Summary
我们描述了用于实现BMP-2的有效固定化在表面上的方法。我们的方法是基于一个自组装单层实现共价通过其游离胺残基的BMP-2的结合的形成。这个方法是研究信令在细胞膜的有用工具。
Abstract
骨形态发生蛋白-2（BMP-2）是嵌入在骨组织中的细胞外基质的生长因子。 BMP-2作为间充质细胞分化为成骨细胞的触发器，从而刺激愈合和新生骨形成。与支架结合临床使用的重组人BMP-2（的rhBMP-2）提出了一些争议，根据演示文稿的方式和交付量。这里介绍的协议提供了一种简单而有效的方式提供的BMP-2的体外研究细胞。我们描述了如何形成自组装单分子层组成的异双功能连接物，并显示在下面的结合步骤中获得的rhBMP-2的共价固定。用这种方法，可以实现BMP-2的持续文稿，同时保持了蛋白质的生物活性。事实上，BMP-2的表面固定允许有针对性的调查，防止非特异性的广告orption，同时减少的生长因子的量和，最值得注意的是，阻碍了从表面不受控制的释放。由BMP-2引起的短期和长期的信号传导事件正在发生时，细胞暴露于表面呈共价固定的rhBMP-2，使得该方法适于在体外研究细胞对BMP-2刺激。
Introduction
骨形态发生蛋白-2（BMP-2）是转化生长因子（TGF-β）家族，并作为新生骨形成的诱导剂，以及几种组织的胚胎发育和成年人中调节动态平衡1-3的成员。 具有生物活性的同型二聚体的BMP-2蛋白的每个单体包含一个“半胱氨酸结”的主题，它是高度保守的所有骨形成蛋白4。六七个半胱氨酸残基形成稳定的每个单体分子内二硫键，而第七个半胱氨酸参与二聚化，形成了两种单体5,6之间的分子键。这个高度保守的半胱氨酸结定义了BMP-2蛋白的三维结构，并确定其独特的性能，如对热，变性剂和酸性pH 7-9的阻力。 BMP-2的结合的丝氨酸/苏氨酸激酶的跨膜受体，从而诱导信号转导
在骨，BMP-2诱导间充质干细胞分化为成骨细胞，从而刺激愈合和从头形成骨。目前，重组表达的BMP-2是临床应用，以提高骨折部位的愈合。在骨组织工程常见的策略是利用注射生长因子，相比本地投递系统，是创伤小。然而， 在体内研究和临床应用表明，短的生物半衰期，非特异性禄alization和BMP-2的快速局部间隙可能导致一些地方，异位和系统性问题15。因此，为了获得有效的演示，BMP-2的范围内或之上的材料的包封或固定是必要的，它的本地和持续递送于靶位点。持续释放可以通过非共价的保留的方法，如物理截留，吸附或离子络合16来实现。然而，它是已知的蛋白质的非特异性吸附到表面可导致分子17的变性。为共价的生长因子结合，已经开发了不同类型的支撑件，在过去十年。使用双官能连接基的分子靶向的蛋白质的氨基或羧基基团例如，是一种类型的，这并不一定需要的蛋白质修饰，以实现其固定的方法。事实上，当蛋白质修饰提供调控蛋白定向的优势，引入人工结构域，肽标记和特定于站点的链可改变生长的生物活性因子17。因此，为了规避变性由于与支撑材料的相互作用，表面可以事先官能化，例如，有自组装单分子层的连接分子（SAM），接着是所需的因子18的耦合。我们已经使用了基于SAM的方法，共价固定化的BMP-2在表面上通过靶向其游离胺残基且已经表明，固定化的蛋白保留其短期和长期的生物活性19。这个协议提供了一种简单而有效的方式提供的BMP-2的细胞的体外研究在其上发生在细胞膜和调节负责信令成骨细胞内信号传导的机制。
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Protocol
1。 11-Mercaptoundecanoyl-N-琥珀酰亚胺酯（MU-NHS）的合成
- 逐滴加入500毫克N-羟基琥珀酰亚胺的溶液和30mg 4 - （二甲氨基）吡啶在10ml丙酮（PA）的1克11-巯基十一酸的40ml二氯甲烷（PA）在室温（RT）。
- 将反应冷却至0℃，并逐滴加入1.1克N，N' -二环己基碳在10毫升二氯甲烷中（氮气氛下）。保持在低温下进行1小时反应，然后在室温搅拌过夜。
- 过滤出沉淀，干燥，减压。通过快速色谱纯化，用石油苯和乙酸乙酯（PA）以1:1的比率提纯产物。
2。齐金层的制备
- 干净的玻璃盖玻片精确湿巾含有乙酸乙酯（PA）和甲醇（PA）1:1混合物的溶液超声仪处理他们5分钟。 RINSË基板用甲醇和在氮气流中干枯脱落。
