Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Analyserer Protein Dynamics hjælp af brint Exchange massespektrometri

Published: November 29, 2013 doi: 10.3791/50839
Automatic Translation
1, 1
1Zentrum für Molekulare Biologie der Universität Heidelberg (ZMBH), University of Heidelberg

Summary

Protein kropsbygning og dynamik er nøglen til at forstå forholdet mellem protein struktur og funktion. Hydrogen udveksling kombineret med høj opløsning massespektrometri er en alsidig metode til at studere de konformationelle dynamik proteiner samt karakterisering af protein-ligand-og protein-protein-interaktioner, herunder kontaktflader og allosteriske effekter.

Abstract

Alle cellulære processer, afhænger af funktionaliteten af ​​proteiner. Selvom funktionaliteten af ​​et givet protein er den direkte konsekvens af sin unikke aminosyresekvens, er den kun realiseres ved foldningen af ​​polypeptidkæden i en enkelt veldefineret tredimensionel arrangement eller mere almindeligt i et ensemble af interconverting konformationer. Undersøgelse af forbindelsen mellem protein kropsbygning og dets funktion er derfor afgørende for en fuldstændig forståelse af, hvordan proteiner er i stand til at opfylde deres store udvalg af opgaver. En mulighed for at studere konformationsændringer et protein gennemgår mens forløber gennem dets funktionelle cyklus er hydrogen-1 H / 2 H-udveksling i kombination med høj opløsning massespektrometri (HX-MS). HX-MS er en alsidig og robust metode, der tilføjer en ny dimension til strukturel information fås ved f.eks crystallography. Det bruges til at studere proteinfoldning og udfoldning binding af små molecule ligander, protein-protein interaktioner, konformationsændringer tilknytning til enzymkatalyse og allostery. Desuden er HX-MS anvendes ofte, når mængden af ​​protein er meget begrænset eller krystallisation af proteinet ikke er mulig. Her giver vi en generel protokol for at studere protein dynamik med HX-MS og beskriver som et eksempel på, hvordan at afsløre samspillet grænseflade to proteiner i en kompleks.

Introduction

Antallet af krystalstrukturer af proteiner og protein komplekser steget kraftigt i de seneste år. De præsenterer uvurderlige snapshots af den strukturelle organisering af disse proteiner og skabe et grundlag for struktur-funktion analyse. Men dynamikken i proteiner og de konformationsændringer, som er afgørende for deres funktioner, er sjældent afsløret ved røntgenkrystallografi. Cryo-elektronmikroskopi på den anden side er i stand til at fange protein og protein-komplekser i forskellige konformationer, men generelt kan ikke løse konformationelle ændringer ned til sekundær struktur niveau 1. Konformationelle dynamik af proteiner i opløsning ved atomare detaljer kan kun løses ved NMR, men denne metode er stadig begrænset til proteiner af relativt små størrelser (generelt ≤ 30 kDa) og har brug for høje koncentrationer af proteiner (≥ 100 mM), som hæmmer eksperimenter med oligomeriserende eller sammenlægning tilbøjelige proteiner 2. En metode, derer i stand til at bygge bro mellem høj opløsning røntgenkrystallografi og cryo-elektronmikroskopi, og som ikke er begrænset af protein størrelse eller koncentration er amid hydrogen-1 H / 2 H-exchange (HX) i kombination med massespektrometri (MS). I de senere år har denne metode udviklet til et værdifuldt analytisk værktøj til analyse af protein-dynamik, proteinfoldning, proteinstabilitet og konformationsændringer 3-5. Den molekylære basis for denne metode er den labile karakter af backbone amide hydrogener i proteiner, som vil veksle med deuteriumatomer når proteinet er anbragt i en D2O løsning. Den efterfølgende stigning i protein masse over tid måles med høj opløsning MS.

I korte ustrukturerede peptider HX afhænger kun af temperatur katalysator fusion (OH -, H 3 O + dvs. pH, se figur 3) og kæder af tilstødende rester aminosyre side grundet induktiv, katalytic og steriske effekter. Disse virkninger på den iboende kemiske vekselkurs k lm er elegant kvantificeret ved Bai et al. 6 og et program er til rådighed (udlånt Z. Zhang), som beregner k lm for hver aminosyre i et polypeptid, afhængig af pH og temperatur. Ved neutral pH og omgivelsestemperaturer k ch er i størrelsesordenen af 10 1 -10 3 sek -1. I foldede proteiner kan HX være 2-9 størrelsesordener langsommere hovedsageligt på grund af hydrogenbinding i den sekundære struktur og i mindre grad på grund af begrænset adgang hydratiserede OH - ioner til det indre af en tæt foldet protein. HX i native proteiner implicerer derfor delvis eller global udfoldning, kemisk udveksling og refoldning til den oprindelige tilstand i henhold til ligning (1), og de ​​observerede valutakurser k obs afhænger åbningen rate k op, balancedagens kurs k cl og den iboende kemisk udveksling rate k ch ifølge ligning (2).

Ligninger 1-2
Under native state betingelser k op er meget mindre end k lm og kan ignoreres i nævneren. Der er to ekstreme valutakurser regimer kaldet EX1 og EX2. Hvis k cl er meget mindre end k lm (EX1) den observerede hastighed er praktisk taget lig med åbningen sats og HX giver umiddelbar iagttagelse af udfoldning af et konstruktionselement. En sådan udveksling regime, hvor alle amid protoner udveksling på en gang ved åbning af den strukturelle element, er umiddelbart kan opgøres i MS med en bimodal fordeling af isotoptoppe 7. Hvis k cl er meget større end k lm (EX2) den observerede rente er proportional med k ch hvorved proportionalitetskonstanten er lig med folde-udfoldning balancer konstant K u = k op cl. Under disse betingelser, er mange åbning og lukning begivenheder er nødvendige, før alle amid protoner bytte for deuteroner, hvilket fører til en gradvis stigning i den gennemsnitlige masse, mens den isotopiske fordeling forbliver nogenlunde det samme. Den EX2 regime tillader bestemmelse af fri energi udfolde ΔG u og dermed stabiliteten på et strukturelt element. Under oprindelige tilstand betingelse EX2 regime er mest almindelig. Forøgelse af pH og tilsætning af chaotrope midler kan flytte udvekslingen mekanisme til at EX1. Derfor kan HX-MS bruges til at udforske termodynamisk samt kinetiske parametre for proteinfoldning og konformationelle ændringer.

