление, уменьшилась OMR, и прогрессивная дегенерация сетчатки 14,15.
Многие исследования использовали возможности visuomotor в взрослых данио, которые часто субъективны и не могут быть количественныйственно проанализированы. Используя ОКР, можно изучать остроту зрения взрослых рыб более объективно. Мы построили нашу собственную ОКР устройство, по образцу одного первоначально использовалась для личинок исследований 1. В этом исследовании мы демонстрируем, что ОКР может быть использована для расчета как монокуляр и острота бинокулярного зрения у рыбок данио.
Protocol
Все животноводство и эксперименты должны быть утверждены и проведены в соответствии с руководящими принципами, изложенными в Институциональная уходу и использованию животных комитета соответствующего учреждения или иными правовыми требованиями по.
1. Данио рерио Уход
- Поддерживать данио в стандартных условиях на 28,5 ° С на 10 ч темноты-14 ч светового цикла 16.
- Держите взрослых данио при плотности бака около 3 рыбы / Л.
2. Оптокинетических ответ (ОКР)
- Постройте устройство записи пользовательских ОКР с использованием 14,5 см в диаметре вращающийся барабан, стерео микроскоп с регулируемыми настройками интенсивности света (300-8,000 люкс) и компьютер (Рисунок 1а).
- Прикрепите камеру к микроскопу, которая обеспечит в прямом эфире на соседний монитор и дать возможность захвата изображения и записи.
- Управление вращающийся барабан помощью микроконтроллера, связанный с компьютером, который будет AccommoДата различные выборы скорость и направление.
- Обезболить рыбу в 0,016% Tricaine в течение 2-3 мин, а затем поместить рыбу на небольшой платформе с глазами и жабрами взвешенных по краю.
- Место тонкий губка / полотенце на теле рыбы и пин-код 2-3 кусков пены, формы для размещения рыбы, над рыбами держать его обездвижен. Ограничение движение хвоста рыбы было обнаружено, что решающим аспектом для иммобилизации, не вызывая повреждение к рыбе, а лучше всего достигается с помощью плоский кусок пены. (Рис. 1б)
- Поместите рыбу в цилиндрической емкости, заполненной водой, который подходит внутри вращающегося барабана записывающего устройства ОКР. Использование магнитов на платформе в положение рыбы в вертикальном положении, с глазами примерно 7,3 см от края барабана. Рыба должна возродить от наркоза в течение нескольких минут - нормальное дыхание возобновится и должны соблюдаться случайные движения глаз.
- Поместите басэ решетка из 0,07 циклах на градус (CPD) во вращающийся барабан и заниматься органы управления компьютерных начать вращение и захват видео (скорость 12 оборотов в минуту был использован для этой статьи, но скорости 8-16 оборотов в минуту должно дать аналогичные результаты).
- После того, как первоначальный ОКР вызванное базе решетки, приостановить вращение кратко, и заменить решетки с меньшим решетки (более высокое пространственное частота).
- Повторите этот процесс, пока ОКР не может быть больше не вызывали. Retest с наименьшим решетки, которая приводила к ОКР следующее модифицированной лестница подхода, а затем повторить с помощью дифракционной решетки, которые не удалось вызвать ответ, чтобы проверить потерю ОКР. Этот процесс может быть повторен для проверки истинное ответ на наименьшей обнаруживаемого решетки, если конечный решетки изменены относительно первого события экстинкции.
- Получить измерения монокулярных остроты, поместив черный полиэтиленовый окклюдер за полосами, прилегающих к противоположной глаза. Повторите процедуру, описанную выше (шаги 2.6-2.7).
- Получить остроту противоположного глаза путем перестановки окклюдер и снова повторяя шаги 2.6-2.7.
- Обратите внимание на расстояние каждый глаз от полосами во время процедуры тестирования с помощью опорного измерения полосу под аквариумом, так что точные меры остроты зрения может быть рассчитана в следующих шагах.