- 将干净的基板中的溅射涂覆装置。疏散室。通过溅射60秒从铬靶中取出最上面的氧化铬层。将样品在金属梁和涂层它们与10纳米的铬层，接着用40nm金层覆盖的下面。
3。 BMP-2的表面固定
- 溶解的MU-NHS在N，N-dimethlyformamide酰胺（DMF），以约1mM的终浓度和孵育金衬底中的MU-NHS的溶液在室温氮气气氛下4小时。
- 在DMF中的声处理的表面，持续2分钟，冲洗，用DMF和MeOH，并在氮气流干燥关闭。
- 制备的rhBMP-2的储备溶液在无菌4mM的盐酸与100微克/毫升（店铺等份在-80℃下）的浓度。对于工作稀释液（3.5微克/毫升），稀原液在PBS /氯化钠（PBS含有1M NaCl的）和一个djust至pH 8.5在使用前立即。
- 孵育功能化MU-NHS在4℃的的rhBMP-2工作液过夜表面。除去培养上清。在PBS / NaCl中2分钟声处理的表面和洗3次，用无菌PBS / NaCl洗涤。
4。表面表征
- 以阻止抗体的非特异性吸附，孵育用5％BSA的表面（重量/体积）中1小时，在室温下，接着温育用抗BMP-2抗体（1:100，以1％（w / v的PBS溶液）BSA / PBS溶液）处理1小时，在室温。用PBS超声，持续30秒洗两次面。
- 孵育底物与HRP偶联的二抗（1:1,000以1％（重量/体积）BSA / PBS溶液）30分钟，在RT，然后用PBS洗两次。
- 使用Ampliflu红测定法测量的HRP酶的活性在570nm处用酶标仪。
5。生物活性分析
- 种子1×10 5个鼠C2C12每孔在6孔PL成肌细胞阿泰在生长培养基中，由含有丙酮酸补充有10％FBS，1％青霉素/链霉素和37℃/ 5％CO 2孵育在他们24小时的高葡萄糖DMEM中。
- 饥饿的细胞在无血清的DMEM培养前3-5小时至播种到装饰有固定的BMP-2的表面上。
- 对于短期的信号感应的调查，以200μl的新鲜的无血清DMEM替换培养基，然后将固定化的BMP-2的表面上的细胞。表面应该用细尖镊子处理，以避免刮伤。
- 轻轻地取出面和吸出培养基用移液管，用PBS洗细胞两次。进到细胞反应的分析。
- 对于长期的生物活性，板单元的分析到六天表面并对其进行培养，在37℃/ 5％CO 2在低血清条件下（2％FBS）中。
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Representative Results
在我们的设置中，黄金被选为赋形剂，因为它提供了一种生物，但非特异性化学可调系统。另外，自组装单分子膜的应用嗣继承很多益处：通过自组装膜对金属和形式的单层缺陷少其“头部基团”自发地吸附，而其末端官能基团可以被进一步修饰。因此，他们提供一个平台，在受控而高度适应性的方式20定制界面的属性。
对于BMP-2对金涂覆的表面上的固定化，我们使用了两个步骤的方法：1）结合的MU-NHS接头的金层，然后2）连接体与该蛋白反应（参见图1）。证明的rhBMP-2的结合，我们使用的酶免疫测定法。在该试验中，表面呈现固定的rhBMP-2孵育用BMP-2特异性抗体和缀合辣根过氧化物酶的二次抗体。后者的结合可以是determined使用Ampliflu红色溶液。在过氧化氢存在下，HRP催化无色Ampliflu红（10 - 乙酰基-3,7 - dihydroxyphenoxazine）转化成荧光化合物试卤灵。我们检测到表面固定的rhBMP-2（IBMP-2）之前，接近贴壁细胞从上面的功能化表面后。请注意的rhBMP检测与Ampliflu红测定，样本受几个孵育步骤和治疗。因此，前和细胞刺激后， 图2A示出了的rhBMP-2的成功结合的表面由抗BMP-2的IgG识别的构象研究相同的表面是不可行的。 图2B显示了一个IBMP- 2面，是用来刺激细胞30分钟前，由HRP免疫测定法。即使在细胞刺激蛋白被检测的表面上。