Som nævnt ovenfor HX er uløseligt pH og temperatur afhængig og udveksling halveringstid af en helt opløsningsmiddel udsat proton rygraden amidgruppen er mellem 5-400 msek ved fysiologisk pH (pH 7,6) og 30 ° C, men 10 min til> 15 timer med et gennemsnit på> 2 timer ved pH 2,9 og 0 °C (bortset fra proton første rygraden amidbinding af et polypeptid, som udveksler med en halveringstid på ca. 1-2 min.) Under sådanne langsom udveksle forhold er det muligt at fordøje prøven ved hjælp af proteaser (f.eks pepsin), som er aktiv under disse betingelser, med ud at miste alle de oplysninger, der findes i de inkorporerede deuteroner. Siden indførelsen af peptisk fordøjelse under langsomme udveksle forhold, kan ikke kun de samlede HX kinetik af proteiner i fuld længde analyseres men HX kan lokaliseres til bestemte regioner 8,9. Rumlig opløsning øjeblikket er begrænset til størrelsen af ​​de peptiske fragmenter, hvilket er generelt mellem 10-30 rester. Overlappende fragmenter skabt på grund af den ikke-specifikke karakter af spaltning med pepsin, kan imidlertid føre til en stigning i rumlig opløsning. Desuden blev flere andre proteaser fundet at være aktive under quench betingelser dog langt mindre effektive end pepsin 10. Yderligere increaSE for rumlig opløsning kan nås ved fragmentering af peptider i gasfasen ved metoder, der bevarede deutereringen mønster såsom indfangning af elektroner dissociation (ECD), elektron transfer dissociation (EBD) og infrarød multiphoton dissociation (IRMPD) 11-13. Disse teknikker forhindre tab af rumlig opløsning på grund af intramolekylær proton migration ("scrambling"), som er observeret ved kollision-induceret dissociation (CID) den mest almindeligt anvendte fragmentering teknik. Men disse metoder kræver optimering for hvert enkelt peptid og er således stadig ganske udfordrende.

HX-MS er blevet anvendt til analyse af protein-ligand-og protein-protein-interaktioner, herunder virale capsid samlingen 14-17. Proteinudfoldning og genfoldning såvel som temperatur inducerede konformationelle ændringer blev undersøgt 7,18,19. Phosphorylering og enkelt aminosyremutation-relaterede konformationsændringer 16,20 og nucleotide-inducerede ændringer blev analyseret 21,22. Derfor er denne metode synes ideelt egnet til at analysere montage og dynamik molekylære maskiner. En attraktiv kandidat, hvis mekanisme er af stor almen interesse, er Hsp90 anstandsdame kompleks.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1.. Forberedelse af buffere og proteinprøver

  1. Forbered H2O puffer. Brug Hsp90 standard buffer (40 mM HEPES / KOH, pH 7,5, 50 mM KCI, 5 mM MgCl2, 10% glycerol), som H2O puffer.
    Bemærk: Hvis prøven blev dialyseret før analyse bruge dialysebufferen som H 2 O buffer. Det er vigtigt, at D2O puffer adskiller sig fra H2O puffer kun hydrogenisotopbygnings. Flygtige buffere som NH4 CO 3 eller NH4-acetat eller pufferbestanddele er ikke egnede!
  2. Forbered D2O puffer ved lyofilisering af Hsp90 standard buffer ved hjælp af et vakuum koncentrator. Efter fuldstændig fordampning af H2O tilføje ren D2O til røret for at nå det oprindelige samlede mængde (fx 1 ml buffer med 15% glycerol kræver tilsætning af 850 pi D2O). Gentag fuldstændig fordampning af bufferen og genopløse buffer / salt comkomponenter i D2O 2x.
  3. Forbered quench buffer (0,4 M KH 2 PO 4 / H 3 PO 4 pH 2,2).
    Bemærk: For at forbedre effektiviteten af peptisk fordøjelse af meget stabile proteiner kan tilsættes 4 M guanidinhydrochlorid og 0,5 M Tris (2-carboxyethyl) phosphinoxid (TCEP-HCI).
  4. Forbered 100% kontrolprøve (6 M guanidinhydrochlorid, D2O). Tilføj guanidinhydrochlorid en Hsp90 alikvot at nå en slutkoncentration på 6 M. Helt fordampe H2O fra prøven og tilføj D2O til røret for at nå det oprindelige samlede volumen (fx 100 pi prøve med 10% glycerol kræver tilsætning 90 pi D2O). Gentag fuldstændig fordampning af bufferen og genopløse buffer / salt komponenter i D 2 O.
    Bemærk: 20-100 pmol prøve kræves til hver injektion. Forbered nok prøve at have et kontrolrum 100% for hver dag i HX-MS eksperimenter.
  5. Forbered 50 pmol Hsp90 i 5 pi Hsp90 standard buffer.
    Bemærk: En mængde på 20-100 pmol prøve er nødvendig for hvert punkt af rådata. Mængden af ​​prøve i reaktionen er 1-5 pi ideelt. Juster koncentrationen til at passe disse krav. Enhver puffer kan anvendes, så længe det ikke indeholder rengøringsmidler eller flygtige bestanddele.

2. Fremstilling af immobiliseret pepsin på Aldehyd aktiverede perler

  1. Opløs 80 mg frisk pepsin i 2 ml 50 mM natriumcitrat (pH 5).
  2. Opløs 20 mg natriumcyanoborhydrid, håndtag med omhu (meget giftig!) I 1 ml 2 M Na 2 SO 4 og tilføje til pepsinopløsning.
  3. Inkuber blandingen i 10 minutter ved stuetemperatur under forsigtig omrøring (f.eks overhead-rystebord).
  4. Tilføj 600 mg perler med immobiliseret aldehydgrupper til blandingen og inkuberes i 5-10 minutter ved stuetemperatur.
  5. Tilføj 2,2 ml 2 M Na 2 SO4 (pH 5) i 100 portioner pi hver 3 min i løbet af en time til langsomt salt ud pepsinet. Bland forsigtigt prøven mellem tilsætningerne i en overhead-rysteapparat ved stuetemperatur.
  6. Inkubér pepsin perlerne ved 4 ° C i 14-16 t / natten over i en overhead ryster.
  7. Stands reaktionen ved tilsætning af 1 ml 1 M ethanolamin og inkubation ved stuetemperatur i 2 timer.
  8. Spin ned perlerne i et 50 ml Falcon rør ved 500 omdrejninger, supernatanten og resuspender perlerne i 0,1% myresyre. Gentag dette trin 2x. Efter det sidste centrifugeringstrin kassere supernatanten og skøn volumen af ​​perler. Tilføj en tilsvarende mængde 0,1% myresyre og opbevares ved 4 ° C.

3. Udarbejdelse af kolonner for Amid brint-exchange

  1. Brug guard kolonne med en indvendig diameter på 1 mm til indfangning kolonner og med 2 mm for pepsin kolonner.
  2. Skru den ene side af kolonnen vagt og fjerne filteret. Skru pakning Funnel på den åbne ende af søjlen. Brug en 1/16 inch adapter og slanger til at fastgøre en tom sprøjte (5 ml) til bundudløb af kolonnen. Sørg for at ordne det gastæt til kolonnen vagt.
  3. Påfør et par dråber af opslæmning perle materiale på toppen af ​​tragten. Træk stemplet i sprøjten til at suge slam gennem tragten i kolonnen vagt. Påfør mere gylle perle materiale på tragten og fortsætte proceduren indtil kolonnen vagt er helt fyldt med perle materiale. Fjern tragten og placere filteret og filteret ringen på den åbne ende. Skru kolonne hætten på kolonnen vagt og fjern sprøjten fra den anden side. Luk begge ender af guard kolonner med propper for at undgå udtørring af kolonnen materiale.