3. Расчет остроты зрения
- Получите остроты зрения путем расчета ДСП:
где это расстояние от центра объектива к решетке, и ч-длина одного цикла наименьшей решетки, на которой ОКР наблюдалось (рис. 1в). - Для комбинированных визуальных измерений остроты зрения, в среднем стоимость как из левого и правого глаза используется.
где это расстояние от центра объектива к решетке, и ч-длина одного цикла наименьшей решетки, на которой ОКР наблюдалось (рис. 1в). Representative Results
ОКР Функциональность устройства
ОКР устройство, как описано выше и показано на рисунке 1 функции с минимальным обслуживанием. Как отмечалось в пункте 2.3, иммобилизации хвост имеет решающее значение для поддержания на рыбу сдержанные во время записи. Достаточно стопорится, рыба может храниться в ОКР устройства в течение длительного периода времени. Следовательно, необходимо принять меры в течение первых шагов иммобилизации, так что больше можно собирать данные для каждого отдельного рыбы.
Измерения остроты зрения
Бинокль ОКР легко вызвали в нормальной взрослой рыбы. По процедуре выше, можно найти остроты зрения для рыбок данио многих возрастов (рис. 2). Лучший бинокль пространственное зрения мы записали составил 0,74 CPD. Как отметил на рисунке 2, бинокулярное зрения обычно увеличивается с возрастом (п = 46, р = 0,002 ANOVA с помощью SPSS V14), но выравниваетсяпримерно через 12 месяцев. Когда мы сравнили измеренное остроту зрения в 5 месяцев дикого типа рыбы в возрасте соответствием lrp2/bugeye рыбы, мы обнаружили, что lrp2/bugeye рыбы значительно уменьшается зрения (р <0,001; дикого типа: 0,49 ± 0,05 CPD; п = 8; lrp2/bugeye: 0,35 ± 0,06, п = 10; Т-тест Стьюдента с помощью Excel).
По окклюзии правый глаз острота зрения для левого глаза может быть определена и наоборот. По сравнению с бинокулярного зрения, бинокулярное суммирования наблюдается аналогично человеческого зрения 17 (рис. 3). Бинокль зрения была, как правило 5-10% лучше, чем любой правой (OD) или влево (ОС) Acuities измеренные самостоятельно. По некоторым отдельных рыб разница была улучшение 25%.
Рисунок 1. ОКР выздоровеетВИДЕОЗАПИСЬ.) ОКР Устройство состоит из 14,5 см в диаметре вращающегося барабана и микроскоп с настройками интенсивности регулируемый свет (300-8,000 люкс). Камера обеспечивает живой корм на соседней монитора. Вращающийся барабан имеет различные настройки скорости в правое и левое направления и сменными пространственной частоты решетки вставлены и удалены по мере необходимости. B) Рыба закреплены и размещены в центре вращающегося барабана. С) циклах на градус (CPD) вычисляется используя CPD = 
Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .
Рисунок 2. Острота зрения с возрастом меняется. На графике видно, независимые остроты зрения измеряемых 5 - 15 месяцев в возрасте. Острота зрения обычно увеличивается в течение первого года развития, а затем хвосты прочь немного в возрасте 15 месяцев (р = 0,002 ANOVA с помощью SPSS V14). Каждая точка может либо представлять 1 или несколько рыб. Острота зрения измеряется в циклах / степени (CPD). (П = 46 всего, 8 на 5 месяцев, 4 на 6 месяцев; 7 на 8 месяцев, 6 на 9 месяцев; 11 в 10 месяцев; 2 на 11 месяцев; 2 на 12 месяцев и 6 на 15 месяцев). Нажмите здесь чтобы просмотреть увеличенное изображение .