细胞的反应，表面呈现固定的相对湿度BMP-2进行评价和比较的未经处理的金衬底（阴性对照）的效果。为了最大限度地减少粘附过程对短期信令的分析的影响，一组特殊的式被用于细胞刺激开发。这里，C2C12细胞中通过的rhBMP-2的官能化的表面从顶部接近刺激30分钟。将小鼠成肌细胞系C2C12是多能干间充质前体细胞系，其被广泛用作模型系统来研究成骨细胞分化过程中的骨形成中的肌肉组织中的早期阶段。在这个模型中，BMP-2抑制细胞分化成多核肌管，诱导成骨细胞表型21。的Smad 1/5/8的激活，这是对BMP-2信号传导途径的下游记者，通过蛋白质印迹分析。 如图3A所示 ，Smad蛋白的磷酸化是在30分钟刺激IBMP-2中观察到，而没有磷酸化的Smad 1/5/8的发生在细胞暴露于未经治疗的黄金样品。这一结果表明，固定化过程中不改变的BMP-2短期活性，并触发在Smad信号早期步骤。
以确定IBMP-2是否会影响长期的成骨分化，碱性磷酸酶（ALP）的表达水平，成骨标记物，通过比色测定的影响。 C2C12细胞中ALP活性孵育细胞6天，在普通金（对照）和IBMP-2的表面后，测定。在细胞上IBMP-2表面上培养的溶胞产物的ALP活性显示了相比于对照组（ 图3B）一个显著更高的吸收。这一结果表明，IBMP-2诱导C2C12细胞的成骨标志物碱性磷酸酶（ALP）的表达。该细胞系是已知的在到达汇合来区分低血清条件下，由此形成肌管和表达特征肌蛋白。然而，与BMP-2处理引起的移位分化途径从成肌细胞以成骨，因此抑制肌管形成。调查IBMP-2对肌肉发育的影响，C2C12细胞进行黄金（对照组）或功能化表面和下分化程度（低血清）条件下培养直接电镀。 6天后，进行肌球蛋白重链（MHC）的染色。 如图3C所示，C2C12细胞不能形成MHC阳性肌管中IBMP-2的存在，但不能在金基板。
图1。的rhBMP-2的固定化过程在金表面的方案。玻璃盖玻片覆盖有金层，随后温育用异双功能接头（MU-NHS）产生了NHS-官能化的自组装单层（SAM）。 BMP-2的伯胺与链接器的反应导致合作在基板上valently固定的蛋白质。 点击这里查看大图 。
图2。表面结合的rhBMP-2可通过酶免疫分析法（B）细胞刺激实验。固定化的rhBMP-2进行定量使用Ampliflu红比色法测定后进行检测（A）之前，以及 。的吸收，测定570nm处和归一化数据，以控制（无处理金表面）的值。误差棒表示与平均值的N> 3的标准偏差。
图3。固定的rhBMP-2保持生物活性和诱导短期的以及长期的信号事件（A）C2C12细胞被暴露在金表面（对照）和表面共价固定的rhBMP-2（IBMP-2）从顶部接近刺激30分钟。细胞裂解后，将样品进行免疫对p-Smad1/5/8和β-肌动蛋白（B）的碱性磷酸酶（ALP）的酶活性表明C2C12细胞的成骨分化和从细胞裂解物中测定的6天培养后期间控制或IBMP-2表面上。 ALP活性测定405nm处的吸光度。条形图显示了一个60分钟的反应后获得的数据。误差棒表示标准偏差，n = 3时，* P <0.01（C）的C2C12细胞接种在指示表面并培养低血清条件下6天让肌肉发育。图像显示，肌球蛋白重链的多核肌管体（MHC）染色（绿色）和DAPI核染色（蓝色）。图像放大20倍。
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Discussion
在这个协议中，我们描述了功能化与生物活性的rhBMP-2表面的准备。该方法包括两个步骤：在金表面的双官能连接体的自组装单层（SAM）的1）初步形成，2）共价的rhBMP-2蛋白的固定化。在以前的工作中，我们验证了双官能连接子和生长因子的有效结合，并表明表面固定化的rhBMP-2保持其生物活性19。在固定化的形式呈现的生长因子的生物活性也已显示在其他研究中，表明该蛋白的释放以及随后的内化是不是为细胞刺激24,25必不可少的。实际上，生长因子的共价固定可在靶细胞的持续刺激，同时保持，因为不同类型的受体的增强的占用率的有效剂量在细胞膜22,23,26-28。
对于表面呈现固定的rhBMP-2，护理的准备，应采取在处理整个过程的表面和编制的rhBMP-2的解决方案。玻璃盖玻片应清洁，干燥，缺陷或杂质的迹象应该是可见的。划伤表面用镊子和移液管，应该避免。对于使用的rhBMP-2的表面官能化步骤中，有必要在准备使用无载体的重组蛋白， 即不加入牛血清白蛋白，以避免表面上的载流子的不期望的固定化。该的rhBMP-2的股票（100微克/毫升）溶解在4毫米盐酸。当表面被孵育的的rhBMP-2溶液的pH应调节至中性至微碱性pH值，以提高与NHS基团的表面结合的连接体的蛋白质的氨基基团的反应。如果pH值太低，在NHS基团可能被水解，才可以发生反应机智h时氨基的蛋白质。我们使用的PBS含1 M氯化钠29，并从股票添加的rhBMP-2，然后用氢氧化钾（10毫米）调节pH值。