4.. Opsætning af System for Hydrogen Exchange massespektrometri (HX-MS)

  1. Tilslut fælden søjlen med HPLC-systemet (figur 1). Ækvilibrer søjlen ved at indstille strømningshastigheden afpumpe A til 0,4 ml / min med 0,1% myresyre som opløsningsmiddel. Tilslut ikke pepsin kolonne eller den analytiske kolonne endnu.
  2. Kalibrer massespektrometer og forbinde udløbet af HPLC til kilden til massespektrometer.

5.. Bestemmelse af Dynamic Range af Exchange

  1. Forbered ultrarent opløsningsmiddel A (0,1% myresyre i vand) og ultrarent opløsningsmiddel B (0,1% myresyre i acetonitril); færdigblandede opløsningsmidler er kommercielt tilgængelige. Purge HPLC pumper. Opsætning af kromatografi og massespektrometri metoder i styresoftware ved at vælge et program med en trinvis gradient efter en kort afsaltningstrin. For fuld længde Hsp90 bruge en 1-2 min afsaltningstrin efterfulgt af skift 6-port ventil fra afsalte / LOAD at eluere og et skridt gradient fra 90% opløsningsmiddel A/10% opløsningsmiddel B til 5% opløsningsmiddel opløsningsmiddel A/95% B. Før injektion indstille injektionsventil at indlæse og 6-port ventil til at afsalte / LOADING position.
    Bemærk: Brug ikke en pepsin eller analytisk kolonne i løbet af dette eksperiment.
  2. Forbered 100-200 pmol Hsp90 i 1-10 pi H2O puffer og inkuberes i 10 minutter ved 30 ° C. Tilføj temperatur justeres D2O buffer til at bringe volumen prøve op til 100 ul og inkuberes netop for en bestemt periode (fx 10 sekunder, 100 sekunder, 1.000 sek.) Tilsæt 100 pi quench puffer og blandes ved pipettering op og ned. Sprøjt 200 ul prøven i indsprøjtningsåbningen af ​​injektionen ventil med en Hamilton-sprøjte. Start kromatografi program og skifte ventilen injektion i INJECT position. Efter 2 min skifte 6-ports ventil fra afsalte / LÆSNING at eluere. Gentag dette for mindst tre tidspunkter.
  3. Gentag trin 5.2, men der tilsættes 2-3x over Sti1 til Hsp90 prøven før inkubering i 10 minutter ved 30 ° C.
  4. Bestem protein masserne fuld længde ved udfoldning af spektre i massespektrometri software. Beregn antallet af indeholdened deuteroner ved at sammenligne molekylvægten af fuld længde Hsp90 med den observerede masse efter hver prøve (fx 10 sekunder, 100 sekunder, 1.000 sek.)
  5. Plot indarbejdet deuteroner for Hsp90 i fravær og nærvær af Sti1 (y-akse) versus tid (x-aksen). Bestemme tid-punkt i den dynamiske område, hvor forskellen mellem de to kurver er maksimal. Brug denne værdi for inkubationstiden i D2O når du identificerer Hsp90-Sti1 interface og dynamik på peptid-niveau.

6.. Bestemmelse af peptisk peptider hjælp af MS / MS Spectra

  1. Tilslut pepsin søjle og analytisk søjle til systemet.
  2. Opsætning parametrene for kromatografi og massespektrometri i kontrol software ved at vælge gradient type og massespektrometri metode. Vælg en lang gradient (fx mere end 90 min) for at sikre god kromatografisk opløsning. Aktiver MS / MS spektre på massespektrometer.
    Bemærk: God opløsningtion på HPLC og høj masse nøjagtighed har højeste prioritet i dette trin.
  3. Forbered 100-200 pmol Hsp90 i 100 ul H2O puffer. Tilsæt 100 pi quench puffer og blandes ved pipettering op og ned. Sprøjt 200 ul prøven i indsprøjtningsåbningen af ​​injektionen ventil med en Hamilton-sprøjte. Start kromatografi program og skifte ventilen injektion i INJECT position. Efter 2 min skifte 6-ports ventil fra afsalte / LÆSNING til eluering af position.
    Bemærk: Hvis der er mere end ét protein skal analyseres i HX-MS (dvs. protein-protein interaktion interfaces) peptider for hvert protein skal bestemmes individuelt.
  4. Identificer peptiske peptider af Hsp90 ved at søge en database (dvs. Mascot) for de resulterende peptider.
    Bemærk: Det er muligt at anvende en brugerdefineret database, som er målet at bestemme så mange peptiske peptider som muligt og analyser udført med oprenset protein. Sample renhedsgrad vil have skal tages i betragtning.
  5. Gentag dette trin uden MS / MS og med gradienten, der skal bruges til den egentlige HX eksperiment. For Hsp90 og Sti1 bruge en 10 min gradient fra 90% opløsningsmiddel A/10% opløsningsmiddel B til 45% opløsningsmiddel A/55% opløsningsmiddel B.
    Bemærk: Gradienter er normalt mellem 5-15 min og stærkt afhængige af prøve kompleksitet og HX systemets specifikationer.
  6. Bestem retentionstid peptiske peptider identificeret i 6.4 i gradienten anvendes i 6.5 og oprette en liste omfatter 1). Peptidsekvens 2.). Peptid opladningstilstand og 3.). Opholdstid. Dette vil blive brugt til at identificere hvert peptid efter HX eksperimenter.
    Bemærk: Vær opmærksom på, at peptider med lille m / z forskelle identisk opladning tilstand og fastholdelse samme tid kan være en kilde til uklarhed.