Рисунок 3. Бинокль острота зрения суммирование эффект. Бинокль (OU) острота зрения, как правило, выше, чем в правом (OD) или влево (ОС) глаз Acuities. В данном конкретном группы ОС остроконечностей были значительно ниже. (* Р = 0,006, n = 8)jove.com/files/ftp_upload/50832/50832fig3highres.jpg "целевых =" _blank "> Нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.
Discussion
Иногда рыба может уйти в бункер для воды. Очень важно, чтобы обездвижить хвост. Кроме того использование тонкой губки / полотенцем на теле рыбы было также установлено, что неоценимое значение для держа рыбу взвешенные в течение длительных периодов времени. Мы смогли сохранить рыбу иммобилизованных в течение более 30 мин с помощью этой процедуры без ущерба для рыбы. Это время более чем достаточно, чтобы сделать бинокль и оба монокулярных Acuities.
Презентация решетки могут быть либо сделано, как описано здесь и в других местах с помощью физически вращающийся барабан или путем представления цифровой дисплей 18-22. Оба типа имеют свои преимущества и недостатки. Мы решили использовать физическую вращение и по экономическим соображениям и технических спецификаций. Без учета компьютером и съемочной аппаратуры, ОКР устройство, описание которого здесь может быть построен примерно за $ 150.
ОКР является объективным способом определения отношениюUAL зрения в взрослых данио. В то время как несколько других visuomotor анализы для видения были использованы в предыдущих экспериментах и даже электроретинограммы успешно сделано у взрослых данио глаза, хотя он не был сильно используется, взрослый данио ОКР открывает двери для многих новых экспериментальных условиях 22. Это исследование показало, утилиту ОКР в в измерении визуальные изменения остроты зрения в течение долгого времени, выявление визуальное различие зрения в моделях болезни глаз, и в определении монокуляр остроту зрения.
Интересно, что взрослых данио рерио зрение по сравнению с человеческого зрения (20/20) примерно 20/1, 000 (0,60 CPD когда преобразуется в LogMAR -0,3). Хотя это может показаться бедных, данио глаза очень хорошо подходит для окружающей среды. Несмотря на визуальной задачи просматривая 6,5 см воды, в несколько миллиметров поликарбоната и другого сантиметре воздуха, рыба выполнять достаточно хорошо! Мы обнаружили, что взрослые данио зрения является абоут 70% от того, что можно было бы предсказать с учетом их расстояние фоторецептора. 23 Контраст что с оптимальной работоспособности человека ~ 20/12, что составляет около 80% от предсказанного 20/10, и ОКР методика измерения визуальный способность в взрослых данио впечатляет 24 , 25.
Метод измерения независимых глаз остроты зрения позволит исследований, в которых один глаз можно лечить, а другой, используемых в качестве контроля. Кроме того, рыба с развитием асимметричной глаз, таких как lrp2/bugeye или рыбы, которые развиваются катаракта может контролироваться более точно. Следует отметить, что уход должны быть приняты, чтобы точно измерить расстояние от глаз до полосами и закупоривать все поле зрения. Этот метод должен открыть двери для более точных и конкретных мер данио зрительной функции.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Финансовые средства, предоставленные Западной университете наук о здоровье колледжа оптометрии к DJC. Отдельное спасибо Ириса Tam для графического дизайна.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Super Low Light Black White Video Security Camera | Super Circuits | PC164CEX-2 | Any low light camera may be used |
| Arduino Duemilanove microcontroller | Adafruit Industries | The Arduino Uno is also compatible with the speed control software. | |
| Tricaine Methanesulfonate | VWR | 101107-950 |
References
- Brockerhoff, S. E., et al. A behavioral screen for isolating zebrafish mutants with visual system defects. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 10545-10549 (1995).
- Neuhauss, S. C., et al. Genetic disorders of vision revealed by a behavioral screen of 400 essential loci in zebrafish. J. Neurosci. 19, 8603-8615 (1999).
- Schumann, W. P. The objective determination of visual acuity on the basis of the optokinetic nystagmus. Am. J. Optom. Arch. Am. Acad. Optom. 29, 575-583 (1952).