有了这个协议，我们取得了具有生物活性的rhBMP-2对表面成功固定，因为：1）我们建立了两个步骤的方法; 2）我们用一个合适的连接器，以从表面获得距离和结合蛋白无重大干扰其与受体的相互作用。胺反应性烷硫醇，11 - mercaptoundecanoyl-N-羟基琥珀酰亚胺酯（MU-NHS），被拴在金衬底中的第一步。像金金属作为硫醇自组装，形成高度有序的单分子膜，它们促进表面具有多种连接分子的30-32的装饰。在SAM屏蔽从固体表面直接接触的生物分子，从而最大限度地减少变性32的风险。此外，连接体的长度也决定了意图ctivity的SAM。的NHS基团的接头，包括至少11个碳原子，如对MU-NHS的，是更容易，从而提高蛋白质的固定化相比，结合到较短的接头34。的rhBMP-2的固定是通过在NHS基团的由蛋白34的赖氨酸残基的置换。考虑到仅仅是空间位阻的环境中，表面固定的NHS基团的反应最可能发生在柔性N端残基35。然而，如图所示为其它配体，其长度和连接体的柔软性可能使相互作用而与其他空间位阻的结合位点，从而补偿不利取向36,37。在未公开的工作中，我们比较了一步法与两步固定化策略。使用含有蛋白质和交联剂，并且连续表面上的连接体与蛋白质的结合的溶液之间的比较，结果显示，只有两步策略导致生物活性配体固定化。这可能是由于在SAM的屏蔽作用，从而阻碍蛋白质变性，否则可能发生上金。另外，由于连接体已经被固定到表面上，通过连接器和其产生的失活的末端基团的蛋白质之间的交联是规避38。
用于与细胞表面固定化的rhBMP-2刺激的实验中，关键的是要事先确定该C2C12没有形成到它们播种到衬底上之前，肌管中的培养瓶中。因此，细胞必须保持汇合的文化。批处理用于培养和用于实验的胎牛血清，必须进行测试，以确保没有成骨刺激都存在。这是通过使用QUANTIKINE法检测骨形态发生蛋白和通过检测所述细胞为成骨细胞分化标记物进行的， 如 alkal鸟嘌呤磷酸酶的表达。当处理基板从培养物顶部的刺激，这是再重要，以避免与镊子任何划痕。应避免在任何情况下，细胞的培养和压缩干燥，否则细胞畸变和死亡将响应于BMP-2的刺激作用产生负面影响。我们建议移液约100μl的DMEM中成6孔板，其中所述细胞是施加在基板上的细胞培养之前的每个孔中。应细胞，在显微镜下观察，以确保没有形态变化是由表面上的培养物顶部的存在触发。最后，除去基板时，一边小心地抬起与镊子和基板轻轻剥离。应进行立即检查任何细胞损伤与明视场显微镜，以及支票的基板，以确定是否有任何细胞系链或主要存在杂质。
_content“>总之，所提出的两个步骤的过程提供了一个有用的工具，通过它的胺残基的固定化的rhBMP-2到基底上，以研究其对细胞反应的影响。所描述的策略结合许多优点。一方面，它不是仅限于BMP-2，但是它也可以适用于BMP家族的其它生长因子，因为它们呈现出高度保守的氨基酸结构。另一方面，通过防止非特异性吸附，通过此方法，有针对性的BMP-2的调查，同时减少的生长因子的量和，最值得注意的是，阻碍了从表面不受控制的释放。Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者什么都没有透露。
Acknowledgments
我们感谢教授太平绅士斯帕茨（生物物理化学系，海德堡大学以及新材料和生物系统学系，马克斯普朗克研究所的智能系统，斯图加特）对他的鼎力支持。从马克斯 - 普朗克协会与德意志研究联合会（DFG SFB/TR79到EAC-A）的财政支持也大大承认。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| N-hydroxysuccinimide | Sigma-Aldrich | 130672 | |
| 4-(dimethylamino)pyridin | Sigma-Aldrich | 522805 | |
| Acetone | AppliChem | A2282 | |
| 11-mercaptoundecanoic acid | Sigma-Aldrich | 674427 | |
| Dichlormethane | Merck | 106050 | |