7.. Identifikation af protein-protein interaktion Interfaces

  1. Opsæt gradient og massespektrometri metode i kontrolgruppen Software. Brug en 10 min lineær gradient fra 90% opløsningsmiddel A/10% opløsningsmiddel B til 45% opløsningsmiddel A/55% opløsningsmiddel B. Læg en massespektrometri metode, der er optimeret til detektering af masserne mellem 300-1,500 m / z, selvom de fleste af peptiderne vil være under 1000 m / z. Indstil ventilen injektion i LOAD position, 6-ports ventil i lastning / afsaltning holdning. Indstil strømningshastigheden for lastning pumpe til 0,4 ml / min.
    Bemærk: længde og type gradient er prøve og er muligvis nødt til at være optimeret. Længere gradienter forbedre opløsningen af ​​kromatografi men forsvinder inkorporering af deuteroner i proteiner på grund af back-udveksling. De valgte metoder skal være den samme for alle eksperimenter, der skal sammenlignes.
  2. For unexchanged henvisning forberede 20-100 pmol Hsp90 i 100 ul H2O puffer. Tilsæt 100 pi iskold quench buffer, pipette op og ned to gange og injicere prøven i indsprøjtningsventilen af ​​HPLC. Kromatografi program og sw straks begyndeklør indsprøjtningsventilen i INJECT position. Efter 2 min skifte 6-ports ventil fra afsalte / LÆSNING til eluering af position. Gør dette for Hsp90 og Sti1 individuelt og for blandingen af ​​proteiner.
  3. Forbered 20-100 pmol Hsp90 i et volumen på 1-5 pl. Tilføj temperatur justeres D2O buffer til at bringe volumen prøve op til 100 ul og inkuberes netop for en bestemt periode (fx 30 sekunder, for konformationelle dynamik se note). Tilsæt 100 pi iskold bratkøling buffer, pipette op og ned to gange og hurtigt injiceres 200 pi i indsprøjtningsventilen HPLC. Straks begynde kromatografi program og skifte ventilen injektion i INJECT position. Efter 2 min skifte 6-ports ventil fra afsalte / LÆSNING til eluering af position. Gør dette for hvert protein individuelt at bestemme deuteron inkorporering i hvert peptid i fravær af interagerende protein.
    Bemærk: Når man studerer dynamikken i overensstemmational ændringer gentage eksperimentet med forskellige inkubationstider af Hsp90 i D2O buffer. Prøv at dække et bredt tidshorisont ved at vælge inkubationstider logaritmisk (fx 10 sek, 30 sek, 100 sek 300 sek 1.000 sek osv.). D 2 O buffer og prøve buffer skal være nøjagtig ens, bortset fra brint isotop.
  4. Forbered et tilsvarende beløb af 100% prøve kontrol (20-100 pmol), og tilføje D2O buffer til at bringe volumen prøve op til 100 gl. Tilsæt 100 pi iskold bratkøling buffer, pipette op og ned to gange og hurtigt injiceres 200 pi i indsprøjtningsventilen HPLC. Straks begynde kromatografi program og skifte ventilen injektion i INJECT position. Efter 2 min skifte 6-ports ventil fra afsalte / LÆSNING til eluering af position.
  5. For at bestemme interaktionen overflade blandes Hsp90 med mindst 2 gange overskud af Sti1 at forskyde ligevægten til bundne tilstand (se note) og inkuberesved den ønskede temperatur, indtil kompleksdannelse er i ligevægt. Tilføj temperatur justeres D2O buffer til at bringe volumen prøve op til 100 ul og inkuberes netop for en bestemt periode (fx 30 sekunder). Tilsæt 100 pi iskold bratkøling buffer, pipette op og ned to gange og hurtigt tilføre indsprøjtningsventilen HPLC. Efter 2 min skifte 6-ports ventil fra afsalte / LÆSNING til eluering af position. Gentag dette eksperiment med 20-100 pmol af Sti1 og overskud af Hsp90.
    Bemærk: De absolutte koncentrationer afhænger af den dissociation ligevægt konstant for interaktion. Ideelt set, efter fortynding i D2O koncentrationen af proteinet tilsættes i overskud bør være mindst 10x K D (svarende til> 85% af den nedre koncentreret proteinbundet).
  6. Analysere de indsamlede data med passende software og bruge retentionstider bestemt i trin 6.5 for at finde hver peptid i analysen. Beregningte centroid af isotopen fordeling for unexchanged protein (trin 7.2) og for HX forsøg (trin 7.3).
    Bemærk: Selvom isotopvaedierne mønstre af udvekslede peptider ser anderledes fra deres unexchanged kolleger, både den viden om opladningstilstand af peptidet og den høje masse nøjagtighed massespektrometer giver mulighed for nem bestemmelse af centroids.
  7. Sammenlign inkorporering af deuteroner af target protein alene og med over bindende partner. Dette kan gøres automatisk med kommerciel software eller manuelt med et regnearksprogram. De 100% kontrolprøve værdier angiver den maksimale udveksling for hvert peptid og kan anvendes til at bestemme mængden af D 2 O etiketten tabt under forsøget på grund af tilbage udveksling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Hsp90 er en molekylær chaperone i gær og medlem af Hsp90 anstandsdame familien. Ved at gå gennem en kompleks ATPase cyklus det hjælper sene folde trin af mange protein klienter. Effektiv foldning kræver overførsel af kunder fra Hsp70 og interaktion af co-chaperone Sti1/Hop. Sti1 binder direkte til Hsp90 og letter klient binding ved inhibering af Hsp90 er ATPase-aktivitet. Interaktion af Hsp90 med Sti1 nylig blev undersøgt ved hjælp af HX-MS 23. Her præsenterer vi repræsentative resultater for de underliggende eksperimenter efter ovennævnte protokol.

Den direkte interaktion protein-protein blev testet ved mærkning af protein-kompleks i ligevægt med D2O og sammenligne Sti1 peptid spektre i fravær og nærvær af Hsp90.The resulterende forskel plot kan ses i figur 5A (data fra 23). Peptiderne er orienteret fra top til bund startende ved N-terminalen. Meste peptider iTPR2a og TPR2b viser en stærk beskyttelse i tilstedeværelse af Hsp90 (negative værdier for D + Hsp90 - D-Hsp90), hvilket indikerer, at disse regioner interagerer med Hsp90. Beskyttelsen i TPR2a let kan rationaliseres fra krystalstrukturen af Sti1-TPR2a-TPR2b i kompleks med et peptid, der repræsenterer den C-terminale MEEVD-motiv af Hsp90 (figur 5B). Er dog ikke altid en sådan klar beskyttelse i protein-protein interaktioner. Beskyttelsen i Hsp90 i nærvær af Sti1 er ikke så udtalt og ikke som lokaliseret i Sti1 (figur 5C og 5D). Alle peptider viser let øget beskyttelse fra deuteron inkorporering i overværelse af Sti1. Sti1 naturligvis stabiliserer Hsp90 globalt som ingen regioner af proteinet viser mere fleksibilitet i overværelse af Sti1. Vi kan dog ikke skelne mellem, om det reducerede deuteron inkorporering stammer fra direkte interaktion med Sti1 eller via allosteriske virkninger på kropsbygningaf Hsp90. De indhentede oplysninger reducerer formodede vekselvirkning websted til et par peptider (f.eks peptid 43-62 af NBD). Yderligere eksperimenter såsom tværbinding er almindeligt anvendt til at bekræfte de bindingssteder efter HX-MS 23. Notatet, sekvensen dækningen af ​​Hsp90 faldt ved måling af Hsp90-Sti1 kompleks. Siden Sti1 blev tilføjet i 3,5 gange overskud det teoretiske samlede peptider i analysen var nogle firedobbelte højere end med Hsp90 alene. Dette øger risikoen for Sti1 peptider overskygger eller overlappende Hsp90 peptider under analyse. For at optimere efter højere sekvens dækning bedre kromatografisk separation synes at være den mest lovende metode.