- Gorman, J. J., Cogan, D. G., Gellis, S. S. An apparatus for grading the visual acuity of infants on the basis of opticokinetic nystagmus. Pediatrics. 19, 1088-1092 (1957).
- Fulton, A. B., Manning, K. A., Dobson, V. A behavioral method for efficient screening of visual acuity in young infants. II. Clinical application. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 17, 1151-1157 (1978).
- Huizinga, E., Van Der Meulen, P. Vestibular rotatory and optokinetic reactions in the pigeon. Ann. Otol. Rhinol. Laryngol. 60, 927-947 (1951).
- Tappeiner, C. Visual Acuity and Contrast Sensitivity of Adult Zebrafish. Front. Zool. 9, 10 (2012).
- Mueller, K. P., Schnaedelbach, O. D., Russig, H. D., Neuhauss, S. C. VisioTracker, an innovative automated approach to oculomotor analysis. J. Vis. Exp. (56), e3556 (2011).
- Zou, S. Q., et al. Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish. J. Vis. Exp. (36), e1742 (2010).
- Mueller, K. P., Neuhauss, S. C. Quantitative measurements of the optokinetic response in adult fish. J. Neurosci. Methods. 186, 29-34 (2010).
- Li, L., Dowling, J. E. A dominant form of inherited retinal degeneration caused by a non-photoreceptor cell-specific mutation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 11645-11650 (1997).
- Ren, J. Q., McCarthy, W. R., Zhang, H., Adolph, A. R., Li, L. Behavioral visual responses of wild-type and hypopigmented zebrafish. Vision Res. 42, 293-299 (2002).
- Maaswinkel, H., Mason, B., Li, L. ENU-induced late-onset night blindness associated with rod photoreceptor cell degeneration in zebrafish. Mech. Ageing Dev. 124, 1065-1071 (2003).
- Stujenske, J. M., Dowling, J. E., Emran, F. The bugeye mutant zebrafish exhibits visual deficits that arise with the onset of an enlarged eye phenotype. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 4200-4207 (2011).
- Veth, K. N. Mutations in zebrafish lrp2 result in adult-onset ocular pathogenesis that models myopia and other risk factors for glaucoma. PLoS Genet. 7, e1001310 (2011).
- Westerfield, M. THE ZEBRAFISH BOOK, A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 5th edn, University of Oregon Press. (2007).
- Cagenello, R., Arditi, A., Halpern, D. L. Binocular enhancement of visual acuity. J. Opt. Soc. Am. A Opt. Image Sci. Vis. 10, 1841-1848 (1993).
- Brockerhoff, S. E. Measuring the optokinetic response of zebrafish larvae. Nat. Protoc. 1, 2448-2451 (2006).
- Hodel, C., Neuhauss, S. C. Computer-based analysis of the optokinetic response in zebrafish larvae. CSH Protoc. 2008, pdb prot4961 (2008).
- Huber-Reggi, S. P., Mueller, K. P., Neuhauss, S. C. Analysis of optokinetic response in zebrafish by computer-based eye tracking. Methods Mol. Biol. 935, 139-160 (2013).
- Tappeiner, C. Visual acuity and contrast sensitivity of adult zebrafish. Front. Zool. 9, 10 (2012).
- Saszik, S., Bilotta, J. The effects of temperature on the dark-adapted spectral sensitivity function of the adult zebrafish. Vision Res. 39, 1051-1058 (1999).
- Haug, M. F., Biehlmaier, O., Mueller, K. P., Neuhauss, S. C. Visual acuity in larval zebrafish: behavior and histology. Front. Zool. 7, 8 (2010).
- Curcio, C. A., Sloan, K. R., Kalina, R. E., Hendrickson, A. E. Human photoreceptor topography. J. Comp. Neurol. 292, 497-523 (1990).
- Kalloniatis, M., Luu, C. Visual Acuity. , (1995).