| N,N'-dicyclohexylcarbodiimide | Sigma-Aldrich | D80002 | |
| Petroleum benzene | Merck | ||
| Glass coverslips | Carl Roth | M 875 | |
| Ethylacetate | AppliChem | A3550 | |
| Methanol | Carl Roth | 4627 | |
| N,N-dimethylformamide | Carl Roth | T921 | |
| rhBMP-2 | R&D Systems | 355-BM | Carrier-free; expressed in E.coli |
| PBS | PAA | H15-002 | |
| NaCl | Carl Roth | HN00.2 | |
| Poly(dimethyl siloxane) (PDMS) | Dow Corning | ||
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Dow Corning | ||
| Anti-rhBMP-2 | Sigma | B9553 | |
| Goat anti-mouse IgG-HRP | Santa Cruz | sc-2005 | Secondary antibody |
| Ampliflu Red assay | Sigma | 90101 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1x), liquid | Gibco | 41966 | High glucose |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F7524 | Sterile filtered, cell culture tested |
| Pen/Strep | Gibco | 15140 | |
| Trypsin 0.05% (1x) with EDTA 4Na | Gibco | 25300 | |
| Glycine (0.1 M) | Riedel-de Haën | 33226 | |
| IGEPAL CA-630 (1%) | Sigma | I8896 | Lysis buffer (ALP assay)19 |
| Magnesium chloride (MgCl2)(1 mM) | Carl Roth | HNO3.2 | |
| Zinc chloride (ZnCl2) (1 mM) | Carl Roth | 3533.1 | |
| p-nitrophenylphosphate (pNPP) | Sigma | S0942 | Phosphatase substrate |
| Anti-mysin heavy chain (MHC) | Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa | MF20 | Monoclonal antibody |
| Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG | Invitrogen | A11001 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Equipment | |||
| Ultrsonic bath (Sonorex Super RK 102H), Frequency 35 kHz | BANDELIN electronic GmbH Co. KG | ||
| MED 020 Sputtercoating system | BAL-TEC AG | Coating conditions Cr: 120 mA, 1.3 x 10-2 mbar, 30 sec Au: 60 mA, 5.0 x 10-2 mbar, 45 sec |
|
| Tecan Infinite M200 Plate reader | Tecan | ||
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