En mulighed for at studere dynamikken i forskellige protein regioner er anvendelsen af ​​kontinuert mærkning HX-MS. Det indebærer inkubation af ligevægt protein prøve i D2O for forskellige perioder, og derfor giver forudsigelser om stabiliteten afindividuelle protein segmenter. Figur 6 illustrerer spektre af peptid 43-62 fra NBD af Hsp90 i nærvær og fravær af en 3,5-fold overskud af Sti1. Inkubationstiderne blev valgt på en logaritmisk skala (10 sek, 100 sekunder og 1.000 sek) for at få en god dækning over et bredt tidsvindue. Peptid-spektre viser en tidsafhængig inkorporering af deuterium i proteinet, der øger længere inkubationstider. For peptid 43-62 udveksling følger EX2 mekanisme, hvor k int << k cl. Graden af ​​beskyttelse skifter hele inkubationstiden, der viser den største forskel på kortere inkubationstid og næsten tilsvarende vekselkurs på den længste tidspunkt. Dette tyder på en lavere grad stabilisering eller en region af dynamiske interaktioner med hyppige dissociation og reassociation. Enten den observerede beskyttelse skyldes en samlet reduceret valuta amid protoner i peptidet eller effekten kan henføres til en eller tospecifikke amid protoner, der udveksler langsommere i overværelse af Sti1. I dette tilfælde er sidstnævnte er langt mere sandsynligt, som Hsp90 krystalstruktur afslørede denne region for at være en eksponeret løkke snarere end en regelmæssig sekundær struktur som α-helixer eller β-ark.

Det er vigtigt at nævne, at ryggen udveksling ikke er blevet trukket fra de viste data antyder, at de observerede effekter vil være mere udtalt, når normaliseret til 100% kontrol af.

Figur 1
Figur 1. HPLC setup for HX-MS. a) Typisk konfiguration af en HX-MS oprettet. De forskellige farvede områder repræsenterer sektioner med forskellige temperaturer. Prøven injiceres i prøvesløjfe af ventilen injektion (i LOAD tilstand cyan) og efter tilkobling af ventilen til "injicere mode" (sort) pumpes gennempepsin kolonne i 6-vejsventil. Søjlen pepsin holdes omtrent ved 10 ° C for at forbedre enzymatiske aktivitet af pepsin. Den 6-port ventil har to tilstande, "Ilægning / Afsaltning Mode" og "Elution Mode" (se b). Efter afsaltning af prøven peptiderne kromatografisk adskilt med en acetonitrilgradient på en analytisk omvendt fase-kolonne. Peptiderne sprøjtes derefter ind i massespektrometer med en ESI-kilden. B) Modes af 6-vejsventil. Direkte efter HX 6-port ventilen er i "Ilægning / Afsaltning Position" til fælde de peptiske peptider på fælden kolonne. Dette fortsættes i op til tre minutter for at fjerne eventuelle salte eller forbindelser af reaktionsbuffere der kan forstyrre med massespektrometri. Efter dette 6-vejsventil skifter til "Elution Mode" sætte indlæst fælde kolonne i strømmen sti mellem gradient pumpe og analytisk kolonne. De fangne ​​peptiske peptider nu elueres fra fælden column og blive separeret i en gradient af 0,1% myresyre acid/0.1% myresyre i acetonitril.

Figur 2
Figur 2. Flow ordning af en HX eksperiment. 1) Target protein renses og leveres i standard buffere uden vaskemiddel. 2) protein fordøjes enzymatisk med pepsin og peptiske peptider identificeret og karakteriseret ved tandem massespektrometri (MS / MS). Først efter at have indhentet sekvens, opkræve stat og retentionstiden for så mange peptider som muligt HX-MS med held kan udføres. 3) De eksperimentelle betingelser er sat op som inkubation af proteinet under særlige betingelser (tilsætning af ligand / kemisk forbindelse eller skift i temperatur eller pH. 4) HX udføres ved at fortynde prøven 1:10 eller højere i D 2 O buffer . D 2 O buffer skal være identisk med prøvebufferen til avoid buffer virkninger. Så prøven inkuberes netop for en bestemt periode. 5) Efter inkubering standses reaktionen og injiceret i HPLC-MS-system. Prøven spaltes enzymatisk, og de resulterende peptiske peptider separeres i et organisk opløsningsmiddel-gradient, som injiceres i massespektrometer. 6) En analyse af den opnåede peptid spektre. Centroiderne af peptidet spektre sammenlignet under forskellige reaktionsbetingelser. Dette kan gøres manuelt med egnet software eller automatisk fra en HX analyseprogram.

Figur 3
Figur 3. Hydrogen udveksling mekanisme. Reaktionen af brint udveksling kan katalyseres af basis-eller syre, og derfor er pH-afhængig med en minimal valutakurs mellem pH 2,5 og 3 afhængigt af kæder af resterne, der flankerer amidbindingen 6 side. During afsaltning og kromatografisk separation af peptider, der er udført i H2O-holdige opløsningsmidler, er indarbejdet deuteroner udveksles frem protoner ifølge den samme mekanisme ("back udveksling"). Derfor optimering af systemet og brugte opløsningsmidler er afgørende for at reducere tabet af indbygget deuteroner.

Figur 4
Figur 4.. Princippet om HX-MS. Binding af en ligand til protein resulterer i beskyttelsen af ​​amidet rygraden hydrogenatomer ved bindingsstedet fra det omgivende opløsningsmiddel. Dette formindsker valutakurserne på de berørte protoner og nedsætter inkorporering af deuteroner. Fordi vægtforskellen mellem proton-og deuteron er 1. Da vil peptider afledt fra denne region af proteinet viser en lavere m / z i massespektrometri. Sammenligning af peptid-spektre af forsøgenei fravær og nærvær af bindende partner vil afsløre en forskydning af tyngdepunktet af spektrene for at sænke m / z-værdier (beskyttelse event). Regioner, der udviser fremtrædende beskyttelse efter tilsætning af bindingspartneren er potentielle bindingssteder. Afhængig af sekvens dækning og tilgængeligheden af ​​overlappende peptider bindingssteder kan indsnævres til et par aminosyrer.

Figur 5
Figur 5. Interaktion af Hsp90 og Sti1. a, Difference plot af deuteron inkorporering i Sti1 i overværelse af bindende partner Hsp90 minus deuteron inkorporering i Sti1 i fravær af Hsp90 (Data fra 23). b, Cartoon repræsentation af et fragment af Sti1 bestående TPR2a og TPR2b (FBF kode 3UQ3) i kompleks med et peptid, der repræsenterer den C-terminale MEEVD-motiv af Hsp90. Tegneserien er farvet overensstemding til antallet af amid protoner beskyttet mod deuteron inkorporering som angivet. c Forskel plot af Hsp90 i nærvær af bindingspartner Sti1. Observeret deuteron inkorporering i Hsp90 efter 10 min inkubation med 3,5 x overskud Sti1 ved 30 ° C og 30 sek HX ved den samme temperatur. Forsøget blev udført i tre eksemplarer og er vist standardfejl af middelværdien for hvert peptid. Globale negative værdier angiver reduceret inkorporering af deuteroner og dermed højere overordnede stabilitet af Hsp90 i tilstedeværelse af Sti1. Tilbage udveksle blev ikke anset for i dette eksperiment. D, Cartoon repræsentation af gær Hsp90 (FBF kode 2CG9) farvet i overensstemmelse med antallet af amid protoner beskyttet mod deuteron inkorporering som angivet ib. Klik her for at se større figur .

Figur 6. Tidsforløb for deuteron inkorporering i gær Hsp90 i fravær og tilstedeværelse af Sti1. a uforarbejdede peptid spektre af peptid 43-62 fra nukleotid bindende domæne af Hsp90 efter kontinuerlig mærkning brint udveksling. 20 uM Hsp90 blev inkuberet med 70 pM Sti1 i 10 minutter ved 30 ° C for at nå ligevægt og D2O mærkning blev udført ved 30 ° C i 10 sek, 100 sekunder og 1000 sek. Røde små markører angiver de beregnede centroids for hvert peptid. B, Exchange kinetik peptid 43-62 i nærvær og fravær af 3,5 x overskydende Sti1. Tilbage udveksling blev ikke anset for i dette eksperiment.

Figur 7
Figur 7. Eksempler på peptid-spektre med bimodal fordelingsnøgleion. a, DEUTERON inkorporering i E. coli Hsp90 i fravær og tilstedeværelse af ATP (data fra 22 suppl. Figur 3). Spektre af peptid-resterne 192-206, er vist før inkubering i D2O (0% D), efter 30 sek, 5 min, 10 min og 30 min inkubering i D2O og en 100% kontrol (100% D) . I fravær af ATP (-ATP) er observeret et typisk EX2 udveksling adfærd. I nærværelse af ATP (+ ATP) iagttages en stærk beskyttelse ved 30 sekunder og 5 minutter og 10 minutter bimodale fordelinger af isotop toppe, der angiver to populationer af proteiner, én population ligner ATP bundet tilstand og en anden svarer til nukleotid-fri tilstand. Ved 30 min ikke er observeret nogen forskel mellem fravær og nærvær af ATP. Den bimodal fordeling er mest sandsynligt forårsaget af ATP hydrolyse og overgang gennem nukleotid-fri stat med større fleksibilitet i dette protein segment. Disse spektre ligne en klassisk EX1 udveksle regimig. b Bimodal fordeling af isotopiske toppe i puls-mærkning af HX eksperimenter. E. coli Hsp90 blev inkuberet i fravær af ATP eller i nærværelse af ATP for 10-300 sekunder og derefter puls-mærket til 10 sek i D2O som angivet (data fra 22 Figur 4A). De bimodale fordelinger indikerer igen to sameksisterende populationer af molekyler, en udveksling hurtigere amid protoner til deuteroner end den anden. ATP inducerer en langsom overgang fra den hurtigere udveksling i langsommere udveksling konformation.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Binding af et samspil partner til et protein uundgåeligt forårsager ændringer i tilgængelighed opløsningsmiddel på bindingssted. Derudover er der mange proteiner undergår dynamiske konformationsændringer ved binding, som påvirker andre regioner end den faktiske bindende interface. HX-MS er en robust metode til at overvåge disse ændringer og er endda i stand til at afsløre konformationsændringer i proteiner på tidsskalaer der andre metoder ikke kan dække.

For med held at udføre HX-MS tre punkter er kritiske: 1) en optimal setup-system, 2) præcis udførelse af prøve forarbejdning og 3) omhyggelig dataanalyse ved tildeling peptid spektre og fortolke resultaterne.

Systemopsætningen

Da massespektrometri anvendes til at påvise deuteron inkorporering i peptider, de samme forholdsregler med hensyn til prøveforberedelse ansøge om HX-MS. Rengøringsmidler, salte og andre forbindelser, der interfererer med massespektrometri Should undgås eller fjernes før analyse. Mens HX-MS tillader analyse af store protein-komplekser, jo højere kompleksitet kræver øget kvalitet af peptid separation og massespektrometri. Optimering af kromatografiske betingelser er nøglen til at opnå data af god kvalitet. Dette indebærer, at valget af den høje kvalitet af organiske opløsningsmidler, omvendt-fase-materiale samt optimering af gradienter og opløsningsmidler. Vask af søjler med organiske opløsningsmidler kan ske mellem eksperimenter og natten over for at reducere baggrunden signal. Massespektrometriske metoder bør optimeres til påvisning af peptiske peptider (mellem 300-1,200 m / z). Høj opløsning massespektrometre høj grad lette dataanalyse fordi kan skelnes delvist overlappende isotopiske peak klynger fra forskellige peptider.

Behandling af prøver er afgørende for HX-MS. Normalt vores puffere og prøver centrifugeres i 10 minutter ved 13.000 rpm (mikrocentrifuge) for at fjerne aggregater og deltatøjer. Desuden kan flere inline filtre installeres i HPLC-systemet for at forhindre tilstopning af kolonner. Mindre afvigelser i D2O inkubationstider kan have store effekter. For meget fleksible protein regioner en forskel på kun et par sekunder kan gøre forskellen mellem ingen deuteron inkorporering på alle og fuld deutereringen. Da protein dynamik samt den iboende valutakurs er en funktion af temperaturen, inkubation af prøven og buffere er stramt kontrolleret temperatur. Det er fordelagtigt altid at gentage den nøjagtige sekvens af trin for hvert eksperiment. Hvis henrettet korrekt fejlen mellem to eksperimenter vil være forholdsvis lille. I dag er automatiserede systemer til HX-MS er kommercielt tilgængelige og mindske de udfordringer, prøve behandling.

Analyse af data

Det mest kritiske skridt i HX-MS er analyse af data, navnlig overdragelsen af ​​peptid spektre og bestemmelse af deuteration niveauer. The produktion af HX-MS er en elueringsprofil af det kromatografiske gradient indeholdende et stort antal af peptid spektre. Den erhvervsdrivende opgave er at tildele disse spektre til peptiderne identificeret af MS / MS i trin 6), i protokollen. Det kan være lidt svært, da spektre markant kan skifte hen imod højere m / z efter HX. Også den delvise overlapning af spektre kan komplicere opgaven af ​​peptider. I dette tilfælde betaler brugen af ​​højopløselige massespektrometre med høj masse nøjagtighed ud, fordi de ofte kan løse overlappende peptider. Forskelle i deuteron inkorporering beregnes på grundlag af de centroids peptid spektre. Centroiderne kan bestemmes: 1) manuelt ved at markere hver isotopiske top af et peptid spektrum og overføre sine værdier for intensitet og m / z i et regneark program (f.eks Excel, Microsoft) og beregning centroiden eller 2) med software designet til at tildele isotop toppe tilhører en identificeret peptid og beregnecentroids automatisk (f.eks HDExaminer, Sierra Analytics eller HeXicon 24,25).

Optimering af HX-MS

Hvis antallet af evaluerbare peptider er for lav, er der flere andre muligheder for at optimere eksperimentet: 1) optimering af kromatografi (opløsningsmidler, længde / form gradient brug af forskellige omvendt fase-materiale) eller 2) ændrer den enzymatiske spaltning af proteinet (alternative protease, længere / kortere inkubationstid med pepsin, tilsætning af denatureringsmidler til quench buffer). Begge parametre ændrer eluering adfærd af peptider, da de enten ændrer peptidet selve poolen eller HPLC-separation. Begge optimering tilgange kommer til en pris af behovet for at recharacterize peptider. Andre proteaser vil producere forskellige peptider, som skal identificeres ved MS / MS og karakteriseret som beskrevet i trin 6.6). Ændring af kromatografiske forhold vil ikke ændre peptid pool, men opbevaring times af de enkelte peptider. Har Retentionstiderne derefter at blive genbestemmes som i trin 6.5). Det bør nævnes, at højere retentionstider altid vil mindske mængden af ​​detekterbart mærke som back valuta over længere retentionstider. Normalisering af data til 100% kontrol det er den bedste måde at beskæftige sig med ryggen udveksling. Høj ryg udveksling fører til et tab af indarbejdet deuteroner og dermed signalet. Det anbefales kraftigt at reducere mængden af ​​ryg udveksling til et minimum. Det skal bemærkes, at forskellige HX-MS opsætninger har divergerende satser tilbage udveksling, afhængigt af hardware, sammensætningen af anvendte puffere og opløsningsmidler og typen af gradienter, der bruges 26.

Fortolkning af data

Ved analyse af data, skal vurderes omhyggeligt, da det kan give indikationer til udvekslingen mekanismen intensiteten fordeling af de isotopiske toppe. For peptider med en masse på mindreend 2.000 Da intensiteten af ​​isotop toppe af unexchanged prøve er generelt asymmetrisk med højere intensiteter for monoisotope eller det første højere isotop højdepunkt. For EX2 udveksling regime denne asymmetriske intensitetsfordeling bliver Gauss-lignende med stigende tid i D2O og øget skift til højere m / z og bredden af isotopisk klynge øges med ca 50% (figur 7). Som nævnt i indledningen EX2 er mest almindeligt observeret i HX-MS under native betingelser og den observerede kurs er proportional med ligevægt udfoldelse konstant K u og dermed den termodynamiske stabilitet af proteinet. I modsætning til EX1 udveksling regime bredden fordeling af de isotopiske klynge stiger markant og bimodale eller multimodale intensitet distributioner er observeret (se figur 7) 25,27. Bimodale isotop distributioner altid angive to eller flere forskellige molekylei analysen, der er potentielt interessant. Der er imidlertid to typer af faldgruber. For det første kan isotop klynge består af toppe med oprindelse fra to forskellige peptider. Det er derfor obligatorisk at tjekke spektre af unexchanged prøven til peptider med lignende m / z og identisk ladning. Sådanne peptider adskiller sig sædvanligvis smule i retentionstid og intensiteten fordeling af isotope toppe varierer med elueringstid. I høj opløsning massespektrometre kan isotopiske toppe, der ikke tilhører det samme peptid også kendetegnet ved decimalerne af m / z-værdier. Sekund, overførsel fra en tidligere HPLC-MS løb observeret 28. En sådan fremførsel vises som nonexchanged arter og kan elimineres ved tomme HPLC gradient kører mellem analyse kørsler. Der er mange grunde til tilsyneladende EX1 udveksling regime. 1) HX eksperimenter i overværelse af denatureringsmidler, EX1 er ofte observeret 29. 2) Spontan eller provokeret, reversibel eller irreversibel local eller global udfoldning af proteiner anledning EX1 adfærd 7,30,31. 3) Konformationelle overgange, der er langsomme i forhold til HX forårsaget af f.eks substrat omsætning, ATP hydrolyse forårsage bimodale isotop distributioner ligner EX1 udveksling regime (figur 7a) 22. 4) ligandinducerede langsomme konforme overgange i puls mærkning eksperimenter også udviser en EX1-lignende signatur (figur 7b) 22.

Fortolkningen af ​​opnåede data er efterhånden hvad der gør HX-MS sådan en udfordrende, men også kraftfuld teknik. En bred viden om protein dynamik er nødvendig for at komme hele vejen fra de observerede beskyttelse / afbeskyttelses mønstre med en mekanistisk model af protein dynamik. Ikke desto mindre kan producere høj kvalitet HX-MS-data gøres inden for forholdsvis kort tid, og er meget reproducerbar. Fortolkningen af ​​data tydeligt nyder godt af eventuelle yderligere oplysninger om strukturen af ​​proteinet investereigated. På den anden side, kan HX-MS angive, hvilke dele af et protein er fleksible, hvilket kan have at blive fjernet for at lette krystallisering for struktur beslutsomhed.

HX-MS er en metode, der i høj grad overskud ved innovationer i massespektrometri og kromatografi. Et nyligt fremskridt i HX-MS er brugen af lipid nanodiscs til analyse af membranproteiner, der yderligere udvider brugen af denne teknik 32. Også brugen af elektron overførsel dissociation (EBD) og elektron capture dissociation (ECD) viser stort potentiale for HX-MS, da det øger opløsningen af inkorporeret deuteron til niveauet af enkelte aminosyrer 11,12 33.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Vi har intet at afsløre.

Acknowledgments

Vi takker M. Boysen for kommentarer til manuskriptet. Dette projekt blev finansieret af Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB638 og MA 1278/4-1 til MPM, og Cluster of Excellence: CellNetworks EXC 81/1). MPM er investigator i Cluster of Excellence: CellNetworks.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
maXis QTOF Bruker
nanoAcquity UPLC Waters Corp.
Shimadzu 10AD-VP Shimadzu
6-port Valve EPC6W with microelectric actuator Valco #EPC6W
Injection valve (manual) Rheodyne #7725
Poros AL20 media Applied Biosystems #1-6029-06
Poros R2 Applied Biosystems #1-1118-02
Pepsin Sigma #P6887 use fresh pepsin
Microbore (1 mm) IDEX #C-128
Microbore (2 mm) IDEX #C-130B
Acquity UPLC BEH C8 Column Waters Corp. #186002876
Thermomixer Eppendorf #5355000.011
Tubing (various diameters) IDEX
Fittings IDEX #PK-110 with PK-100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Saibil, H. R. Conformational changes studied by cryo-electron microscopy. Nat. Struct. Biol. 7 (9), 711-714 (2000).
  2. Mittermaier, A., Kay, L. E. New tools provide new insights in NMR studies of protein dynamics. Science. 312 (5771), 224-228 (2006).
  3. Hoofnagle, A. N., Resing, K. A., Ahn, N. G. Protein analysis by hydrogen exchange mass spectrometry. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 32, 1-25 (2003).
  4. Wales, T. E., Engen, J. R. Hydrogen exchange mass spectrometry for the analysis of protein dynamics. Mass. Spectrom. Rev. 25 (1), 158-170 (2006).
  5. Konermann, L., Pan, J., Liu, Y. -H. Hydrogen exchange mass spectrometry for studying protein structure and dynamics. Chem Soc. Rev. 40 (3), 1224-1210 (2011).
  6. Bai, Y., Milne, J. S., Mayne, L., Englander, S. W. Primary structure effects on peptide group hydrogen exchange. Proteins. 17 (1), 75-86 (1993).
  7. Rist, W., Jørgensen, T. J. D., Roepstorff, P., Bukau, B., Mayer, M. P. Mapping temperature-induced conformational changes in the Escherichia coli heat shock transcription factor sigma 32 by amide hydrogen exchange. The Journal of biological chemistry. 278 (51), 51415-51421 (1074).
  8. Englander, J. J., Rogero, J. R., Englander, S. W. Protein hydrogen exchange studied by the fragment separation method. Anal Biochem. 147 (1), 234-244 (1985).
  9. Zhang, Z., Smith, D. L. Determination of amide hydrogen exchange by mass spectrometry: a new tool for protein structure elucidation. Protein Sci. 2 (4), 522-531 (1993).
  10. Cravello, L., Lascoux, D., Forest, E. Use of different proteases working in acidic conditions to improve sequence coverage and resolution in hydrogen/deuterium exchange of large proteins. Rapid Commun. Mass Spectrom. : RCM. 17 (21), 2387-2393 (2003).
  11. Rand, K. D., Zehl, M., Jensen, O. N., Jørgensen, T. J. D. Protein hydrogen exchange measured at single-residue resolution by electron transfer dissociation mass spectrometry. Anal chem. 81 (14), 5577-5584 (2009).
  12. Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. Electron capture dissociation of electrosprayed protein ions for spatially resolved hydrogen exchange measurements. J. Am. Chem. Soc. 130 (35), 11574-11575 (2008).
  13. Yamada, N., Suzuki, E. -I., Hirayama, K. Identification of the interface of a large protein-protein complex using H/D exchange and Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 16 (4), 293-299 (2002).
  14. Lee, T., Hoofnagle, A. N., et al. Docking motif interactions in MAP kinases revealed by hydrogen exchange mass spectrometry. Mol. Cell. 14 (1), 43-55 (2004).
  15. Hasan, A., Smith, D. L., Smith, J. B. Alpha-crystallin regions affected by adenosine 5'-triphosphate identified by hydrogen-deuterium exchange. Biochem. 41 (52), 15876-15882 (2002).
  16. Lanman, J., Lam, T. T., Emmett, M. R., Marshall, A. G., Sakalian, M., Prevelige, P. E. Key interactions in HIV-1 maturation identified by hydrogen-deuterium exchange. Nat. Struct. Mol. Biol. 11 (7), 676-677 (2004).
  17. Wang, L., Lane, L. C., Smith, D. L. Detecting structural changes in viral capsids by hydrogen exchange and mass spectrometry. Protein Sci. 10 (6), 1234-1243 (2001).
  18. Pan, H., Raza, A. S., Smith, D. L. Equilibrium and kinetic folding of rabbit muscle triosephosphate isomerase by hydrogen exchange mass spectrometry. J. Mol. Biol. 336 (5), 1251-1263 (2004).
  19. Mazon, H., Marcillat, O., Forest, E., Smith, D. L., Vial, C. Conformational dynamics of the GdmHCl-induced molten globule state of creatine kinase monitored by hydrogen exchange and mass spectrometry. Biochem. 43 (17), 5045-5054 (2004).
  20. Lanman, J., Lam, T. T., et al. Identification of novel interactions in HIV-1 capsid protein assembly by high-resolution mass spectrometry. J. Mol. Biol. 325 (4), 759-772 (2003).
  21. Rist, W., Graf, C., Bukau, B., Mayer, M. P. Amide hydrogen exchange reveals conformational changes in hsp70 chaperones important for allosteric regulation. J. Biol. chem. 281 (24), 16493-16501 (2006).
  22. Graf, C., Stankiewicz, M., Kramer, G., Mayer, M. P. Spatially and kinetically resolved changes in the conformational dynamics of the Hsp90 chaperone machine. EMBO J. 28 (5), 602-613 (2009).
  23. Lee, C. -T., Graf, C., Mayer, F. J., Richter, S. M., Mayer, M. P. Dynamics of the regulation of Hsp90 by the co-chaperone Sti1. EMBO J. 31 (6), 1518-1528 (2012).
  24. Lou, X., Kirchner, M., et al. Deuteration distribution estimation with improved sequence coverage for HX/MS experiments. Bioinformatics. 26 (12), 1535-1541 (2010).
  25. Kreshuk, A., Stankiewicz, M., Lou, X., Kirchner, M., Hamprecht, F. A., Mayer, M. P. Automated detection and analysis of bimodal isotope peak distributions in H/D exchange mass spectrometry using HeXicon. Intl. J. mass spectrom. 302 (1-3), 125-131 (2011).
  26. Walters, B. T., Ricciuti, A., Mayne, L., Englander, S. W. Minimizing back exchange in the hydrogen exchange-mass spectrometry experiment. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 23 (12), 2132-2139 (2012).
  27. Weis, D. D., Wales, T. E., Engen, J. R., Hotchko, M., Ten Eyck, L. F. Identification and characterization of EX1 kinetics in H/D exchange mass spectrometry by peak width analysis. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 17 (11), 1498-1509 (2006).
  28. Fang, J., Rand, K. D., Beuning, P. J., Engen, J. R. False EX1 signatures caused by sample carryover during HX MS analyses. Intl. J. Mass Spectrom. 302 (1-3), 19-25 (2011).
  29. Deng, Y., Smith, D. L. Identification of unfolding domains in large proteins by their unfolding rates. Biochem. 37 (18), 6256-6262 (1998).
  30. Wales, T. E., Engen, J. R. Partial unfolding of diverse SH3 domains on a wide timescale. J. Mol. Biol. 357 (5), 1592-1604 (2006).
  31. Pan, Y., Piyadasa, H., O'Neil, J. D., Konermann, L. Conformational dynamics of a membrane transport protein probed by h/d exchange and covalent labeling: the glycerol facilitator. J. Mol. Biol. 416 (3), 400-413 (2012).
  32. Hebling, C. M., Morgan, C. R., Stafford, D. W., Jorgenson, J. W., Rand, K. D., Engen, J. R. Conformational analysis of membrane proteins in phospholipid bilayer nanodiscs by hydrogen exchange mass spectrometry. Anal chem. 82 (13), 5415-5419 (2010).
  33. Abzalimov, R. R., Kaplan, D. A., Easterling, M. L., Kaltashov, I. A. Protein conformations can be probed in top-down HDX MS experiments utilizing electron transfer dissociation of protein ions without hydrogen scrambling. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 20 (8), 1514-1517 (2009).

Tags

Kemi molekylchaperoner massespektrometre aminosyrer peptider proteiner enzymer coenzymer Protein dynamik konformationsændringer allostery protein foldning sekundær struktur massespektrometri
Analyserer Protein Dynamics hjælp af brint Exchange massespektrometri
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hentze, N., Mayer, M. P. Analyzing… More

Hentze, N., Mayer, M. P. Analyzing Protein Dynamics Using Hydrogen Exchange Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (81), e50839, doi:10.3791/50839 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter